CN109735467A

CN109735467A - 一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用

Info

Publication number: CN109735467A
Application number: CN201910090224.9A
Authority: CN
Inventors: 连云阳; 张祝兰; 严凌斌; 邱观荣; 张引; 王德森; 杨煌建; 黄洪祥
Original assignee: Fujian Institute of Microbiology
Current assignee: Fujian Institute of Microbiology
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109735467B

Abstract

本发明提供一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株，所述诱变菌株为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM‑07‑23，于2019年01月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17137；所述筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM‑07‑23在发酵生产他克莫司中的应用。本发明所述筑波链霉菌能够发酵高产他克莫司，大幅度提高了他克莫司的产量，且遗传稳定性好。

Description

一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用

【技术领域】

本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用。

【背景技术】

大环内酯类免疫抑制剂是一类具有经体内外研究证明具有显著的免疫抑制作用的大环内酯结构的免疫抑制剂，其代表物质为他克莫司(Tacrolimus,FK506)、子囊霉素(Ascomycin，FK-520)及其衍生物、西罗莫司(Sirolimus,Rapamycin)等。大环内酯类免疫抑制剂可被用于治疗器官移植的排异反应和自身免疫相关性疾病等。

他克莫司(Tacrolimus，FK506)是从Streptomyces tsukubaensis的发酵液中提取得到的一种含哌可酰基的23元大环内酯类化合物，具有免疫抑制药效强、用药剂量低、急性排异反应发生率低等优点，在器官移植和自身免疫系统疾病方面疗效显著。他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应，患者使用后的细菌和病毒感染率也较环孢素治疗者低，尤其是他克莫司有较强的亲肝性，对肝移植的功效比环孢素强，而且FK-506和MMF(霉酚酸酯)及Pred(强的松)三联用药具有明显的协同作用，效果更好。目前他克莫司不仅是肝脏及肾脏移植后排斥反应的一线药物，还广泛应用于斑秃、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎及多发性硬化病等自身免疫疾病的治疗,具有广阔的应用前景。自从1984年首次发现他克莫司以来，国内外对其进行了大量的基础及临床研究，1998年进入中国市场后，市场份额迅速上升。目前国内他克莫司市场上，进口原研药仍然占据80％左右的市场。

国内微生物发酵法生产他克莫司的技术瓶颈主要是其产率低。申请号为201310644714.1的中国专利公开了一种发酵生产他克莫司的方法，最终的链霉菌产他克莫司为385μg/mL。申请号为200810019003.4的中国专利公开了一种链霉菌及其应用，其公开的最高发酵单位为550μg/mL。申请号为201210447477.5的中国专利公开了一种高纯度他克莫司的制备方法，其公开的最高发酵单位为491μg/mL。申请号为201710309551.X的中国专利公开了一种提高他克莫司产量的发酵方法，其在常规的他克莫司发酵过程中加入吸附树脂以及流加补充糊精，发酵170h后他克莫司含量可达1248mg/L，虽发酵水平较高，但发酵周期过长，生产产本仍较高。申请号为201610135737.3的中国专利公开了一种筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用，主要是一种由筑波链霉菌HDW68发酵制备他克莫司中间体的方法，该发明提供的发酵工艺经1吨、4吨、20吨发酵罐的生产实践，证明其生产能力可达1100mg/L，但发酵周期(6～7天)仍较长，且培养基复杂。申请号为201510664099.X的中国专利公开了一种基因工程菌株筑波链霉菌L21及其应用，其通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的特异性调控基因的拷贝数，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，将他克莫司的发酵单位提高至945mg/L，但基因工程菌株的稳定性有待进一步验证，该发明未详细给出进一步说明。

综上所述，虽然生产他克莫司的链霉菌有很多，有些菌种遗传性状和发酵单位较稳定，但其菌种有的发酵能力较低，有的发酵周期长，生产成本高，与国外存在较大差距，导致目前国内的他克莫司市场还是由美日等国家主导。

有鉴于此，获得一株能够遗传稳定性好的高产他克莫司菌株是从业人员所迫切期望地。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用，所述链霉菌能够发酵高产他克莫司，大幅度提高了他克莫司的产量，且遗传稳定性好。

本发明是这样实现的：

一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株，所述诱变菌株为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23，于2019年01月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17137。

进一步地，所述筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23在发酵生产他克莫司中的应用。

本发明以筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07为出发菌株、采用⁶⁰Co诱变技术以链霉素为选择压力筛选得到的菌株，对该菌株的理化特性等进行鉴定，最终鉴定其为链霉菌菌属的一株菌株。

且菌株筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07，于2019年01月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17136。

本发明具有如下优点：

本发明提供的筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23，其能够发酵高产他克莫司，大幅度提高了他克莫司的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23遗传稳定性良好，目标菌种即菌株(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23产他克莫司水平最终维持在1522mg/L左右，连续传代四代其产他克莫司效价均可维持在高产水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明实施例3中⁶⁰Co处理剂量与致死率的关系曲线图。

【具体实施方式】

本发明中筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23是以筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07为出发菌株、采用⁶⁰Co诱变技术以链霉素为选择压力筛选得到的菌株，该菌株能够发酵生产他克莫司，且产量优异。

以下结合具体实施例对本发明作进一步地的说明。

实施例1、菌株FIM-07的分离

(1)于昆明市鸣凤山树林下采集土壤，具体地，用取样铲将表层10cm左右的浮土除去，采集10cm处土样10g～25g；称取2g土样并加入10mL无菌生理盐水，振荡后静置30min，取上清液即原液并用无菌生理盐水进行梯度稀释，选用稀释度为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的悬浮液；

(2)分别取原液及选用的悬浮液0.1mL涂布于添加50mg/L重铬酸钾的水配制的ISP4培养基平板上，每个样重复3个平行板，然后将涂布后的平板置于28℃培养，观察菌落外观、大小、颜色、边缘形状、表面干湿状态等形态特征；

(3)无菌操作条件下，培养8～12d后挑出菌落圆形、表面光滑、白色或浅灰至灰色等具有代表性的单菌落，并划线接种于ISP4培养基斜面，置于28℃条件下培养，分离纯化得到菌株，并将得到的菌株命名为菌株FIM-07，然后于-80℃条件下将分离获得的菌株FIM-07以20％甘油保存。

实施例2、菌株FIM-07的鉴定

(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-07在ISP4培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片,28℃培养8～12d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。得到该菌株FIM-07的主要形态及生理生化特性如下：

成熟孢子链有5～10个孢子，孢子形状呈椭圆形状，0.4～0.6×0.6～0.7μm。在平板上，菌落圆形，菌落培养10d直径约5～6mm，表面光滑，白色或浅灰色至灰色，在ISP4培养基生长丰茂,气生菌丝灰白色,基内菌丝贫乏,不产色素或产浅粉红色素。随着培养时间的延长，菌落由白色或浅灰变成灰白色或灰色；可利用糊精、葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、山梨醇，不利用蔗糖、乳糖、棉籽糖；在明胶培养基上能使明胶液化，胨化牛奶；不利用纤维素；硝酸盐还原阴性；此菌株FIM-07为高耗氧菌，生长温度为18～35℃，最适生长温度为25-30℃，生长pH值为5.5～9.0，最佳生长pH为6.5～8.5。

(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-07的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN

(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-07与筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)的序列同源性为100％。

结合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株FIM-07属于筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)，命名为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07。

实施例3、菌株FIM-07-23的获得

(1)、取所述筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07菌株并转接至ISP4培养基斜面上，并于恒温培养箱中培养8～12d，且培养温度为28℃；之后用生理盐水洗下培养基斜面上的孢子，玻璃珠打散，经擦镜纸过滤，制成10⁶个/mL的孢子悬液；

(2)、将步骤(1)制得的孢子悬液分装于5个无菌试管中，进行⁶⁰Co辐射处理，剂量分别为300Gy、450Gy、600Gy、800Gy、1000Gy，剂量率为900rad/min。将诱变前后的菌悬液进行梯度稀释涂布于分离平板，于28℃培养10d，观察菌落生长情况，进行菌落计数，制作致死率曲线如图1所示；从图1中可以看出诱变处理剂量与筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)FIM-07菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理剂量的增大，致死率快速升高，辐照剂量为800Gy后菌落完全不生长；

(3)、根据步骤(2)的致死率曲线，选择致死率分别75％左右和95％左右的辐射剂量对筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07菌株的孢子悬液,进行⁶⁰Co处理，得诱变孢子悬液，备用；

(4)将步骤(3)中两个不同处理剂量的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀；

(5)将步骤(1)中的孢子悬浮液，分别涂布于分离平板培养基和含链霉素平板培养基中，其中培养基中链霉素浓度为12.5μg/mL～400μg/mL。28℃培养10天后，观察不同平板上的菌落生长情况(见下表1所示)，未长出菌落的链霉素最低作用浓度为链霉素最小抑菌浓度；

表1不同浓度的链霉素对FIM-07孢子生长的影响

注：+菌落生长；-菌落不生长

(6)以步骤(5)中的确定的抗最小抑菌浓度链霉素作为选择压力，将步骤(4)中的诱变孢子悬液进行梯度稀释后，分别涂布于含有最小抑菌浓度链霉素的抗性平板上，28℃避光培养10d；

(7)、将步骤(6)中各个分离平板上长出的单菌落转接ISP4培养基斜面上培养10d后，以划线法接种于种子培养基中，于28℃、250r/min条件下培养40h后得种子液；以10％的接种量将种子液接种于发酵培养基中，于28℃、250r/min条件下培养5d，得发酵液；

(8)取步骤(7)中所得发酵液适量，加入三倍体积的无水乙醇，即发酵液与无水乙醇的体积比为1:3，充分振荡、静置、4000r/min离心10min，上清液过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定他克莫司的产量，通过此方法即筛选出产他克莫司量最大的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株FIM-07-23，且菌株FIM-07-23于20％甘油中保存。

实施例4、菌株FIM-07-23的鉴定

(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-07-23在ISP4培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，28℃培养8～12d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。得到该菌株FIM-07的主要形态及生理生化特性如下：

成熟孢子链有5～10个孢子，孢子形状呈椭圆形状，0.4～0.6×0.6～0.7μm。在平板上，菌落圆形，菌落培养10d直径约5～6mm，表面光滑，白色或浅灰色至灰色，在ISP4培养基生长丰茂,气生菌丝灰白色,基内菌丝贫乏,不产色素或产浅粉红色素。随着培养时间的延长，菌落由白色或浅灰变成灰白色或灰色；可利用糊精、葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、山梨醇，不利用蔗糖、乳糖、棉籽糖；在明胶培养基上能使明胶液化，胨化牛奶；不利用纤维素；硝酸盐还原阴性；此菌株为高耗氧菌，最适生长温度为25-30℃，最适生长pH为6.5-8.5；在摇床转速为230～280r/min，培养4～6d时，他克莫司产量最高，发酵过程中溶氧对他克莫司的产生具有显著作用。

(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-07-23的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-07-23与筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)的序列同源性为100％。

通过上述的鉴定，可确定该菌株FIM-07-23属于筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)，因此命名为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23。

实施例5、菌株FIM-07-23摇瓶发酵生产他克莫司

菌株FIM-07-23的活化：将采用甘油保存的菌株FIM-07-23转接至ISP4培养基斜面上，并于恒温培养箱中培养8～12d，且培养温度为28℃；

制备种子液：将菌株FIM-07-23活化所得的单菌落接种于种子培养基(500mL三角瓶内装50mL种子培养基)中，于28℃、250r/min条件下培养43h，得种子液；

发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(500mL三角瓶内装50mL发酵培养基)中，于28℃、250r/min条件下发酵培养6d，之后将所得发酵液进行检测；检测结果：菌株FIM-07-23在发酵培养基上他克莫司的产量高达1503mg/L。

实施例6、菌株FIM-07-23罐(100L)发酵生产他克莫司

菌株FIM-07-23的活化：将采用甘油保存的菌株FIM-07-23转接至ISP4斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8～12d，且培养温度为28℃；

罐种子液培养：按0.5％接种量移种至20L种子罐种子培养基中，罐压0.05±0.01Mpa，通气量1:0.3～1.0(V/V)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时；

罐发酵培养：按5％移种量将生长良好的种子移入100L发酵罐发酵培养基中，罐压0.05±0.01Mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(V/V)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(V/V)，27℃～29℃下发酵132h，发酵结束后将所得发酵液进行检测；检测结果：菌株FIM-07-23在发酵培养基上他克莫司的产量高达1518mg/L。

实施例7、菌株FIM-07-23罐(1T)发酵生产他克莫司

罐种子液培养：按0.5％接种量移种至100L种子罐种子培养基中，罐压0.05±0.01Mpa，通气量1:0.3～1.0(V/V)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时；

罐发酵培养：按5％移种量将生长良好的种子移入1000L发酵罐发酵培养基中，罐压0.05±0.01Mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(V/V)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(V/V)，27℃～29℃下发酵132h，发酵结束后将所得发酵液进行检测；检测结果：菌株FIM-07-23在发酵培养基上他克莫司的产量高达1522mg/L。

实施例8、菌株FIM-07-23的遗传稳定性验证

将经实施例5、实施例6、实施例7验证过的高产他克莫司的菌株FIM-07-23进行500ml摇瓶连续培养5代，以检测其遗传稳定性，菌株传代发酵实验结果如下：

对高产菌株FIM-07-23连续传代5次：F1、F2、F3、F4、F5，经摇瓶发酵后测定发酵效价，以生长良好的原代菌株(F0)为对照,其相对效价为100％，结果见下表2：

表2传代对菌株FIM-07-23产他克莫司的影响

表2中表明菌株FIM-07-23传四代发酵水平无明显影响，其他克莫司效价基本稳定，维持在同一较高水平；从而表明菌株FIM-07-23具有较好的遗传稳定特性，目标菌种即菌株FIM-07-23产他克莫司水平最终维持在1522mg/L左右，相对于出发菌株即菌株FIM-07(548mg/L)提高了178％左右，所以诱变菌株筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

另外，需要说明的是，在发明所涉及的各培养基的组分如下：

ISP4培养基的组分为：可溶性淀粉2.0％，K₂HPO₄.3H₂O 0.05％，MgSO₄.7H₂O0.05％，NaCl 0.05％，KNO₃0.1％，FeSO₄.7H₂O 0.01％，琼脂2.0％，余量为蒸馏水，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min；

种子培养基的组分为：玉米淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、蛋白胨0.3％、酵母粉0.5％、麦芽浸膏0.7％、碳酸钙0.1％、余量为蒸馏水，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min；

发酵培养基的组分为：玉米淀粉6.0％、黄豆粉2.0％、葡萄糖2.0％、玉米浆0.5％、吐温803.0％、碳酸钙0.6％、余量为蒸馏水，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min；且在无特殊说明的情形下，本发明中的百分数均为质量百分数。

综上，本发明提供一种筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)FIM-07-23，其能够发酵高产他克莫司，大幅度提高了他克莫司的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM-07-23稳定性良好，连续传代四代其产他克莫司效价基本稳定，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 福建省微生物研究所

<120> 一种高产他克莫司的链霉菌诱变菌株

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1523

<212> DNA

<213> （Streptomyces tsukubaensis）

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60

gatgaagccg cttcggtggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg 120

ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggataata ccttcggggg 180

catccttgaa ggttgaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt 240

ggtggggtga tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca 360

atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420

ctctttcagc agggaagaag cgagagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540

agagctcgta ggcggcttgt cacgtcgggt gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg 600

cattcgatac gggcaggcta gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg 660

aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga 720

cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgttggg aactaggtgt tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt 840

aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

cgcacaagca gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct 960

tgacatacac cggaaagcat tagagatagt gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg 1020

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgtcccgt gttgccagca agcccccttg tggggtgttg gggactcacg ggagaccgcc 1140

ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat catgcccctt atgtcttggg 1200

ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaaa gagctgcgat gccgtgaggc ggagcgaatc 1260

tcaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga agtcggagtt 1320

gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380

cccgtcacgt cacgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg gcccaacccc ttgtgggagg 1440

gagctgtcga aggtgggact ggcgattggg acgaagtcgt aacaaggtag ccgtaccgga 1500

aggtgcggct ggatcacctc ctt 1523

<210> 2