KR100542573B1

KR100542573B1 - 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법

Info

Publication number: KR100542573B1
Application number: KR1020030088121A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 이경한; 박장희; 한종권; 이광호; 최향
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2006-01-11
Also published as: KR20050055176A

Abstract

본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용한 바실러스 서브틸리스 균주 CJKB0005 및 상기 미생물을 이용하여 리보플라빈을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 리보플라빈 생성의 중간 단계 물질인 포스포리보실 피로포스페이트(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate)를 합성하는 효소인 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase)의 발현량을 증가시킴으로써 리보플라빈의 생산량을 증가시키는 것을 특징으로 한다. 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 발현량 증가로 펜토즈 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway)의 대사흐름이 강화되고, 결국 리보플라빈 생성에 필요한 전구체의 공급이 더욱 원활하게 이루어져 궁극적으로는 리보플라빈을 고농도로 생산하게 된다. 따라서, 본 발명은 상기 미생물을 배양하고 그 배양물로부터 리보플라빈을 대량으로 수득할 수 있는 효과가 있다.

리보플라빈, 바실러스 서브틸리스, 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈, 펜토즈 포스페이트 경로

Description

리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법 {Microorganism producing riboflavin and method for producing riboflavin using thereof}

도 1은 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 획득을 위한 프라이머 제작에 관한 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 pDP-P1, pDP-P2 플라스미드의 제작과정을 나타낸 도면이다.

본 발명은 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 발현량 증가를 통해 펜토즈 포스페이트 경로가 강화되어 리보플라빈 생산량의 향상을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005 및 상기 미생물을 이용하여 리보플라빈을 생산하는 방법에 관한 것이다.

리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2)은 다양한 종의 미생물과 모든 식물에서 생합성되는 수용성 비타민의 일종이다. 그러나, 인간을 포함한 척추동물에서는 생 합성되지 않는 특성이 있다. 리보플라빈은 모든 유기 세포체의 산화-환원반응에 필요한 조효소인 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)와 플라민 모노뉴클레오티드(flavin mononucleotide, FMN)의 전구물질로서 인간을 포함한 동물에게 필수영양소이다. 리보플라빈이 결핍되면 구강 및 인두점막의 염증, 피부 염증 및 다른 피부손상, 결막염, 시력감퇴, 성장저해 및 체중감소 등을 유발할 수 있다. 따라서, 리보플라빈은 상술한 바와 같은 비타민 결핍과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 비타민 제제 및 가축성장을 위한 사료첨가물로서 사용되어 왔다. 특히, 농축된 상태의 리보플라빈은 그 자체가 사료로 사용되어 왔다. 현재 리보플라빈의 생산량은 전세계적으로 연간 6000톤 규모이며, 그 중 75% 정도가 사료 첨가제로 사용되고, 나머지가 식품 및 의약용으로 사용되고 있다.

현재, 리보플라빈을 생산하는 방법으로는 화학적 합성법과 미생물을 이용한 발효법이 병용되고 있다. 화학적 합성법은 대개 D-리보오스와 같은 전구물질을 이용하여 다단계 공정을 거쳐 고순도의 리보플라빈을 생산하는 방법이다. 상기 화학적 합성법은 그 출발물질이 고가이기 때문에, 생산비용이 비싼 단점이 있어 미생물을 이용한 발효법이 개발되었다. 미생물을 이용한 발효법은 자연으로부터 리보플라빈을 생산하는 미생물을 분리하거나 또는 리보플라빈이 과생산되도록 유전공학적 방법 또는 화학적-물리적 방법으로 변이를 유도한 미생물을 적절한 조건으로 배양한 다음 상기 배양물로부터 리보플라빈을 분리하는 방법이다.

상기 리보플라빈을 생산하는 미생물로는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)과 캔디다 속(Candida sp.)에 속하는 효모, 클로스트리듐 속(Clostridium sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.) 및 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)에 속하는 세균 및 에레모테시움 속(Eremothecium ashbyii sp.)과 에쉬비아(Ashbya sp.) 속에 속하는 곰팡이 등이 알려져 있다.

미국특허 제5,231,007호에는 효모인 캔디다 파마타(Candida famata)를 이용한 리보플라빈의 제조방법이 개시되어 있으며, 문헌에는 리보플라빈 생합성 관련 효소 유전자가 과발현되도록 조작된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 이용하여 각각 4.5g/L와 17.4g/L의 리보플라빈을 생산한 예가 보고된 바 있다.(Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-`8, 1999). 유럽특허 제0821063호에는 재조합 바실러스 서브틸리스를 이용한 리보플라빈의 생산방법이 개시되어 있으며, 미국특허 제5,837,528호에는 재조합 기술을 이용하여 바실러스 서브틸리스에 rib 오페론을 가진 벡터를 도입함으로서 리보플라빈의 생산성을 증가시킨 재조합 균주가 개시되어 있다. 또한 미국특허 제5,334,510호에는 5'-GMP 분해능을 약화시켜 리보플라빈 생산성을 향상시킨 바실러스 서브틸리스의 변이주를 이용한 리보플라빈 생산방법이 개시되어 있다. 리보플라빈의 산업적 생산에 있어서는, 자낭균류인 에레모테시움 에쉬비(Eremothecium ashbyii)와 에쉬비아 고시피(Ashbya gossypii)가 가장 많이 사용되는 균주이다. 상기 자낭균류의 변이주를 당밀이나 식물유를 주요 탄소원으로 하는 영양 배지에서 배양하여 발효액 1리터 당 15g의 리보플라빈을 생산한 바 있다. 상기 에쉬비아 고시피(Ashbya gossypii)를 이용한 리보플라빈 생산과 관련해서는 국제특허공개 제9526406호에도 개시된 바 있다.

그러나, 상기의 연구성과에도 불구하고 리보플라빈의 산업적 대량생산은 여전히 요구되고 있기 때문에, 이를 위해 리보플라빈의 생산능이 향상된 미생물을 더욱 더 개발할 필요성이 있다.

한편, 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈는 뉴클레오사이드 트리포스페이트 체인(nucleoside triphosphate chain)의 베타-포스포릴 그룹(β-phosphoryl group)을 공격하는 반응을 촉매화하는 효소이다. 그 결과물인 포스포리보실 피로포스페이트는 뉴클레오타이드 생합성, 뉴클리오베이스 재생, 피리미딘 조효소 생산, 트립토판과 히스티딘 생합성 등의 반응 경로에 있어서 중요한 전구체로 작용한다.

이러한 기능을 하는 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈는 일본특허공개 평5-192164호에 개시된 바와 같이, 이노신(inosine)이나 구아노신(guanosine)과 같은 핵산 관련 물질을 다량으로 생산해 내기 위해서 바실러스용 벡터에 재조합하여 사용함이 보고된 바 있다.

이에 본 발명자들은 리보플라빈의 생산능이 향상된 미생물을 연구하던 중, 바실러스에 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈를 과발현시킴으로써 핵산을 생산하는 경로를 강화하고 결국에는 리보플라빈을 고농도로 생산하는 균주를 만들어 냄으로써 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 리보플라빈을 생산하는 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 리보플라빈의 생산방법을 제공 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리보플라빈을 생산하는 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005(KCCM-10527)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005를 이용한 리보플라빈의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005(KCCM-10527)은 리보플라빈을 생산하는 재조합 균주로서 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈를 과발현시키기 때문에 핵산 관련 물질을 다량으로 만들어내고, 결국 리보플라빈을 고농도로 생산하는 특징이 있다.

리보플라빈 합성과정 경로를 기초로 하여 바실러스 서브틸리스 변이주 CJKB0001의 매크로어래이(macroarray) 결과를 살펴보면, 바실러스 서브틸리스 야생균주에 비해 리보플라빈 합성 단계의 중간 물질인 포스포리보실 피로포스페이트를 합성하는 효소인 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 발현이 반으로 줄어든 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스의 야생균주의 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈를 바실러스에서 사용할 수 있는 벡터에 클로닝하여 모균주인 CJKB0001에 도입시킨 다음, 이 중에서 리보플라빈 생산능이 가장 우수한 균주를 선별하였다.

상기 사용한 벡터는 pDG148의 항생제 중 가나마이신(kanamycin) 내성 부여 유전자 위치에 퓨로마이신(puromysin) 내성 부여 유전자를 삽입시켜서 만든 벡터를 사용하고, 이를 pDPu6라 명명하였다.

상기 모균주로 사용한 바실러스 서브틸리스는 프롤린 유사체의 내성을 갖는 균주 CJKB0001(대한민국특허 제10-2002-076868)을 사용하였다.

상기 삽입한 유전자인 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈는 두가지 형태로 제작하였다. 첫째로 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 자체의 프로모터(promoter) 및 사인-달가노 시퀀스(Shine-Dalgarno sequence)를 사용하여 유전자를 발현시키도록 하는 것과 둘째로 벡터의 프로모터와 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 자체의 사인-달가노 시퀀스를 조합하여 발현되도록 제작하였다.

본 발명자들은 바실러스 서브틸리스 야생 균주의 염색체로부터 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)을 통해 획득한 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 유전자를 pDPu6의 Sal Ⅰ과 BamH Ⅰ 부위에 클로닝하여 pDP-P1, pDP-P2를 제작하고, 제작된 플라스미드 벡터를 다시 바실러스 서브틸리스 CJKB0001에 형질전환하였다. 재조합 균주들의 선별방법은 균주들의 플라스미드를 분리하여 폴리머라제 연쇄 반응 및 제한효소 절단을 이용하여 확인하였다. 이렇게 해서 얻은 재조합 균주들을 역가배지(표 1)가 함유된 삼각 플라스크에서 리보플라빈 생산량을 모균주와 비교해 본 결과 모균주는 96시간에 8.0g/l를 생산한 반면 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 발현을 강화한 재조합 균주 중 최고의 성적을 보인 균주 CJKB0005는 9.0g/l의 리보플라빈을 생산함으로써 약 12.5%의 수율향상을 달성하였다. 또한 이 균주의 경우, 51 발효조에서는 모균주 CJKB0001(26.8g/l)에 비해 성적이 10.1% 향상된 29.5g/l의 리보플라빈을 생산하였다.

따라서, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005는 모균주에 비해 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 발현량이 증가된 균주로, 리보플라빈 합성 중간단계물질들이 원활히 공급됨으로써 리보플라빈 생산능이 현저하게 향상된 균주이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005를 적합한 조건 하에 배양함으로써 상기 배양물로부터 리보플라빈을 생산하는 방법을 제공한다.

즉, 상기 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005(KCCM-10527)을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산 및 비타민 등이 함유된 통상의 배지 내에 접종하고 호기적인 조건 하에서 온도 및 pH 등을 조절함으로써 배양한다. 상기 탄소원으로는 포도당(glucose), 당밀(molasses), 젖당(lactose), 설탕(sucrose), 말토스(maltose), 덱스트린(dextrin), 전분(starch), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol) 및 글리세롤(glycerol)을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 포도당과 당밀을 사용한다. 상기 질소원으로는 암모니아(ammonia), 염화암모늄(ammonium chloride), 황산암모늄(ammonium sulfate)과 같은 각종 무기 질소원이나 펩톤(peptone), NZ-아민(NZ-amine), 육류 추출물(beef extract), 효모 추출물(yeast extract), 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해 생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물과 같은 유기 질소원을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 효모 추출물 및 옥수수 침지액을 사용한다. 상기 무기 화합물로는 인산1수소칼륨(Kalium monohydrogen phosphate), 인산2수소칼륨(Kalium dihydrogen phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 황산철(ferrous sulfate), 황산망간(magnese sulfate) 및 탄산칼슘(calcium carbonate) 등을 사용할 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양 요구성 염기 등을 추가로 첨가할 수 있다. 배양은 호기적 조건 하에서 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해 30~45℃의 온도, 바람직하게는 37~40℃의 온도에서 수행한다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양 기간은 2~6일간 수행한다.

본 발명에 따른 일 실시예에서는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005를 종배지에 접종하여 공기를 1vvm으로 공급하면서 37℃, 800rpm에서 20시간 배양한 후, 발효배지에 상기 종배양액을 접종하여 공기를 1vvm으로 공급하고 40℃, 800rpm, pH 7.0에서 60~70시간동안 진탕배양하면서, 배양액 내 잔존 당농도가 0.5~1%가 되도록 포도당이 첨가된 추가배지를 공급하여 배양액 내 총당함량이 27%가 되도록 첨가하여 배양함으로써 모균주에 비해 약 10.1% 향상된 농도로 리보플라빈을 수득하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 본 발명에 따른 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 획득을 위한 프라이머 제작>

본 발명의 재조합 균주 CJKB0005에 필요한 유전자를 획득하기 위해서, 야생 균주의 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 유전자를 주형으로 사용하기 위한 프라이머를 제작하였다. 바실러스에서 사용할 수 있는 벡터에 삽입하기 위해 PCR할 유전자 앞, 뒤에 제한 효소 서열을 넣어서 제작하였다. 유전자의 앞부분은 Sal Ⅰ, 뒷부분은 BamH Ⅰ, DNA 조각끼리 연결시켜 주는 부분은 Kpn Ⅰ의 서열을 포함하여 제작하였다. 제한 효소의 서열은 밑줄로 나타내었다. 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 획득을 위한 프라이머 제작 도면을 제 1도에 나타내었다.

prs-1(Sal Ⅰ) gat aga cgc gtc gac gaa ttc gaa gaa gct gga

prs-2(Kpn Ⅰ) cgt cgg ggt acc aaa ccg ctt atc cat tta

prs-3(Kpn Ⅰ) cat cgg ggt acc att cat aaa aaa taa tcc

prs-4(BamH Ⅰ) cgt cgc gga tcc aat ggt tta gct gaa cag ata

prs-3'(Sal Ⅰ) gat aga cgc gtc gac taa tcc taa att cgg agg ttt

<실시예 2: 본 발명에 따른 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 암호와 유전자 획득>

상기 실시예 1에서 제작된 프라이머를 이용하여 바실러스 서브틸리스 야생 균주의 염색체 DNA를 주형으로 pfu 폴리머라제(pfu polymerase)(stratagene)를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 수행한 조건은 변성 단계(denaturation step)은 94℃에서 30초, 어닐링 단계(annealing step)은 55℃에서 1분, 그리고 신장 단계(elongation step)은 72℃에서 1분 30초 동안 실시하였고, 28회 수행하였다. 사용된 프라이머 세트는 prs-1(Sal Ⅰ) & prs-2(Kpn Ⅰ)<반응 1>, prs-3(Kpn Ⅰ) & prs-4(BamH Ⅰ)<반응 2>, prs-3'(Sal Ⅰ) & prs-4(BamH Ⅰ)<반응 3>이였다. 폴리머라제 연쇄 반응 후 얻어진 반응 1, 2, 3의 결과물은 약 0.2kb, 1.0kb, 1.0kb로 확인되었다. 1, 2의 결과물은 제한 효소 Kpn Ⅰ으로 자른 뒤 T4 DNA 라이게이즈(ligase)로 접합하였고, 그 접합된 1.2kb의 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 prs-1(Sal Ⅰ) & prs-4(BamH Ⅰ)<반응 4>를 사용하여 다시 폴리머라제 연쇄 반응을 상기 조건과 동일하게 수행하여서 1.2kb의 결과물을 얻을 수 있었다.

<실시예 3: 본 발명에 따른 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈 유전자와 벡터의 조립>

상기 실시예 2에서 얻은 반응 3과 4의 결과물을 제한 효소 Sal Ⅰ, BamH Ⅰ으로 자른 후. 0.7% 아가로스 젤에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용출하였다. 각각의 결과물을 Sal Ⅰ, BamH Ⅰ으로 자른 후, Sal Ⅰ, BamH Ⅰ으로 절단된 pDPu6 벡터와 섭씨 16℃에서 24시간 접합하였다. 이 재조합 플라스미드들을 대장균 DH5α에 형질전환하여 암피실린(Ampicillin) 100mg/l가 함유된 고체 배지에서 37℃, 24시간 배양하고 생성된 콜로니들을 toothpick하여 암피실린 액체 배지 5ml에 접종하여 37℃, 16시간 배양 후 QIAGEN miniprep kit를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 반응 4에서 얻어진 결과물을 도입한 플라스미드를 pDP-P1, 반응 3에서 얻어진 결과물을 도입한 것은 pDP-P2로 명명하였다.

<실시예 4: 본 발명에 따른 조립된 pDP-P1과 pDP-P2 플라스미드의 확인 및 CJKB0005의 제작>

도 2에 나타낸 바와 같이 실시예 2에서 분리한 pDP-P1, pDP-P2의 플라스미드 DNA를 확인하기 위하여, 그 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 세트 prs-1(Sal Ⅰ) & prs-4(BamH Ⅰ), prs-3'(Sal Ⅰ) & prs-4(BamH Ⅰ)를 사용하여 확인한 결과 1.2kb, 1kb 크기의 결과물을 얻을 수 있었다. 그리고, 조립된 플라스미드에 도입된 유전자도 제한 효소 Sal Ⅰ, BamH Ⅰ을 사용하여 절단되는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 각각의 pDP-P1, pDP-P2 플라스미드를 모균주인 CJKB0001에 형질 전환하였다. 플라스미드 pDP-P1이 도입된 균주를 CJKB0005, pDP-P2가 도입된 균주를 CJKB0006으로 명명하였다. 상기 미생물 중 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005는 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2003년 11월 17일 기탁하여 수탁번호 제KCCM-10527호를 부여받았다.

<실시예 5: 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005와 CJKB0006의 플라스크 발효 역가>

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CJKB0005의 플라스크 발효 역가를 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 발효 역가와 비교하여 조사하였다. 상기 본 발명에 따른 재조합 균주와 모균주를 각각 종배지에 접종하여 종배양한 다음 종배양액을 플라스크 발효 배지에 접종하여 발효하였다. 종배지는 지름 18mm의 시험관에 5ml씩 분주한 다음 이를 121℃에서 15분간 가압 살균하여 제조하였다. 여기에 본 발명에 따른 재조합 균주와 모균주를 각각 접종하고 200rpm, 37℃에서 20시간 동안 진탕배양하였다. 배양이 완료되면 종배양액 1ml를 플라스크 발효 배지에 접종하고 200rpm, 37℃에서 90~96시간 동안 진탕 배양하였다. 상기에서 플라스크 발효 배지는 본 배지와 별살 배지를 상기 종배지와 동일한 방법으로 가압 살균한 다음 미리 가압 살균한 250ml 용량의 플라스크에 각각 15ml와 5ml씩 분주하여 제조하였다. 배양이 완료되면, 배지 내에 축적된 리보플라빈의 양을 분석하였다. 리보플라빈 농도는 HPLC로 분석하였으며, 이 경우 분석방법은 다음과 같다.

장치: Waters 510

컬럼 크기: 내경 4.6mm, 길이 250mm

충진제: 크로마실 C18 5um

이동상: A. 5mM 소디움 헥사네술포네이트(5mM Sodium hexanesulfonate)

+ 20mM H₃PO₄

B. 아세토니트릴(Acetonitrile)

A : B = 89 : 11

유속: 1ml/min

검출기: TSP UV2000(UV 260nm)

시료주입량: 15ul

시료용매: 증류수

실험에 사용한 종배지와 발효배지의 조성은 표 1에 나타낸 바와 같다.

플라스크 발효를 위한 배지 조성

배지	조성
종배지	효모 추출물 5g/l, 트립톤 10g/l, 염화나트륨 10g/l, pH 조정 안함
발효배지	본배지: 포도당 100g/l, 건조효모 20g/l, 황산 마그네슘 7수화물 0.5g/l 별살배지: 인산제1칼륨 1.5g/l, 인산제2칼륨 3.5g/l, 요소 6g/l, 에리스로마이신 10mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, 퓨로마이신 20mg/l, pH 7.2~7.4

실험 결과, 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 배지 내 리보플라빈 축적량은 8.0g/l인 반면, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005의 배지 내 리보플라빈 축적량은 모군주에 비해 무려 12.5%가 향상된 9.0g/l였다. CJKB0006의 경우는 3.6%가 향상된 8.3g/l였다.

<실시예 6: 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005와 CJKB0006의 발효 역가>

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CJKB0005의 51 발효조에서의 발효 역가를 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 발효 역가와 비교하여 조사하였다. 상기 본 발명에 따른 재조합 균주와 모균주를 각각 종배지에 접종하여 종배양한 다음 종배양액을 발효 배지에 접종하여 유가식 발효(fed-batch fermentation)를 수행하였다. 먼저, 종배지를 2.5l 용량의 실험용 발효조에 11씩 분주한 다음 121℃에서 10분간 가압 살균하여 제조하였다. 이를 냉각한 다음 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주와 모균주를 각각 식염수에 현탁하여 10ml씩 접종한 후 제균된 공기를 1vvm으로 공급하고 37℃에서 800rpm으로 교반하면서 20시간 동안 배양하였다. 배양 중 pH는 조절하지 않았다. 종배양이 완료되면, 상기 종배양액을 발효 배지에 접종하여 유가식 발효를 수행하였다. 상기 발효 배지는 51 용량의 실험용 발효조에 1.41씩 분주한 다음 121℃에서 20분간 가압 살균하여 제조하였다. 이를 냉각한 다음 상기의 종배양액 200ml씩을 접종하고 제균된 공기를 1vvm으로 공급하면서 800rpm, 40℃에서 배양하였다. 이 때, 배양 중 잔존 당농도가 0.5~1%가 되도록 조절하면서 추가 배지를 공급하여 발효배지에 첨가된 총당농도가 20%가 되도록 하였다. 배양 중 pH는 암모니아수를 이용하여 7.0으로 조절하면서, 60~70시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 리보플라빈의 배지 내 축적량을 HPLC법으로 분석하였다. HPLC에 의한 리보플라빈 분석 방법은 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명에서 사용한 배지의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같다.

51 발효조 배양을 위한 배지 조성

배지	조성
종배지	당밀(50% 당기준)30g/l, 옥수수 침지액(corn steep liquor) 15g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/l, 황산암모늄 5g/l, 인산제1칼륨 1.5g/l, 인산제2칼륨 3.5g/l, 에리스로마이신 10mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, pH 7.4
발효 배지	본배지: 건조효모 20g/l, 옥수수 침지액 5g/l, 황산암모늄 2g/l, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/l, 인산 제1칼륨 17.5g/l, 인산 제2칼륨 7.5g/l, 에리스로마이신 5mg/l, 클로람페니콜 10mg/l, pH 7.2~7.4 추가배지: 포도당 270g/l, 건조효모 26.7g/l, 옥수수 침지액 26.7g/l

실험 결과, 리보플라빈의 배지 내 축적량은 모균주인 바실러스 서브틸리스 CJKB0001의 26.8g/l인 반면, 본 발명에 따른 재조합 균주 CJKB0005의 경우에는 모균주에 비해 약 10.1%가 향상된 29.5g/l였다. CJKB0006의 경우에는 약 1.1%가 향상된 27.2g/l였다.

이상, 상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 CJKB0005는 모균주인 CJKB0001에 비해 포스포리보실 피로포스페이트 신세테이즈의 발현이 증가되어 균체내 펜토즈 포스페이트 경로가 강화되고, 그로 인해 리보플라빈 중간 물질인 핵산 관련 물질이 빠르게 생성되므로 리보플라빈을 고농도로 생산할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 상기 미생물을 배양하고 그 배양물로부터 리보플라빈을 대량으로 수득할 수 있는 효과가 있다.

Claims

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도 2의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pDP-P1으로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 CJKB0005(Bacillus subtilis CJKB0005) KCCM-10527.
제3항의 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 리보플라빈을 생산하는 방법.