CN116286542B - 一种阴沟肠杆菌cby-9及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）CBY‑9，保藏编号为CGMCC No.26726，该菌株可以使铁尾矿砂及土壤中的难溶性硅、磷、钾、铁、镁、锰、锌、钙等元素活化，由惰性状态变为有效状态，供植物吸收利用。该菌株在pH 4~10、NaCl浓度0~8%、温度15~40℃时均能很好生长，具有较好的耐酸碱性、耐盐性和广适温特性。该菌还具有产嗜铁素和IAA能力。本发明还公开了该菌株在促进植物生长、土壤质量提升方面的应用。另外，根据菌株生长特性，其在尾矿区土壤生态复垦、土壤改良、新型生物有机肥研制等方面有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种阴沟肠杆菌CBY-9及其应用。
背景技术
近年来，随着铁矿资源的快速发展，每年产生了上万吨的铁尾矿等工业废弃物，对周边的土壤、地下水等生态环境造成了严重污染。在这些工业废物中，铁尾矿不仅颗粒细小，易飘散扩张，易造成大范围污染，并且由于其缺少植物营养成分，生物在铁尾矿中难以生存，严重影响了植物生长和人类健康。因此，治理铁尾矿废弃物，维护人类生态环境安全，是人类当前需要解决的重要问题之一。
在铁尾矿的治理过程中，微生物起到了必不可少的作用。人们以铁尾矿为基质，将高效固氮菌属与紫花苜蓿接种，结果高效固氮菌属有效促进了铁尾矿上植株的生长，改善了铁尾矿基质的生态环境。通过盆栽实验，在铁尾矿中接种菌根真菌，结果微生物数量和活性明显提升。另外，利用植物-微生物联合改良对铁尾矿进行改良，降低了铁尾矿中的重金属含量，提高了持水量和酶活性，从而有效改善了铁尾矿中的微生物活性，并为植物生长提供了良好的空隙结构。总之，在微生物的作用下，使铁尾矿的治理更加高效。
利用微生物将铁尾矿中的不溶性元素进行高效的降解和转化，不仅对于治理铁尾矿污染是十分有效，而且有利于植物生长，促进生态环境健康发展。其中，铁尾矿中以SiO2的含量最多，一般在40%以上，甚至超过70%。而相关研究表明，植物可以直接利用硅的唯一形式是单硅酸（H4SiO4），又称为有效硅，然而有效硅在中国的耕地中也十分缺乏。因此，筛选挖掘新型释硅功能微生物，开辟效果好、成本低又不污染环境的微生物制剂，对开发铁尾矿及土壤中的硅素资源，发展绿色生态农业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种既可高效释硅、溶磷解钾，又可以使铁尾矿砂及土壤中的难溶性铁、镁、锰、锌、钙等元素活化，由惰性状态变为有效状态，供植物吸收利用的阴沟肠杆菌CBY-9及其应用。
本发明采用如下技术方案：
一种阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）CBY-9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 26726，保藏日期为2023年3月3日。
所述的阴沟肠杆菌CBY-9在LB培养基上生长良好，单个菌落表面湿润光滑，边缘整齐；CBY-9菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，有周身鞭毛，无芽孢，无荚膜。甲基红、V.P、KCN反应阳性，脲酶、吲哚实验为阴性，具有水解淀粉、明胶和纤维素等特性，不能利用酒石酸，但能很好地利用柠檬酸盐、葡萄糖、甘露醇等多糖为碳源。
进一步的，该菌株具有释硅、溶磷、解钾、固氮的能力。
进一步的，该菌具有促进铁尾矿和土壤中铁、锰、锌、镁、钙的释放，供植物利用的能力。
进一步的，该菌株可产嗜铁素和IAA。
进一步的，该菌株在pH为4~10、NaCl浓度0~8%、温度15~40℃时均能很好生长，具有耐酸碱、耐盐和广适温特性。
一种上述阴沟肠杆菌CBY-9在植物促生中的应用。
一种包含上述阴沟肠杆菌CBY-9的生物硅肥，其中阴沟肠杆菌CBY-9的含量不低于109个/g。
一种上述阴沟肠杆菌CBY-9在土壤修复中的应用，特别是在酸性或盐碱土壤修复和改良中的应用。
一种包含上述阴沟肠杆菌CBY-9的土壤改良剂，其中阴沟肠杆菌CBY-9的含量不低于109个/g。
一种上述阴沟肠杆菌CBY-9在制备生物有机肥中的应用，特别是在生产嗜铁素和/或IAA中的应用。
一种上述阴沟肠杆菌CBY-9在制备人工基质中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）利用本发明的阴沟肠杆菌CBY-9应用于土壤或者尾矿砂，不仅有释硅作用，还能解磷、解钾、固氮、产嗜铁素和IAA，为植物生长提供养分，促进植物生长等作用。
（2）利用本发明的阴沟肠杆菌CBY-9，在盐碱土耐受性方面优势显著，最适生长NaCl浓度为4%，最高NaCl耐受浓度为8%，定殖能力强，可用于铁尾矿区盐碱地土壤改良及质量提升。
（3）本发明可以为研制新型生物有机肥、土壤调理剂、人工基质等提供优良菌种，还可以为释硅、解磷解钾功能微生物的开发提供优质的菌种资源，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。
附图说明
图1为阴沟肠杆菌CBY-9系统发育树。
图2为温度对阴沟肠杆菌CBY-9生长的影响。
图3为pH对阴沟肠杆菌CBY-9生长的影响。
图4为NaCl浓度对阴沟肠杆菌CBY-9生长的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
实施例1阴沟肠杆菌CBY-9分离、鉴定和保藏
铁尾矿砂样品来源于河北省来源县京源城矿业有限公司拴马桩铁矿大卜沟尾矿库，研磨过200目筛，制备成10-3、10-4、10-5的3个稀释度菌悬液，均匀涂布于亚历山大罗夫培养基上，于30℃恒温培养箱中培养2~3天，挑取不同形态单菌落重复划线2~3次，直至获得纯培养，转接到斜面4℃冰箱保存备用。
以铁尾矿砂为底物，以发酵液中有效硅含量的增加为标准，对初筛得到的单菌落进行释硅能力复筛。复筛过程中，种子液由LB培养基发酵至对数生长期，按10%体积接入浸矿脱硅培养基，30℃摇床180 r/min振荡培养，第5 d取样，离心发酵液取上清，用硅钼蓝比色法测定有效硅含量。
表1 铁尾矿砂样品的化学成分
。
培养基配方：
（1）亚历山大罗夫培养基：蔗糖5.0 g、Na2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeCl30.005 g、CaCO30.1 g、三硅酸镁1.0 g、琼脂15~20 g、水1000 mL，pH调为7.0~7.4。
（2）浸矿脱硅培养基：葡萄糖10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaCl2·2H2O 0.2 g、铁尾矿砂1.0 g、CaCO35 g、水1000 mL、pH7.0~7.2。
（3）LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，固体培养基需加琼脂15~20 g、水1000 mL，pH 7.2~7.5。
菌株CBY-9在亚历山大罗夫培养基上生长较慢，3~4天后长出边缘整齐的圆形凸起菌落，表面光滑湿润，无色半透明，挑时有粘稠感，呈粘液状。显微镜下CBY-9菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，有周身鞭毛，无芽孢，无荚膜。甲基红、V.P、KCN反应阳性，脲酶、吲哚实验为阴性，具有水解淀粉、明胶和纤维素等特性，不能利用酒石酸，但能很好地利用柠檬酸盐、葡萄糖、甘露醇等多糖为碳源（具体见表2）。
表2 菌株CBY-9的生理生化特征
。
用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取CBY-9菌株的总DNA，以其为模板，通用16SrDNA引物：27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ）和1492 R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），进行扩增，琼脂糖电泳检测得到1条1500 bp左右的条带。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
将测序结果提交NCBI，与数据库中已有的16S rDNA序列进行同源性比较分析, 并从Genebank中选择近缘菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA7.0构建系统进化树。结果如图1所示，该序列与菌株Enterobacter sp.亲缘关系最近。综合形态学、生理生化特性及16SrDNA序列分析，鉴定菌株CBY-9为阴沟肠杆菌，即Enterobacter cloacaeCBY-9。该菌株于2023年3月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26726。
实施例2 阴沟肠杆菌CBY-9的抗逆性
根据菌株CBY-9在不同NaCl浓度、温度和pH下的生长情况，探究该菌株的抗逆性。具体方法是：设置温度4℃~50℃、pH 2~12、NaCl浓度0~15%范围，按1%（v/v）接种量将菌株CBY-9种子液接到30 mL PB液体摇瓶中，在30℃、180 r/min条件下摇床培养24 h，然后用稀释涂布平板法测定发酵液中细菌浓度。
稀释涂布平板法测定细菌浓度：吸取1 mL发酵液至9 mL去离子水的试管中，震荡混匀，得到10-1发酵稀释液，进一步通过梯度稀释至不同浓度，分别吸取10-6、10-7、10-8稀释液100 μL涂布至PB培养基平板，每个梯度设置3个平行，于30℃恒温倒置培养24 h。选取菌落数在30~300个之间的平板进行计数，计算1 mL发酵液中CBY-9的菌体数量即为CBY-9的细菌浓度。
测定结果表明，菌株CBY-9在15℃~40℃范围内生长良好，具有较好的广适温性（见图2）。而当温度小于15℃或大于40℃（45℃、50℃）时菌株数量急剧下降，说明菌株生长受到了强烈抑制。适宜的温度是细菌发酵必不可少的条件，当温度过低，会使细胞中所含生物酶活性降低导致相应酶促反应速率下降，生命代谢和增殖速度也会降低；而温度过高时，会使菌体内蛋白质失活，造成细胞死亡，呈现出菌株生长缓慢或不生长现象。而菌株CBY-9适宜的温度生长范围为15℃~40℃，可以在多种温度应用，不必额外提供温度环境，具有很好的应用前景。
菌株CBY-9的生长受pH影响较小，在pH 4~10的范围内均能较好的生长（见图3）。当pH<4或pH>10 时，几乎检测不到菌株，说明菌株生长受到抑制。细菌作为有机生命体，初始pH会促进或抑制菌种生长。而菌株CBY-9在pH 4~10均生长良好，说明具有较强的耐酸碱能力和环境适应能力，可以应用于酸性或碱性土壤，研制土壤改良剂有明显优势。另外铁尾矿区土壤多数呈碱性，在尾矿区土壤生态复垦中有很好的应用优势。
菌株CBY-9在0~8%的NaCl范围内生长良好（见图4）。当NaCl浓度为10%时，菌株数量急剧下降，说明菌株生长受到了强烈抑制。细菌在一定的盐浓度范围内才能生长，当浓度较高时，发酵液中渗透压大于细菌内渗透压，细胞失水收缩，从而抑制了微生物体内的生理生化反应，抑制其生长繁殖。而在低渗溶液中，由于细胞壁的保护作用，微生物受低渗的影响不大。该菌株CBY-9能够在0~8%的NaCl范围内生长良好，说明其具有较好的耐盐性，在进行盐碱地土壤修复时也能保证其自身不受抑制，具有较大优势。
进一步说明菌株CBY-9对逆境条件耐受能力强，具有较强的耐酸碱、耐盐特性和广适温特性。
实施例3 阴沟肠杆菌CBY-9释硅特性
制备菌株CBY-9种子液，将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，以2%（v/v）的接种量，将种子液接种到浸矿脱硅培养基（矿砂粒径0.15 mm、矿砂浓度2.5%）中，装液量50 mL（摇瓶100 mL），置于30℃、120 r/min摇床上培养2 d，每个处理3个重复。合理改变浸矿时间、温度、接种量、装液量、不同矿浆浓度和矿砂粒径任一因素，其他数据不变，探究菌株浸矿脱硅的最佳工艺条件。取第3天的发酵液8000 r·min-1离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜，采用NYT1121.15-2006硅钼蓝比色法测定培养后发酵液中有效硅含量。
结果表明，菌株CBY-9脱硅的最适条件为：温度25~30℃，初始pH 6.0~7.0，矿砂浓度5~6%，矿砂粒径≤0.076 mm，接种量5%，装液量50 mL和转速120 r/min，有效硅含量达45.22 mg/L。
实施例4阴沟肠杆菌CBY-9对铁尾矿中难溶性元素释放性能检测
将保藏的CBY-9接种于装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min震荡培养24 h，得到CBY-9种子液，将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，以体积比2%接种于浸矿脱硅培养基中，30℃，180 r/min震荡培养4天，同时以不接CBY-9种子液为对照。将培养4天的发酵液离心取上清，用Agilent ICPOES730检测发酵液上清中各金属离子含量，结果见表3。
表3 阴沟肠杆菌CBY-9对铁尾矿中难溶性元素释放性能检测
。
与对照组相比，处理组中各元素浓度均呈现不同程度的上升趋势。其中，硅作为有益元素，具有促进植物生长、提高作物产量的作用，同时硅还能增强植物的抗逆性，浸出液中的硅浓度达到157.32 mg/L，比对照组93.16 mg/L提高了68.87%。镁是植物生长必需的大量元素，能促进作物体维生素的形成，光合作用中的某些酶也必须是在有镁离子的作用下才能被激活的，同时，镁还能促进植物对硅的吸收，浸出液中的镁浓度为60.00mg/L，比对照组25.24 mg/L提高了137.72%。磷、钾可促进植物生长，提高产量和品质，提高抗逆性，处理组比对照分别提高了433.10%、59.28%。铁能参与植物的光合、呼吸及叶绿素的合成等过程，是多种植物内的必须营养元素，处理组比对照提高了500.46%。钙也是植物生长发育过程中必须的营养元素之一，钙离子是组成细胞壁的主要成分，对植物细胞壁和细胞膜的稳定性有着重要作用，处理组比对照提高了879.83%。锰离子是细胞中许多酶的活化剂，尤其是影响糖酵解和三羧酸循环，锌是叶绿素植物的必需微量元素，在植物中作为许多蛋白酶的辅因子，是乙醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和碳酸酐酶等的组成成分之一，分别比对照提高了589.47%、277.78%。
经过菌株CBY-9处理，发酵液中各种金属元素大量释放，以上几种元素至少比对照含量提高了59.28%以上。说明菌株发酵破坏了铁尾矿砂原来的晶体结构，使难溶性物质变成可溶性成分大量释放，不仅可以供植物利用，改善土壤质量的同时促进植物各种营养成分平衡利用，还可以用于铁尾矿区土壤改良和生态复垦。
实施例5阴沟肠杆菌CBY-9溶磷、解钾、固氮能力测定
NBRIP溶磷培养基：葡萄糖 10g、Ca3(PO4)25 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25g、KCl 0.2 g、MgCl2·6H2O 5 g、琼脂15 g、0.4%溴酚蓝 6 mL、超纯水1 L，pH 7.0~7.2。
解钾培养基：10 g 蔗糖、1 g Na2HPO4、0.5 g、(NH4)2SO4、1 g MgSO4·7H2O、0.2 g酵母粉、0.1 g NaCl、0.1 g CaCO3、0.005 g FeCl3、5 g 钾长石、1 000 mL 水。
固氮活性检测培养基（Ashby无氮培养基）：甘露醇 10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4·2H2O 0.2 g、CaCO35 g、pH7.2。
制备菌株CBY-9种子液，分别点接于NBRIP溶磷培养基和解钾培养基上，于30℃恒温培养箱中培养2 d后，观察其生长情况及是否有溶解圈。
计算方法为：溶解能力＝溶解圈直径D/菌落直径d。
将菌株CBY-9种子液浓度调整为1×109CFU/mL，以体积比2%接种于固氮活性检测培养基中，30℃培养2 d，观察其生长情况。转接3次后，菌株仍能够生长，说明CBY-9具有自生固氮功能。
结果表明：在NBRIP溶磷培养基和解钾培养基中，CBY-9菌落周边均出现明显的透明圈，D/d值均大于1.5，说明其具有一定的溶磷、解钾能力。菌株CBY-9在固氮培养基连续转接3次还可以生长，说明该菌株具有固氮能力。
实施例6 阴沟肠杆菌CBY-9产嗜铁素和IAA能力
制备菌株CBY-9种子液，点接于CAS检测培养基上，30℃培养2d，若出现黄绿色晕圈，则说明产嗜铁素。将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，以体积比2%接种于LB液体培养基中（含100 mg/L的L-色氨酸），置于30℃、180 r/min的摇床上振荡培养1~2 d，取经过8000 r/min离心后的上清液50μL，加入50μL Salkowski比色液，滴在白瓷板上避光显色30min后，若出现粉红色则为阳性，表示该菌株能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。
结果表明，菌株CBY-9具有产IAA、嗜铁素的能力，并进一步说明其具有促进植物生长的能力。
实施例7 阴沟肠杆菌CBY-9对土壤及植物生长的影响
制备菌株CBY-9种子液，将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，按照100 mL·kg-1拌入基质，基质是由30%园林土、40%铁尾矿砂和30%蛭石复合而成。对照则在基质中拌入相同体积的培养基，进行玉米盆栽试验。25℃温室中，在种子萌发后保留每盆中生长最为良好的三株幼苗，50 d后对土壤和植株的地上指标及根系生长状况进行测定。每组实验做3组平行处理。
表4 阴沟肠杆菌CBY-9对玉米植株生长的影响
。
结果显示，玉米在植株长势及根系方面都要显著优于对照处理，特别是在株高、根长、茎粗、叶长、叶宽和叶绿素含量方面均显著高于对照组，分别比对照组提高了9.48%、20.56%、41.06%、19.75%、33.57%和31.22%，具体见表4。
表5阴沟肠杆菌CBY-9对土壤肥力的影响 单位：mg/kg
。
土壤养分含量是玉米生长发育的关键，是产量形成的前提。由表5可知，施加菌株CBY-9菌液，可以显著提高土壤中的铵态氮、硝态氮、有效硅、有效磷和速效钾含量，与对照相比，分别提高了10.58%、10.74%、34.70%、118.3%和47.44%。进一步说明，施用CBY-9菌液，可以有效提高土壤养分含量，与提高植物生长量正相关。
根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）CBY-9，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.26726。
2.根据权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9，其特征在于，其具有释硅、溶磷、解钾、固氮的能力。
3.根据权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9，其特征在于，其可促进铁尾矿和土壤中铁、锰、锌、镁、钙的释放。
4.根据权利要求1所述的一种阴沟肠杆菌CBY-9，其特征在于，其可产嗜铁素和IAA。
5.根据权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9，其特征在于，其在pH为4~10、NaCl浓度0~8%、温度15~40℃时均能很好生长，具有耐酸碱、耐盐和广适温特性。
6.一种如权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9在促进植物生长和提升土壤质量中的应用。
7.一种如权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9在制备生物有机肥中的应用。
8.一种如权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9在制备土壤调理剂中的应用。
9.一种如权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9在制备人工基质中的应用。
10.一种如权利要求1所述的阴沟肠杆菌CBY-9在酸性或碱性土壤修复中的应用。
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