CN102911874A - 一种红色糖多孢菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)新菌株BJX001,其保藏编号为CGMCC No.4767。本发明还提供了通过发酵红色糖多孢菌BJX001可以得到红霉素的应用。实验证明,本发明的菌株其发酵方法生产红霉素A组分的能力强,生产红霉素的化学效价可达10000μg/mL发酵液,且本发明菌株连续传5代后其生产红霉素有效组分A的能力保持原水平,表明其遗传稳定性好,能够提高生产红霉素的效率,而且方法简单、成本低廉,适合于在红霉素的生产中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域,具体地,涉及一种红色糖多孢菌及其在发酵生产红霉素中的应用。
背景技术
红霉素为大环内酯类抗生素,具有与青霉素类似的抗菌谱,特别对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性,是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物。其作用机制主要是与核糖核蛋白体的50S亚单位相结合,抑制肽酰基转移酶,影响核糖核蛋白体的移位过程,妨碍肽链增长,抑制细菌蛋白质的合成,从而起到抑菌作用。红色糖多孢菌在发酵过程中会产生A,B,C三个组分,其中A组分活性最强,所占比例也最大,根据菌种特性的不同比例约在60%~80%。B和C两个组分活性较差,且具有一定毒性,所占比例因菌种不同而已,比例在10%以内,一般为3%~5%。
目前国内拥有红霉素原料药批文的企业近40家,其主要下游产品硫氰酸红霉素的生产厂家已近30家,2007年国内年产硫氰酸红霉素可达8000吨以上。红霉素衍生物阿奇霉素、琥乙红霉素、罗红霉素、克拉霉素等产量逐年增加,销售额不断上升,预计今后仍有广阔的发展空间。随着市场对红霉素衍生品的大量需求,红霉素原药需求量也将逐年增大。在激烈的市场竞争中,生产菌种本身质量是占据行业优势的决定性因素,因为高产菌种在不增加任何生产成本(原料、动能、人员等)的情况下即可大幅度提高产量。目前国外红霉素发酵水平明显高于国内,我国于1958年开始试制红霉素,1965年开始在上海第三制药厂正式投产,当时发酵单位不足3000μg/mL。后来经过 多年的菌种选育及工艺优化,发酵单位逐渐提高,目前国内平均发酵单位可达8000μg/mL,但与目前国际上的18000μg/mL仍然有较大的差距,较低的发酵单位仍是限制我国红霉素发酵工业发展的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的应用,以提高我国红霉素发酵行业的红霉素发酵效率。
本发明提供的菌株BJX001,该菌株于2011年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.4767,分类命名为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)。
红色糖多孢菌菌株BJX001形成紧密螺旋形的孢子链,孢子呈球形或卵圆形,表面光滑。在蔗糖硝酸盐琼脂培养基中,气丝厚,白色至淡粉色,基丝微黄色,后变红色,无可溶色素;在营养琼脂培养基中,基丝乳脂色,无可溶色素。
本发明提供了一种通过发酵红色糖多孢菌BJX001制备红霉素的方法,包含培养和发酵两个阶段:
(1)将红色糖多孢菌BJX001接种于斜面菌种培养基中,置于35~37℃,55%~65%湿度的培养箱中静止培养144~192小时;
(2)从培养成熟的斜面菌种培养基中挖取面积约1cm2大小的菌苔接种于发酵培养基中,在温度为30~34℃的条件下,振荡培养,相对湿度为50%~60%,培养46~50小时后,向发酵培养基中一次性补加过滤除菌的正丙醇,使其质量百分比终浓度为1.0%,控制发酵时间在168~216小时内,得到红霉素。
为了防止发酵液因过多蒸发而浓缩,造成发酵单位虚高,保持发酵过程中所述环境相对湿度为50%~60%。
上述振荡转速优选220r/min,发酵时间优选192小时。
本发明菌种培养基组份为:玉米淀粉10~14g/L,玉米浆5~7g/L,七水硫酸镁0.8~1.2g/L,碳酸钙2.5~3.5g/L,琼脂粉20~24g/L,余量为水,灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至7.0~7.4。
本发明菌种培养基组分优选为:玉米淀粉12g/L,玉米浆6g/L,七水硫酸镁0.1%1g/L,碳酸钙3g/L,琼脂22g/L,余量为水,灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至7.2。
本发明发酵培养基组份为:玉米淀粉40-60g/L,黄豆饼粉16-24g/L,玉米浆(其中干物质含量为30%-60%)8-12g/L,酵母粉4-6g/L,磷酸二氢钾0.4-0.6g/L,氯化钠4-6g/L,豆油4-6g/L,碳酸钙4-6g/L,余量为水,灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至6.5-7.5。所述浓度均为在发酵培养基中的终浓度。
本发明发酵培养基组份优选为:玉米淀粉50g/L,黄豆饼粉20g/L,玉米浆10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钠5g/L,豆油5g/L,碳酸钙5g/L,余量为水,灭菌前pH调节为7.0。
本发明添加正丙醇的终浓度为10mL/L。
本发明发酵液化学效价的测定方法是:预估发酵液产量之后将其稀释至300-500μg/mL范围,加入碳酸钾与醋酸丁酯进行萃取,取有机相调酸,取水相进行温水浴,将水浴的后的溶液进行紫外分光光度计比色,得到的吸光度带入线性公式计算发酵效价。
实验证明,本发明的菌株生产红霉素的能力强,其发酵液的化学效价可达10000μg/mL,而且本发明菌株连续传5代后其生产红霉素的能力仍保持原来水平,表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备红霉素的方法,能够提高生产红霉素的效率,而且方法简单、成本低廉。因此,本发明菌株及制备红霉素的方法适合于在红霉素的生产中推广应用。
附图说明
图1是红色糖多孢菌菌落形态图;
图2是红色糖多孢菌种子成熟时显菌丝体形态图;
图3是红色糖多孢菌发酵60小时菌丝形态图;
图4是红霉素标准品高效液相色谱图,其中组分A保留时间为5.257min,面积为3428639;B组分保留时间为3.147min;C组分保留时间为7.889;
图5是红霉素样品高效液相色谱图,其中组分A保留时间为5.260min,面积为3380373.2;B组分保留时间为3.115min,峰面积为311;C组分保留时间为7.808,峰面积为83715.8。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1菌株的分离及鉴定
1、菌株的分离
从黑龙江省宁安市随机采集泥土样品。将冷冻保藏的泥土样品梯度稀释,每个稀释度涂布2-3块双碟培养基,34℃培养2-6周,培养时将双碟放置在湿润的纱布上面,保持一定的湿度,防止双碟干燥;之后,每2-3天用相差显微镜观察一次双碟生长情况,将长出的微生物菌落转接至新双碟(如发现微小菌落不再生长及时将菌落挑入液体10%LB培养基静止培养2周左右时间,待液体内长出菌丝后,该菌已经复苏再进行双碟划线),划线,进行形态观察。
2、菌株的鉴定
红色糖多孢菌是好氧型革兰氏阳性放线菌,气生菌丝为粉黄色,营养菌丝为黄色到黄褐色,产灰色或灰白色孢子。孢子呈球形或卵圆 形,表面光滑。在蔗糖硝酸盐琼脂培养基中,气丝厚,白色至淡粉色,基丝微黄色,后变红色,无可溶色素;在营养琼脂培养基中,基丝乳脂色,无可溶色素。菌体生长温度为25-38℃。本发明分离的菌株其生长特性和形态均符合红色糖多孢菌。
菌落的形态如图1所示,种子菌丝形态如图2所示。
通过PCR扩增该菌的16SrDNA,PCR所用的引物序列为:
正向引物:CGACAGTCATTGTTGGAGAG
反向引物:TGCTCCTTAGAAAGGAGGTG。
将PCR产物进行凝胶电泳,发现与目的条带大小相同,为1542bp。测序后发现,该菌与红色糖多孢菌的16S序列相同,鉴定为红色糖多孢菌。
综上鉴定结果,本发明菌株为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea),将该菌株命名为BJX001。菌纯化后进行保藏入新菌种库。从菌种库中进行活性筛选,得到本发明具有活性的红色糖多孢菌菌株。
该菌株于2011年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCCNo.4767,分类命名为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)。
实施例2发酵生产红霉素
菌种培养基的配备
1、培养基配方:玉米淀粉12g/L,玉米浆6g/L,七水硫酸镁1g/L,碳酸钙3g/L,琼脂22g/L,余量为水,灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至7.2。
2、配制方法:先向1L烧杯中加入蒸馏水700mL,置于带有石棉网的电热板上加热,称取玉米淀粉12g以100mL水溶解,待蒸馏水加 热至70-80℃左右时,将溶解的淀粉溶液缓缓注入蒸馏水中,并以玻璃棒匀速搅拌,以免淀粉因迅速受热而板结,待淀粉溶液澄清后,将烧杯浸入冷水中冷却。分别称取相应量玉米浆、七水硫酸镁加入50mL烧杯中,以30mL蒸馏水溶解后加入冷却的玉米淀粉液中,搅拌均匀。冷却至室温后定容至1L,以10%氢氧化钠溶液调pH至7.2。向调解pH值后的培养基中加入相应量的碳酸钙及琼脂。充分搅拌均匀后分别装入1000mL的三角烧瓶中,每瓶500mL,依次用2层棉垫,牛皮纸,线绳包扎好后放入灭菌锅内,以0.1MPa,121℃的高压蒸汽灭菌锅灭菌30分钟,待培养基温度降到45℃~50℃时进入无菌室内的超净工作台上,按无菌操作向无菌双碟中倒入25~30mL的培养基,凝固后可做分离菌种使用。
另外,还可以将上述培养基制成茄瓶固体斜面:在每个茄瓶(250mL)内分装入80mL培养基,再依次用棉塞、2层纱布、牛皮纸、线绳包扎好后放入灭菌锅内,以0.1MPa,121℃的高压蒸汽灭菌30min,待培养基温度降到45℃~50℃时,取出茄瓶,在操作台上摆成斜面,凝固后备用。
发酵培养基的配备
培养基配方:玉米淀粉50g/L,黄豆饼粉20g/L,玉米浆10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钠5g/L,豆油5g/L,碳酸钙5g/L,余量为水,灭菌前pH调节为7.0。
配制方法:将称好的玉米淀粉,按照配制固体培养基的方法液化到透明后,置于冷水中冷却至室温,分别将黄豆饼粉,酵母粉,玉米浆,磷酸二氢钾,氯化钠,豆油按相应量称取,加入小烧杯中,以少量水充分溶解后加入液化好的玉米淀粉中,搅拌均匀后调pH至7.0,加入相应量的碳酸钙搅匀后,分装入250mL三角烧瓶中,每瓶装入量为35mL,然后依次用8层纱布垫,牛皮纸,线绳包扎好后放入灭菌锅内,以0.1MPa,121℃的高压蒸汽灭菌30min。取出放入无菌缓 冲间中自然冷却,备用。
发酵生产
1)菌种活化
将红色糖多孢菌BJX001菌种冻存管自-80℃菌库中取出后,自然解冻至室温。以无菌移液器吸取0.5mL菌悬液加入准备好的斜面培养基中,以接种环涂布均匀,置于温度36℃,湿度50%的培养箱中静止培养168小时左右。
2)菌种分离。
从成熟的活化菌种斜面中挖取1cm2左右的菌苔,放于带有玻璃珠的无菌水三角瓶中,220r/min,震荡10min。将震荡后的孢子悬浮液进行10倍梯度稀释,之后将各稀释梯度的悬浮液进行涂布平板涂布,150μL/平板。将平板倒置于36℃,湿度50%的培养箱中静止培养。
3)斜面培养。
选择合适浓度的涂布平板(每平板20-30个菌落),以无菌环挑取单菌落,接种于事先准备的茄瓶培养基中,以“之”字形线路涂布均匀,置于36℃,50%湿度的培养箱中静止培养168小时左右。
4)摇瓶培养。
从培养成熟的斜面菌种中挖取面积约1cm2大小的菌苔接种于事先准备好的发酵培养基中,置于220rpm的摇床上培养,培养温度32℃,湿度60%。培养至48小时,向摇瓶中一次性补加过滤除菌的正丙醇(纯度为50%)使终浓度达到10mL/L,之后继续培养192小时,放瓶检测产量。
实施例3红霉素的提取及产量检测。
1、化学法检测。
1)试液及配制:
A.0.35%碳酸钾:称取35g碳酸钾溶于10000mL水中,摇匀。
B.醋酸丁酯:透明清亮的工业丁酯。
C.0.1mol/L盐酸:90mL盐酸用水稀释至10000mL,摇匀。
D.8mol/L硫酸:450mL硫酸缓缓倒入550mL水中,搅匀,冷却后,标定。
2)标准曲线的绘制:
A.精密称取红霉素标准品适量,加少量乙醇溶解,用蒸馏水稀释至100mg/mL。
B.准确量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于试管中,分别用水稀释至5mL,再加8mol/L的硫酸5mL,摇匀,于50℃水浴中保温30分钟。
C.冷却后,用721型分光光度计483nm处比色。
D.以同样溶剂作空白,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标作标准曲线,求出线性方程,绘制标准曲线表,见表1。
表1标准曲线表
吸光度平均值 | 红霉素含量ug/mL |
0.054 | 100 |
0.114 | 200 |
0.173 | 300 |
0.235 | 400 |
0.293 | 500 |
E.标准曲线方程:
Y=1669.3X+9.8716(R2=0.9999)
其中:X为吸光值,Y为红霉素含量。
3)发酵液效价测定
A.取发酵液10mL,4000rpm离心10分钟。
B.吸取适量滤液用0.35%的K2CO3溶液稀释至标准曲线范围中点浓度,稀释至发酵单位在300ug/mL左右。
C.吸取发酵稀释液2mL于装有8mL 0.35%的K2CO3分液漏斗中, 摇匀后加入醋酸丁酯10mL,振摇30秒,静置分层,弃去下层液。
D.加无水Na2SO41g,振摇脱水至透明。
E.取脱水上层液5mL于另一分液漏斗中,准确加入0.1mol/L的HCl10mL,振摇30s,静置分层。
F.吸取下层液5mL放入另一干燥试管,加入8mol/L的H2SO45mL,摇匀,于50℃水浴中保温30min。
G.以同样溶剂作空白,483nm处721型分光光度计上比色测定,读其吸收度,根据吸收度查标准曲线表,乘以稀释倍数即得。
H.计算公式:红霉素效价=稀释倍数×(1669.3X+9.8716)其中:X为实际测得吸光度值。
4)结果实验设三次重复,结果取平均值,结果表明红霉素化学效价为10000μg/mL。
2、生物法检测。
1)准备:
A.培养基:
培养基组成为:蛋白胨5g/L,牛肉粉3g/L,磷酸氢二钾3g/L,琼脂粉20g/L,消前调解pH至8.0。115℃,灭菌30min。
B.磷酸盐缓冲液(pH7.8):
磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,加水定容至1000mL,115℃,灭菌30min。
C.菌悬液制备:
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus,CMCC(B)63202)于营养琼脂培养基中35~37℃培养7天,革兰氏染色涂片镜检,芽孢比例85%以上方可使用。无菌水将芽孢洗下,65℃加热30min,杀死非芽孢杆菌,4℃保藏备用。
D.标准品溶液制备:
精密称取标准品适量,加入乙醇溶解后,用无菌水制备成1000μg/mL的标准品母液,再将母液以磷酸盐缓冲液稀释至100μg/mL的标准品溶液。
E.双碟制备:
注入20mL融化的培养基,使其在碟底内均匀摊布,放置于水平台上凝固,作为底层。取少量培养基适量加热融化后,放冷到48~50℃,加入规定的实验菌悬液(产生抑菌圈在18mm左右为宜),摇匀,在每一个双碟中分别加入5mL,涂布均匀,作为菌层。放置水平台上冷却后,在每一个双碟中以等距离均匀安置牛津杯(内径6mm±0.1mm,高10mm±0.1mm,外径7.8mm±0.1mm),用陶瓦圆盖覆盖备用。
2)检测方法:
A.标准品溶液制备。取标准品溶液10mL,分别用无菌磷酸盐缓冲液稀释成10μg/mL,20μg/mL的标准品溶液。
B.供试品溶液制备:精密量取适量发酵滤液,用无菌水制备成供试品母液,取母液10mL,以无菌磷酸盐缓冲液稀释成100μg/mL,20μg/mL,10μg/mL的供试品溶液。
C.按照上述方法制备的双碟不得少于4个,在每个双碟中对角的2个牛津杯中分别加入高浓度和低浓度的标准品溶液,其余2个牛津杯中分别加入相应的供试品溶液,滴加完毕后,以陶瓦盖覆盖,在35~37℃培养箱中培养14~16小时。测量各个抑菌圈的直径(或面积),按照生物检定法进行可靠性测验及效价计算。
D.效价计算。计算公式如下:
试中:
P为供试品效价(相当于估计效价的百分数);
S2为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径(面积)的总和;
S1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径(面积)的总和;
T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径(面积)的总和;
T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径(面积)的总和;
I为高、低剂量之比的对数值,2∶1是,I=0.301;4∶1时,I=0.602。
3)结果。实验设三次重复,结果取3次平均值,结果表明生物效价为8534μg/mL。
实施例4高效液相色谱法检测各组分含量
1)样品制备:取红霉素样品约0.1克(精确到0.0001克),以5mL甲醇进行彻底溶解,以磷酸盐缓冲液(pH=7)∶甲醇=15∶1溶液定量稀释成浓度约为4000μg/mL的供试液,取适量体积供试液以0.45μm针式过滤器过滤后,等待检测。
2)检测方法:采用型号高效液相色谱仪;150mm×4.6mm(id)不锈钢C18,5μm液相色谱柱;用C18反相柱,柱温35℃,流速1.0mL/min,以磷酸缓冲盐(pH8.2)∶乙腈(体积比为2∶3)为流动相进行分离,进样量20μl,利用紫外检测器在215nm波长下进行检测。在此色谱条件下红霉素A、B、C标准品各组分图谱4。将供试液进行高效液相色谱检测,色谱图5。根据保留时间计算各组分峰面积值,峰面积,计算各组分产量。
3)根据药典II得计算公式:
a)A组分含量=标准品质量×标准品含量×样品A组分峰面积÷标准品A组分峰面积÷样品质量×100%
b)B组分含量=A组分含量×样品B峰面积÷样品A峰面积×0.7×100%
c)B组分含量=A组分含量×样品C峰面积÷样品A峰面积×0.7×100%
4)结果实验设三次重复,计算得红霉素A组分含量为77.19%,B组分含量为4.18%,C组分含量为1.91%。表明本发明提供的菌株和发酵方法生产红霉素A组分的能力强。
实施例5传代稳定性实验
按照实施例2方法制作茄瓶固体斜面培养基,将菌株BJX001自母斜面转接至空茄瓶固体斜面培养基中,按实施例2中斜面培养工艺进行培养。待斜面成熟后按以上步骤重新转接下一代斜面,并将成熟的斜面放置于4℃冰箱中保藏备用。依次进行至第5代斜面,之后将前5代斜面同时进行传代,便可同时得到新鲜的5代斜面。将所得到的5代新鲜斜面,按照实施例2中摇瓶培养工艺进行发酵。按照实施例3的方法进行效价检测,每代斜面设3个重复。经检测,结果见表2。
表2培养代数化学效价均值
代数(代) | 效价平均值(μg/mL) |
I | 10756 |
II | 9865 |
III | 11024 |
IV | 9754 |
V | 10359 |
VI | 10038 |
实施例6红色糖多孢菌L0319发酵结果
以国内现有菌种红色糖多孢菌L0319进行摇瓶发酵,发酵工艺按实施例2进行,提取及产量检测按实施例3进行,实验设三次重复取平均值,结果表明该菌种的化学效价为7547μg/mL,生物效价为6415μg/mL。
以上述发酵得到的红霉素发酵液,按照实施例4进行高效液相检测,结果表明该菌种的A组分含量为69.7%,B组分含量为5.24%,C组分含量为7.35%。这一结果说明,本发明的红色糖多孢菌BJX001发酵生产红霉素的化学效价和生物效价(实施例3的结果)均高于国内现有菌种红色糖多孢菌L0319。
Claims (10)
1.红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)BJX001,其保藏号为CGMCC No.4767。
2.权利要求1所述的菌株在制备红霉素中的应用。
3.一种制备红霉素的方法,该方法用权利要求1所述菌株发酵生产红霉素。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)将红色糖多孢菌BJX001接种于斜面菌种培养基中,置于35~37℃,55%~65%湿度的培养箱中静止培养144~192小时;
(2)从培养成熟的斜面菌种培养基中挖取面积约1cm2大小的菌苔接种于发酵培养基中,在温度为30~34℃的条件下,振荡培养,相对湿度为50%~60%,培养46~50小时后,向发酵培养基中一次性补加过滤除菌的正丙醇,使其质量百分比终浓度为1.0%,控制发酵时间在168~216小时内,得到红霉素。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的菌种培养基组份为:玉米淀粉10~14g/L,玉米浆5~7g/L,七水硫酸镁0.8~1.2g/L,碳酸钙2.5~3.5g/L,琼脂粉20~24g/L,余量为水,pH 7.0~7.4。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的菌种培养基组份为:玉米淀粉12g/L,玉米浆6g/L,七水硫酸镁0.1g/L,碳酸钙3g/L,琼脂粉22g/L,余量为水,pH 7.2。
7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的发酵培养基组份为:玉米淀粉40~60g/L,黄豆饼粉16~24g/L,玉米浆8~12g/L,酵母粉4~6g/L,磷酸二氢钾0.4~0.6g/L,氯化钠4~6g/L,豆油4~6g/L,碳酸钙4~6g/L,余量为水,pH 6.5~7.5。
8.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的发酵培养基组份为:玉米淀粉50g/L,黄豆饼粉20g/L,玉米浆10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钠5g/L,豆油5g/L,碳酸钙5g/L,余量为水,pH 7.0。
9.如权利要求4所述的方法,其特征在于,添加正丙醇的终浓度为10mL/L。
10.如权利要求4所述的方法,其特征在于,其中步骤2)所述温度为32℃,所述振荡培养的转速为200~250r/min,旋转半径为50mm,发酵周期为192小时。
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