CN114657072B

CN114657072B - 一种溶磷真菌、菌剂及其应用

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Publication number: CN114657072B
Application number: CN202111494579.8A
Authority: CN
Inventors: 肖谋良; 魏晓梦; 祝贞科; 田宝虎; 葛体达; 陈剑平
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114657072A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种溶磷真菌、菌剂及其应用。本发明公开的溶磷真菌菌株名为青霉ISA‑C26，分类名为青霉(Penicillium sp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.23239，保藏日期为：2021年9月18日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。青霉ISA‑C26在低磷环境和高磷环境下，均具备较强的解磷能力，且其解磷能力强于常见的溶磷真菌。将青霉ISA‑C26开发为菌剂，应用于植物肥料，对有效提高土壤速效磷含量及磷肥利用率具有重要意义，具备广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种溶磷真菌、菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种溶磷真菌、菌剂及其应用。

背景技术

亚热带红壤区是水稻的主产区，由于长期的风化淋溶，该区域土壤严重缺磷，磷素缺乏严重影响水稻的产量和品质。目前磷肥主要来源于不可再生的磷矿石，据估计我国磷矿石将在50年内消耗殆尽，给粮食安全造成压力。土壤中总磷累积量超过8500万吨P₂O₅，说明土壤中磷的含量并不低，但由于矿物颗粒对磷的强吸附性，土壤磷有效性差，导致磷素利用率低，仅为10％左右。因此，开发有效的活化措施，充分利用累积在土壤中的磷素供植物吸收利用是缓解磷矿石资源紧缺的有效措施。

在南方红壤性水稻土中，富含铁铝的土壤矿物对磷的强烈吸附是限制土壤磷有效性的首要因素。同时溶磷微生物在土壤中广泛存在，通过微生物驱动的磷溶解、矿化、吸收、分配等过程，将土壤中的难溶磷酸盐转化成易于植物吸收的速效磷，调整土壤磷库组成。近年来，溶磷菌的分离得到越来越多的关注，但这些研究主要集中在旱地，长期淹水导致稻田具有与旱地截然不同的生态环境，亟需特异性溶磷菌资源提高稻田土中的速效磷含量，以供稻苗生长吸收利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何获得可提高长期淹水的稻田土中速效磷含量的溶磷真菌。针对以上问题，本发明的首要目的是提供一种溶磷能力强、高效转化难溶磷的溶磷真菌。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

一种溶磷真菌青霉ISA-C26，其分类命名为青霉(Penicillium sp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号： CGMCC NO.23239，保藏日期为：2021年9月18日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明提供的溶磷真菌溶磷能力强，能在较短时间内将稻田土中大量难溶磷转化为速效磷，利用该溶磷真菌可显著提高稻田淹水环境土壤速效磷含量，有效解决土壤供磷不足的难题，提高磷肥利用效率。

所述溶磷真菌青霉ISA-C26含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。基于基因测序结果和生理生化实验结果，确定溶磷真菌属于青霉菌 (Penicillium sp.)。溶磷真菌青霉ISA-C26在磷酸培养液中菌丝排列紧密，细胞褶皱形似树皮且细胞表面附着颗粒。

本发明还提供了一种菌剂，其含有所述溶磷真菌青霉ISA-C26。将溶磷真菌青霉ISA-C26配制成菌剂，可以更好地利用溶磷真菌青霉ISA-C26的解磷能力。

本发明还提供了所述菌剂在提高稻田土壤中速效磷含量的应用。将含有所述溶磷真菌青霉ISA-C26的菌剂应用于提高稻田土壤中，可有效提高土壤中的速效磷含量。

可选地，在应用时将所述菌剂配制成菌悬液，按照30％～50％微生物生物量碳质量比例投放入稻田土壤中。含有所述溶磷真菌青霉ISA-C26的菌液在速效磷含量3.25mg/kg和25.33mg/kg的环境下均具备较强的解磷能力，可知溶磷真菌青霉ISA-C26既可以应用于高磷的环境又可以应用于低磷的环境。

本发明还提供了所述溶磷真菌在溶解难溶磷酸盐中的应用。将所述溶磷真菌青霉ISA-C26用于溶解难溶性磷酸盐，可在短时间内将大量难溶性磷酸盐转化为速效磷。

可选地，所述难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。溶磷真菌青霉ISA-C26在磷酸钙固体培养基中培养5天后，溶磷指数为1.712，在磷酸钙液体培养基中培养8天后，可溶性磷浓度达到1128.69mg/L。溶磷真菌青霉 ISA-C26具备高效的溶磷能力，溶磷能力强于常见的溶磷真菌。

本发明还提供了所述的溶磷真菌在用作农用微生物菌剂肥料中的应用。将该溶磷真菌用于肥料，可提高土壤速效磷含量和肥料中磷的利用率，有助于缓解磷矿石开采压力。

与现有技术相比，本发明提供的溶磷真菌青霉ISA-C26，溶磷能力强，能够在较短时间内大量转化难溶态磷，对促进水稻对土壤中难溶磷的吸收利用效果显著，补充了溶磷菌的微生物资源库，具有广阔的应用前景和市场价值。

附图说明

图1为ISA-C26在磷酸钙固体培养基上的溶磷圈形貌图；

图2为ISA-C26菌株的扫描电镜图；

图3为ISA-C26的系统发育树；

图4为ISA-C26培养39天后稻田土壤中海德利磷分级相对含量变化图；

图5为实施例4中的海德利磷分级图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是，以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特征说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本实施例提供了一种溶磷真菌青霉ISA-C26，其分类命名为青霉 (Penicilliumsp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO.23239，保藏日期为：2021年9月18日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本实施例提供的溶磷真菌溶磷能力强，能在较短时间内将稻田土中大量难溶磷转化为速效磷，利用该溶磷真菌可显著提高稻田淹水环境土壤速效磷含量，有效解决土壤供磷不足的难题，提高磷肥利用效率。

实施例1：溶磷真菌青霉ISA-C26菌株的筛选和鉴定

1、菌株筛选

(1)溶磷真菌驯化培养：采取湖南长沙市亚热带稻田表层0～5cm土样，放置于无菌袋中低温保存，并带回实验室4℃保存。将稻田表层土壤制成土壤悬液，梯度稀释浓度至10^-6倍，在无菌的96深孔板中加入0.5mL 的不溶性磷酸钙培养液(NBRIY培养基)，培养液中添加0.1g/L溴甲酚紫作为酸性指示剂，接种10uL稀释浓度为10^-6倍的土壤悬液，置于恒温培养箱(28℃)培养7～10天。然后再次进行梯度稀释，取制备的10^-4倍和10^-5倍的稀释菌液200uL在NBRIY固体培养基涂布平板，从涂布平板上选择溶磷真菌菌落，后置于恒温培养箱培养7～10天。

其中不溶性磷酸钙培养基(NBRIY培养基)成分为葡萄糖10g、 Ca₃(PO₄)₂5g、(NH₄)₂SO₄0.5 g、NaCl 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、KCl 0.2g、 MnSO₄·H₂O,0.03g、FeSO₄·7H₂O0.03g，溶于1升无菌水中，调节pH为 7-7.5。

(2)溶磷真菌纯化：在NBRIY固体培养基上选择具有透明圈的菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上用接种环按照三区划线纯化，划线纯化至少5次。纯化好的真菌用50％的甘油与新鲜菌液1:1混合，保存于 -80℃冰箱。

2、菌株鉴定

按照生工试剂盒操作说明书提取DNA，用分光光度计检测提取溶磷真菌DNA的浓度和质量。以溶磷真菌DNA模板，进行普通聚合酶链式反应 (PCR)。

真菌PCR反应体系总体积25uL，溶磷真菌DNA模板1uL，DNA模板浓度0.1～10ng/uL。上引物ITS1(5'–TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 下引物ITS4(5'–TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')各0.5uL，Mix(DNA 酶和四种核苷酸)12.5uL。PCR反应条件94℃4min，然后94℃30s，56℃30s，72℃60s，30个循环，延伸温度72℃10min。

凝胶电泳跑胶，观察PCR产物质量，选取PCR产物电泳结果条带单一，亮度明亮的PCR产物，送往上海生工测序。将测序的结果在NCBI(美国国立生物技术信息中心，NationalCenter for Biotechnology Information)进行相似性序列比较，选取相似度较高的菌株，下载其相关的序列。将菌株序列及其相似序列在Mega软件中进行多重序列比对，注意序列方向一致。按照NJ法构建系统发育树如图3所示。

该菌株的基因测序结果如序列表中SEQ ID NO.1所示。

基于基因测序结果和生理生化实验结果，确定溶磷真菌分类名为青霉(Penicillium sp.)，溶磷真菌ISA-C26在磷酸培养液中菌丝排列紧密，细胞褶皱形似树皮且细胞表面附着颗粒。

实施例2：溶磷真菌青霉ISA-C26溶磷活性测定

溶磷真菌在磷酸钙固体培养基溶磷能力，基于溶磷真菌在磷酸钙固体培养皿上的溶磷指数：三点接种法将筛选到的真菌接种到磷酸钙固体培养基，放置恒温培养箱(28℃)培养5天，相机拍照记录溶磷真菌在培养皿上的生长状况。图1为溶磷真菌ISA-C26在磷酸钙固体培养基中培养5天后的溶磷圈形貌图，图中存在两个大的溶磷圈，说明溶磷真菌ISA-C26磷酸钙固体培养基中具备强的解磷能力，再用处理图像软件Fiji计算溶磷圈面积S(cm²)以及菌株面积s(cm²)，计算溶磷指数I＝S/s。

溶磷真菌在磷酸钙液体培养基溶磷能力，通过观察其在磷酸钙培养液可溶性磷浓度变化：250mL三角瓶加50mL的磷酸钙液体培养基，将溶磷真菌接种到培养瓶中，每个菌株三个重复。摇床180rpm，28℃震荡8天，培养2、4、5、6、7、8d(天)时取样4mL，每次取样前，摇匀三角瓶，使不溶性的磷酸钙与溶磷真菌均匀分布，然后在12000rpm离心1min，分析上清液中可溶性磷浓度的变化，可溶性磷浓度用电感耦合等离子光谱发生仪ICP(720ES)测定。

结果表明ISA-C26溶磷真菌的溶磷指数达到1.712，可溶性磷浓度达到1128.69mg/L，且随着培养时间的延长，磷酸钙液体培养基中的可溶性磷浓度逐渐增加，溶磷真菌ISA-C26在磷酸钙液体培养基中具备强的解磷能力，也说明了溶磷真菌ISA-C26是适于在淹水的稻田土壤环境中将难溶磷转化为速效磷，其解磷能力强于常见的解磷真菌。

基于溶磷真菌ISA-C26的强解磷能力，可将该溶磷真菌应用于菌剂，该菌剂在高磷或低磷环境中，均能表现出高效解磷能力。将含有ISA-C26 的菌剂配制成菌悬液，按照30％～50％微生物生物量碳质量比例投放入稻田土中。采用所述菌剂的应用方法，稻田土中难溶磷的溶解能力可达 1128.69mg/l，能够将土壤中难溶态磷转化为植物可吸收的速效磷。

实施例4溶磷真菌ISA-C26对水稻土磷素转化的影响

土壤样品采集和预处理：从湖南省金井长期定位水稻试验田施氮磷钾肥(NPK)处理和施氮钾肥(NK)处理中采集土壤样品。试验田处于晒田期，选取不同处理的三个小区，用土钻从每个小区随机采取三个表层土芯 (0～20cm)，共9个土芯，混合均匀，作为一个样品。采集到的土样手动剔除残根，加ddH₂O淹没，混合均匀，过2mm筛，室温静置使土壤沉淀(约2～3天)。倒掉上清，将每个样品均匀分成两份，一份直接在广口瓶中 25℃预培养，另一份放入相同的广口瓶中，121℃高压灭菌30min。预培养一周后测量灭菌土壤呼吸商，若土壤有较高CO₂释放，则再次重复灭菌、预培养操作，直到灭菌土壤无明显CO₂释放。

菌体制备：以筛选的优势溶磷真菌为材料，将其扩大培养，并取少量于89℃烘箱测量菌体含水率。培养的菌体进入生长期时，将菌体富集保存于4℃冰箱。将保存的菌体重新转移至新鲜培养液活化，然后用无菌水清洗 3～5次，以除去培养液中的养分。

土壤培养和采样分析：分别称取以上施NPK肥和施NK肥的灭菌土和未灭菌土30g于500mL培养瓶中。施磷肥和未施磷肥的土壤，将其作为高磷和低磷的两种不同土壤的磷水平。每种土样共4个处理，每个处理做12 个平行，如表1所示。

表1高磷和低磷土壤土样

在无接菌的对照组中加无菌水10mL。其它的土壤处理，加制备好的 15mL菌液(菌体浓度为1mg/ml)。基于每千克土壤微生物生物量碳(MBC) 的含量500mg计算，30g土壤真菌的干燥菌体的加入量为15mg，然后添加一定量的无菌水，使土壤淹水2cm(还原水稻土壤淹水生长条件)，用透气封口膜将培养瓶封口。在摇床180rpm摇20min，使活性溶磷真菌均匀分布于土壤，后静置放置在25℃的培养室培养。于培养后的39天进行破坏性采样。

海德利磷分级如图5所示。

结果表明，添加溶磷真菌青霉ISA-C26培养39天后，在低磷环境下(速效磷含量3.15mg/kg)，未灭菌稻田土壤中NaOH-Pi和残留态磷分别增加了 10％和9％，NaHCO₃-Pi、NaOH-Po和HCl-P的分别减少了5％、14％和4％；灭菌稻田土壤中NaHCO₃-Po、NaOH-Po和HCl-P含量分别增加2％、12％和8％，减少了4％的NaOH-Pi和18％的残留态磷。在高磷环境下(速效磷含量25.33mg/kg)，未灭菌稻田土壤中NaHCO₃-Pi和NaOH-Po分别增加1％和16％，NaHCO₃-Po、NaOH-Pi、HCl-P和残留态磷含量分别降低了1％、 2％、3％和9％；灭菌稻田土壤中NaOH-Po增加了15％，NaHCO₃-Po、 NaOH-Pi、HCl-P和残留态磷含量分别降低了5％、3％、6％和1％。

溶磷真菌青霉ISA-C26促使低磷土壤稳定态的磷转化为活性或中等活性磷，提高中等活性无机磷含量，土壤不稳定性的可溶性磷增加；高磷土壤稳定态的磷转化为中等活性有机磷，提高土壤磷的利用率。

溶磷真菌青霉ISA-C26用作农用微生物菌剂肥料中的应用。将该溶磷真菌用于肥料，可提高土壤速效磷含量和肥料中磷的利用率，有助于缓解磷矿石开采压力。

所溶磷真菌ISA-C26的还可以用于土壤生态环境调节剂，调节土壤中难溶磷盐的比例，缓解长期使用磷肥造成的土壤板结、酸化、微生物种群结构失衡等问题。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种溶磷真菌、菌剂及其应用

<130> 2021/12/1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtatcc ctacctgatc cgaggtcaac 60

ctgaaaaaaa gattgatggg ggtcggcaag cagccggccg ggcctacaga gcgggtgaca 120

aagccccata cgctcgagga tcggacggtg ccgccactgc ctttcgggcc tgtcccccgg 180

gggggacaag acccaacaca caagccgggc ttgagggcag caatgacgct cggacaggca 240

tgccccccgg aataccaggg ggcgcaatgt gcgttcaaag actcgatgat tcactgaatt 300

ctgcaattca cattaattat cgcatttcgc tgcgttcttc atcgatgccg gaaccaagag 360

atccgttgtt gaaagtttta actaattttg cttaatcgct cagactgcat tcttcagaca 420

gcgttcaaga ttgtctccgg caggcgcggg cccgggggca gaagcccccc ggcggccgtg 480

aggcgggcct gccgaagcaa caaggtacaa taaacacggg tgggaggttg gacccagagg 540

gccctcactc agtaatgatc cttccgcagg tcccccctac ggaag 585

Claims

1.一种溶磷真菌菌株名为青霉ISA-C26，其特征在于，其分类命名为青霉(Penicilliumsp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO.23239，保藏日期为：2021年9月18日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.根据权利要求1所述的溶磷真菌，其特征在于，所述溶磷真菌含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的溶磷真菌。

4.权利要求3所述的菌剂在提高稻田土壤中速效磷含量的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用时将所述菌剂配制成菌悬液，按照30％～50％微生物生物量碳质量比例投放入稻田土壤中。

6.权利要求1所述的溶磷真菌在溶解难溶磷酸盐中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。

8.权利要求1所述的溶磷真菌在用作农用微生物菌剂肥料中的应用。