CN1876822B - 他克莫司的产生菌株及生产方法 - Google Patents
他克莫司的产生菌株及生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1876822B CN1876822B CN200510026504A CN200510026504A CN1876822B CN 1876822 B CN1876822 B CN 1876822B CN 200510026504 A CN200510026504 A CN 200510026504A CN 200510026504 A CN200510026504 A CN 200510026504A CN 1876822 B CN1876822 B CN 1876822B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tacrolimus
- streptomyces
- streptomycete
- culture
- powder
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株新的大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的产生菌株及生产方法。本发明通过发酵培养微生物菌株链霉菌(Streptomyces sp.4908)CGMCCNo.1288，得到含有他克莫司的发酵液。本发明的他克莫司产生菌的发酵液中发酵产物他克莫司的浓度高、因而可进行工业化生产。
Description
技术领域
本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种大环内酯类强效免疫抑制剂他克莫司的产生菌及其生产方法。
背景技术
他克莫司(tacrolimus)又称FK-506，是日本藤泽药品株式会社(Fujisawa制药有限公司)的研究人员1984年从日本筑波地区土壤中一株链霉菌株streptomyces tsukubaensis的发酵产物中分离出来的大环内脂类抗生素(红霉素族)，具有强效免疫抑制作用，藤泽公司于1991年12月完成日本新药申请，1993年4月获得认可，同年6月完成欧美新药申请，并于1999年正式批量上市，商品名为普乐可复(prograft)。目前已知，他克莫司分子式为C44H69NO12·H2O，分子量822.05，几乎不溶于水，易溶解于乙醇、甲醇、丙酮和氯仿，其化学命名为：17-烯丙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环已基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，9，21，27-四甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环[22.3.1.0]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮，它在化学结构上分为两个部分：与亲免疫蛋白结合的结合区段和结合后发挥免疫抑制效应的药效区段，并显示出左旋光学活性，含有L-六氢吡啶羧基和三个双重结合键，形成一个圆环状23元大环内酯。
他克莫司具有与环孢霉素A(CsA)相似而更广泛的免疫抑制作用，但效力比CsA，而且毒副作用比CsA更少。他克莫司在临床中主要应用于器官移植和治疗自身免疫性疾病，它的作用机制是通过与FKBP(FK506结合蛋白)结合后，阻遏IL-2，IL-2受体、γ-干扰素((IFN-γ)等的基因的转录，从而抑制T细胞的增殖，它还可以抑制免疫反应的早期淋巴细胞聚集，并阻止已聚集的淋巴细胞对其他炎症细胞的吸引，另外它还通过抑制T细胞衍生生长因子而影响B细胞生长和抗体形成，引起免疫抑制，因此他克莫司不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防治器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。
目前有关他克莫司的生产制备的文献报道并不多，主要有美国专利U.S.4,894,366和U.S.4,929,611公开了产他克莫司的菌株Streptomyces tsukubaensis No.9993和Streptomyceshydroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238及他克莫司的提取过程，美国专利U.S.5,116,756和U.S.5,194,378公开了产他克莫司的菌株Streptomyces sp.，(MA 6858)ATCC No.55098及他克莫司的提取过程。在上述报道中，通过微生物发酵得到他克莫司浓度最低为10.5μg/ml，其中专利U.S.5,116,756和U.S.5,194,378所公开的菌株Streptomyces sp.，(MA6858)ATCC No.55098发酵产他克莫司浓度最高可达37.8μg/ml
由此可知，目前他克莫司制备存在的不足在于菌株发酵单位不高，技术水平还满足不了工业化生产的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有他克莫司生产技术的不足，从而提供一种能够工业化实施的生产工艺，具体为通过发酵培养链霉菌(Streptomyces sp4908)，得到含他克莫司浓度较高的发酵液。所述发酵培养用链霉菌(Streptomyces sp4908)已于2005年1月18日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1288。
为达到上述目的，本发明的具体实施过程如下：
有关该微生物的一些细节如下：
(1)来源和保藏
本发明的发明者从浙江临安地区的土壤中分离得到一株微生物菌株，经过分类鉴定命名为链霉菌streptomyces sp.4908，其保藏号为CGMCC No.1288。经过长期的育种和改良，该菌株具有较高的产他克莫司水平。
(2)部分细菌学特性
(a)形态特性
链霉菌streptomyces sp.4908(CGMCCNo.1288)革兰氏染色为阳性，在高氏合成一号琼脂和Bennett’s琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝，孢子丝直或柔曲。
(b)培养特征：
链霉菌streptomyces sp.4908(CGMCCNo.1288)菌株的培养特征见表1
表1、链霉菌streptomyces sp.4908的培养特征
| 培养基 | 气生菌丝 | 基内菌丝 | 可溶色素 |
| 高氏合成一号琼脂 | 浅浅灰 | 无色 | 无 |
| ISP4琼脂 | 浅灰 | 无色 | 无 |
| 甘油天门冬琼脂 | 弱，烬灰色 | 无色 | 无 |
| GYM琼脂 | 灰白 | 褐黄 | 无 |
| Bennett‘s琼脂 | 灰白 | 污黄 | 浅橙 |
| ICM42培养基 | 灰白 | 橙黄，局部橙红 | 浅黄 |
(c)细胞型化学组分分析
链霉菌streptomyces sp.4908(CGMCCNo.1288)菌株的全细胞水解液含有L，L-DAP(L，L-二氨基庚二酸Diaminopimelic acid)。无特征性糖；细胞壁属于I型，糖型C。
(d)生理生化特性
链霉菌streptomyces sp.4908(CGMCCNo.1288)菌株的生理生化特性见表2
表2、链霉菌streptomyces sp.4908菌株的生理生化特性
(e)16SrDNA序列分析
16SrDNA序列分析：用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后直接用Taq Deoxy Terminator CyeleSequencing Kit测序，电泳及数Applied Biosystems DNA Sequencer(model377)自动进行。所测的16SrDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较，菌株streptomyces sp.4908(CGMCCNo.1288)的16SrDNA序列与已注册的链霉菌序列均有较大差别，最高同源性为97.4％。
(3)与其他专利报道菌株的比较
表3、Streptomyces，sp.4908菌株与其他专利报道菌株的比较
| 相关专利菌株 | 生理生化特性 | 专利号 |
| Streptomyces tsukubaensisNo.9993 | 淀粉液化阴性，产生硫化氢，不产生黑色素，可利用蔗糖，麦芽糖，棉籽糖，D-果糖 | US5830717US5624842US5565559 |
| 相关专利菌株 | 生理生化特性 | 专利号 |
| Streptomyces sp.，(MA6858)ATCC No.55098 | 淀粉液化阴性，不产生硫化氢，可利用棉籽糖，D-果糖，乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖，甘露糖 | US5116756US5194378 |
| Streptomyceshydroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238 | 淀粉液化阴性，产生硫化氢，不产生黑色素，可利用蔗糖，麦芽糖，棉籽糖，D-果糖 | US5496727US5830717 |
| Streptomyces，sp.4908(CGMCCNo.1288) | 淀粉液化阴性，产生硫化氢，可利用葡萄糖，丁二酸盐 | 本专利申请 |
(4)发酵生产他克莫司
(a)斜面培养：斜面培养基为(W/W％)：燕麦片5.0(煮沸30分钟过滤取汁)，蔗糖2.0，琼脂2.0，pH自然。
培养基配制后装入试管(18×180mm)，每支装入15毫升，塞上棉花塞子，121℃消毒20分钟后，待稍冷却搁成斜面备用。
将Streptomyces，sp.4908(CGMCCNo.1288)菌种接于斜面后，将接种后的斜面放置在20-40℃恒温培养室内或生化培养箱内培养5～7天后取出放4℃冰箱保存备用。
(b)摇瓶培养：摇瓶培养采用二级发酵培养工艺。
种子培养工艺：在250毫升三角瓶中装入适量的培养基(10-40毫升)，灭菌后接入一定量的斜面菌种，在20-40℃恒温培养室内，置旋转式摇床(100-300rpm)上培养30-72小时，得种子液，备用。
发酵培养工艺：在250毫升三角瓶中装入适量的培养基(10-40毫升)，灭菌后接入3～10％(V/V％)的种子液，在20-40℃恒温培养室内，置旋转式摇床(100-300rpm)上培养72～150小时，得他克莫司发酵液供提取备用。
其中，种子培养基组成(W/W％)：可溶性淀粉：1.0；酵母粉：0.5；葡萄糖：0.5；NaCl：0.05；K2HPO4：0.05；KH2PO4：0.05；玉米浆：0.5；甘油：1.0；PH：7.2；CaCO3.：0.2(调好PH后加入)。
发酵培养基组成(W/W％)：玉米淀粉：1.5；葡萄糖：2.0；黄豆饼粉：1.0花生粉；1.5；酵母粉：0.2；NaCl：0.2；K2HPO4：0.5；PH：7.2。
本发明通过培养能够产生他克莫司微生物新菌株Streptomyces，sp.4908(CGMCCNo.1288)或其变异株，得到含有较高浓度他克莫司的发酵液，其通过发酵罐得到的发酵液的他克莫司平均浓度达到了150μg mL-1。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面通过实施例予以进一步说明。
以下实施例所使用的菌种为链霉菌streptomyces sp.4908，已于2005年1月18日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1288。以下实施例中所列的百分比浓度均为重量百分比。
实施例1
分别配制摇瓶发酵培养基A、B、C、D、E，其中培养基组成(％)如下：
A：玉米淀粉1.5；酵母粉0.2；葡萄糖2.0；NaCl0.2；K2HPO40.5；黄豆粉1.0；花生粉1.5；pH7.2；
B：玉米淀粉2.0；黄豆粉2.5；葡萄糖1.0；NaCl0.2；K2HPO40.5；PH7.2；
C：玉米淀粉2.0；花生粉2.5；葡萄糖1.0；NaCl0.2；K2HPO40.5；PH自然；
D：玉米淀粉2.0；酵母粉2.5；甘油1.0；NaCl0.2；K2HPO40.5；PH7.2；
E：玉米淀粉2.0；酵母粉2.5；蔗糖1.0；NaCl0.2；K2HPO40.5；PH7.2。
分别将以上配制好的培养基以30mL一份倒入250mL的三角瓶内，于高压灭菌器中120℃灭菌20分钟。冷却后分别接入一环链霉菌(Streptomyces，sp.4908CGMCCNo.1288)于各培养基中，在28℃和250rpm转速下震荡培养96小时。培养结束后，分别收集发酵液，取发酵液2mL，离心后，用3mL80％丙酮萃取，萃取液用高效液相色谱(岛津公司LC-10A，下同)分析，得到每毫升发酵液中他克莫司浓度，结果如表1。
表1
实施例2
分别配制种子培养基A、B、C、D，其中培养基组成(％)如下：
A：可溶性淀粉2.0；酵母粉0.5；葡萄糖0.5；NaCl0.05；K2HPO40.5；KH2PO40.5；PH7.2；
B：可溶性淀粉2.0；酵母粉0.5；甘油1.0；NaCl0.05；K2HPO40.5；KH2PO40.5；PH7.2；
C：可溶性淀粉1.0；玉米浆0.5；葡萄糖0.5；甘油1.0；酵母粉0.5；K2HPO40.05；KH2PO40.05；CaCO30.2；PH7.2；
D：玉米淀粉1.0；酵母粉0.5；甘油0.5；NaCl0.05；K2HPO40.5；KH2PO40.5KH2PO40.5；PH自然。
再配制发酵培养基，其组成(％)如下：
玉米淀粉1.5；葡萄糖2.0；黄豆饼粉1.0；花生粉1.5；酵母粉0.2；NaCl0.2；K2HPO40.5；PH：7.2。
在250毫升三角摇瓶中分别装入30毫升种子培养基，灭菌后接入一环链霉菌(Streptomyces，sp.4908CGMCCNo.1288)，在温度28℃和摇床转速200rpm的条件下培养48小时，得到种子液。然后再在250毫升三角摇瓶中装入30毫升发酵培养基，消毒后接入5％的种子液，在摇床转速200rpm和温度28℃的条件下，发酵培养96小时。发酵培养结束后，分别收集发酵液，取发酵液2mL，离心后，用3mL80％丙酮萃取，萃取液用高效液相色谱分析，得到每毫升发酵液中他克莫司浓度，结果如表2。
表2
实施例3
先配制种子培养基，其组成(％)为：可溶性淀粉1.0；酵母粉0.5；葡萄糖0.5；NaCl0.05；K2HPO40.05；KH2PO40.05；玉米浆0.5；甘油1.0；PH7.2；CaCO3.0.2(调好PH后加入)；泡敌0.005；在5L种子罐中装入种子培养基3.5L，灭菌后接入一茄子瓶菌种，在温度28℃，通气量1∶0.5，罐压0.05MPa，搅拌转速250rpm的条件下培养48小时，得到种子液。在50L的发酵罐中装入发酵培养基35L，其组成(％)为：玉米淀粉1.5；葡萄糖2.0；黄豆饼粉1.0花生粉1.5；酵母粉0.2；NaCl0.2；K2HPO40.5；PH7.2；泡敌：0.005；实罐消毒后接入5％接种量移入种子液，在通气量1∶0.5，搅拌转速250rpm，罐压0.05MPa，温度28℃的条件下，发酵培养96小时。按上述方法分别生产五批产品，发酵培养结束后，收集五批发酵液，分别各取发酵液2mL，用3mL80％丙酮萃取，萃取液用高效液相色谱分析，得到五批发酵液中每毫升他克莫司浓度，结果如表3。为150μg mL-1。
表3
本发明与现有的方法相比，具有明显的特点是：他克莫司高产菌株为从自然源筛选得到的新菌株，现鉴定为链霉菌(Streptomyces，sp.4908)，其菌种保藏号为CGMCCNo.1288。经过长期的育种工作，发酵得到产物他克莫司的平均浓度可达到150μg/ml，远超过文献报道的水平，发酵工艺可实施工业化生产。
Claims (6)
1.一种他克莫司的生产方法，包括通过发酵培养微生物菌株，得到含有他克莫司的发酵液，其特征在于以链霉菌(Streptomyces sp.)4908CGMCC No.1288作为他克莫司的产生菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该链霉菌的发酵培养包括菌种的斜面培养，摇瓶的种子培养和摇瓶的发酵培养，种子罐的培养以及发酵罐的培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于菌种的斜面培养基包含有燕麦片、蔗糖和琼脂。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于种子培养基包含有可溶性淀粉、酵母粉、葡萄糖和甘油。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于发酵培养基含有玉米淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、花生粉和酵母粉。
6.一种产生他克莫司的链霉菌(Streptomyces sp.)4908，其特征在于保藏号为CGMCC No.1288。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200510026504A CN1876822B (zh) | 2005-06-06 | 2005-06-06 | 他克莫司的产生菌株及生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200510026504A CN1876822B (zh) | 2005-06-06 | 2005-06-06 | 他克莫司的产生菌株及生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1876822A CN1876822A (zh) | 2006-12-13 |
| CN1876822B true CN1876822B (zh) | 2010-05-12 |
Family
ID=37509376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200510026504A Expired - Fee Related CN1876822B (zh) | 2005-06-06 | 2005-06-06 | 他克莫司的产生菌株及生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1876822B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101481662B (zh) * | 2008-01-08 | 2011-11-16 | 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 | 一种链霉菌及其应用 |
| CN101486975B (zh) * | 2008-01-18 | 2012-04-18 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种链霉菌、用其产生他克莫司的方法及其应用 |
| CN103695496B (zh) * | 2013-12-05 | 2016-06-29 | 成都雅途生物技术有限公司 | 发酵生产他克莫司的方法 |
| CN108384819B (zh) * | 2017-02-03 | 2021-06-25 | 上海医药工业研究院 | 一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法 |
| CN107090477B (zh) * | 2017-05-04 | 2021-08-27 | 广州市微生物研究所有限公司 | 一种提高他克莫司产量的发酵方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116756A (en) * | 1991-01-28 | 1992-05-26 | Merck & Co., Inc. | Process for producing FK-506 |
| US5194378A (en) * | 1991-01-28 | 1993-03-16 | Merck & Co., Inc. | Process for producing fk-506 |
| US5496727A (en) * | 1984-12-03 | 1996-03-05 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same |
-
2005
- 2005-06-06 CN CN200510026504A patent/CN1876822B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496727A (en) * | 1984-12-03 | 1996-03-05 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same |
| US5624842A (en) * | 1984-12-03 | 1997-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Strain of Streptomyces for the production of tricyclo compounds |
| US5116756A (en) * | 1991-01-28 | 1992-05-26 | Merck & Co., Inc. | Process for producing FK-506 |
| US5194378A (en) * | 1991-01-28 | 1993-03-16 | Merck & Co., Inc. | Process for producing fk-506 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 徐亲民.他克莫司的工业化研究.国外医学抗生素分册21 4.2000,21(4),151-155. |
| 徐亲民.他克莫司的工业化研究.国外医学抗生素分册21 4.2000,21(4),151-155. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1876822A (zh) | 2006-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101392227B (zh) | 一种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素 | |
| CN108676757B (zh) | 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用 | |
| CN106282044B (zh) | 一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法 | |
| CN1876822B (zh) | 他克莫司的产生菌株及生产方法 | |
| CN101597578A (zh) | 一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法 | |
| CN106148216B (zh) | 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素a3的方法 | |
| CN101402929B (zh) | 一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用 | |
| CN109735467A (zh) | 一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用 | |
| JP2018509166A (ja) | ストレプトマイセスおよびそれを用いてミルベマイシンａ４を製造する方法 | |
| CN108823110B (zh) | 一株产灰黄霉素的菌株及其应用 | |
| CN108641982B (zh) | 一种特氏盐芽孢杆菌s61及其应用 | |
| CN117106649B (zh) | 一株拮抗黄曲霉的菌株及其在黄曲霉生物防治中的应用 | |
| CN102229905B (zh) | 不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法 | |
| CN109280034B (zh) | 一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用 | |
| CN112877237B (zh) | 一株武夷菌素高产菌株、发酵方法及应用 | |
| CN115197853B (zh) | 内生菌Epicoccum thailandicum LF-28菌株及其应用 | |
| CN106520572A (zh) | 一种香椿内生真菌56‑50及其次级代谢产物、制备方法和应用 | |
| CN1358838A (zh) | 一种活菌制剂的保藏方法 | |
| CN102911874B (zh) | 一种红色糖多孢菌及其应用 | |
| CN113046249A (zh) | 一株蜡蚧轮枝菌ll-01及其生防应用 | |
| CN104946555B (zh) | 一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用 | |
| CN110092758A (zh) | 一种新型生物碱化合物及发酵制备该化合物的疣孢菌株 | |
| CN109207398A (zh) | 一株施氏假单胞菌及其应用 | |
| CN114395501B (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治茶饼病中的应用 | |
| CN103740781B (zh) | 一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20061213 Assignee: Jiangxi Yu Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: Shanghai Pesticide Research Institute|Xue Jianping Contract record no.: 2015360000118 Denomination of invention: Tacrolimus generation strain and production method thereof Granted publication date: 20100512 License type: Exclusive License Record date: 20150629 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100512 Termination date: 20170606 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |