CN101914478A - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种枯草芽孢杆菌及其应用，该菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.4018。本发明所述枯草芽孢杆菌是以保藏编号为CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌BS-1为出发菌株，通过紫外诱变的方法，经初筛、复筛和小罐发酵验证后获得的菌株，其中初筛培养基为包含蔗糖、玉米浆和蛋白胨的培养基A和包含葡萄糖、酵母粉和豆饼粉的培养基B，复筛培养基主要由葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、酵母膏和硫酸镁组成。实验表明，本发明所述枯草芽孢杆菌CGMCC No.4018发酵生产维生素B₂产量高，糖耗低，可应用于维生素B₂的工业化生产，有利于提高生产效率，降低生产成本。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)芽孢杆菌属的一种需氧菌，因其广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢杆菌单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动，为革兰氏阳性菌。芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，还能合成维生素B₁、B₂、B₆、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。

维生素B₂，又称核黄素，它是人体必需的13种维生素之一，它是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。维生素B₂具有强化肝功能、调节肾上腺素的分泌、保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能。此外维生素B₂还可以预防动脉硬化，是增进脑记忆功能不可缺少的物质，摄取足够的维生素B₂对防范动脉硬化很有帮助。维生素B₂缺乏会引起多种疾病，奶类及其制品、动物肝脏与肾脏、蛋黄、鳝鱼、胡萝卜等食物中富含维生素B₂。然而身体贮存维生素B₂的能力有限，当摄入量较大时，肝肾常有较高的浓度，超过肾阈即通过泌尿系统，以游离形式排出体外，很难在人体内贮存，所以必须每天补充维生素B₂，因此维生素B₂市场需求量很大。

目前生产维生素B₂的方法主要有植物体提取法、化学合成法、化学半合成法和微生物发酵法。植物提取法产量低、成本高，不能形成规模化生产。化学合成法反应步骤多，反应复杂且收率很低，限制其工业化生产。化学半合成法产品纯度高，主要用于医药方面，但收率低，且生产过程需要多种有机溶剂，能耗高，并伴随产生大量废料。目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产维生素B₂。

维生素B₂可被多种微生物合成，如芽孢杆菌属，阿舒假囊酵母，棉病囊霉，假丝酵母等。1940年由Meade等采用丙酮丁醇梭状杆菌首先实现了微生物发酵法生产维生素B₂，发酵单位约为70mg/L。80年代以后，人们借助于基因工程技术有目的改造微生物，构建出多种基因工程菌，如以枯草芽孢杆菌作为受体菌所构建的维生素B₂生产菌。但现有的枯草芽孢杆菌株维生素B₂产量较低、成本较高，无法满足大规模工业化生产的需要。

发明内容

本发明目的是提供一种糖耗低，维生素B₂产量高的枯草芽孢杆菌。

本发明所述枯草芽孢杆菌，是以保藏编号为CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌BS-1为出发菌株，通过紫外诱变的方法，经初筛、复筛和小罐发酵验证后获得的一株新型枯草芽孢杆菌。

本发明所述初筛为将枯草芽孢杆菌在培养基A上37℃培养2天后，选取菌落呈黄色、不透明、表面粗糙、直径大于2mm，菌落背面培养基明显变黄的单菌落接种到培养基B中37℃培养。培养2天后选取菌落直径小于1mm的单菌落进行复筛。其中所述培养基A包含蔗糖、玉米浆和蛋白胨，所述培养基B包含葡萄糖、酵母粉和豆饼粉。

本发明所述复筛为将初筛选出的枯草芽孢杆菌在复筛培养基上摇瓶培养40h，选取维生素B₂发酵单位大于6000mg/L的维生素B₂高产菌株，所述复筛培养基主要由葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、酵母膏和硫酸镁组成。

将复筛选出的枯草芽孢杆菌进一步进行发酵罐培养，比较发酵液中的生物量、维生素B₂发酵单位及发酵过程中补料消耗量，最终确定一种糖耗低，维生素B₂产量高的新型枯草芽孢杆菌菌株S5。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌株S5已于2010年7与20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为北京中关村中国科学院微生物所内，保藏号为CGMCCNo.4018。

本发明采用浊度法，利用分光光度计测定发酵液在600nm下的浊度，快速、准确得知发酵液中的生物量。实验表明，本发明所述枯草芽孢杆菌发酵后，生物量比对照菌株BS-1提高了23.6％，发酵液中维生素B₂产量提高了39.9％，糖耗降低了29.1％。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌糖耗显著降低，维生素B₂产生量大幅提高，即本发明所述枯草芽孢杆菌提高了维生素B₂生产效率，降低了生产成本，适合于维生素B₂大规模工业化生产。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌在发酵生产维生素B₂中的应用。在具体实施方式中，本发明提供利用所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B₂的方法，将本发明所述枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基，在发酵温度为40℃、pH为6.5、溶氧为20-40％的条件下进行补料分批发酵，残糖(葡萄糖)浓度低于6-8mg/ml时补料。发酵后收集发酵液，混匀后加入氢氧化钠溶液碱溶，离心收集上清即得。

生物保藏说明

菌株BS-1：分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis于2010年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4019。

菌株S5：分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis于2010年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4018。

具体实施方式

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述枯草芽孢杆菌，是通过紫外诱变的方法，经初筛、复筛和小罐发酵验证后获得的一株新型枯草芽孢杆菌。

本发明所述枯草芽孢杆菌，是以保藏编号为CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌BS-1为出发菌株，紫外照射30s后，经两种不同培养基进行初筛。

所述初筛具体步骤为：在培养基A上37℃培养2d后，选取菌落呈黄色、不透明、表面粗糙、直径大于2mm，菌落背面培养基明显变黄的单菌落接种到培养基B中培养。培养基B中37℃培养2d后选取菌落直径小于1mm的单菌落进行复筛。其中所述培养基A包含蔗糖、玉米浆和蛋白胨，所述培养基B包含葡萄糖、酵母粉和豆饼粉。

所述复筛为将初筛选出的枯草芽孢杆菌在复筛培养基上摇瓶培养40h，筛选维生素B₂发酵单位大于6000mg/L的维生素B₂高产菌株，所述复筛培养基主要由葡萄糖、玉米浆、硫酸铵、酵母膏和硫酸镁组成。

在复筛基础上进一步进行发酵罐培养，比较发酵液中的生物量、维生素B₂发酵单位及发酵过程中补料消耗量，最终确定了一种糖耗低，维生素B₂产量高的新型枯草芽孢杆菌菌株S5。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌株S5已于2010年7与20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏中心地址为北京中关村中国科学院微生物所内，保藏号为CGMCC No.4018。

生物量是表征微生物生长状况的一项基本参数，测定生物量对了解发酵过程中微生物的生长情况及发酵情况至关重要。测定生物量的方法有多种，如质量法、浊度法、显微镜直接计数法等，其中浊度法简便、快速且可连续测定。本发明采用浊度法，利用分光光度计测定发酵液在600nm下的浊度，快速、准确得知发酵液中的生物量。

实验表明，本发明所述枯草芽孢杆菌采用补料分批发酵，发酵35h后，生物量比对照菌株BS-1提高了23.6％，每升发酵液中维生素B₂产量提高了39.9％，生产每克维生素B₂糖耗降低了29.1％。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌糖耗显著降低，维生素B₂产生量大幅提高。

补料分批发酵，又称半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质的方法。与传统的分批发酵相比，补料分批发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻退等问题，得到较高的转化率，染菌和退化的概率小。合适的补料工艺能够有效地控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。本发明采用补料分批发酵工艺，在残糖(葡萄糖)浓度低于6-8mg/ml时补加葡萄糖和玉米浆，以提高维生素B₂的转化率，达到提高生产效率的目的。本发明所述枯草芽孢杆菌采用补料分批发酵，可提高维生素B₂生产效率，降低生产成本，适合于维生素B₂大规模工业化生产。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌在发酵生产维生素B₂中的应用。具体实施例提供的利用所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B₂的方法包括以下步骤：将本发明所述枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基，在发酵温度为40℃，pH为6.5，溶氧为20-40％的条件下补料分批发酵，残糖(葡萄糖)浓度低于6-8mg/ml时补料。发酵35h后收集发酵液，混匀后加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液碱溶，8000rpm，离心5min，收集上清即得。

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：本发明所述枯草芽孢杆菌的诱变

取保藏编号为CGMCC No.4019的枯草芽孢杆菌BS-1接种于斜面培养，在超净台内用10mL无菌生理盐水冲洗菌种斜面后，取1mL菌悬液至含有9mL无菌生理盐水的试管内，稀释10倍，混匀后，再取出1mL菌悬液至含有9mL无菌生理盐水的试管内，稀释100倍混匀，依次稀释至10^-6倍。

取稀释至10^-6倍的菌悬液平铺在灭菌后的9cm培养皿内，用18W紫外灯，距离平板28cm处照射，一次三个培养皿。照射时间为30s。吸取1mL处理过的菌悬液涂平板，分离菌种。

实施例2：本发明所述枯草芽孢杆菌的初筛

1、初筛培养基

培养基A：1％蔗糖、1％玉米浆和0.5％蛋白胨，余量为蒸馏水；

培养基B：1％葡萄糖、0.5％酵母粉和0.5％豆饼粉，余量为蒸馏水。

2、菌株的初筛

将紫外诱变后分离的菌种接种于培养基A中，37℃培养2d后观察菌落生长情况。挑取单菌落为黄色、不透明，菌落表面粗糙，菌落直径大于2mm，且菌落背面培养基明显变黄的菌落，共挑取单菌落76个。将挑取的单菌落接种到培养基B中，37℃培养2d，选取菌落直径小于1mm单菌落，共挑取8个，作为目标菌株命名S1-S8。

实施例3：本发明所述枯草芽孢杆菌的复筛

1、复筛培养基

复筛液体培养基：5％葡萄糖、2％玉米浆、0.05％硫酸铵、0.5％酵母膏和0.005％硫酸镁，余量为蒸馏水。

2、摇瓶培养

将初筛获得的8个目标菌株分别接种于复筛液体培养基中，37℃，128rpm摇瓶培养40h。

3、维生素B₂的提取及测定

取出摇瓶中的培养液，混匀后稀释，精确移取一定体积置于一定体积的棕色容量瓶中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液，蒸馏水定容。摇匀后，放于避光处进行碱溶。若所取培养液镜检存在维生素B₂晶体，碱溶15min；若无晶体出现，碱溶5min。经过碱溶后的培养液混匀后倒入离心管中，8000rpm，离心5min，收集上清。

将离心后的上清液置于比色杯中，以蒸馏水为参比，在444nm波长下测量，读数为a，读数在0.2-0.8之间为可信值，维生素B₂发酵单位按下式计算：

维生素B₂发酵单位＝读数a×稀释倍数/0.0321

每个菌种重复3次，测量结果如表1(单位为mg/L)。

表1复筛菌株维生素B₂发酵单位

结果显示，目标菌株S2和S5维生素B₂发酵单位分别为6059.3mg/L和6364mg/L，明显高于其它目标菌株，并且符合摇瓶培养40h，维生素B₂发酵单位大于6000mg/L的复筛标准，因此选取目标菌株S2、S5进一步进行小罐发酵验证。

实施例4：本发明所述枯草芽孢杆菌的小罐发酵验证

1、发酵培养基：

底料：4.5％玉米浆、0.6％硫酸铵和0.04％硫酸镁，余量为蒸馏水；

补料：50％葡萄糖和1.5％玉米浆，余量为蒸馏水。

发酵培养基121℃、灭菌30min。

2、小罐发酵

取目标菌株S2、S5以及出发菌株BS-1的摇瓶菌种各100ml分别接种于7L发酵罐中，发酵培养基定容至2L。采用补料分批发酵，发酵温度40℃，pH为6.5，溶氧为20-40％。残糖(葡萄糖浓度低于6-8mg/ml时补糖。

3、维生素B₂及生物量测定

发酵35h后收集发酵液，混匀后稀释，精确移取一定体积按照实施例3所述的方法测定维生素B₂的含量。

另外精确移取一定体积稀释的发酵液，测定发酵液生物量。将移取的发酵液置于一定体积的棕色容量瓶中，蒸馏水定容，。混匀后置于比色杯中，以蒸馏水为参比，在600nm波长下测量生物量，读数为b，读数在0.2-0.8之间为可信值。生物量按下式计算：

生物量＝读数b×稀释倍数

维生素B₂及生物量测定每个菌种重复3批，并记录每批发酵葡萄糖消耗量，结果如表2。

表2目标菌株S2、S5小罐发酵维生素B₂及生物量测定

结果显示，本发明所述枯草芽孢杆菌半连续式发酵35h后，目标菌株S5菌体生长最快，生物量平均为131，比对照菌株BS-1高了23.6％，比目标菌株S2高3％。目标菌株S5维生素B₂发酵单位最高，平均为14133.3mg/L，每升发酵液中维生素B₂产量比对照菌株BS-1提高了39.9％，比目标菌株S2高19.7％。目标菌株S5生产每克维生素B₂消耗葡萄糖最低，平均为11.43g，比对照菌株BS-1低29.1％，比目标菌株S2低13.2％。

因此选取菌株S5于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis保藏编号为CGMCC No.4018。

本发明所述枯草芽孢杆菌与对照菌株BS-1和比目标菌株S2相比，维生素B₂产生量大幅提高，补料消耗量显著降低，即本发明所述枯草芽孢杆菌大大提高了维生素B₂生产效率，节约了生产成本，适合于维生素B₂大规模工业化生产。

实施例5：本发明所述枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B₂

1、发酵培养基：

底料：4.5％玉米浆、0.6％硫酸铵和0.04％硫酸镁，余量为蒸馏水；

补料：50％葡萄糖和1.5％玉米浆，余量为蒸馏水。

发酵培养基121℃、灭菌30min。

2、发酵培养与维生素B₂的提取

取本发明所述枯草芽孢杆菌S5摇瓶菌种100ml接种于7L发酵罐中，发酵培养基定容至2L，控制发酵温度为40℃，pH为6.5，溶氧为20-40％。残糖浓度低于6-8mg/ml时补糖(葡萄糖)。培养35h后测定生物量，同时收集发酵液，混匀后加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液，避光处放置进行碱溶。若所取培养液镜检存在维生素B₂晶体则碱溶15min，若无晶体出现，则碱溶5min。碱溶后混匀，8000rpm，离心5min，收集上清即得维生素B₂，按照实施例3所述的方法检测上清液中维生素B₂的含量。

本发明所述枯草芽孢杆菌半连续式发酵35h后，菌体生长快，生物量为131，菌株维生素B₂发酵单位为14100mg/L，生产每克维生素B₂消耗葡萄糖为11.3g。采用本发明所述方法发酵生产维生素B₂，糖耗低，维生素B₂产量高，适合维生素B₂大规模工业化生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.4018。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产维生素B₂中的应用。