CN101898100A - 生物表面活性剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物表面活性剂及其制备方法和应用。所述生物表面活性剂是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛而得到的铜绿假单胞菌产生的，属于槐糖脂类。所述生物表面活性剂可以配制成复合制剂加入到鲜秸秆中，增加秸秆的降解效率，从而缩短秸秆降解时间，促进秸秆还田，修复退化的土壤。

Description

生物表面活性剂及其制备方法和应用

方法领域

本发明涉及一种生物表面活性剂，具体涉及一种由微生物产生的生物表面活性剂，还涉及该生物表面活性剂的制备方法及其在作物秸秆的微生物降解中的应用。

背景方法

加强能源资源节约和生态环境保护，增强可持续发展能力，关系到人民群众切身利益和中华民族生存发展。随着世界各国对全球气候的变化的重视以及能源危机的出现，各国联合讨论节污减排的需要，在这个背景下秸秆在能源化、肥料化、饲料化等方面都具有较大前景。

秸秆是一种生物质能资源，是当今世界上仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源，是唯一可再生的能源。但是我国秸秆资源45％～47％作为农村燃料，15％以烧荒形式烧掉，只有很少一部分过腹还田或直接还田。秸杆直接焚烧不仅污染环境，而且造成资源浪费。

利用微生物发酵降解秸秆是肥料化的优良途径，但是秸秆直接还田，存在很多具体问题，如秸杆利用率低，不易腐烂，影响下茬播种，容易浮出土面飘的到处都是等，还有报道表明秸秆直接还田更容易引起作物烂根和病害。秸秆间接还田技术是将作物秸秆堆腐沤制后还田，包括秸秆堆腐、高温堆腐、秸秆腐熟剂堆腐等形式；秸秆作基料生产食用菌，再将废渣还田以及沼肥还田等。

这些技术同样存在各种具体问题和不足，例如技术不成熟，效率不高，菌种不优良等。在农业中，生物表面活性剂可用作肥料、用于土壤的改良、喂养小牛、植物保护以及用作杀虫剂等方面。特别是生物表面活性剂以其能完全生物降解、无毒、对环境无污染坏等优势，在促进有机物的降解、减少农药污染、去除金属元素等环境修复中起到了很重要的作用。因此，为了修复退化的土壤，发展循环经济，实现可持续发展，必须研制一种高效优良的生物表面活性剂。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的在于研制一种生物表面活性剂，将其与其他微生物菌剂配施，可提高秸秆的降解效率，促进秸杆还田，以图修复退化的土壤。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种生物表面活性剂，是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下(5～10℃)，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛而得到的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的，属于槐糖脂类。所述铜绿假单胞菌菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3661。

所述生物表面活性剂的制备方法，包括先得到铜绿假单胞菌，然后进行发酵培养，再从发酵培养液中经分离提纯制得的。

所述铜绿假单胞菌是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下(5～10℃)，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛而得到的。

其中，所述细菌富集培养是分别取5ml各种浓度的土壤悬液，接种于细菌富集培养基，24℃震荡培养1～2d，转速200r/min得到富集液；所述细菌富集培养基(XF)为：植物油4g，(NH₄)₂SO₄ 10g，KCl 1.1g，FeSO₄·7H₂O 2.5×10^-5g，KH₂PO₄ 3.4g，K₂HPO₄·3H₂O 5g，MgSO₄ 0.5g，EDTA 1g，酵母浸膏0.5g，用蒸馏水定容至1L，pH值为7.0。

其中，所述血平板划线初筛是将上述富集液在血平板培养基上划线培养，挑选产生溶血圈较大的菌株进行分离纯化，分离纯化的单菌落接于斜面培养基上，30℃培养1～2d；所述血平板培养基(g/L)为：羊血8～10％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母粉0.01％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.7％，pH 6～7，115℃灭菌15min；所述斜面培养基为：葡萄糖16g，蛋白胨4g，酵母浸膏0.2g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值为6.5。

其中，所述蓝色凝胶培养基复筛是将上述富集液稀释涂布于蓝色凝胶平板培养基，挑选菌落周围产生蓝圈的菌株进行分离纯化，分离纯化的单菌落接于斜面培养基上，30℃培养1～2d，将斜面培养的菌种转接于种子培养基中培养16h后，接种于摇瓶培养液中，30℃振荡培养2～3d，转速200r/min，从而得到所述铜绿假单胞菌；所述蓝色凝胶平板培养基(g/L)为：牛肉膏1，葡萄糖20，蛋白胨5，酵母膏0.2，琼脂18，十六烷基三甲基溴化0.2，亚甲基蓝0.005；所述斜面培养基为：葡萄糖16g，蛋白胨4g，酵母浸膏0.2g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值为6.5；所述种子培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、用蒸馏水定容至1L，pH值为7.2。

进一步，可将分离出的单菌株进行液体发酵培养，所述液体发酵培养基为葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，NH₄NO₃ 2.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，Na₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.02g/L，无机盐溶液3mL/L，正十六烷2mL/L，pH7.0，其中无机盐溶液为硫酸锌0.029g/L，氯化钙0.024g/L，硫酸铜0.025g/L，硫酸镁0.017g/L。将其发酵液分别在常温(25℃)和低温环境下(0～10℃)做排油性测定。在低温条件下，发酵液排油直径均大于3cm。

更进一步，可将排油性好的菌株在所述液体发酵培养基中培养4～5天，对其发酵液的表面张力进行测定，用FD-NST-I液体表面张力系数测定仪测量其表面张力值，将发酵液表面张力值低于40mN/m的菌株保存。

所述铜绿假单胞菌优化后的发酵培养是在温度35～37℃，pH值6.8～7.2的条件下进行，接种量为5～7％，培养时间为1-4d，培养基为：蔗糖30-31g/L，酵母膏1-1.1g/L，NH₄NO₃ 1-1.1g/L，Na₂HPO₄ 1-1.1g/L，液体石蜡5-6ml，无机盐溶液体积比浓度(v/v)为3-3.2％。

本发明所述生物表面活性剂是从所述铜绿假单胞菌的发酵培养液中经一些适当的方法就能分离提纯制得槐糖脂类，这些方法是常使用于提取代谢物的方法，例如可利用槐糖脂类与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取。例如35～37℃培养24h的发酵液，离心，收集絮状沉淀，得到粗品，再用二氯甲烷重新悬浮，过滤，抽提，离心，收集沉淀，即为纯化后的表面活性剂。

本发明所述的生物表面活性剂可以将发酵液直接应用也可以经分离纯化后应用。本发明所述生物表面活性剂可以广泛应用于作物秸秆的微生物降解、石油的开采、输油管道的清洗、纺织工业、制药业、化妆品、家用清洁剂、造纸工业、陶瓷及冶金工业等领域。具体地，将其应用于秸秆降解中，是将该表面活性剂与木霉属真菌按适当比例混合成复合制剂，均匀地施在新鲜秸秆表面，所述复合制剂的用量为新鲜秸秆重量的4～5％。

本发明所述的生物表面活性剂由于其特有的产生方式，决定了其某些特性大大优于一般的人工合成表面活性剂，它们能吸收、乳化、润湿、分散、溶解水不溶的物质。在复合制剂中的作用是提高了秸秆的可利用性，从而增加了秸秆的降解效率，缩短秸秆降解时间，从而促进秸秆快速还田，以利于修复退化的土壤。

附图说明

图1为从碳源、氮源、无机盐溶液、初始pH值、培养温度等方面进行最佳发酵培养基组成和发酵条件的研究结果曲线图；

图2为本发明铜绿假单胞菌菌株产生的生物表面活性剂的红外光谱鉴定图。

本发明所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株于2010年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.3661。

具体实施方式

下面进一步详述本发明。

本发明所述生物表面活性剂是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下(5～10℃)，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛，筛选出具有表面活性的菌株，其发酵液排油直径均大于3cm，发酵液表面张力低于40mN/m。

菌株的筛选

①细菌富集培养

分别取5ml各种浓度(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9g/ml)的土壤悬液，接种于细菌富集培养基，24℃震荡培养1～2d，转速200r/min得到富集液。

所述细菌富集培养基(XF)为：植物油4g，(NH₄)₂SO₄ 10g，KCl 1.1g，FeSO₄·7H₂O 2.5×10^-5g，KH₂PO₄ 3.4g，K₂HPO₄·3H₂O 5g，MgSO₄ 0.5g，EDTA1g，酵母浸膏0.5g，用蒸馏水定容至1L，pH值为7.0。

②血平板培养基初筛

将上述富集液在血平板培养基上划线培养，挑选产生溶血圈较大的菌株进行分离纯化，分离纯化的单菌落接于斜面培养基上，30℃培养1～2d。

所述血平板培养基(g/L)为：羊血8～10％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，酵母粉0.01％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.7％，pH 6～7，115℃灭菌15min。

所述斜面培养基：葡萄糖16g，蛋白胨4g，酵母浸膏0.2g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值为6.5。

③蓝色凝胶培养基复筛

分别取5ml各种浓度(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9g/ml)的土壤悬液，接种于前述富集培养基(XF)，24℃震荡培养1～2d，转速200r/min。将富集液稀释涂布于蓝色凝胶平板培养基，挑选菌落周围产生蓝圈的菌株进行分离纯化，分离纯化的单菌落接于前述斜面培养基上，30℃培养1～2d，将斜面培养的菌种转接于种子培养基中培养16h后，接种于摇瓶培养液中，30℃振荡培养2～3d，转速200r/min，从而得到所述铜绿假单胞菌。

所述蓝色凝胶平板培养基(g/L)为：牛肉膏1，葡萄糖20，蛋白胨5，酵母膏0.2，琼脂18，十六烷基三甲基溴化0.2，亚甲基蓝0.005。

所述种子培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、用蒸馏水定容至1L，pH值为7.2。

④排油性的测定

将上述分离出的单菌株进行液体发酵培养(发酵培养基为葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，NH₄NO₃ 2.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，Na₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，无机盐溶液3mL/L，正十六烷2mL/L，pH7.0，其中无机盐溶液为硫酸锌0.029g/L，氯化钙0.024g/L，硫酸铜0.025g/L，硫酸镁0.017g/L)，将其发酵液分别在常温(25℃)和低温环境下(0～10℃)做排油性测定。即在一个玻璃平皿(D＝9cm)中加入60mL的蒸馏水，然后加入8mL的正十二烷，待正十二烷均匀分布于水面上后，在其表面加入1mL的发酵液，如果产生排油圈，则证明发酵液中存在生物表面活性剂，反之，则证明该发酵液中无生物表面活性剂。排油圈越大，说明排油性越好。选取排油性好(即其发酵液排油直径大于3cm)的菌株保留，继续进行下一步的发酵液表面张力的测定试验。

⑤发酵液表面张力的测定

将排油性好的菌株在前述发酵培养基中培养4～5天，对其发酵液的表面张力进行测定，用FD-NST-I液体表面张力系数测定仪测量其表面张力值，将发酵液表面张力值低于40mN/m的菌株保存，做细菌生理生化鉴定。

细菌鉴定

菌落形态观察-平板制作：将15～20ml融化的普通培养基，冷却至50℃左右，按无菌操作倒入直径为9cm的培养皿内。

单菌落平板(划线法)：取待测菌纯培养物或一环细菌悬液，在无冷凝水的平板一侧边缘处，在直径约为1厘米大小的面积上反复涂抹，烧灼接种环，冷却后，在上述涂菌处划出7～8条直线，划线时接种环要与平板表面成30°-40°角，重复操作数次，以划满整个平板为宜，倒置平板，于最适温度培养1～2天，直至出现单菌落，开始观察菌落形态，包括形状和大小、表面、边缘、透明度、隆起形状，培养基及菌落的颜色等

革兰氏染色试验：将培养18～24h的培养物涂片，自然风干，将涂片在火焰上加温固定，冷却后滴加结晶紫溶液，1min后水洗，在玻片上加适量(以盖满细菌涂面)结晶紫染色液染色1分钟，倾去染色液，用水冲洗，滴加卢哥氏碘液，媒染1min，用水洗去碘液，倾斜玻片，连续滴加95％乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗，滴加番红溶液，复染5min，用水洗去涂片上的番红染色液，将染好的涂片置于空气中晾干，或用吸水纸吸干，进行镜检，先低倍，再高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

氧化发酵试验：用接种针/环移取纯培养物少许，接种于液体发酵培养基管中，置于36±1.0℃温度中培养，观察培养基颜色有无改变(产酸)、小倒管中有无气泡(产气)。本试验主要是检查细菌对各种糖、糖苷和醇等的发酵能力，从而对细菌的种类进行鉴别，因此每次试验，通常都需同时接种多管。常用的指示剂一般有：溴甲酚紫、溴百里蓝酚、红和An-drade指示剂。

甲基红(MR)试验：挑取新的待检测纯培养物少许，接种于细菌培养基中，置于36±1℃或30℃(以30℃较好)培养3～5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂1～2滴，呈鲜红色是微阳性，呈淡红色为弱阳性，黄色则是阴性。直到发现呈阳性或到第5天时仍为阴性，即可判定结果。

明胶液化试验：挑取18～24h待检测菌培养物，较大量穿刺接种于明胶高层约三分之二深度或点种于平板培养基。置于20～22℃中培养7～14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果。如的确被液化，则为阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板上点种的菌落上滴加试剂，若10～20min后，菌落周围出现清晰带环，则为阳性，否则为阴性。

淀粉水解试验：取18～24h的待测试纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板，置于36±1℃中培养24～48h，然后将碘试剂直接滴加于培养物表面，立即检视结果，若菌落或培养物周围出现无色透明环琼脂、培养基呈深蓝色，则是阳性反应(淀粉被分解)。阴性反应则无透明环。

吲哚(靛基质)：将待检测菌接种到胰蛋白胨水培养基中，于37℃中培养24h～48h后，加入10～20滴乙醚，振荡数次，静置1～3分钟，沿试管壁在培养物液面滴加2滴吲哚试剂，观察结果。阳性呈现红色，黄色则为阴性。

枸橼酸盐利用试验(常量法)：将待检测菌纯培养物或单个菌落于枸橼酸钠琼脂斜面上划线，并在37℃中培养24～48h。肠杆菌、枸橼酸杆菌和一些沙门氏菌种科产生阳性反应，即菌体生长良好或培养基显为深蓝色。

试验接触酶试验：区分乳酸菌和多数厌氧菌与其他细菌最主要的依据就是测定有无过氧化氢酶。过氧化氢酶又称接触酶，它可以将H₂O₂分解为H₂O和O₂。若氧分子变做气泡释放出来，则为过氧化氢酶阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢试验中呈阴性。

经过菌落形态观察和细菌生理生化鉴定(表1、表2)，分别从以上所述九个指标进行鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色试验、氧化/发酵型、甲基红(MR)试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、吲哚(靛基质)、枸橼酸盐利用试验(常量法)、试验接触酶试验，最终确定所筛选出的菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)，同时也是耐冷菌，其发酵液在低温环境下(0～10℃)仍具有较低的表面张力(均小于35mN/m)。

表1 40个菌株菌落形态

注：表格中括号里的文字表示所观察菌落的颜色

表2 40个菌株的生理生化特性

注：表格明胶液化项目中液化为阳，反之为阴，括号里高、低表示菌种明胶液化水平

发酵培养

对得到的所述铜绿假单胞菌进行最佳发酵培养基组成和发酵条件的研究。分别从碳源、氮源、磷源、无机盐溶液、初始pH值、培养温度、接种量等几方面进行研究(如图1所示)。

结果表明，通过测定其发酵液表面张力值，得到优化后培养基成分及培养条件，培养基成分为：蔗糖30-31g/L，酵母膏1-1.1g/L，NH₄NO₃ 1-1.1g/L，Na₂HPO₄1-1.1g/L，液体石蜡5-6ml，无机盐溶液体积比浓度(v/v)为3-3.2％，接种量为5～7％，pH控制在6.8～7.2，温度35～37℃，培养时间为1-4d。

分离提取

从上述铜绿假单胞菌的发酵培养液中经一些适当的方法就能分离提取制得槐糖脂类，这些方法是常使用于提取代谢物的方法，例如可利用槐糖脂类与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取。例如将35～37℃培养24h的发酵液，离心，收集絮状沉淀，得到粗品，再用二氯甲烷重新悬浮，过滤，抽提，离心，收集沉淀，即为纯化后的表面活性剂。

对耐冷菌菌株产生的生物表面活性剂进行红外光谱鉴定(如图2所示)，鉴定结果为耐冷菌菌株的代谢产物是槐糖脂类。

秸秆降解制剂

本发明生物表面活性剂可以将前述发酵液直接应用，或者将发酵液经分离纯化后应用。应用于秸杆降解中，是将该表面活性剂与木霉属真菌按适当比例混合成复合制剂，均匀地施在新鲜秸秆表面，所述复合制剂的用量为新鲜秸秆重量的4～5％。

例如，将前述生物表面活性剂发酵液直接与木霉属真菌按1∶1体积比配成复合制剂，将复合制剂施于鲜秸秆上，复合微生物制剂的用量为新鲜秸秆重量的4.5％。秋季收获时将混有复合微生物菌剂的鲜秸秆施于地里，以不施菌剂和秸秆为对照。第二年春天种上作物，按常规进行田间作业。

经过试验测试，本发明的复合制剂施于鲜秸秆上，与未加复合制剂与秸秆对照相比较，土壤含水率高出18％，土壤细菌数量高出3倍，土壤溶磷菌的数量提高44％，土壤硝化细菌的数量提高4倍，作物根部长度提高30％，作物茎部长度提高34％，作物重量提高37％，苗期地上生物量提高55％。

Claims (8)

1.一种生物表面活性剂，是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛而得到的铜绿假单胞菌(保藏编号CGMCC No.3661)产生的，属于槐糖脂类。

2.一种制备权利要求1所述的生物表面活性剂的方法，包括先筛选得到铜绿假单胞菌，然后进行发酵培养，再从发酵培养液中经分离提纯制得的。

3.根据权利要求2所述的制备方法，所述铜绿假单胞菌是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下(5～10℃)，经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛而得到的，其发酵液排油直径均大于3cm，发酵液表面张力低于40mN/m。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其发酵培养是在温度35～37℃，pH值6.8～7.2的条件下进行，接种量为5～7％，培养时间为1-4d，培养基为：蔗糖30-31g/L，酵母膏1-1.1g/L，NH₄NO₃1-1.1g/L，Na₂HPO₄1-1.1g/L，液体石蜡5-6ml，无机盐溶液体积比浓度(v/v)为3-3.2％。

5.根据权利要求2所述的制备方法，所述分离提纯包括35～37℃培养24h的发酵液，离心，收集絮状沉淀，得到粗品，再用二氯甲烷重新悬浮，过滤，抽提，离心，收集沉淀，即为纯化后的表面活性剂。

6.权利要求1所述的生物表面活性剂应用于秸秆降解中，是将该生物表面活性剂与木霉属真菌按适当比例混合成复合制剂，均匀地施在新鲜秸秆表面，所述复合制剂的用量为新鲜秸秆重量的4～5％。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述生物表面活性剂是以发酵液直接应用或将发酵液分离纯化后应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述比例为生物表面活性剂与木霉属真菌的体积比为1∶1。

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