CN108504596A - 一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，其特征是：生物菌肥发酵剂为伯克霍尔德菌40‑60份、酵母菌20‑30份、枯草芽孢杆菌20‑30份制成的生物菌剂；伯克霍尔德菌菌株：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15326，保藏日期为2018年1月29日；该发酵剂制成的菌肥为在草莓根际定殖能力好并且安全可靠，并且对连作草莓土壤中自毒物质具有良好的降解作用，促进了草莓植株的抗逆能力，提高草莓的产量和果实品质；制备方法简单，配方合理，功效稳定对缓解草莓的自毒作用效果明显。

Description

一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂
技术领域
本发明涉及微生物和连作障碍修复领域，具体涉及一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂。
背景技术
草莓是一种草本作物，生育期中易感病，感染的病害种类较多，长期在同一田土中种植，有害微生物及土传病菌逐渐积累，极易造成病虫害滋生和蔓延，对植株侵染危害越来越严重，使植株长势衰弱，逐渐萎缩矮化，最后整株死亡，导致严重减产甚至绝收。调查表明，草莓连作障碍主要是由于土壤障碍的因素引起的，突出表现在土壤微量元素丰缺差距加大，有机质含量降低，土壤次生盐渍化、盐碱化，特别是土壤微生物生态结构不平衡，有益微生物菌群减少，细菌、真菌、放线菌三大菌类组成比例发生变化。同时由于长期使用同一草莓品系，导致抗病力下降，品种退化，病毒侵染严重，病害发病率增加。
添加有益微生物或拮抗菌等手段可以有效的防治由自毒作用和根系土传病害等引起的连作障碍的发生。目前应用于草莓连作障碍的益生菌比较少，大多采用杀菌剂和化肥进行土壤治理，导致土壤板结酸化、养分失衡、次生盐渍化等问题，缺乏安全有效的生物菌治理严重制约了草莓连作障碍的治理和可持续发展，已成为目前草莓农业生产亟需解决的瓶颈问题之一。
目前我国食用菌种植面积迅速扩大,食用菌栽培后产生了大量的菌渣，有些菇农把菌渣随意丢弃在水沟里、路面上,不仅造成资源浪费,污染环境,而且下次种菇时更容易感染病虫害,危害食用菌的正常生长。甚至有些工厂化生产的企业为了使菌渣卖出更好的价格，把菌渣长时间堆起来，不仅污染环境,还会滋生病虫害并很快传播,在食用菌的生长和菌种的培养过程中易感染病虫害，制作出的菌产品质量也会受到影响。食用菌栽培料中的农作物秸秆，棉籽壳富含木质素、纤维素等，一部分被菌丝吸收利用，食用菌栽培结束后，菌渣中还残留大量的菌丝体富含氨基酸和纤维素、碳氢化合物和微量元素，可作为蔬菜栽培很好的有机肥，但是食用菌渣不经过发酵处理并不能完全被植物吸收，反而回破坏土壤原有的营养结构，造成营养成分不均衡，而导致植株根部吸收受阻而形成伤根的现象。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，以改善草莓根系土壤的营养结构，降解根系分泌物中的自毒物质，解决草莓的连作障碍问题，起到促进植株生长和降解自毒作用的目的，同时合理利用农业废弃物，提高设施农业用地质量和经济效益。
本发明的目的是通过以下技术解决方案实现的：一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，其技术要点是：生物菌肥发酵剂为伯克霍尔德菌40-60份、酵母菌20-30份、枯草芽孢杆菌20-30份制成的生物菌剂。
伯克霍尔德菌菌株：分类命名为伯克霍尔德菌(Burkholderia phytofirmans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15326，保藏日期为2018年1月29日。
该菌株的菌落及菌体特征为：该自毒物质降解菌在NA培养基(酵母浸粉1g；牛肉膏3g；蛋白胨5g；蔗糖10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；121℃灭菌30min)上培养48h后菌落成白、圆形、表面光滑、隆起、边缘整齐、直径2～4mm。菌体杆状，丛生鞭毛，革兰氏染色阴性，不产芽孢。
该菌株生理生化特征为：氧化酶试验阴性或阳性、接触酶试验阴性或阳性、淀粉水解试验阴性、明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、丙二酸盐利用试验阳性、H2S试验阳性、甲基红试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、蔗糖利用试验阳性、麦芽糖利用试验阴性。
伯克霍尔德菌菌株的最适宜培养基为LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天。
发酵剂中伯克霍尔德菌的浓度为2.5-3.5×108cfu/ml。
进一步的，所述生物菌肥包括食用菌渣30-50份，禽畜粪便50-70份，秸秆粉10-20；
进一步的，生物菌肥制备方法包括以下步骤：
(1)按重量份数计取原料：食用菌渣30-50份，禽畜粪便50-70份，秸秆粉10-20混合均匀得到有机混合物备用；
(2)配制发酵剂：按照各组分重量比计称取物料，其中微生物菌剂：伯克霍尔德菌40-60份、酵母菌20-30份、枯草芽孢杆菌20-30，并将物料混合均匀，得到发酵剂；
(3)将上述有机混合物和发酵剂混合均匀，在发酵槽内开始堆积发酵，发酵中堆料高度为1.2-1.5m，在发酵中前期待温度升至55-60℃时开始翻拌，2-3天翻拌一次；发酵中后期，温度控制在60-70℃以内，每当温度达到60℃以上就需要翻拌一次，直至发酵温度降到常温时，整个发酵过程为：当气温在20℃以下时为15-20天，当气温在20℃以上时为6-10天，发酵完成得到生物菌肥。
进一步的，所述的生物菌肥中含有2-6亿cuf/g有效活菌数，按重量比含有有机质为40-75％，NPK为5-15％，微量元素3-10％，腐殖酸15-30％，氨基酸2-8％。
本发明的有益效果：采用该发酵剂制成的菌肥为在草莓根际定殖能力好并且安全可靠，并且对连作草莓土壤中自毒物质具有良好的降解作用，明显改善了土壤理化性质，促进了草莓植株的抗逆能力，提高草莓的产量和果实品质；发酵剂制备方法简单，配方合理，发酵效果功效稳定，大幅度提高了菌肥中有机质、氮、磷、钾等含量。
具体实施方式
1.材料和方法
(1)按重量份数计取原料：食用菌渣40份，禽畜粪便50份，秸秆粉10份混合均匀得到有机混合物备用；
(2)配制发酵剂：按照各组分重量比计称取物料，发酵剂Ⅰ：霍尔德菌菌株60份、酵母菌20份、枯草芽孢杆菌20，并将物料混合均匀；发酵剂Ⅱ：酵母菌50份、枯草芽孢杆菌50份，并将物料混合均匀；酵母菌、枯草芽孢杆菌购自郑州农富康生物科技有限公司。
霍尔德菌菌株分离方法，称取甜瓜根际土壤10g打磨后放入250mL的三角瓶中，加入90mL无菌水摇匀，在摇床上以120r·min-1摇30min，使土样充分混匀，配成10-1倍稀释液；用移液枪吸取1mL 10-1稀释液移入装有9mL无菌水的灭菌试管中，配成10-2倍稀释液；再用移液枪吸取1mL 10-2稀释液移入装有9mL无菌水的灭菌试管中，最终配成10-3倍稀释液。将无机盐培养基熔化，加入链霉素倒入灭菌培养皿中，待培养基冷却完全，用移液枪吸取0.1mL10-3倍稀释液于培养皿中，用无菌刮铲将培养液涂匀，每个处理重复3次，28℃温箱中培养48h，得到伯克霍尔德菌菌株。
分类命名为伯克霍尔德菌(Burkholderia phytofirmans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15326，菌株编号为20180101辽CK1，保藏日期为2018年1月29日。
制备伯克霍尔德菌菌剂：用于培养伯克霍尔德菌菌株(菌株编号为20180101辽CK1)的适宜培养基和LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天，得到菌悬液。
(3)将上述有机混合物和两种发酵剂混合均匀，在发酵槽内开始堆积发酵，发酵中堆料高度为1.5m，在发酵中前期待温度升至60℃时开始翻拌，2-3天翻拌一次；发酵中后期，温度控制在70℃以内，每当温度达到60℃以上就需要翻拌一次，直至发酵温度降到常温时；整个发酵过程为：当气温在20℃以下时为18天，当气温在20℃以上时为8天，发酵完成得到两种生物菌肥。
1.5微生物菌剂对土壤中的酚酸物质的降解作用检测方法：
(1)草莓移栽时，采用生物菌肥采用穴施处理，每穴20-30克，设不采用生物菌肥处理为对照，采收期分别称取25g的不施用生物菌肥的草莓连作土壤和施用采用发酵剂Ⅰ进行所得的生物菌肥的草莓连作土壤置于75mL的离心管中，向土壤中添加25mL的1mol·L-1的NaOH溶液，用漩涡震荡仪混匀后静置24h，次日经翻转摇匀仪混匀1h，超声波振荡器震荡30min，离心后分离上清液，采用12mol·L-1的盐酸调整土壤溶液pH值到2.5，静置2h后离心除去胡敏酸，分离上清液4℃保存准备分析测定。
(2)酚酸类物质HPLC分离和鉴定
标准溶液的配制：准确称量10mg香草醛、苯甲酸、肉桂酸、对羟基苯甲酸、香豆酸、香兰素、苯甲基苄基质、咖啡酸(由上海sigma生物科技有限公司提供)分别置入100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至100mL，则该标准溶液每种酚酸的浓度100μg·mL-1。
(3)色谱条件：土壤中不同种类的酚酸的测定采用HPLC法(Agilent LC 1100，美国)。样品进样前必须经过用0.22μm的微孔滤膜过滤去除溶液中存在的杂质，色谱分离柱为SB-C18(Agilent 4.6mm×250mm)，设流速1mL·min-1，柱温25℃，样品检测波长280nm，每次进样量均为20μL，流动相A：甲醇(色谱级)和流动相B：pH＝2.8的乙酸水溶液(色谱级)，样品分离通过梯度洗脱的方法达到分离和缩短酚酸类物质保留时间的目的。洗脱条件B：70％(0min)→50％(15min)→30％(16min)→0％(30min)→end(30min)。采用保留时间进行定性，采用峰面积外标法进行定量。
(4)数据处理及统计分析
每试验重复3次，使用spss 17.0对数据进行统计分析，各处理间显著性差异分析使用Duncan法进行分析。
土壤中酚酸类物质含量R(mg·kg-1)的计算公式如下：R(mg·kg-1)＝
S样×V样×C标/S样×m(R-样品中某物质酚酸含量；S样-样品峰面积；V样-样品定容体积，mL；C标-标准溶液浓度，mg·L-1；S标-标准溶液峰面积；m-样品重量，g。)
1.6生物菌肥对草莓产量的影响
供试草莓品种：丹东99
试验地点：沈阳农业大学试验基地。
草莓移栽时，采用生物菌肥采用穴施处理，每穴20-30克，设不采用生物菌肥处理为对照，采收期调查产量，即待田间草莓坐果成熟后，对各个处理条件下的草莓果实进行称重并记录数据，计算不同处理条件下的草莓产量。
2结果与分析
微生物菌剂对草莓连作土壤中的酚酸物质的降解作用结果表明，该菌剂对草莓连作土壤中的主要酚酸具有优异的降解作用。
表1采用发酵剂Ⅰ进行发酵的生物菌肥对连作土壤中的酚酸物质的降解作用
采用发酵剂Ⅰ进行发酵的生物菌肥中含有5亿cuf/g有效活菌数，按重量比含有有机质为55.4％，NPK为10.1％，微量元素5.2％，腐殖酸18.2％，氨基酸5.8％。
采用发酵剂Ⅱ进行发酵的生物菌肥含有3.5亿cuf/g有效活菌数，按重量比含有有机质为32.4％，NPK为8.1％，微量元素2.9％，腐殖酸11.5％，氨基酸3.6％。
大田试验研究结果表明，外源施加生物菌肥可利于增强草莓植株的生长和产量的提高，降低草莓移栽时的死苗率。
表2微生物菌剂对草莓产量和生长的作用
处理 死苗率 产量(kg/亩)
生物菌肥处理(经发酵剂Ⅰ发酵) 0 1077±2.8
生物菌肥处理(经发酵剂Ⅱ发酵) 2.34 915±1.2
CK 5.59％ 860±2.5

Claims (4)

1.一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，其特征是：生物菌肥发酵剂为伯克霍尔德菌40-60份、酵母菌20-30份、枯草芽孢杆菌20-30份制成的生物菌剂；
伯克霍尔德菌菌株：分类命名为伯克霍尔德菌（Burkholderia phytofirmans），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 15326，保藏日期为2018年1月29日；
该菌株的菌落及菌体特征为：该自毒物质降解菌在NA培养基（酵母浸粉1g；牛肉膏3g；蛋白胨5g；蔗糖10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；121℃灭菌30min）上培养48h后菌落成白、圆形、表面光滑、隆起、边缘整齐、直径2~4mm，菌体杆状，丛生鞭毛，革兰氏染色阴性，不产芽孢；
该菌株生理生化特征为：氧化酶试验阴性或阳性、接触酶试验阴性或阳性、淀粉水解试验阴性、明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、丙二酸盐利用试验阳性、H2S试验阳性、甲基红试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、蔗糖利用试验阳性、麦芽糖利用试验阴性；
伯克霍尔德菌菌株的最适宜培养基为LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠（NaCl）10g/L，接种量为培养基重量的2%，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天；
发酵剂中伯克霍尔德菌的浓度为2.5-3.5×108cfu/ml。
2.根据权利要求1所述的一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，其特征是：所述生物菌肥包括食用菌渣30-50份，禽畜粪便50-70份，秸秆粉10-20。
3.根据权利要求2所述的一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，其特征是：生物菌肥制备方法包括以下步骤：
（1）按重量份数计取原料 ：食用菌渣30-50份，禽畜粪便50-70份，秸秆粉10-20混合均匀得到有机混合物备用；
（2） 配制发酵剂 ：按照各组分重量比计称取物料，其中微生物菌剂 ：伯克霍尔德菌40-60份、酵母菌20-30份、枯草芽孢杆菌20-30，并将物料混合均匀，得到发酵剂；
（3）将上述有机混合物和发酵剂混合均匀，在发酵槽内开始堆积发酵，发酵中堆料高度为1.2-1.5m，在发酵中前期待温度升至 55-60℃时开始翻拌，2-3天翻拌一次；发酵中后期，温度控制在 60-70℃以内，每当温度达到 60℃以上就需要翻拌一次，直至发酵温度降到常温时，整个发酵过程为：当气温在 20℃以下时为15-20 天，当气温在 20℃以上时为6-10天，发酵完成得到生物菌肥。
4.根据权利要求2所述的一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂，其特征是：所述的生物菌肥中含有2-6亿cuf/g有效活菌数，按重量比含有有机质为 40-75％， NPK 为5-15％，微量元素 3-10％，腐殖酸 15-30％，氨基酸2-8％。
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