CN116656524A - 一株Pseudomonas sp.CYIJM 17及其应用和菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株Pseudomonassp.CYIJM17及其应用和菌剂，属于微生物技术领域。所述Pseudomonassp.CYIJM17于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M20221562。本发明提供的菌株溶磷能力强，适用土壤中磷素的活化，利用该溶磷菌可以显著提高土壤速效磷含量，减少磷肥的施用。本发明提供的溶磷菌株作用底物广泛，既可以释放有机酸等小分子活化固定态无机磷，也可以分泌磷酸酶水解有机磷，利用该溶磷菌可以显著提高土壤磷素活化能力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株Pseudomonas sp.CYIJM 17及其应用和菌剂。
背景技术
磷肥施用是保证作物产量的必需措施之一，然而施入磷肥的75-90％被土壤固定无法利用。大量磷素以无效态形式在土壤中积累，不仅影响土壤养分结构，还会提高面源污染的风险。更重要的是，磷肥的主要来源磷矿是不可再生资源，亟需有效的土壤磷素活化技术，能够高效利用土壤中积累的磷素，兼顾农业生产与磷素的可持续利用。
溶磷微生物能有效溶解土壤难溶磷、减少磷肥固定、增加作物吸磷量，从而提高磷肥利用率和提高作物产量，是目前世界上公认的安全、经济和有效的生物措施。然而，能够分离得到的高效溶磷微生物菌株种类和数量有限，筛选多与不同环境土壤的适配能力差。因此，特异性溶磷微生物资源开发及其利用，对于活化土壤磷素、保障粮食产量以及减少环境污染和能源浪费具有重要的战略意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株Pseudomonas sp.CYIJM 17及其应用和菌剂，本发明提供的菌株溶磷能力强，适用土壤中磷素的活化，利用该溶磷菌可以显著提高土壤速效磷含量，减少磷肥的施用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株Pseudomonas sp.CYIJM 17，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M20221562。
本发明还提供了上述技术方案所述的Pseudomonas sp.CYIJM 17在溶磷解磷中的应用。
优选的，所述溶磷解磷中的磷包括有机磷和/或无机磷。
优选的，所述有机磷包括植酸钙。
优选的，含有所述植酸钙的培养基以水为溶剂，包括：葡萄糖10g/L、植酸钙3g/L、MgCl2 5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、KCl 0.2g/L和(NH4)2SO4 0.1g/L。
优选的，所述无机磷包括磷酸钙。
优选的，含有所述磷酸钙的培养基以水为溶剂，包括：葡萄糖10g/L、Ca3(PO4)25g/L、MgCl25g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、KCl0.2g/L和(NH4)2SO40.1g/L。
本发明提供了一种溶磷解磷的菌剂，所述菌剂中上述技术方案所述Pseudomonassp.CYIJM17的菌含量为1×109CFU/mL。
本发明的有益效果为：
本发明提供的菌株溶磷能力强，适用土壤中磷素的活化，利用该溶磷菌可以显著提高土壤速效磷含量，减少磷肥的施用。
本发明提供的溶磷菌株作用底物广泛，既可以释放有机酸等小分子活化固定态无机磷，也可以分泌磷酸酶水解有机磷，利用该溶磷菌可以显著提高土壤磷素活化能力。
本发明提供的溶磷菌Pseudomonassp.CYIJM17在磷酸钙(无机磷)固体培养基中培养5天后，溶磷指数为1.61，可溶性磷浓度达到458mg/L。
本发明提供溶磷菌Pseudomonassp.CYIJM17在植酸钙(有机磷)固体培养基中培养5天后，解磷指数为1.68，解磷量为210mg/L。
生物保藏说明
Pseudomonassp.CYIJM17，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M20221562，保藏地址：武汉大学。
附图说明
图1为Pseudomonassp.CYIJM17基因组测序完成图；
图2为依据130个持家基因以Maximumlikelihood法构建进化树。
具体实施方式
本发明提供了一株Pseudomonassp.CYIJM17，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M20221562。
本发明还提供了上述技术方案所述的Pseudomonassp.CYIJM17在溶磷解磷中的应用。在本发明中，所述溶磷解磷中的磷优选包括有机磷和/或无机磷。在本发明中，所述有机磷优选包括植酸钙，含有所述植酸钙的培养基以水为溶剂，优选包括：葡萄糖10g/L、植酸钙3g/L、MgCl25g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、KCl0.2g/L和(NH4)2SO40.1g/L。。在本发明中，所述无机磷包括磷酸钙，含有所述磷酸钙的培养基以水为溶剂，包括：葡萄糖10g/L、Ca3(PO4)25g/L、MgCl25g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、KCl0.2g/L和(NH4)2SO40.1g/L。
本发明还提供了一种溶磷解磷的菌剂，所述菌剂中上述技术方案所述Pseudomonassp.CYIJM17的菌含量为1×109CFU/mL。本发明对所述菌剂的制备方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规制备方法即可。在本发明中，所述菌剂的使用量优选为40～50L/公顷。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌株筛选与保存
(1)采集朝阳双塔区农田耕层土壤，放置无菌袋低温保存。
(2)将1g土壤放于100mL无机磷筛选液体培养基(葡萄糖：10g/L，Ca3(PO4)2：5g/L，MgCl2：5g/L，MgSO4·7H2O：0.25g/L，KCl：0.2g/L，(NH4)2SO4：0.1g/L)，置于恒温培养箱28℃震荡培养24小时。
(3)取1mL培养悬浊液接种于100mL新鲜配置的无机磷筛选液体培养基，置于恒温培养箱28℃震荡培养24小时。
(4)重复(3)1次后，取培养悬浊液梯度稀释104和105倍，取200μL涂布无机磷筛选培养基平板，置于恒温培养箱28℃培养24-48小时。
(5)选择具有较大透明圈(即溶磷圈)的菌株，命名为CYIJM17，计算溶磷指数(溶磷圈直径/菌落直径)。并将菌株在无机磷筛选平板纯化，单克隆纯化至少3次。纯化后的菌株用50％甘油与新鲜菌液1:1混合，于-80℃超低温冰箱保存。
实施例2
菌株TELL-Seq全基因组测序
(1)基因组DNA提取：从土壤样本提取高质量基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，Qubit荧光计精确定量DNA浓度，NanoDrop检测DNA纯度(OD260/OD280)。
(2)测序文库构建：使用TELL-SeqTMWGSLibraryPrep试剂盒(UST公司)处理高质量基因组DNA，首先通过组合微珠的创新性转座酶对长片段DNA进行特异性标记，然后通过转座酶及核酸外切酶对DNA进行切割，并与接头连接形成不同片段大小的文库。微珠清洗后进行文库扩增，添加i5Index序列，最终磁珠清洗形成合格的文库。Qubit检测文库浓度，Agilent片段分析仪检测文库片段长度，保证文库质量。
(3)上机测序：检测合格的文库，使用高通量测序平台对文库进行PE150双端测序。
(4)原始测序数据质控与过滤：原始测序数据利用FastQC软件(v0.11.9)进行质量检测，包括基本的统计信息、碱基每个位置的分布情况、ATCG的比例分布、GC含量分布、测序读长分布、重复水平评估以及接头序列的比例情况；使用Cutadapt软件(v1.0.3)对原始测序数据中的测序接头进行剪切，同时去除低质量碱基和模糊碱基比例高的序列、错误的标签和对应序列，剩余高质量数据(cleanreads)用于后续生物信息学分析。
(5)基因组组装与评估：利用Tell-Link对质控后的数据组装，获得scaffo ld序列，并使用GapCloser(v1.12)软件校验；统计组装序列的GC含量和序列覆盖深度，理想情况下应呈现泊松分布。
(6)非编码RNA与基因预测：利用barmap(0.9)和ARAGORN(v1.2.41)软件对基因组中包含的rRNA和tRNA进行预测；使用PRODIGAL(v2.6.3)对细菌进行基因预测。
(7)基因功能注释：将预测基因的蛋白序列分别与NR、GO、COG、KE GG和Swiss-Prot数据库进行blastp比对(BLAST+2.7.1，比对标准：E值≤1e-5)，获得预测基因的注释信息。
(8)基因组完成图：采用Circos软件(v0.64)绘制基因组圈图，全面展示基因组特征，包括基因在正、反义链上的分布情况、基因的COG功能分类情况、GC含量、基因组岛以及同源基因等信息，对菌株基因组特征有更全面、更直观。
(9)进化树构建：选择130个持家基因，采用RaxML软件以最大似然法构建进化树，确定CYIJM17为假单胞菌(Pseudomonassp.)，保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M20221562。
实施例3
磷活化能力(解磷量)测定：
(1)菌悬液的配制：用接种环挑取1环实施例1保存的菌种，接种于装有LB培养基的试管中，28℃恒温振荡培养过夜。按2％接种量转接于装有LB培养基的三角瓶中，28℃恒温振荡培养至菌悬液OD600≈1.0。
(2)培养：吸取1mL的菌悬液，置于1.5mL离心管中，用无菌水洗涤3次，并重悬于无菌水中。
(3)吸取0.2mL洗涤后的菌悬液(接种量：1％)，转接于装有20mL的液体培养基(测定无机磷溶能力：无机磷筛选液体培养基同实施例1；测定有机磷溶能力：植酸钙培养基(葡萄糖：10g/L，植酸钙：3g/L，MgCl2：5g/L，MgSO4·7H2O：0.25g/L，KCl：0.2g/L，(NH4)2SO4：0.1g/L))，28℃恒温振荡培养7d，设置3个平行，每24h取样；同时，吸取0.2mL的无菌水替代菌悬液，作为阴性对照。
(4)室温静置15min，将发酵液倒入离心管中，1500rpm离心3min，收集上清液A；部分上清液A再次10000rpm离心10min，收集上清B。
(5)测定菌液浓度：吸取100μL上清液A，加入100μL的1MHCl，用分光光度计测定OD600值。
(6)测定有效磷：
吸取适量上清液B于50mL容量瓶中，加入8mL钼锑抗显色液(0.528g抗坏血酸溶于100mL硫酸钼锑贮备液，混合均匀，该溶液需现用现配。硫酸钼锑贮备液：称取经磨细的钼酸铵6.0g溶于200mL水中；称取0.146g酒石酸锑钾溶于50mL水中；量取74mL浓硫酸，缓缓加入400mL水中，不断搅拌，冷却；将上述三种溶液缓慢混合，冷却后，加水稀释定容至1000mL，摇匀后贮于棕色试剂瓶中)用去离子水定容至50mL，充分摇匀，显色后用分光光度计在880nm下测定溶液吸光值。
绘制标准曲线：准确吸取5mg/L磷标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL，分别放入50mL容量瓶中，加入钼锑抗试剂5mL，用水定容至50mL。充分摇匀，显色后用分光光度计在880nm下测定溶液吸光值。
解磷量(mg/L)＝ρ×V2/V1
式中：ρ—待测液中磷的质量浓度(mg/L)；
V1——吸取上清液B体积(mL)；
V2——显色的溶液体积(mL)。
(7)测定pH值：用pH计测定上清液B的pH值。
结果如下：
溶磷菌Pseudomonassp.CYIJM17在磷酸钙(无机磷)固体培养基中培养5天后，溶磷指数为1.61，解磷量达到458mg/L。
溶磷菌Pseudomonassp.CYIJM17在植酸钙(有机磷)固体培养基中培养5天后，解磷指数为1.68，解磷量为210mg/L。
由此可以得出，本发明提供的溶磷菌株作用底物广泛，既可以释放有机酸等小分子活化固定态无机磷，也可以分泌磷酸酶水解有机磷，利用该溶磷菌可以显著提高土壤磷素活化能力。
实施例4
菌剂制备
纯化平板上单克隆菌落(实施例1Pseudomonassp.CYIJM17)接种于5mLLB液体培养基中，28℃180rpm震荡培养过夜。按照1％接种量转接于100mLLB培养基中，28℃，180rpm震荡培养至对数生长期。8000rpm离心10mi n后，弃上清，收集菌体。菌体重悬于无菌水，8000rpm离心10min，该步骤重复2～3次。菌体最终重悬于无菌水至OD600＝1.0的菌剂悬液，Pseudomonassp.CYIJM17的菌含量为1×109CFU/mL。
实施例5
菌株农田生态系统的应用
在辽宁省昌图县亮中桥镇设置定位试验(120°51′17.21″E，42°43′2.09″N)。试验开始前土壤经历多年的一年一熟制的传统耕作，种植方式以玉米连作为主。试验采用随机区组设计，主要包括常规施肥(NPK；N：230kg/公顷，P2O5：100kg/公顷，K2O：100kg/公顷)、磷肥减量施用20％(NP80K；N：230kg/公顷，P2O5：80kg/公顷，K2O：100kg/公顷)以及磷肥减量施用20％配施实施例4制备的菌剂(NP80KL，N：230kg/公顷，P2O5：80kg/公顷，K2O：100kg/公顷，菌剂：45L/公顷)3个处理，每个处理4次重复。每个小区面积为70m2(7m×10m)，种植作物为玉米。收获期测定作物产量与土壤有效磷含量。
1、作物产量测定：玉米成熟期，称取具有代表性的面积S(3垄宽×5m长为取样范围，记录垄距计算面积)内所有果穗重，再根据平均穗重法取10穗具有代表性的果穗进行出籽率和含水量计算，后根据样点面积、果穗数量、实际鲜重、出籽率、含水量计算出实际产量。产量(14％含水量)(kg/亩)＝(666.7÷样点面积)×样点总穗数×每穗样品平均籽粒鲜重×(1-样品籽粒含水量)÷(1-14％)×0.85(注：0.85为测产系数，为矫正人为误差用)。
2、土壤样品采集:在试验处理的每个小区内，除去表层杂物后，按照五点取样法用直径为3cm土钻采集0-10和10-20cm土层的土壤样品。将同一土层的5个采样点的土样混合，去除石子、植物根系等杂质后过2mm筛，并均匀混合成一个土壤样品，自然风干后测定土壤有效磷含量。
结果如表1：
表1实验结果
该菌株制备菌剂后，可作为磷素增效剂、活化剂及农用微生物菌剂使用。将该溶磷菌与化学肥料配施，可以提高土壤有效磷含量和肥料利用效率，从而减少磷肥的施用20％，仍可保证作物稳产，土壤有效磷含量提高8.6％。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一株Pseudomonas sp.CYIJM 17，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M 20221562。
2.权利要求1所述的Pseudomonas sp.CYIJM 17在溶磷解磷中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述溶磷解磷中的磷包括有机磷和/或无机磷。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有机磷包括植酸钙。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有所述植酸钙的培养基以水为溶剂，包括：葡萄糖10g/L、植酸钙3g/L、MgCl25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、KCl 0.2g/L和(NH4)2SO40.1g/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述无机磷包括磷酸钙。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，含有所述磷酸钙的培养基以水为溶剂，包括：葡萄糖10g/L、Ca3(PO4)25g/L、MgCl25g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、KCl 0.2g/L和(NH4)2SO40.1g/L。
8.一种溶磷解磷的菌剂，其特征在于，所述菌剂中权利要求1所述Pseudomonassp.CYIJM 17的菌含量为1×109CFU/mL。
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