CN102925389B

CN102925389B - 一株具有高效分泌生长素能力和固氮能力的自生固氮菌及其应用

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Publication number: CN102925389B
Application number: CN201210427526.9A
Authority: CN
Inventors: 朱瑞芬; 唐凤兰; 张月学; 陈积山; 刘杰淋; 刘凤歧
Original assignee: HEILONGJIANG GRASS INDUSTRY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: HEILONGJIANG GRASS INDUSTRY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: CN102925389A

Abstract

本发明涉及一株具有高效分泌生长素能力和固氮能力的自生固氮菌及其应用，属于微生物领域。本发明发明人从黑龙江省兰西县远大乡胜利村草原盐碱化草地上进行羊草取样，通过对分离纯化后的菌株进行生长素分泌能力、溶磷能力、固氮能力的测定，最终得到了一株具有高效分泌生长素能力和固氮能力的自生固氮菌，命名为ZLXTR6，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6572。将接种该菌后的羊草种子与紫花苜蓿进行混播后，结果发现该方法有效提高了羊草的成株速度与再生能力，同时抑制了紫花苜蓿对羊草的种间竞争作用，提高了混播草地的羊草的产量。因此，本发明的固氮菌在羊草的种植方面将会具有广阔的应用前景。

Description

一株具有高效分泌生长素能力和固氮能力的自生固氮菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种固氮菌的分离及其应用，特别涉及一种具有高效分泌生长素能力的自生固氮菌及其在羊草—紫花苜蓿草地建植过程中提高羊草对紫花苜蓿的竞争力中的应用。本发明属于微生物领域。

背景技术

植物促生菌可以定殖于一些植物根部并提供一系列有益影响，主要促生途径有：分泌一些特殊的化合物，促进植物对营养物质的摄入；分泌有机酸，使土壤中的难溶性元素溶解后促进植物的吸收，如解磷菌；固定空气中的氮，为植物提供氮素，这样的植物促生菌统称为“固氮菌”，其中包含有自生固氮菌，联合固氮菌与共生固氮的根瘤菌。

目前对于植物根际促生菌的研究利用常规方法为：1.大田取样：选取四个具有代表性的点即距根系较远的土壤（NRS）、根表土壤(Rs)、根系表面(RP)、根内(HP)，利用选择性培养基进行促生菌的分离，选择性培养基包括无氮培养基（Ashby培养基、Burk,s培养基），溶磷培养基（孟金娜培养基，PKO培养基）。2.理化性质及促生能力测试：对获得的菌株进行一系列理化性质及促生能力的测试，进行筛选后留下表现优秀的菌株。3.生产测试：表现优异的菌株进入实际生产促生能力阶段。菌株进行发酵培养后，进行接种，接种方式为菌液浸泡种子和固体菌剂拌种两种方式。大田测试后促生效果良好的菌株就可认为是优质促生菌株。

现有分离得到的植物根际促生菌其理化性质及促生能力差别较大，且在与土著菌的竞争中处在劣势，很多菌种存在抗逆性较差的缺陷。而东北地区极端天气较多，因此对抗逆性高的菌株很少，特别是在东北等地理环境下满足豆-禾混播草地建植需要的禾草自生固氮菌菌株就显得特别重要。

羊草与紫花苜蓿混播草地可显著提高了干物质和粗蛋白产量。增加的草地生产力主要源自紫花苜蓿种群，原因是豆科牧草（紫花苜蓿）在生长初期阶段具有较强的生长速率，其对禾本科牧草的抑制作用表现较强。因此在建植羊草-紫花苜蓿混播地时，由于存在种间竞争，羊草的生长因占据较少的光资源而受到抑制（多立安,赵树兰.几种豆禾牧草混播初期生长互作效应的研究[J].草业学报,2001,10(2):72-77）。

发明内容

为了解决现有技术中问题，本发明发明人于2009年9月从黑龙江省兰西县远大乡胜利村草原盐碱化草地上进行羊草取样，样品带回实验室后进行分离纯化，通过对分离纯化后的菌株进行生长素分泌能力、溶磷能力、固氮能力的测定，最终得到了一株具有高效分泌生长素能力的自生固氮菌，命名为ZLXTR6，分类命名为褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum），该菌种已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6572，保藏日期为2012年9月18日。

对本发明的保藏编号为：CGMCC No.6572的菌株进行促生能力测试，结果表明：该菌株有极强的生长素（3—吲哚乙酸）分泌能力，菌株培养14天后菌液生长素含量可达52.16mg/L以上，而普通固氮菌生长素分泌能力多为10mg/L—50mg/L之间（刘小龙，芦云，罗明等.3个旱生禾草内固氮菌的分离及促生性能测定[J],草地学报，2012,20（4）；李剑峰,张淑卿,师尚礼.微波诱变选育高产生长素及耐药性根瘤菌株研究[J].核农学报，2009,23（6））。将接种该菌后的羊草种子与紫花苜蓿进行混播后，结果发现该方法有效提高了羊草的成株速度与再生能力，同时抑制了紫花苜蓿对羊草的种间竞争作用，提高了混播草地的羊草的产量达到干重0.45吨/亩以上，并且接种该菌后的人工羊草草地蛋白质含量也显著高于未接种对照。

因此，进一步的，本发明提出了以上所述的自生固氮菌在提高羊草对紫花苜蓿的竞争力、提高羊草产量及产氮量中的应用。

更进一步的，本发明还提供了一种在羊草-紫花苜蓿草地种植羊草的方法，其特征在于将本发明所述的菌株接种到羊草种子上后，与紫花苜蓿种子进行混播后，按照常规管理措施进行管理。

优选的，所述紫花苜蓿与羊草的种子重量之比为2:3。

本发明的有益效果在于提供了一种满足豆-禾混播草地建植需要的禾草自生固氮菌菌株，命名为ZLXTR6，分类命名为褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）。该菌接种的羊草与紫花苜蓿的混播草地试验证明，接种的羊草的草产量和产氮量比不接种的对照分别增加72.73%和115.91%。上述试验证明自生固氮菌（ZLXTR6）与紫花苜蓿的混播草地中提高了羊草在混播草地中的竞争能力具有增产效果，产量提高可达72.73%，且具有较高的实用性和可推广性。本发明在东北地理条件下，退化草地建植中具有广阔的应用效果。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1自生固氮菌的分离、保藏

本发明发明人于2009年9月从黑龙江省兰西县远大乡胜利村草原盐碱化草地上进行羊草取样，样品带回实验室后进行分离纯化，分离方法如下：根际土壤按照距根系较远的土壤（NRS）、根表土壤(Rs)进行区分，分别称取NRS与Rs各0.1克，在无菌条件下用0.85%生理盐水配成不同浓度梯度的悬浮液，取稀释度为10^-2～10^-7的悬浮液各0.1ML，用玻璃刮刀均匀涂布于阿须贝（Asbhy）平板培养基上，28℃培养三天，选取菌落分布均匀分散的菌斑，按菌落大小、颜色、形状进行多次分离，直至菌落的大小、颜色、形状一致，经菌落形态、菌体形态检查后，接入试管斜面保存。对分离纯化后的菌株进行生长素分泌能力、溶磷能力，固氮能力的测定，最终得到了一株具有高效分泌生长素能力的自生固氮菌，命名为ZLXTR6，分类命名为褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum），该菌种已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6572，保藏日期为2012年9月18日。

羊草自生固氮菌CGMCC No.6572采用阿须贝（Asbhy）平板培养基配方为：葡萄糖10.0g，K₂HPO₄0.2g，K₂SO₄0.2g，NaCl 0.2g，CaCO₃5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g,琼脂18.0g,蒸馏水1000ml，pH值在7.0~7.2。

实施例2本发明的菌株（保藏编号为：CGMCC No.6572）分泌IAA和其他能力测定

1、供试菌株来源及编号

供试菌株为分离纯化后的所有菌株进行生长素分泌能力、溶磷能力，固氮酶活性的测定，菌株编号及来源见表1。

表1供试菌株

菌株编号	菌株来源
		ZLXTR1	羊草（Leymus chinesis）根际土壤(Rs）
ZLXTR2	羊草（Leymus chinesis）根际土壤(NRS)
		ZLXTR3	羊草（Leymus chinesis）根际土壤(Rs）
ZLXTR4	羊草（Leymus chinesis）根际土壤(NRS)
		ZLXTR5	羊草（Leymus chinesis）根际土壤(NRS)
ZLXTR6	羊草（Leymus chinesis）根际土壤（Rs)

2、IAA测定方法

参照Eric G等的方法，采用Salkowski比色法测定菌株分泌植物生长素(IAA)的能力。S2比色液的组成:FeCl₃4.5g、10.8mol/L H₂SO₄1L,IAA测定范围5~200mg/L，一般超过100mg/L就需要稀释。PC比色液的组成:FeCl₃12g、7.9mol/L H₂SO₄1L，IAA测定范围0.3~20mg/L。用分析纯的3-IAA(3-吲哚乙酸)加去离子水配制1~20mg/L梯度浓度的标准溶液,取标准溶液1ml加比色液1ml冰浴中黑暗静置30min显色,取出后立即用722-E型分光光度计测定OD_530nm的吸光度值,并绘制标准曲线。得到标准曲线方程为y=45.7x+0.72。将在将初筛菌株稀释为109cfu/ml的菌悬液,以4%的接种量接入Asbhy液体培养基,以加入同体积高温灭活菌液的Asbhy液体培养基作为空白对照,28℃、120r/min摇床培养14d后测定IAA产量（表2）。测定各菌株发酵液的生长素含量以制作标准曲线的方法相同。

表2供试菌株的IAA产量

菌株编号	培养14d产IAA量	方差分析（LSD₀₀₁）
			ZLXTR1	41.20mg/L	B
ZLXTR2	39.52mg/L	C
			ZLXTR3	36.63mg/L	CD
ZLXTR4	35.96mg/L	D
			ZLXTR5	24.20mg/L	E
ZLXTR6	52.16mg/L	A

菌株促生能力测试结果表明：供试菌株（ZLXTR1-6）通过14d培养的IAA产量的比较，最终选取1株产IAA能力较强的菌株(表2)。其中菌株编号ZLXTR6产IAA能力最强，产IAA量为52.16mg/L，方差分析在0.01水平上差异极显著。表明该菌株有极强的生长素（3-吲哚乙酸）分泌能力，目前有关资料表明，普通固氮菌生长素分泌能力多为10mg/L—50mg/L之间。因此，菌株ZLXTR6生长素（3-吲哚乙酸）分泌能力极强。

3、溶磷能力测定

采用有机磷（蛋黄卵磷脂EYPC）和无机磷（Ca₃(PO₄)₂）固体培养基溶磷圈法进行测定，每个供试菌株分别进行有机磷和无机磷培养基培养，各3个重复培养皿，每培养皿5个接菌点，置生化培养箱28℃下恒温培养，培养11d后测量根瘤菌菌落直径和溶磷透明圈直径，计算根瘤菌菌落溶磷透明圈直径与菌落直径的比值，比值越大，溶磷能力越强，比值越小，溶磷能力越弱，比值为1时表示菌落无溶磷能力。

溶解有机磷能力测定培养基采用蒙金娜培养基，配方(g/L)：10g葡萄糖，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.3g NaCl，0.3g KCl，0.03g FeSO₄·7H₂O，0.03g MnSO₄·4H₂O，0.2g卵磷脂，5g CaCO₃，0.4g酵母膏，20g琼脂，1000ml蒸馏水，pH值在7.0～7.2。其中卵磷脂用75%的酒精加热溶解，单独灭菌，温度降至70℃后与培养基混合。

溶解无机磷能力测定培养基采用PKO培养基，配方(g/L)：10g葡萄糖，5.0gCa₃(PO₄)₂，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.2g NaCl，0.2g KCl，0.03g MgSO₄·7H₂O，0.03gMnSO₄，0.003g FeSO₄，0.5g酵母膏，20g琼脂，1000ml蒸馏水，pH值在6.8～7.0。其中Ca₃(PO₄)₂过筛并单独灭菌后与培养基混合。

表3供试菌株的溶磷能力

菌株编号	均值	方差分析（LSD₀₀₁）
			ZLXTR1	1.5	BC
ZLXTR2	1.2	D
			ZLXTR3	1.6	B
ZLXTR4	1.4	C
			ZLXTR5	1.4	C
ZLXTR6	1.8	A

自生固氮菌对其溶解有机磷进行测定见表3。结果表明：6个菌株中全部菌株可以在有机磷培养基上形成明显透明圈，表明这些菌株具有溶磷能力。方差分析表明，具有溶有机磷能力的各菌株的溶磷圈之间有显著差异。其中溶磷能力最强的是菌株ZLXTR6，其次是菌株ZLXTR3，这两株菌株均来羊草根表土壤(Rs)。

2.3固氮酶活性测定

将供试菌株接种于含有50ml阿须贝（Asbhy）培养基的三角瓶内，于28℃条件下培养72小时后，用灭过菌的液体阿须贝（Asbhy）培养基配成OD_530nm＝1的均一菌液。用移液枪转5ml入医用抗凝管，用无菌注射器抽出2.5ml的气体，注入2.5ml C₂H₂气体，反应5小时（样品较多时，可向瓶中加0.5ml,0.5mol/l的NaOH终止固氮酶反应）。然后用注射器抽取0.05ml瓶内气体注入气相色谱仪，测定乙烯产生的量，并用乙烯生成量表示固氮酶活性大小。反映条件：C₁C₂填充柱,，柱温70℃，进样器温度150℃，检测器温度180℃；检测器为氢火焰检测器（FID）。外标法计算测定结果，以mmolC₂H₄/mL/h表示固氮酶活性，并计算固氮酶活性大小。

表4供试菌株的固氮能力

菌株编号	均值（mmolC2H4/mL/h)	方差分析（LSD₀₀₁）
			ZLXTR1	6.25	B
ZLXTR2	5.20	D
			ZLXTR3	6.67	B
ZLXTR4	5.66	C
			ZLXTR5	5.42	C
ZLXTR6	7.55	A

自生固氮菌固氮能力测定见表4。结果表明：待测的6株菌株之间固氮酶活性差异显著（0.01水平），菌株ZLXTR6固氮酶活性最高，可达7.55mmolC2H4/mL/h。

固氮酶活性最低的菌株为ZLXTR2为5.20mmolC2H4/mL/h。这两株菌株分别来自羊草根际土壤Rs和NRS。

通过以上对分离的菌种的性能测定，发现菌株ZLXTR6具有良好的生长素分泌能力、溶磷能力以及固氮酶活性，该菌种已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6572。

实施例3本发明的菌株（保藏编号为：CGMCC No.6572）在羊草-紫花苜蓿草地建植过程中提高羊草对紫花苜蓿的竞争力中的应用

将本发明的菌株（保藏编号为：CGMCC No.6572）接种于含有灭菌阿须贝（Asbhy）液体培养基的三角瓶内，于28℃条件下培养72小时后，用灭过菌的液体阿须贝（Asbhy）培养基配成OD_530nm＝1的均一菌液（以发酵起始菌数达10⁸~10⁹个/ml为正常量），按照每克羊草种子喷洒10毫升菌液的量将菌液洒到种子上，并充分混拌，使每粒种子都能均匀地沾到菌液，种子拌好后，与紫花苜蓿种子进行混播。混播组合分接种上述菌株组和未接种组（对照）。混播方法为1份紫花苜蓿（肇东苜蓿，种子用价92.5%）、2份羊草（种子用价72.5%）的种子彼此均匀混合，每份以重量单位计，即上述的紫花苜蓿种子与羊草的种子重量之比为2:3，混合后的种子以每亩2千克的亩播量在绥化综合试验站（125°28′24″E，46°32′17″N）进行草地建植。该地区年降水量469．7mm，年均气温2.9℃；≥10℃年积温2760℃·d；年均日照时数2713h；无霜期130d，属大陆性季风气候。试验地土壤以黑钙土和草甸土为主，土壤全盐量0.157%，有机质8.85g/kg，全氮0.335g/g，速效氮103.50mg/kg，田间持水量平均22.71％，pH值8.12。在田间实施中混播组合重复3次。整个生育期间不灌水不施肥，适时人工除杂，管理等同大田。

草产量测定以当年建植的紫花苜蓿初花期进行。在不同混播组合草地中随机取样1m2，重复4次，齐地刈割后将紫花苜蓿和羊草分离，称取鲜重，将其带回实验室自然风干后分别称其干重。将不同组合干样粉碎过筛（0.25mm），凯式定氮仪测含氮率并计算紫花苜蓿和羊草的氮产量。

表5供试菌株（CGMCC No.6572）的田间实验结果

接种上述菌株组和未接种组结果表明，本发明的菌株（CGMCC No.6572）具有较强的自生固氮能力，建植当年将羊草的氮产量较对照提高了115.91％，平均干草产量提高了72.73%。不同组合干草产量表明，接种该菌使得建植当年混播草地产量较对照（0.38吨/亩）提高到0.47吨/亩，打破了该区历史以来混播草地干草产量不高于0.45吨/亩的记录。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一株具有高效分泌生长素能力和固氮能力的自生固氮菌，命名为ZLXTR6，分类命名为褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6572。

2.权利要求1所述的一株具有高效分泌生长素能力和固氮能力的自生固氮菌在提高羊草对紫花苜蓿的竞争力、提高羊草产量及产氮量中的应用。

3.一种在羊草—紫花苜蓿草地种植羊草的方法，其特征在于将权利要求1所述的自生固氮菌接种到羊草种子上后，与紫花苜蓿种子进行混播，按照常规管理措施进行管理即可。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于紫花苜蓿与羊草的种子重量之比为2:3。