CN102599196B

CN102599196B - 苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅生长的调节方法

Info

Publication number: CN102599196B
Application number: CN2012100519866A
Authority: CN
Inventors: 多立安; 赵树兰; 程田
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: CN102599196A

Abstract

本发明公开了一种苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法，它是在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150μl不同浓度的各种微生物过滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标。实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%。实验结果表明：加入苏云金芽孢杆菌菌剂后在一定程度上促进了草坪植物的生长。

Description

苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅生长的调节方法

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种的应用。更具体的说是一种苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法。

背景技术

堆肥化（Composting）是指在有控制的条件下，使有机废弃物在微生物（主要为细菌）作用下，发生降解，并同时使有机物向稳定的腐殖质方向转化的过程。堆肥化后的产物称之为堆肥（Compost）。堆肥过程可以将混合物的体积有效地减少40%-50%，并且可以依靠在高温阶段中代谢产生的热量杀死垃圾中的病原物质。堆肥不是一项新的技术，但用这种方法处理城市固体垃圾，符合环境的利益，因为在堆肥过程中清除或者减少了城市固体垃圾中的毒性并使得最终的产物可以被用来进行再利用。堆肥的程序包括原料的预处理、原料发酵和后处理，堆肥过程受水分、氧含量、C/N比、温度、pH和通风情况等因素的影响。

堆肥化过程的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，在堆肥化过程中，生活垃圾中的可溶解有机物质透过微生物的细胞壁和细胞膜而被微生物所吸收，而微生物通过自身的生命活动过程，把吸收的有机物转化成无机物。微生物在堆肥过程中扮演着重要角色，与堆肥周期和堆肥质量密切相关。因此，堆肥中微生物的研究对开发堆肥微生物资源，加速堆肥过程，减短堆肥周期，提高堆肥质量都具有重要的意义。

微生物种类繁多，自然界中仅有极少数的微生物得到鉴定，能够存活、培养的种类更是少之又少，至多为微生物总量的l%。目前，国内外对于堆肥中的微生物进行了一系列理论和实践的研究。对于应用堆肥可能出现的环境问题也已经引起了人们的重视，但如何解决这些问题还缺少细致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的质量，解决堆肥应用过程中可能产生的环境问题一直是相关科研人员研究关注的热点。对于堆肥中的微生物组成及堆肥过程中的微生物变化的研究已有诸多报道，但对于将堆肥中微生物分离、应用于其他基质的研究却少有报道。

将生活垃圾堆肥用作草坪基质，不但可以避开食物链，同时又解决了垃圾的出路问题。但垃圾堆肥中含有重金属等物质可能对环境造成不利的影响，这一直是堆肥应用中的重要问题，从垃圾堆肥中分离和提取有益的微生物菌种，配制成不同的微生物菌剂接种到草坪建植体系中，既可以提高堆肥的利用效率，同时又解决了堆肥重金属等可能构成的环境威胁，体现生物制剂的优越性，符合可持续发展的要求，通过研究苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节的影响，目的是为了筛选适合的微生物菌剂，提高草坪植物的质量和抗逆性，改善草坪土壤基质的质量提供理论依据。

苏云金芽孢杆菌是目前国际上生产量最大并成功地用于防治农、林、贮粮害虫和一些卫生害虫的微生物杀虫剂，苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的同时，可以形成一种由杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体，它的主要杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白。研究发现，这种蛋白对多种农林害虫具有特异性杀伤作用。昆虫取食芽孢晶体混合物后，晶体在昆虫体内的中肠碱性环境和蛋白酶的作用下被降解形成杀虫活性蛋白，研究结果表明这些毒蛋白单独作用或不同蛋白间协同作用对昆虫具有不同程度的毒杀作用，进一步加强苏云金芽孢杆菌在防治和控制害虫危害方面的研究，对于保护人类生存环境实现可持续发展具有重大意义。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。关于采用苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法尚为见文献报道。

发明内容

本发明采用的苏云金芽孢杆菌（拉丁名：Bacillus thuringiensis）菌种保藏号:CFCC10206,保藏单位：中国林业微生物菌种保藏管理中心，对外可以提供。

生理生化特性：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为1.0-1.2×3-5μm。形成半孢晶体，对阿拉伯糖甘露醇不产酸产淀粉酶，硝酸盐还原到亚硝酸盐。

苏云金芽孢杆菌毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD₅₀852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒。

本发明将配制成不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液接种到草坪建植体系中。通过研究苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法，可为草坪植物的建植提供依据。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)苏云金芽孢杆菌的分离：苏云金芽孢杆菌本身有市售；也可以分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；本发明从生活垃圾堆肥所得到的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的苏云金芽孢杆菌相同，分离的方法如下：

1）将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0^-1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天；

2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养；选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数；

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养8～12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；其中苏云金芽孢杆菌的菌落数（个）

结论：通过在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的苏云金芽孢杆菌的菌落数情况可以看出，堆肥中的苏云金芽孢杆菌菌落数高于土壤对照，由于l0^-4倍浓度下的土壤中和l0^-5、l0^-6的浓度下堆肥和土壤中的菌落数均少于30个，因此无法进行统计计数。

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150 μl 不同浓度的各种微生物过滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标。实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%。

其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。

本发明所制备的苏云金芽孢杆菌与从生活垃圾堆肥所所制备的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的相同，故未保藏。

关于苏云金芽孢杆菌的鉴定结果

在牛肉膏蛋白胨培养基上挑取与苏云金芽孢杆菌相似的菌落，发现在培养基上形成的菌落为圆形，白色，边缘光滑，不透明，革兰氏染色为阳性，菌体在显微镜下观察呈椭圆形杆状，芽孢为椭圆形，用溴酚蓝和番红染液进行伴胞晶体染色，镜下观察到有红色菌体，无色芽孢以及蓝色伴孢晶体，初步鉴定其为苏云金芽孢杆菌（与市售的相同）。

细菌的生理生化实验结果

将初步鉴定为苏云金芽孢杆菌的菌株定为待测菌株，对其进行生理生化实验的检测，得到结果如下表：细菌的生理生化实验结果

对待测菌株进行了生理生化测试，结果如上表所示。待测菌株为革兰氏阳性，过氧化氢酶阳性，V.P反应阳性，葡萄糖发酵产酸，水解淀粉、明胶，都能利用柠檬酸盐。

待测菌株的显著特点是：待测菌株对D-木糖不发酵产酸，对D-甘露醇不发酵产酸，不产气。根据以上实验结果，进一步鉴定待测菌株为苏云金芽孢杆菌（与市售的相同）。将菌株纯化保存，以备后续实验使用。

本发明更加详细的试验方法如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

生活垃圾堆肥来自天津小淀垃圾堆肥处理厂，草坪植物选择高羊茅（Tall fescue），供试土壤取自天津师范大学校园内深度为5-15cm表层土壤，土壤质地为砂质粘土，其性质为：pH 7.44，有机质含量4.68％，全氮0.21％，有效磷22.03mg·kg^-1，饱和含水量0.58ml·g^-1。

1.2 实验方法

实验用苏云金芽孢杆菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液。取一部分原液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用。

2.各项指标的测定

2.1幼苗生长指标测定

发芽后每5d测定1次株高，播种30d后刈割，测定地上鲜重和干重、根长、须根数及根干重以及叶绿素。方法为：使用解剖剪子将草坪植物齐根剪下，用电子天平先对其进行鲜重的测定，然后将草坪植物地上部分先置于烘箱中105℃条件下杀青1h，80℃烘干至恒重，测量地上部的干重。洗净每个培养皿中的土壤，随机抽取20株的根，测量须根数和根长，然后将根置于烘箱中105℃条件下杀青1h，80℃烘干至恒重，测量根的干重。测定叶绿素含量测定。

3 统计分析

数据分析采用Excel 2003和SPSS 17.0统计分析软件进行分析。

4 研制结果分析

4.1 微生物的生长曲线

由图1可知，苏云金芽孢杆菌的生长延迟期，2～8 h 为对数生长期，8～12 h 为稳定期，12 h 以后为衰亡期，应采用8～12 h时的菌液作为菌种。

4.2 微生物发酵滤液的浓度

取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算出的每mL菌液中的活菌数作为微生物发酵滤液的浓度（见表1）。

表1 不同微生物发酵滤液的浓度（CFU/mL）

4.3堆肥微生物发酵滤液对高羊茅株高的影响

对照高出了16.0%，16.9%，17.9%；稀释8倍的发酵滤液在播种后第20d，第25d和第30d对株高的影响分别比对照高出了10.7%，13.0%，14.0%，稀释4倍发酵滤液的影响仍然为最显著。

苏云金芽孢杆菌对高羊茅株高的初期生长没有明显的促进作用（表2），但在播种后第20d，稀释4倍和稀释8倍的发酵滤液对株高有显著影响（p <0.05），尤其是用稀释8倍的发酵滤液处理的实验组，更能显著地促进高羊茅的生长，分别比对照提高了18.7和15.3%。随着时间的推延，稀释4倍和稀释8倍的发酵滤液对株高的促进作用基本稳定不变。

表2 不同浓度的堆肥微生物发酵滤液对幼苗株高的影响（厘米）

abc代表多重比较的结果（p < 0.05）

4.4 堆肥微生物发酵滤液对高羊茅地上生物量的影响

用稀释4倍和稀释8倍的苏云金芽孢杆菌发酵滤液处理的实验组地上部分鲜重分别增加了54%和44%。

表3 不同浓度的堆肥微生物发酵滤液对高羊茅地上部生物量的影响（克/皿）

abc代表多重比较的结果（p < 0.05）

4.5堆肥微生物发酵滤液对高羊茅幼苗根系生长的影响

稀释4倍的放线菌发酵滤液能明显促进高羊茅根系的生长（表4.4）。当用稀释4倍的放线菌发酵滤液处理时，根重比对照增加67%；须根数是对照的1.2倍，根冠比也是对照的1.5倍；用原浓度的放线菌发酵滤液处理的实验组的须根数是对照的1.2倍；用稀释8倍的放线菌发酵滤液处理的实验组的根冠比是对照的1.4倍。同对照相比，用稀释8倍的枯草芽孢杆菌发酵滤液和原浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液处理的实验组，其根长分别增加了23.6%和26.4%。其余浓度的微生物发酵滤液对高羊茅根系的生长则无明显的促进作用（p >0.05）。

表4 不同浓度的堆肥微生物发酵滤液对幼苗根系的影响

abc代表多重比较的结果（p < 0.05）

4.6堆肥微生物发酵滤液对高羊茅叶绿素含量的影响

苏云金芽孢杆菌发酵滤液对叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素含量最显著的影响均是在稀释8倍的浓度下，分别高出对照52.8%，53.5%和53.0%。

表5 不同浓度的堆肥微生物发酵滤液对高羊茅叶绿素含量的影响(毫克/克鲜重)

abc代表多重比较的结果（p < 0.05）

5 研制结论

在本研究中，不同浓度的堆肥微生物对高羊茅初期生长均有一定的促进作用，其中以稀释4倍的放线菌发酵滤液影响最为显著，除了对高羊茅地上干重，根长和干鲜比无明显影响外，其对高羊茅萌发和初期生长的各项指标均有显著的促进作用；稀释4倍和稀释8倍的枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌发酵滤液也对高羊茅的株高，地上鲜重，地下干重和叶绿素含量等指标有明显的促进作用；虽然三种微生物的原浓度的发酵滤液对高羊茅的株高和叶绿素也有一定影响，但与稀释后浓度的处理组相比，影响效果较差，这可能与发酵滤液的浓度过高有关。上述研究表明，通过加入适宜浓度的堆肥微生物发酵滤液，对草坪草高羊茅的初期生长有积极地促进作用。

实验过程中为了保证每个处理一致，采用搭建塑料棚防水，棚的高度约为1 m，棚覆可活动式透明塑料薄膜，晴天移开塑料薄膜，以使植物可充分接受阳光，雨天覆盖薄膜，防止雨水过量影响土壤基质中的含盐量。

附图说明：

图1为苏云金芽孢杆菌的生长曲线；

图2为苏云金芽孢杆菌菌落照片。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）有市售，也可以根据实施例1的方法加以获得，从生活垃圾堆肥所得到的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的相同。所采用的牛肉膏蛋白胨固体培养基有市售。平板培养基为：高氏一号的培养基也有市售。

实施例1

(1)苏云金芽孢杆菌的分离：

2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；

其中苏云金芽孢杆菌的菌落数（个）

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养8～12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150 μl 不同浓度的各种微生物过滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标。实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%。其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。

实施例2

1）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将购买的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，向土中加入150 μl 不同浓度的各种微生物过滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标。实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%。

本发明在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims

1. 一种苏云金芽孢杆菌发酵液对高羊茅生长的调节方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）苏云金芽孢杆菌的分离：

将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90mL无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取l mL母液，加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混匀，此为l0^-1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天；

2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：

A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养二代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；

其中的纯化培养二代指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代；

B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养8～12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22μm的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；

3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：

取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；

4）苏云金芽孢杆发酵液对高羊茅生长的调节方法：

在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150 μL不同浓度的各种微生物过滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项萌发指标，实验时室温平均为18℃，湿度平均为40%。