CN102250786B - 一株能提高桉树叶绿素含量的无机解磷菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株无机解磷菌，所述无机解磷菌为芽孢杆菌属（B acillussphaericus）菌株P7，保藏号为CGMCCNo.4768。将所述无机解磷菌接种于桉树，能提高桉树植株叶绿素含量。本发明的菌株P7对提高桉树植株叶绿素含量效果较强，具有高效的促进磷吸收的能力，能够大幅提高桉树植株的叶绿素含量，从而达到较大程度提高桉树干物质积累的作用。

Description

一株能提高桉树叶绿素含量的无机解磷菌

技术领域

本发明涉及一株芽孢杆菌属菌株及其应用，更具体地涉及了一株能提高桉树叶绿素含量的无机解磷菌。

背景技术

桉树同松树、杨树一起被称为世界上三大速生树种，由于其具有广泛的适应性，且经济价值高，同时兼具有生态和社会效益，而受到不少国家的青睐。目前，桉树已经成为我国南方发展速生丰产林的战略树种。但由于桉树受到连栽导致地力衰退严重的问题的影响，对桉树的正常生长造成了很大影响。

磷素是植物营养三大要素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、ATP等的重要组成成分，同时又以多种方式参与植物体内的各种生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢起着重要作用^[1]。一般农田土壤中磷素含量蕴藏丰富，然而据估计，我国耕地面积的三分之二缺磷，因为这些磷素大多是不易被植物吸收利用的难溶性有机态和无机态含磷物质。影响土壤中磷的利用率的因素很多，其中微生物对土壤磷的转化和利用率影响最大。所以近些年来利用有解磷作用的微生物肥料，以促进土壤中植物不能直接吸收利用的有机态或无机态磷素的分解或溶解，使其在作物根际形成一个磷素供应较充分的微区，从而提高磷素的利用率，达到提高植物磷素营养的目的。此类微生物化肥在我国应用面积较大，在农业生产中表现出一定的效果，应用前景看好。

解磷微生物是土壤微生物的重要组成部分。解磷微生物或解磷菌( phosphatesoluble microorganisms，PSMs)是指土壤中能将难溶性化合态磷转化为植物能够吸收利用的简单的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，主要包括解磷细菌、解磷真菌和解磷放线菌^[3]，目前已报道的大约有二十几个属。三大类解磷微生物解磷的效果存在较大的差异性，真菌数量少于细菌，但有些真菌的解磷能力则明显大于细菌。又有学者根据解磷微生物作用于磷的形态不同，将其分为解无解磷菌和解有机磷菌。认为能够将复杂的有机磷矿化为简单的植物可吸收形态磷的微生物称之为有机磷微生物；能够将植物难以吸收的无机磷酸盐化合物转化为可直接吸收利用形态磷的微生物，称之为无机磷微生物。但是，很多解无机磷微生物也同时具有解有机磷的能力，因此，在实际上却很难将它们分得很清楚，有些菌仅具有单一的解磷能力，有些菌同时具有两种解磷能力，后者是比较理想的筛选对象。

发明内容

本发明提供了一株无机解磷菌，能提高桉树叶绿素含量。

本发明的无机解磷菌为芽孢杆菌属（Bacillus sphaericus）菌株P7，所述菌株P7的保藏号为CGMCC No. 4768。

本发明的芽孢杆菌属（Bacillus sphaericus）菌株P7，已经于2011年4月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 4768。

本发明的菌株P7可应用于接种桉树。

所述接种的具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃；所述液体培养基配制为：每升液体培养基含有牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.2-7.4；

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度；

⑶将菌液用超纯水稀释；

⑷在桉树根际施入菌株浓度为0.5×10⁶cfu/ml -2.5×10⁶cfu/ml的菌液。

本发明的菌株P7对提高桉树植株叶绿素含量效果较强，具有高效的促进磷吸收的能力。

本发明的显著优点：本发明的菌株P7能够大幅提高桉树植株的叶绿素含量，从而达到较大程度提高桉树干物质积累的作用。

附图说明

图1为无机解磷菌周期培养有机酸总量变化；

图2为无机解磷菌周期培养有效磷含量分析。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：无机解磷菌菌株P7的获得

一、无机解磷菌菌株P7的分离筛选过程如下：

（1）野外采集桉树根际土壤。土壤取自福建省永安国有林场，地处永安市城郊，经纬度为E117°23'18"，N25°56'27"。

（2）无机解磷菌分离

①根际土壤悬浊液的制备：在无菌室中，准确称取新鲜土壤样品5 g，放入装有95 ml无菌水的250 ml三角瓶中，置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30 s，即成10^-1稀释液；在按10倍逐步稀释的方法，连续稀释，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀释菌液，用于有关微生物的测定^[4]。

②采用稀释平板涂抹法分离解磷菌时，采用10^-4、10^-5、10^-6稀释度，用移液器各取100ul的稀释菌液于无机磷平板中央，并用接菌环在平板上涂布均匀。每个样品设3个重复。细菌 28℃培养7d，观察菌落生长情况，同时计算具有解磷作用的解磷菌的菌株数。分离无机解磷菌采用无机磷培养基。

③用接种环挑取培养基上出现明显溶磷圈或透明圈的菌落，用连续划线的方法划线纯化，无机解磷菌于 28 ℃ 培养7 d，得到单株具解磷能力的菌株。同时测量无机解磷菌的菌落直径和透明圈直径，计算透明圈与菌落直径比，初步断定菌落解磷效果。将提纯的无机解磷菌株接种到斜面培养基上，培养保存置于4℃冰箱备用。

（3）无机解磷菌解无机磷能力的定量测定：将不加磷的无机磷液体培养基分装于150 ml三角瓶中，每瓶30 ml，精确加入0.250 g Ca₃(PO₄)₂，灭菌后加入1ml已用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化24 h的待测菌液， 设3次重复。置28℃全温振荡培养箱160 r·min^-1培养5d，菌株培养液，10000 rpm离心20 min，上清液采用钼锑抗比色法测定其磷含量，同时用pH计测定培养液的pH值，以加1ml牛肉膏蛋白胨液体培养基做为参比液。

（4）培养液有效磷含量测定——钼锑抗比色法。

取菌株培养液离心后的上清液200 μl加入50 ml容量瓶中，加水至15-20ml，加1滴2，4-二硝基酚指示剂，用稀碱溶液和稀酸（硫酸）调节pH值至溶液呈微黄色。用移液管加5 ml钼锑抗显色剂，用水定容，摇匀。30 min后，在分光光度计上用700 nm波长比色，以空白试验溶液为参比液，调吸收值到零，然后测定待测液的吸收值，在工作曲线上查出显示液的溶磷量，颜色在8 h内可保持稳定。

牛肉膏蛋白胨培养基^[6]：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，琼脂18.0 g/L，pH 7.2-7.4。

无机磷培养基（蒙金娜基础培养基）^[6~8]：葡萄糖10.0 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03 g/L，MnSO₄·4H₂O 0.03 g/L，Ca₃(PO₄)₂ 5.0 g/L，酵母浸膏0.5g/L，琼脂18.0 g/L，pH 7.2-7.4。

（5）结果分析

①无机磷菌平板试验

无机磷平板上筛选出30株具有明显透明圈的无机解磷菌。菌株P7，透明圈与菌落直径的比为2.493cm，从平板试验分析具有较强的解磷能力。

②无机磷菌菌体吸收磷含量

进一步测定无机解磷菌在溶解难溶性磷的过程中被菌体自身吸收利用的磷含量，表明菌株P7，吸收磷含量为29.162μg/ml，从菌体本身的磷含量分析可知，菌种P7具有较强的吸收磷的能力。

③无机磷菌溶解的有效磷含量

测定发现，无机解磷菌菌株P7溶解的有效磷含量为367.169μg/ml，而对照仅5.481μg/ml，无机解磷菌菌株P7的解磷能力是对照的66.99倍。菌株P7具有较强的解磷能力。

④无机磷菌培养液pH值

进一步测定无机解磷菌菌株P7的培养液pH值为4.26，对照为6.73。菌株P7的培养液pH值比对照下降了2.47。结果表明，溶磷量与pH值存在相关关系，这与陈阳等^[9]研究结果相一致，表明菌株P7具有较强的溶磷能力。

（6）其它性能

①菌株P7对不同磷源物质的溶解活力：配制无机磷液体培养基，同时分别用磷酸铁(12.088 g/L)、磷酸氢钙(11. 096 g/L)替代原培养基中磷酸钙作为磷源物质，其它成分不变^[10]。按每瓶30mL的装液量装入150mL锥形瓶中，121℃灭菌20min。冷却后用移液枪吸取1ml已用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化48h，浓度约调节为 10⁹cfu /mL 的P7的菌液，分别接入上述2种不同磷源物质培养基中，设3个重复，同时对不同磷源物质培养基分别以不接菌的摇瓶作为空白对照。置于28℃、160 r/min条件下摇瓶培养5 d。

②菌株P7周期培养有效磷含量分析：配制无机磷液体培养基，分别将灭菌后的液体无机磷培养基装入150ml三角瓶中。用移液枪分别移取1ml的P7菌液于三角瓶中，置28℃全温振荡培养箱160 r/min培养7d，分别于第1d、2d、3d、5d、7d取出每个样的三个重复进行相关指标测定。取5ml进行离心测培养液中有效磷的含量，采用钼锑抗比色法测定其磷含量。

③有机酸总量的测定^[14]：准确称取4 g氢氧化钠并用蒸馏水定容至1000 ml，用精确配制的0.05 mol/L草酸进行标定，标定氢氧化钠溶液的浓度为0.081967mol/L。将上述所得发酵液稀释10倍，用移液管精确吸取10 mL到三角瓶中，加入酚酞指示液2滴，用标定好的氢氧化钠滴定液(0.081967mol/L)滴定，滴定至溶液显粉红色。根据所用氢氧化钠溶液的体积计算出发酵液中的总酸含量，总酸含量以草酸计。每1 ml氢氧化钠滴定液相当于3.688525mg草酸(C₂H₂O₄)。

④结果分析

a、无机磷菌株对磷酸铁的溶解活力

通过液体培养发现，对照与菌株P7对磷酸铝的溶解活力存在较大差异。对照处理为15.211 vg.ml^-1，菌株P7处理为68.152 vg.ml^-1，是对照的4.48倍，菌株P7具有较强的溶解磷酸铁能力。

b、无机磷菌株对磷酸一氢钙的溶解活力

菌株P7对磷酸一氢钙的溶解能力为317.403 vg.ml^-1，而对照的磷酸一氢钙溶解能力仅为28.947 vg.ml^-1。因此，菌株P7溶解磷酸一氢钙能力是对照的10.96倍。对培养液pH值进行测定显示，空白对照pH值为6.47，菌株P7 pH值为5.18，比对照下降了19.9%。表明菌株P7具有较强的溶解磷酸一氢钙能力。

c、培养液有机酸含量与时间关系

随着培养时间的推进，培养液中有机酸含量呈现逐渐上升的趋势（图1）。菌株的解磷效果与它的产酸作用息息相关。有机酸含量在一定程度上反应了培养液的解磷效果。

d、周期培养磷含量与时间的关系

可以看出随着时间的推移，菌液中有效磷的含量基本呈上升趋势（图2）。不同作用时间内不同菌株的解磷能力存在差异性。菌株P7菌液中有效磷的含量基本呈上升趋势，且趋势明显。这可能是因为培养过程中，菌株发挥解磷作用，增加了培养液中有效磷的含量。

二、菌株P7鉴定

无机解磷菌菌株P7的光学显微镜鉴定：将菌种制成载玻片，在显微镜下观察并参考《伯杰细菌鉴定》进行初步鉴定。

[1]供试菌株：P7。

[2]芽孢杆菌属（Bacillus sp.）：细胞呈直杆状，0.5～2.5μm×1.2～10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所抑制。好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。接触酶阳性。

无机解磷菌菌株分子分类鉴定：

⑴供试菌株

P7。

⑵培养基

将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃。所述液体培养基配制为：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.2-7.4。

⑶引物

利用细菌16S rDNA特异引物F27和R1492进行PCR扩增^[15]，该引物可以扩增供试菌株几乎全部的16S rDNA序列，引物序列如下：

Primer l(F27)：5ˊ-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3ˊ

Primer2(R1492)：5ˊ-TAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3ˊ；

试验方法

①细菌总DNA的提取

将供试菌株分别用牛肉膏蛋白胨液体培养基进行活化，大约24-48 h。采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒（购自上海生工生物工程有限公司）提取总DNA，步骤如下：

a. 取1.5 m1菌体培养液于一灭菌EP管中，10 000 rpm离心1 min，去上清液，收集菌体。

b. 向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

c. 向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀。

d. 加入220 μl缓冲液GB，振荡15 s，70℃放置10 min，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

e. 加入220 μl无水乙醇，充分振荡混匀15 s，简短离心以管盖内壁的水珠。

f. 将上一步所得都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

g. 向吸附柱CB3中加入500μl 缓冲液GD，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

h. 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

i.向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

j. 将吸附柱CB3放入收集管中，12000 rpm离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数8 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

k. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴100 μl洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中，－20℃保存备用。

② PCR扩增

（1） PCR反应体系为               25 μl

10×PCR Buffer                     2.5 μl

dNTP(浓度2.5 mmol/L)             2.5 μl

Mg^2＋                                3.25 μl

引物1 (50 μmol)                          1.0 μl

引物2 (50 μmol)                          1.0 μl

模板DNA                          2.0 μl

Tag酶(1 U/μl)                            1.0 μl

补ddH₂O 至总体积                        25.0 μ1

（2） PCR反应条件

            95℃变性                  5 min

            95℃变性                  1 min

            56.0℃复性                50 s                                                 

   33个循环

            72℃延伸                  1 min

            72℃延伸                  10 min。

（3） PCR产物检测

PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳（含核酸染料0.5 μl/ml），电解液为0.5×TAE，以Marker指示谱带的大小及相对位置，然后在紫外凝胶成像系统中观察并拍照记录。

DNA 序列测定：

③凝胶成像系统下出现亮带的PCR扩增产物经纯化后直接测序，测序由上海生化生物工程有限公司完成。

④16S rDNA序列分析

将菌株的16S rDNA序列（如SEQ ID NO.1所示）在美国国立生物信息中心NCBI网页上进行BLAST比对，找到与Genebank中同源性最高的相关序列，相似菌株为Bacillus sp.（登录号为FJ738147），相似性为99%，为此初步确定菌株P7为芽孢杆菌属（Bacillus sphaericus）。

实施例2：菌株P7对桉树苗木生长的影响

供试土壤为黑色泥炭土（来自福州建新花卉市场），pH值为7.23，有效磷5 mg·kg^-1。有机肥购置福州建新花卉市场，供试桉树苗来自福建林业科学研究学院，巨桉5号无性系。设空白、施P对照(KH₂PO₄)、有机肥（氮4％、磷3％、钾4%、有机质30%、水分25%、腐殖酸10%）及单菌P7等处理。菌株P7接种于桉树的接种量为每盆50 ml培养液/(1×10⁶CFU·ml^-1) ，三天时间重复3次，用蒸馏水处理作为空白对照。施P肥为每盆KH₂PO₄ 5g，装土5 kg，3次重复。有机肥为每盆20 g，装土5 kg，3次重复。本试验于2010年4月25日前往苗圃接种，桉树生长132d后收获，测定植株株高、茎粗、鲜质量、干重量。105℃下杀青30 min，75℃烘干至恒重，植株样品粉碎后用H₂SO₄-H₂O₂消煮，钼锑抗比色法测定磷含量。

将菌株P7接种于桉树，具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃。所述液体培养基配制为：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.2-7.4。

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度。

⑶将菌液用超纯水稀释成1.0×10⁶cfu/ml。

⑷在桉树根际施入菌株浓度为1.0×10⁶cfu/ml的菌液50ml，3天时间重复3次，用蒸馏水处理作为空白对照。

采用GFS-3000光合仪，设定光强800μmol·m^-2·s^-1，温度25℃，湿度70%，同时控制气温(Ta)、相对湿度(RH)和CO₂浓度(Ca)与测定时外界环境一致。从顶端开始，选择植物第5-6片成熟叶片，测定不同处理下桉树净光合速率^[16~18]。测定完毕后，立即将叶片带回实验室，采用乙醇-丙酮1:1混合法测定测定植物叶片的叶绿素含量^[18~19]。准确称取0.1g，用剪刀将植物叶片剪成细小条状，装入试管，每个处理重复3次。加入20ml混合液，密封，置于暗处浸提叶绿素。待浸泡24 h后，再以参比作为对照，用紫外分光光度计在645 nm和663nm波长处测其吸光值，求得叶绿素的浓度，并带入公式求出叶绿素a、叶绿素b、叶绿素的含量。计算公式：A₆₄₅=82.04Ca+9.27Cb；A₆₆₃=82.04Ca+9.27Cb，单位为g.L^-1。叶绿素含量=C*V/样品质量m。

1、菌种处理对桉树植株叶绿素含量的影响

对照处理植株叶绿素含量为7.414 mg/g，菌株P7叶绿素含量为12.909 mg/g，比对照增加了74.12％。施磷肥和有机肥处理植株叶绿素含量分别为8.507 mg/g和8.912 mg/g，均较接种菌株P7处理更低，表明菌株P7具有较强的提高植株叶绿素含量的能力。

在30株筛选得到的具有明显透明圈的无机解磷菌中，菌株P7提高桉树植株叶绿素含量的能力高于其它菌株。

2、菌种处理对桉树植株鲜重、干重的影响

对照处理单株平均鲜重为51.500g，单株平均干重为15.400g。菌株P7处理单株平均鲜重为63.267g，单株平均干重为17.200g，分别比对照增加了22.85％和11.69％，表明菌株P7具有较强的促进植株干物质积累的能力。但与施磷肥和有机肥处理比较相差无几。

3、菌种处理对桉树植株树高、地径的影响

对照处理苗木平均树高为80.767 cm，地径为0.571 cm。菌株P7处理平均树高为79.467 cm，地径为0.856 cm，树高与对照相差无几，地径增加了49.91％。施磷肥和有机肥处理植株平均地径分别为0.675cm和0.815cm，也均较接种无机解磷菌P7生长量更小，表明菌株P7具有较强的促进植株生长的能力。

4、菌种处理对桉树植株体内磷含量影响

对照处理植株磷含量为1.018 g/kg，菌株P7处理磷含量为1.882 g/kg，比对照增加了84.87％。施磷肥和有机肥处理植株磷含量分别为1.5343 g/kg和1.4187 g/kg，均较接种菌株P7处理更低，表明菌株P7具有较强的促进植株对磷的吸收的能力。

5、菌种处理桉树植株净光合速率

对照处理植株净光合速率为5.286 CO₂μmol·m^-2 ·s^-1，接种菌株P7处理植株净光合速率为13.984 CO₂μmol·m^-2 ·s^-1，比对照增加了164.55％。施磷肥和有机肥处理植株净光合速率分别为9.960 CO₂μmol·m^-2 ·s^-1和8.711m CO₂μmol·m^-2 ·s^-1，均较接种菌株P7处理更低，表明菌株P7具有较强的提高植株光合速率的能力。

综合以上各项指标考虑，菌株P7对桉树生长促进效果最强，具有较高的提高植株叶绿素的能力。

本发明大幅提高了桉树植株叶绿素含量从而提高其对光能的利用率，并显著提高了桉树干物质的积累。

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[17]吕廷良,孙明高,宋尚文,等. 盐、旱及其交叉胁迫对紫荆幼苗净光合速率及其叶绿素含量的影响[J]. 山东农业大学学报(自然科学版),2010,2:191-195.

[18]叶尚红主编. 植物生理生化实验教程[M]. 昆明: 云南科技出版社,2004:68-78

[19]张宪政等主编. 植物生理学实验技术[M]. 沈阳: 辽宁科学技术出版社,1994:110-125.

<110> 福建农林大学

<120> 一株能提高桉树叶绿素含量的无机解磷菌

<160> 1

<210> 1

<211> 1477

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属（Bacillus sphaericus）菌株P7

<400> 1

gggggggggg tgctatacgt gcagtcgagc gaatggattg agagcttgct ctcaagaagt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca taagactggg ataactccgg 120

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agtgtacagt tatccag 1477 

 

Claims (3)

1.一株无机解磷菌，其特征在于：所述无机解磷菌为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）菌株P7，保藏号为CGMCC No.4768。

2.一种如权利要求1所述的无机解磷菌的用途，其特征在于：将所述无机解磷菌接种于桉树。

3.根据权利要求2所述的无机解磷菌的用途，其特征在于：所述接种的具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃；所述液体培养基配制为：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L， pH 7.2-7.4；

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度；

⑶将菌液用超纯水稀释；

⑷在桉树根际施入菌株浓度为0.5×10⁶cfu/ml -2.5×10⁶cfu/ml的菌液。

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