CN112812977B

CN112812977B - 一种溶磷真菌及其应用

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Publication number: CN112812977B
Application number: CN202110250786.2A
Authority: CN
Inventors: 王继华; 任氢欣; 曾齐
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-03-08
Also published as: CN112812977A

Abstract

一种溶磷真菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明的目的是为了提供一种溶磷真菌，应用于土壤中潜在难溶磷的溶解，以提高植物可吸收利用的磷元素，为增加土壤固定的难溶磷的利用率等问题提供帮助。一种溶磷真菌，它为溶磷真菌(Talaromyces sp.)WR1‑4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M 2020981。所述溶磷真菌用于溶解土壤中含有钙、锌、铝、铁或镁的无机磷酸盐。本发明可获得一种溶磷真菌及其应用。

Description

一种溶磷真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种溶磷真菌及其应用。

背景技术

磷是植物生长必须的三大营养元素之一，不仅参与许多重要的生命代谢活动，而且还是很多器官的组成成分，磷对作物碳水化合物的运输、合成和分解起着重要作用，磷素供给不足将会制约植物的生长。我国土壤总磷含量较高，但大部分磷与镁、钙、铁和铝等结合形成难溶磷酸盐被土壤固定，导致土壤中95％以上的磷源不能直接被植物吸收利用。因此，研究溶磷真菌以挖掘土壤中潜在的磷库资源，对于缓解我国磷资源紧张、减少环境污染与资源浪费具有重要的意义。

磷肥属于不可再生资源，我国优质富磷矿资源不足，现今的消费趋势使我国正面临着磷资源枯竭的局面，国内外对于溶磷真菌的研究又相对比较少见，针对于此，筛选溶磷真菌并了解其溶磷特性，探知其溶磷方式，可为可持续且具有生态意义的微生物肥料的研发提供优良的菌种资源，从而进一步改善农业化肥和农药施用造成的土壤和水体等的污染。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种溶磷真菌，应用于土壤中潜在难溶磷的溶解，以提高植物可吸收利用的磷元素，为增加土壤固定的难溶磷的利用率等问题提供帮助。

一种溶磷真菌(Talaromyces sp.)WR1-4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M 2020981。

所述溶磷真菌用于溶解土壤中含有钙、锌、铝、铁或镁的无机磷酸盐。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用植物根际土壤为样品，通过梯度稀释涂布法、平板划线法对溶磷真菌进行分离和纯化，并对菌株进行形态观察和ITS rDNA鉴定，经鉴定该溶磷真菌WR1-4属于踝节菌属，适宜在温度为28℃、pH值为7的环境中生长。最后测定溶磷真菌WR1-4菌株对磷酸钙、磷酸锌、磷酸铝、磷矿粉和磷酸铁等5种不同难溶性磷酸盐的溶解能力，测定结果表明：该溶磷真菌WR1-4菌株对磷酸钙和磷酸锌具有极强的溶解能力。

(2)本发明溶磷真菌对难溶性磷源的溶解具有广谱性，对于土壤难溶性磷的溶解具有很大的帮助，具有较高的应用价值。

本发明可获得一种溶磷真菌及其应用。

附图说明

图1为溶磷真菌WR1-4在难溶性磷培养基上的菌落形态图；

图2为溶磷真菌WR1-4在PDA培养基上的菌落形态图；

图3为溶磷真菌WR1-4在CA培养基上的菌落形态图；

图4为溶磷真菌WR1-4在CYA培养基上的菌落形态图；

图5为溶磷真菌WR1-4和相近的菌株的ITS rDNA基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种溶磷真菌(Talaromyces sp.)WR1-4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M 2020981。

具体实施方式二：本实施方式一种溶磷真菌的应用，所述溶磷真菌用于溶解土壤中含有钙、锌、铝、铁或镁的无机磷酸盐。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同点是：所述无机磷酸盐为磷酸三钙、磷酸锌、磷酸铁、磷酸铝、磷矿粉或磷酸镁。

其他步骤与具体实施方式二相同。

实施方式一至三的有益效果：

(1)本实施方式采用植物根际土壤为样品，通过梯度稀释涂布法、平板划线法对溶磷真菌进行分离和纯化，并对菌株进行形态观察和ITS rDNA鉴定，经鉴定该溶磷真菌WR1-4属于踝节菌属；其适宜在温度为28℃、pH值为7的环境中生长。最后测定溶磷真菌WR1-4菌株对磷酸钙、磷酸锌、磷酸铝、磷矿粉和磷酸铁等5种不同难溶性磷酸盐的溶解能力，测定结果表明：该溶磷真菌WR1-4菌株对磷酸钙和磷酸锌具有极强的溶解能力。

(2)本实施方式溶磷真菌对难溶性磷源的溶解具有广谱性，对于土壤难溶性磷的溶解具有很大的帮助，具有较高的应用价值。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：一种溶磷真菌；

1.样品来源：

选择黑龙江省农业科学院民主示范区大豆生态试验田的大豆根际土壤为土壤样品，对其进行初筛和复筛，获得溶磷真菌。

2.主要实验试剂及培养基：

难溶无机磷固体培养基：10g葡萄糖，5g磷酸钙，5g六水氯化镁，0.25g七水硫酸镁，0.2g氯化钾，0.1g硫酸铵，15-20g琼脂，蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0，121℃，灭菌30min。

难溶无机磷液体培养基：10g葡萄糖，5g磷酸钙，5g六水氯化镁，0.25g七水硫酸镁，0.2g氯化钾，0.1g硫酸铵，蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0，121℃，灭菌30min。

PDA固体培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，15-20g琼脂，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，121℃，灭菌30min(注：马铃薯去皮，切块煮沸半个小时，然后用纱布过滤，再加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000mL)。

CA培养基：3.0g硝酸钠，0.01g七水硫酸亚铁，0.5g氯化钾，0.5g七水硫酸镁，1.0g磷酸氢二钾，30.0g蔗糖，15-20g琼脂，pH为7.2，121℃，灭菌30min。

CYA培养基：3.0g葡萄糖，0.5g氯化钾，0.5g七水硫酸镁，1.0g磷酸氢二钾，1.0g硝酸钠，0.1g七水硫酸亚铁，5.0g酵母浸粉，15-20g琼脂，pH为7.2，121℃，灭菌30min。

3.主要的实验方法：

3.1菌株的筛选

初筛是根据菌株在难溶无机磷固体培养基中的生长情况，筛选出透明圈比较明显的真菌，初筛具体步骤如下：①称取10g从某生态试验田大豆根际采集的土壤过筛，放置于已灭菌的装有玻璃珠和90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇动恒温振荡培养90min，使真菌呈单细胞状态分散于液体中，与营养物质充分接触；②从锥形瓶内吸取振荡培养后的菌悬液1mL，以倍比稀释法接种于以磷酸三钙Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源的难溶无机磷筛选培养基中，倒置于28℃恒温培养箱中培养7～11d；③分别挑取不同形态的、具有清晰的溶磷圈的单菌落，在平皿上做好标记，并在PDA培养基上重复划线培养进行纯化，重复以上操作3～4次，得到菌落特征一致的纯菌平板；④所得纯化的菌株接种于PDA斜面保藏。

复筛即是在初筛的基础上进一步在难溶无机磷液体培养基的条件下，以溶磷真菌是否具有较高溶磷量为依据，筛选出溶磷效能较好的菌株。

3.2菌株的鉴定

3.2.1菌株形态学观察

依据真菌鉴定手册(魏景涛,1979)等相关文献资料对溶磷真菌进行形态学观察。溶磷真菌的形态学特征:如图2所示，在PDA培养基上孢子体从白色逐渐转为黄绿色，培养基背面呈棕色环状，孢子紧密不易脱落。如图3所示，在CA培养基上，菌落由黄色、白色、黄色由内到外呈环状排布，随着培养时间的增加，环状条数逐渐增加，培养至第11天时，菌落直径可达59.33mm；菌落的菌丝体呈绒状，排列紧密。如图4所示，在CYA培养基上，橘黄色外侧出现淡淡的黄绿色的菌丝体，培养到第11天时，菌落直径可达48.87mm；菌落的菌丝成绒状，排列紧密。如图1所示，在难溶磷无机盐培养基上，菌丝体变为黄绿色，培养到第11天时，菌落直径可达46.37mm，菌落呈绒状，反面为黄色菌落边缘为圆形、整齐，孢子不易脱落。

3.2.2菌株的ITS rDNA鉴定

对真菌DNA进行提取，将所得真菌基因组DNA用真菌ITS rDNA通用引物进行PCR扩增，电泳后割胶回收PCR产物，进行ITS rDNA测序，ITS rDNA序列如下：

TCCTACCTGATCCGAGGTCAACCGTGGTAAAACATGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACGCTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCGGGGGGACCACACCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACAATTTTCACAGTACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGAGACGTGCGTCCCCCGGCGACCAGGTGGCCCCGGTGGGCCCGCCAAAGCAACAGGTGTATAGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGCCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCCTTACGGAAG。

将测序结果用BLAST软件对ITS rDNA序列进行同源性比较，发现筛选得到的溶磷真菌WR1-4最相近的种属是Talaromyces sp.，同源性达99.82％，结合真菌形态特征、生长条件结果，确定溶磷真菌属于踝节菌属，命名为WR1-4；根据ITS rDNA测序结果，利用NCBI提供的Blast工具和MEGA7.0等相关软件建立了系统发育树(如图5所示)。

3.3菌株溶磷能力的测定

将菌株接种于液体培养基中，测定溶磷真菌WR1-4对溶磷钙、磷酸锌、磷酸铝、磷矿粉、磷酸铁的溶解能力，表1表示菌株对不同难溶性磷源的溶解能力；

表1

如表1所示，磷酸钙为磷源时，菌株WR1-4的有效磷增量最高可达693.07mg/L，磷酸锌为磷源时，菌株WR1-4的有效磷增量最高可达613.47mg/L，磷酸铝为磷源时，菌株WR1-4的有效磷增量最高可达260.14mg/L，磷矿粉为磷源时，菌株WR1-4的有效磷增量最高可达137.84mg/L，磷酸铁为磷源时，菌株WR1-4的有效磷增量最高可达386.33mg/L，可见，菌株对磷酸钙和磷酸锌的溶磷能力较强。

序列表

<110> 哈尔滨师范大学

<120>一种溶磷真菌及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 545

<212> DNA

<213>溶磷真菌。

tcctacctga tccgaggtca accgtggtaa aacatggtgg tgaccaaccc ccgcaggtcc 60

ttcccgagcg agtgacagag ccccatacgc tcgaggacca gacggacgtc gccgctgcct 120

ttcgggcagg tccccggggg gaccacaccc aacacacaag ccgtgcttga gggcagaaat 180

gacgctcgga caggcatgcc ccccggaatg ccagggggcg caatgtgcgt tcaaagattc 240

gatgattcac ggaattctgc aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg 300

atgccggaac caagagatcc attgttgaaa gttttgacaa ttttcacagt actcagacag 360

cccatcttca tcagggttca cagagcgctt cggcgggcgc gggcccggag acgtgcgtcc 420

cccggcgacc aggtggcccc ggtgggcccg ccaaagcaac aggtgtatag agacaagggt 480

gggaggttgg gccgcgaggg cccgcactcg gtaatgatcc ttccgcaggt tcacccttac 540

ggaag 545

Claims

1.一种溶磷真菌，其特征在于它为溶磷真菌(Talaromyces sp.)WR1-4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M 2020981；所述溶磷真菌用于溶解土壤中的磷酸三钙、磷酸锌、磷酸铝、磷矿粉和磷酸铁。