KR101285515B1 - 변형된 트랜스케톨라제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리보즈-5-포스페이트, 리불로즈-5-포스페이트 또는 자일룰로즈-5-포스페이트가 생합성 전구체인 화합물, 예를 들어 리보플라빈(비타민 B₂), 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD), 피리독살 포스페이트(비타민 B₆), 구아노신, GMP, 아데노신, AMP를 생명공학적으로 생성시키는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 화합물을 생성시키는 생물체의 생성에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생성 균주 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 내로 도입될 때 글루코즈 상에서는 정상적인 생육을, 글루콘에이트 상에서는 감소된 생육을 허용하는 돌연변이된 트랜스케톨라제의 생성에 관한 것이다.

트랜스케톨라제, 리보플라빈.

Description

변형된 트랜스케톨라제 및 이의 용도{MODIFIED TRANSKETOLASE AND USE THEREOF}

본 발명은 변형된 트랜스케톨라제 효소를 제공한다. 야생형 트랜스케톨라제 대신 변형된 트랜스케톨라제중 하나를 합성하는 미생물은 방향족 아미노산의 독립 영양체이고, 펜토즈 포스페이트 경로를 통해 흡수되는 탄소 공급원을 사용하는데 결함이 있다. 예컨대 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD) 및 이들의 유도체 같은, 생합성을 위한 기질로서 리보즈-5-포스페이트, 리불로즈-5-포스페이트 또는 자일룰로즈-5-포스페이트를 사용하는 성분의 발효 공정에 변형된 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용할 수 있다. 또한, 피리독살 포스페이트(비타민 B₆), 구아노신 및 아데노신, 및 이들 뉴클레오타이드의 유도체의 생성에도 이들을 사용할 수 있다.

리보플라빈(비타민 B₂)은 모든 식물 및 다수의 미생물에 의해 합성되지만, 고등 동물에 의해서는 생성되지 않는다. 이는 탄수화물의 효소적 산화에 필요한 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 및 플라빈 모노뉴클레오타이드 같은 조효소에 대한 전구체이기 때문에, 리보플라빈은 기초 대사에 필수적이다. 고등 동물에서,리보플라빈이 불충분하면 탈모, 피부 염증, 시력 감퇴 및 성장 불량이 야기될 수 있다.

구아노신 트라이포스페이트(GTP) 및 리불로즈-5-포스페이트로부터의 리보플라빈의 생합성을 촉진하는데 필요한 효소는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 4개의 유전자(ribG, ribB, ribA 및 ribH)에 의해 코딩된다. 이들 유전자는 오페론에 위치하며, 이들 유전자 순서는 효소에 의해 촉진되는 효소 반응의 순서와는 상이하다. 예를 들어, 리보플라빈 생합성의 제 1 단계를 촉진하는 GTP 사이클로하이드롤라제 II는 오페론의 제 3 유전자(ribA)에 의해 코딩된다. ribA 유전자는 또한 제 2 효소 활성, 즉 리불로즈-5-포스페이트의 4개-탄소 단위인 3,4-다이하이드록시-2-뷰탄온 4-포스페이트(DHBP)로의 전환을 촉진시키는 3,4-다이하이드록시-2-뷰탄온 4-포스페이트 신타제(DHBPS)를 코딩한다. 데아미나제 및 리덕타제는 오페론의 제 1 유전자(ribG)에 의해 코딩된다. 리보플라빈 생합성의 끝에서 두번째 단계는 마지막 rib 유전자(ribH)의 생성물인 루마진 신타제에 의해 촉진된다. 경로의 최종 단계를 제어하는 리보플라빈 신타제는 오페론의 제 2 유전자(ribB)에 의해 코딩된다. rib 오페론의 3' 말단에 위치하는 유전자의 기능은 현재 불명확하지만, 그의 유전자 생성물은 리보플라빈 합성에 필요하지 않다.

ribP1 프로모터로부터의 리보플라빈 오페론의 전사는 ribP1과 ribG 사이에 위치하는 조절 리더 영역을 포함하는 감쇠 메카니즘에 의해 제어된다. 이 리더 영역 내의 ribO 돌연변이는 리보플라빈 오페론의 조절 해제된(deregulated) 발현을 야기한다. 조절 해제된 발현은 또한 ribC 유전자에 미스센스 돌연변이를 함유하는 균주에서도 관찰된다. ribC 유전자는 바실러스 서브틸리스의 플라빈 키나제/FAD 신타제를 코딩하는 것으로 밝혀졌다[맥(Mack, M.) 등, J. Bacteriol., 180:950-955, 1998]. 조절 해제 돌연변이는 ribC 유전자 생성물의 플라보키나제 활성을 감소시켜, 리보플라빈 조절 시스템의 작동자(effector) 분자인 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN)의 세포내 농도를 감소시킨다.

과거에는 다수의 상이한 방식으로, 증가된 리보플라빈 생성 속도 및 수율을 갖는 리보플라빈 생성 균주를 처리하였다. 예를 들어, (1) 전통적인 돌연변이 발생을 이용하여 선택 생물체의 게놈에 무작위적인 돌연변이를 갖는 변이주를 생성시킨 후, 퓨린 유사체에 대한 더 높은 저항성을 선택하고/하거나 리보플라빈의 증가된 생성을 선별하였다. (2) 다르게는, 리보플라빈 생합성의 말기 효소, 즉 구아노신 트라이포스페이트(GTP) 및 리불로즈-5-포스페이트의 리보플라빈으로의 전환을 촉진시키는 효소를 과발현시켜 표적 생성물로의 더 높은 흐름(flux)을 생성시켰다. 이 특정 경로의 속도-제한 효소의 비활성(specific activity)에 의해 또한 이들 효소의 기질의 세포내 농도에 의해, 생합성 경로, 예컨대 리보플라빈 생합성 경로로의 또한 상기 경로를 통한 대사 흐름이 결정된다. 효소는 포화 기질 농도 이상에서만 그의 최대 활성으로 작동될 수 있다. 포화 기질 농도는 각 효소 특유의 특징이다. 예를 들어, 리불로즈-5-포스페이트의 세포내 농도를 3,4-다이하이드록시-2-뷰탄온 4-포스페이트 신타제, 즉 리보플라빈 생합성 경로의 추정되는 속도 제한 효소의 포화 기질 농도보다 높게 또는 가능한한 상기 포화 기질 농도에 근접하게 유지시킴으로써, 리보플라빈 경로로의 대사 흐름을 증가시키거나 높은 수준으로 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 펜토즈 포스페이트 경로의 비-산화 부분을 거쳐 리불로즈-5-포스페이트가 중심 대사 내로 배출되는 것을 방지하거나 방해함으로써, 리불로즈-5-포스페이트의 높은 세포내 농도를 달성할 수 있다.

펜토즈 포스페이트 경로의 비-산화 부분의 핵심 효소는 트랜스케톨라제 효소이고, 이 효소는 리보즈-5-포스페이트 및 자일룰로즈-5-포스페이트의 세두헵툴로즈-7-포스페이트 및 글라이세르알데하이드-3-포스페이트로의 가역적인 전환을 촉진시킨다. 덧붙여, 트랜스케톨라제는 프룩토스-6-포스페이트 및 글라이세르알데하이드-3-포스페이트의 자일룰로즈-5-포스페이트 및 에리쓰로즈-4-포스페이트로의 전환도 촉진시킨다[코체토프(Kochetov, G. A.) 1982, Transketolase from yeast, rat liver, and pig liver, Methods Enzymol., 90:209-23].

트랜스케톨라제 코딩 유전자에 넉아웃 돌연변이를 갖는 트랜스케톨라제 결핍 바실러스 서브틸리스가 발효액에 축적되는 리보즈를 생성시키는 것으로 이미 보고된 바 있다[드 울프(De Wulf, P.) 및 반담(E. J. Vandamme), 1997, Production of D-ribose by fermentation, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:141-148; 사사지마(Sasajima, K.) 및 요네다(Yoneda, M.), 1984, Production of pentoses by microorganisms. Biotechnol. and Genet. Eng. Rev. 2: 175-213]. 명백하게, 트랜스케톨라제 넉아웃 돌연변이체에서는 증가된 세포내 C5 탄소 당 풀(pool)이 세균의 생리학적 요구치를 초과하여 과량의 리보즈를 분비시키는 수준까지 도달할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 3가지 단백질성 방향족 아미노산이 유도되는 에리쓰로즈-4-포스페이트를 생성시키는데 트랜스케톨라제 촉진된 반응이 또한 요구된다. 그러므로, 트랜스케톨라제 결핍 미생물은 이들 아미노산의 영양 요구체이다. 이들은 이들 아미노산 또는 이들의 생합성 전구체, 예컨대 시킴산이 배지를 통해 공급될 수 있는 경우에만 생육될 수 있다.

방향족 아미노산 또는 시킴산의 바람직하지 못한 영양 요구체에 덧붙여, 트랜스케톨라제-결핍 바실러스 서브틸리스 돌연변이체는 글루코즈 상에서의 매우 느린 생육, 결함있는 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템, 조절 해제된 탄소 이화 생성물 억제, 및 변화된 세포막 및 세포벽 조성 같은 다수의 심각한 다면 발현 효과를 나타낸다[드 울프 및 반담, 1997].

다른 트랜스케톨라제-결핍 리보플라빈 분비 바실러스 서브틸리스 균주가 거샤노비치(Gershanovich) 등[거샤노비치(Gershanovich VN), 쿠카노바(Kukanova AIa), 갈루쉬키나(Galushkina ZM), 스테파노프(Stepanov AI) (2000) Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 3:3-7]에 의해 기재되었다.

뿐만 아니라, 미국특허 제 6,258,554 B1 호는 트랜스케톨라제 활성이 결핍된 리보플라빈 과생성 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 개시한다. 미국특허 제 6,258,554 B1 호의 개시내용으로부터, 독립 영양성 복귀 돌연변이체가 야생형 트랜스케톨라제 배경 수준을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주와 유사한 양으로 리보플라빈을 생성시키기 때문에, 트랜스케톨라제 활성 및 그로 인한 아미노산 영양 요구성의 결핍이 개선된 리보플라빈 생산성에 필수적임을 알 수 있다.

이들 단점, 즉 상기 논의된 방향족 아미노산에 대한 영양 요구성 및 추가적인 다면 발현 효과로 인해 트랜스케톨라제 결핍 돌연변이체가 안정한 산업상 공정(예컨대, 이러한 균주 내에서의 리보플라빈의 산업상 생산)에 덜 바람직한 생성 균주가 된다.

일반적으로, 본 발명의 목적은 변형된 트랜스케톨라제의 촉매적 특성이 변형되지 않은 트랜스케톨라제보다 더 높은 세포내 리불로즈-5-포스페이트 및 리보즈-5-포스페이트 농도를 허용하도록 하는 방식으로 변형된, 그러나 상기 언급된 트랜스케톨라제-결핍 균주의 단점을 갖지 않는 트랜스케톨라제 돌연변이 균주를 제공하는 것이다.

놀랍게도, 최근 조절된 비활성을 가짐으로써 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 일부 잔류 흐름을 허용하는 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하는 돌연변이된 유전자로 야생형 유전자를 대체함으로써, 예컨대 바실러스 서브틸리스 같은 미생물을 유전공학적으로 변화시킴에 의해, 예컨대 독립 영양성을 상실하지 않으면서 리보플라빈 같은 발효 생성물의 생성이 크게 개선될 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 변형된 트랜스케톨라제, 상기 기재된 특성을 갖는 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 형질전환된 숙주 세포, 및 야생형 트랜스케톨라제 유전자가 돌연변이된 트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 안정적으로 대체된 숙주 세포에 기초하여 예컨대 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 피리독살 포스페이트 또는 이들의 하나 이상의 유도체 같은 발효 생성물을 생명공학적으로 생성시키는 방법에 관한 것이다.

야생형 트랜스케톨라제가 이러한 변형된 트랜스케톨라제중 하나로 대체된 돌연변이체를 단리하는 제 1 단계로서, 단백질성 방향족 아미노산에 대한 영양 요구체이고 펜토즈 포스페이트 경로를 통해 흡수되는 탄소 공급원(예컨대, 글루콘에이트)으로는 생육될 수 없는 결실 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 이어, 다양한 트랜스케톨라제 돌연변이체를 코딩하는 DNA 단편의 혼합물로 트랜스케톨라제 결실 돌연변이체를 형질전환시킬 수 있다. 독립 영양성 형질전환체를 단리할 수 있고, 이들로부터 글루콘에이트 상에서 감소된 생육 속도를 나타내는 것을 선택한다. 이러한 방법에 따라 단리된 돌연변이체는 영양 요구성 생육을 방지하기에 충분한 에리쓰로즈-4-포스페이트 생합성을 허용하지만 글루콘에이트의 흡수에 대해 장애(bottle neck)로서 작용하는 변형된 트랜스케톨라제 효소를 합성할 수 있다. 또한, 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제 결실 돌연변이체에서 전형적으로 관찰되는 원치 않는 다면 발현 효과가 방지될 수 있다. 미국특허 제 6,258,554 B1 호는 영양 요구성 생육의 독립 영양성 생육으로의 복귀와 함께, 리보플라빈 분비 코리네박테리움 글루타미쿰 트랜스케톨라제 돌연변이체가 야생형 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 유사한 균주보다 더 많은 리보플라빈을 생성시키는 이들의 능력을 상실함을 지적한다. 본 발명의 실시예에서 보여지는 바와 같이, 상기 개략적으로 기재된 바와 같이 단리된 독립 영양성 바실러스 서브틸리스 돌연변이체는 예기치 못하게 트랜스케톨라제 야생형 모 균주보다 더 많은 리보플라빈을 생성시킨 반면, 트랜스케톨라제 결실 돌연변이체는 이들의 리보플라빈 생성능을 부분적으로 상실하였다.

DNA 단편 내로 돌연변이를 도입하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 아미노산 서열의 적합한 위치를 선택하기 위하여 효모 트랜스케톨라제의 이용가능한 3D 구조중 하나를 이용하는 단백질 처리[린드크비스트(Lindqvist, Y.), 슈나이더(G. Schneider), 엄러(U. Ermler) 및 선드스트롬(M. Sundstrom), 1992, Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution. Embo. J. 11:2373-9]에 의해, 또는 무작위적인 돌연변이 생성에 의해 트랜스케톨라제 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 두 경우 모두에서의 선택 과정은 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 야생형 트랜스케톨라제에 대한 대체물로서 사용되는 경우, 변형된 트랜스케톨라제는 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원(예컨대, 글루콘에이트) 상에서의 숙주 세포의 성장을 야생형 트랜스케톨라제를 함유하는 숙주 세포에 비해 감소된 생육 속도로 허용하는 촉매 특성, 즉 조절된 비활성을 나타낸다. 이들 특성은 더 높은 세포내 리불로즈-5-포스페이트 및 리보즈-5-포스페이트 농도 및 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 잔류 흐름을 생성시켜, 영양 요구성 생육을 방지하기에 충분한 에리쓰로즈-4-포스페이트를 생성시킬 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 "야생형 효소" 또는 "야생형 트랜스케톨라제"는 본 발명에 따른 돌연변이를 디자인하기 위한 출발점으로서 사용되는 상기 정의된 임의의 트랜스케톨라제를 포함할 수 있다. 야생형 트랜스케톨라제는 진핵 생물 또는 원핵 생물, 바람직하게는 특히 에스케리치아(Escherichia), 바실러스, 코리네박테리움, 사카로마이세스(Saccharomyces), 에레모테시움(Eremothecium), 칸디다(Candida) 또는 아시비아(Ashbya)로부터, 바람직하게는 에스케리치아 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 할로두란스(B. halodurans), 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 에레모테시움 고씨피(E. gossypii), 코리네박테리움 플라레리(C. flareri) 또는 아시비아 고씨피(A. gossypii) 또는 도 1에 도시된 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열을 갖는 임의의 트랜스케톨라제로부터 선택되는 진균 또는 세균 기원일 수 있다. 가장 바람직하게는, 트랜스케톨라제는 바실러스 서브틸리스로부터 유래된다. "상동"은 도 1에 도시된 아미노산 서열중 하나 이상과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 더욱 바람직하게는 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 동일한 트랜스케톨라제를 일컫는다. 본 발명과 관련하여 "야생형"은 천연으로부터 유래되는 트랜스케톨라제 서열 및 합성 트랜스케톨라제 효소의 변이체 둘 다를 포함할 수 있다(이들이 도 1에 도시된 서열중 임의의 하나와 상동인 한). 용어 "야생형 트랜스케톨라제" 및 "변형되지 않은 트랜스케톨라제"는 본원에서 교환 가능하게 사용된다.

당해 분야에 공지되어 있는 용어 "% 동일성"은 경우에 따라 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 가닥 사이의 매치에 의해 결정되는 상기 서열 사이의 연관성의 정도를 의미한다. "동일성"은 예컨대 매개변수(갭 생성 페널티 8, 갭 연장 페널티 2(결핍 매개변수))를 사용하는 프로그램 베스트핏(BESTFIT)[GCG 위스콘신 패키지, 버전 10.2, 액셀리즈 인코포레이티드(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 92121-3752 샌디에고 스크랜턴 로드 9685 소재]을 사용하여 공지 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본원에 사용되는 "돌연변이체", "돌연변이 효소", "돌연변이된 효소" 또는 "돌연변이 트랜스케톨라제" 또는 "변형된 트랜스케톨라제"는 본 발명의 교시에 따라 소정의 야생형 효소/트랜스케톨라제(상기 정의에 따른)로부터 유도될 수 있는 임의의 변이체를 의미하고, 숙주 생물체/세포의 야생형 유전자를 대체하여 사용되는 경우 예컨대 글루콘에이트 및/또는 리보즈 상에서의 생육에 대해 효과를 가져야 한다. 본 발명의 영역에 있어서, 돌연변이체(들)가 수득되는 방법은 의미가 없으며; 이러한 돌연변이체는 예를 들어 부위-특이적 돌연변이 발생, 포화 돌연변이 발생, 무작위적인 돌연변이 발생/방향성 분자 진화, 전체 세포/생물체의 화학적 또는 UV 돌연변이 발생 등에 의해 수득될 수 있다. 이들 돌연변이체는 또한 예를 들어 합성 유전자를 디자인함으로써 생성될 수 있고/있거나 시험관내(무세포(cell-free)) 번역에 의해 생성될 수도 있다. 비활성을 시험하기 위하여, 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 방법에 의해 돌연변이체를 (과)발현시킬 수 있다. 용어 "돌연변이 트랜스케톨라제", "변형된 트랜스케톨라제" 또는 "돌연변이된 트랜스케톨라제"는 본원에서 교환 가능하게 사용된다.

"숙주 세포"는 소정의 발효 생성물을 생성시킬 수 있고 야생형 트랜스케톨라제 또는 본 발명에 따른 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있는 세포이다. 적합한 숙주 세포는 미생물 세포를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "비활성"은 코체토프(Kochetov)의 문헌[코체토프, 1982, Transketolase from yeast, rat liver, and pig liver. Methods Enzymol. 90:209-23]에 기재되어 있는 적절하게 한정된 반응 조건하에서의 야생형 및 돌연변이 트랜스케톨라제 효소의 반응 속도를 나타낸다. "비활성"은 소정의 시간 내에 한정된 온도에서 한정된 양의 단백질당 소비되는 기질의 양 및/또는 생성되는 생성물의 양을 정의한다. 전형적으로 "비활성"은 1분당 단백질 1mg당 소비되는 기질 또는 생성되는 생성물(μ몰)로 표현된다. 전형적으로, μ몰/분은 U(=단위)로 약칭된다. 그러므로, μ몰/분/(단백질 mg) 또는 U/(단백질 mg)의 비활성에 대한 단위 정의를 본원 전체에서 교환 가능하게 사용한다. 본 발명과 관련하여, 유사하거나 바람직하게는 동일한 폴리펩타이드 쇄 길이에 기초하여 비활성을 비교해야 함을 알아야 한다.

다수의 돌연변이가 상기 기재된 바와 같이 글루콘에이트 상에서의 생육이 영향을 받도록 하는 방식으로 야생형 트랜스케톨라제를 변화시킬 수 있다.

본 발명의 목적은 변형된 트랜스케톨라제의 아미노산 서열이 상응하는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 아미노산 서열과 비교할 때 하나 이상의 돌연변이를 함유하는, 상기 정의된 특성을 갖는 변형된 트랜스케톨라제를 제공하는 것이다.

하나 이상의 돌연변이는 부가, 결실 및/또는 치환일 수 있다.

바람직하게는, 하나 이상의 돌연변이는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 아미노산 서열에 존재하는 소정의 아미노산이 본 발명의 변형된 트랜스케톨라제의 아미노산 서열의 상이한 아미노산으로 대체된 하나 이상의 아미노산 치환이다. 변형된 트랜스케톨라제의 아미노산 서열은 상응하는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 아미노산 서열과 비교할 때 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 변형된 트랜스케톨라제는 서열 번호:2에 도시된 바와 같은 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제 아미노산 서열의 아미노산 위치 357에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 함유한다.

추가적인 실시양태에서, 변형된 트랜스케톨라제는 상응하는 트랜스케톨라제의 아미노산 서열과 비교할 때 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 치환을 함유한다. 예를 들어, 변형된 트랜스케톨라제는 상응하는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 아미노산 서열과 비교할 때 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 1 내지 4, 2 내지 10, 2 내지 7, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 10, 3 내지 7, 3 내지 5 또는 3 내지 4개의 아미노산 치환을 함유한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 변형되지 않은 트랜스케톨라제는 서열 번호:2에 도시된 바와 같이 바실러스, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스로부터 수득될 수 있다. 상응하는 DNA 서열이 서열 번호:1에 기재된다. 변형된 트랜스케톨라제는 서열 번호:2의 위치 357에 하나 이상의 돌연변이를 함유하여, 상기 기재된 특성을 갖는 변형된 트랜스케톨라제를 생성시킨다.

서열 번호:2에 도시된 아미노산 357에 상응하는 위치에 위치한 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 하나 이상의 아미노산 치환은 치환 R357H, R357A, R357S, R357N, R357T, R357K, R357I, R357V, R357G 및 R357L로부터 선택될 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 돌연변이된 트랜스케톨라제는 서열 번호:2에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 위치 357에 상응하는 아미노산 위치에 영향을 주고 치환 R357H, R357A, R357S, R357N, R357T, R357K, R357I, R357V, R357G 및 R357L로부터 선택될 수 있는 하나의 치환으로 구성된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 변형된 트랜스케톨라제는 상응하는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 아미노산 서열과 비교할 때 둘 이상의 아미노산 치환을 함유하며, 이 때 하나 이상의 돌연변이는 서열 번호:2에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 위치 357에 상응하고 치환 R357H, R357A, R357S, R357N, R357T, R357K, R357I, R357V, R357G 및 R357L로부터 선택될 수 있다.

변형되지 않은 트랜스케톨라제에 존재하는 아미노산은 바람직하게는 위치 357의 아르기닌이다. 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 서열의 아미노산은 위치 357에서 히스티딘, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 리신, 트레오닌, 류신, 글라이신, 아이소류신 또는 발린으로 변화될 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호:2에 도시된 서열의 위치 357에 상응하는 아미노산 위치에서의 치환은 아르기닌의 히스티딘으로의, 아르기닌의 알라닌으로의, 아르기닌의 세린으로의, 아르기닌의 류신으로의, 아르기닌의 리신으로의, 아르기닌의 아스파라긴으로의, 아르기닌의 트레오닌으로의, 아르기닌의 글라이신으로의, 아르기닌의 아이소류신으로의, 아르기닌의 발린으로의 대체로 구성된다.

본 발명의 변형된 트랜스케톨라제는 바람직하게는 그의 N- 또는 C-말단에 외래 아미노산을 포함할 수 있다. "외래 아미노산"은 천연(천연 발생) 트랜스케톨라제에 존재하지 않는 아미노산, 바람직하게는 천연 케톨라제에 존재하지 않는 약 3개 이상, 약 5개 이상 또는 약 7개 이상의 연속적인 아미노산의 연장부를 의미한다. 바람직한 외래 아미노산의 연장부는 재조합 기법으로 생성된 변형된 트랜스케톨라제의 정제를 용이하게 하는 "택(tag)"을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 이러한 택의 예는 "His₆" 택, FLAG 택, myc 택 등을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 비활성을 계산하기 위하여, 값을 이들 부가적인 아미노산(상기 참조)에 대해 보정해야 할 필요가 있다.

다른 실시양태에서, 변형된 트랜스케톨라제는 상응하는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 아미노산 서열과 비교할 때 하나 이상, 예컨대 2개의 결실을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 결실은 상응하는 변형되지 않은 트랜스케톨라제의 N- 또는 C-말단 아미노산에 영향을 끼치며, 효소의 기능성, 예컨대 비활성을 크게 감소시키지는 않는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에 사용되는 "폴리뉴클레오타이드"는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 더욱 전형적으로는 이중 가닥 또는 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 하나 이상의 통상적이지 않은 염기, 예컨대 이노신, 또는 하나 이상의 변형된 염기, 예를 들어 트리틸화된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다.

변형되지 않은 트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 용이하게 수득할 수 있다. 이러한 변형되지 않은 트랜스케톨라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 예는 도 1의 아미노산 서열을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 변형되지 않은 트랜스케톨라제는 바실러스, 구체적으로는 바실러스 서브틸리스로부터 유래되며, 더욱 바람직한 것은 서열 번호:2에 도시된 변형되지 않은 트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.

변형되지 않은 트랜스케톨라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 내로 돌연변이, 예컨대 부가, 결실 및/또는 치환을 도입하는 방법은 부위-특이적 돌연변이 발생 및 PCR에 기초한 방법을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.

예를 들어 젠뱅크(Genbank)(인텔리제네틱스(Intelligenetics), 미국 캘리포니아주 소재), 유러피안 바이오인포매틱스 인스티튜트(European Bioinformatics Institute)(영국 캠브리지 힌스턴 홀 소재), NBRF(조지타운 대학 메디컬 센터, 미국 워싱턴 디씨 소재) 및 벡베이스(Vecbase)(위스콘신 대학 바이오테크놀로지 센터, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구입가능한, 당해 분야에 공지되어 있는 트랜스케톨라제 효소-코딩 게놈 또는 cDNA 서열로부터, 또는 시험관내 돌연변이 발생 방법에 의해 도 1에 개시된 서열 정보로부터 출발하여 본 발명의 DNA 서열을 구축할 수 있다[예컨대, 샘브룩(Sambrook) 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕]. 본 발명을 실행하는데 또한 적합할 수 있는 소정의 DNA 서열을 돌연변이시키는 다른 가능성은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 이용에 의한 돌연변이 발생이다. 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning]에 기재되어 있는 방법에 의해 개별 균주/생물체로부터 출발물질로서의 DNA를 단리할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 구축되고/돌연변이되는 트랜스케톨라제를 코딩하는 DNA는 또한 공지의 DNA 서열에 기초하여, 예를 들어 당해 분야에 공지되어 있는(예컨대 유럽특허 제 747483 호에 기재되어 있는) 방법에 의해 합성 유전자를 구축함으로써도 제조될 수 있다.

본 발명의 완전한 DNA 서열을 수득한 후에는, 이들을 당해 분야에 공지되어 있고 예를 들어 샘브룩 등의 상기 문헌에 기재되어 있는 방법에 의해 벡터 내로 통합시키거나 바로 숙주 생물체의 게놈 내로 도입하여, 적절한 숙주 시스템 내에서 코딩된 폴리펩타이드를 (과)발현시킬 수 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 또한 DNA 서열 자체를 사용하여 본 발명의 적합한 숙주 시스템을 형질전환시킴으로써 코딩된 폴리펩타이드의 (과)발현을 달성할 수 있음을 알 것이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 상기 정의된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하고 특이적인 변형된 트랜스케톨라제 효소의 임의의 DNA 서열과 표준 조건하에서 하이브리드 형성되는(예를 들어, 서열 번호:1에 따른 DNA 서열과 하이브리드 형성되는) DNA 서열; 또는 (ii) 상기 정의된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하지만 유전자 암호의 퇴보(degeneracy)로 인해 하이브리드 형성되지는 않으나, 본 발명의 특이적인 변형된 트랜스케톨라제 효소의 임의의 DNA 서열과 표준 조건하에서 하이브리드 형성되는 DNA 서열과 정확하게 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열; 또는 (iii) 폴리펩타이드(하기 단편이 이의 단편임)의 활성을 유지하는 이러한 변형된 DNA 서열의 단편인 DNA 서열을 제공한다.

하이브리드 형성의 "표준 조건"은 본 발명에 있어서 특이적인 하이브리드 형성 신호를 검출하기 위해 당해 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 사용되고 예컨대 샘브룩 등의 문헌["Molecular Cloning", 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 뉴욕]에 기재되어 있는 조건, 또는 바람직하게는 당해 분야의 숙련자가 잘 알고 있고 예를 들어 샘브룩 등의 상기 문헌에 기재되어 있는 소위 엄격한 하이브리드 형성 및 엄격하지 않은 세척 조건, 더욱 바람직하게는 소위 엄격한 하이브리드 형성 및 엄격한 세척 조건을 의미한다. 엄격한 하이브리드 형성 조건의 구체적인 예는 50% 폼아마이드, 5×SSC(150mM NaCl, 15mM 시트르산삼나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5×덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20㎍/ml 변성 및 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 하룻밤동안 배양(예컨대, 15시간)한 후, 약 65℃에서 0.1×SSC 중에서 하이브리드 형성 지지체를 세척하는 것이다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 구체적으로 기재된 DNA 서열에 기초하여 디자인된 도 2에 도시된 PCR 프라이머에 의한 소위 폴리머라제 연쇄 반응 방법("PCR")에 의해 수득될 수 있는 DNA 서열을 추가적으로 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 단리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 균질해질 때까지 정제된다.

용어 "단리된"은 물질이 그의 원래 환경(예를 들어, 천연 발생되는 경우 천연 환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 미생물에 존재하는 천연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이 아니지만, 천연 시스템에 공존하는 물질중 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 천연 환경중 일부가 아니기 때문에 여전히 단리된 것이다.

본원에 사용되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 그가 유래되는 생물체의 천연 발생 게놈에서 바로 인접하는 코딩 서열(5'-말단상의 하나 및 3'-말단상의 하나) 둘 다와 바로 인접하지 않은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 그러므로, 한 실시양태에서, 핵산은 코딩 서열에 바로 인접한 5'-비-코딩(예컨대, 프로모터) 서열중 일부 또는 전부를 포함한다. 따라서, 용어 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 예를 들어 벡터 내로, 독립적으로 복제되는 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 혼입되거나, 또는 다른 서열과는 독립적으로 별도의 분자(예컨대, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배지(재조합 DNA 기법에 의해 생성되는 경우), 또는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질(화학적으로 합성되는 경우)을 실질적으로 함유하지 않는 추가적인 폴리펩타이드를 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA도 포함한다. 뿐만 아니라, "단리된 핵산 단편"은 천연에서 단편으로서 발생되지 않고 천연 상태로 발견되지 않는 핵산 단편이다.

본원에 사용되는 용어 단리된 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드를 실질적으로 함유하지 않는 폴리펩타이드를 말한다. 단리된 폴리펩타이드는 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 순수하다. 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 따라, 예를 들어 SDS-PAGE 및 후속 단백질 염색에 의해 순도를 결정할 수 있다. 이어, 밀도 측정법에 의해 단백질 밴드를 정량할 수 있다. 순도를 결정하는 추가 방법은 통상적인 기술 수준 내에 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 변형된 트랜스케톨라제 및 상응하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 숙주 세포의 유전공학적 처리에 사용하여, 이를 생합성을 위한 기질로서 리보즈-5-포스페이트, 리불로즈-5-포스페이트 또는 자일룰로즈-5-포스페이트를 사용하는 성분의 발효 공정에 더욱 우수하고 더욱 효과적이도록 만들 수 있다. 적합한 숙주 세포 내에서의 상기 변형된 트랜스케톨라제의 존재는 더 높은 세포내 리불로즈-5-포스페이트 및 리보즈-5-포스페이트 농도 및 상기 재조합 숙주 내에서의 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 잔류 흐름을 생성시켜, 영양 요구성 생육을 방지하기에 충분한 에리쓰로즈-4-포스페이트를 생성시킬 수 있다.

적절한 숙주 세포는 예를 들어 아스퍼질러스(Aspergillus), 예를 들어 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 또는 트리코더마(Trichoderma), 예컨대 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 또는 아시비아, 예를 들어 아시비아 고씨피, 또는 에레모테시움, 예컨대 에레모테시움 아시비 같은 진균, 또는 사카로마이세스, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애, 또는 칸디다(Candida), 예를 들어 칸디다 플라레리, 또는 피키아(Pichia), 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 예컨대 한세눌라 폴리모파(DSM 5215) 같은 효모이다. 사용될 수 있는 세균은 예를 들어 바실러스, 예컨대 바실러스 서브틸리스, 또는 스트렙토마이세스, 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)이다. 사용될 수 있는 에스케리치아 콜라이는 예를 들어 에스케리치아 콜라이 K12 균주, 예컨대 M15 또는 HB 101이다.

그러므로, 본 발명은 미생물이 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원(예컨대, 글루콘에이트) 상에서 야생형 트랜스케톨라제를 함유하는 숙주 세포와 비교하여 감소된 생육 속도로 생육될 수 있도록 하는 방식으로, 트랜스케톨라제의 활성을 변경시킨 미생물에 관한 것이다. 일반적으로, 특정 생물체, 예를 들어 바실러스 서브틸리스로부터 유래되는 수득된 트랜스케톨라제 돌연변이체를 동일한 생물체 내에 다시 도입하고, 숙주 세포로서 또는 임의의 수득된 돌연변이체를 임의의 다른 관련 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 사용할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "생육 속도"는 세균 세포가 둘로 분열됨으로써 재생됨을 나타낸다. 생육이 제한되지 않으면, 이분화가 일정 속도로 지속되어, 각각의 연속적인 시간에 따라 세포의 수 및 개체군 증가 속도 둘 다가 2배로 된다. 이러한 유형의 기하급수적인 생육의 경우, 시간(바람직하게는 시간)에 대한 세포 수의 자연 로그 플롯팅은 직선을 생성시킨다. 이 선의 기울기는 생물체의 특이적인 생육 속도이고, 이는 세포 1개당 단위 시간당 분열 수의 척도이다. 음식에서는, 이용될 수 있는 영양분의 양이 유한하고 노폐물이 축적되기 때문에 세균이 지속적으로 생육될 수 없다. 이러한 조건에서는, 생육 곡선이 S자형이 되는 경향이 있다.

본 발명의 목적은 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원(구체적으로는, 글루콘에이트) 상에 변형된 트랜스케톨라제를 갖는 본 발명에 따른 재조합 숙주 세포(예컨대, 미생물)의 생육 속도가 야생형 생물체와 비교할 때 100% 미만인 상기 재조합 숙주 세포를 제공하는 것이다. 특히, 생육 속도는 야생형 생물체의 생육 속도에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상까지 감소될 수 있다. 바람직하게는, 생육 속도 감소는 야생형 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 세포에 비해 10 내지 90%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80%, 더욱더 바람직하게는 25 내지 75%이다.

특히, 본 발명은 야생형 트랜스케톨라제 유전자가, 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 것은 아닌 탄소 공급원 상에서는 약간 감소되거나 감소되지 않은 생육을 허용하지만 생물체가 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원 상에서 생육될 때에는 명확하게 감소된 생육 속도를 나타내는 효소를 코딩하는 변형된 트랜스케톨라제 유전자로 대체된, 유전공학적으로 처리된/재조합 기법으로 생성된 숙주 세포(재조합 세포 또는 형질전환된 세포라고도 함)에 관한 것이다. 이러한 유전공학적으로 처리된 숙주 세포는 원치 않는 영양 요구성 생육 및 다면 발현 효과가 방지될 수 있는 이점과 함께 발효 생성물의 수율 및 생성 공정의 효율 개선을 나타낸다.

본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 트랜스케톨라제를 발현시킬 수 있는 숙주 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다:

(i) 개별적인 야생형 효소와 비교하여 조절된 활성을 나타내는 돌연변이된 트랜스케톨라제를 생성시키는 단계, 즉 a) 채택되어야 하는 촉매 활성을 갖는 제 1 또는 변형되지 않은 트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하고; b) 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 서열이 제 1 트랜스케톨라제와 비교할 때 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 함유하는 새로운 또는 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하도록 폴리뉴클레오타이드 서열 내로 하나 이상의 돌연변이를 도입하며(이때, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 서열 번호:2에 도시된 아미노산 서열 위치 357에 상응하는 아미노산에 존재할 수 있다); c) 임의적으로는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 벡터 또는 플라스미드에 삽입하는 단계;

(ii) 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 것은 아닌 탄소 공급원 상에서는 정상적이거나 약간 감소된 생육을 허용하지만 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원 상에서 미생물을 생육시킬 때에는 생육 속도에 대해 효과를 나타내는 동일한 생물체 또는 다른 생물체로부터의 트랜스케톨라제 변이체로 숙주 세포의 야생형 트랜스케톨라제(들)를 대체하는 단계, 즉 a) 유전자의 조절 서열을 변화시키지 않으면서 적합한 야생형 숙주 세포의 야생형 트랜스케톨라제를 대체하고; b) 최소 배지에서 글루콘에이트 상에서의 생육 속도를 결정하고 이를 야생형 숙주 균주와 비교하며; c) 야생형 균주의 100% 미만인 글루콘에이트상에서의 생육 속도를 허용하는 트랜스케톨라제 돌연변이체를 선택하는 단계.

본 발명은 또한 a) 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 것은 아닌 탄소 공급원 상에서는 약간 감소되거나 감소되지 않은 생육을 허용하지만 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원 상에서 생물체를 생육시킬 때에는 감소된 생육 속도를 나타내는 효소를 코딩하는 변형된 트랜스케톨라제 유전자로 야생형 트랜스케톨라제 유전자를 대체시킨 유전공학적으로 처리된/재조합 기법으로 생성된 숙주 세포를 배양하고; b) 발효 생성물을 배지로부터 분리함을 포함하는, 리보즈-5-포스페이트, 리불로즈-5-포스페이트 또는 자일룰로즈-5-포스페이트의 부산물인 성분을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용되는 "발효 생성물"은 생합성에 기질로서 리보즈-5-포스페이트, 리불로즈-5-포스페이트, 또는 자일룰로즈-5-포스페이트가 사용되는, 상기 정의된 적합한 세포에 의해 생성되는 임의의 생성물일 수 있다. 이러한 발효 생성물의 예는 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD) 및 이들의 전구체, 피리독살 포스페이트(비타민 B₆), 구아노신, 아데노신 및 이들 뉴클레오타이드의 유도체를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명과 관련하여 "리보플라빈 전구체" 및 "리보플라빈, FMN 또는 FAD의 유도체"는 이들의 (생)합성에 중간체 또는 기질로서 리불로즈-5-포스페이트 또는 리불로즈-5-포스페이트를 필요로 하는 임의의 모든 대사산물(들)을 포함한다. 본원과 관련하여, 이러한 (생)합성 경로가 천연적인지 아닌지(즉, 경로가 천연에서 발생되지 않고 생명공학적으로 처리됨)의 여부는 상관없다. 바람직하게는, 합성 경로는 특성상 생화학적이다. 리보플라빈 전구체 및 리보플라빈, FMN 또는 FAD의 유도체는 DRAPP; 5-아미노-6-리보실아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온-5'-포스페이트; 2,5-다이아미노-6-리비틸아미노-4(3H)-피리미딘온-5'-포스페이트; 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4-(1H,3H)-피리미딘다이온-5'-포스페이트; 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온; 6,7-다이메틸-8-리비틸루마진(DMRL); 및 황색 단백질을 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 용어 "리보플라빈"은 또한 예컨대 리보플라빈-5-포스페이트 같은 이들의 유도체, 및 예컨대 소듐 리보플라빈-5-포스페이트 같은 이들의 염을 포함한다.

본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 재조합 숙주 세포 및 방법을 상기 정의된 발효 생성물중 하나 이상의 생명공학적 생성에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 적합한 숙주 세포의 유전공학적 및 대사적 처리 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 유사하게, 예컨대 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 피리독살 포스페이트 또는 이들의 하나 이상의 유도체에 (잠재적으로) 적합한 정제 방법은 정제 화학약품 생합성 및 생성 분야에 널리 공지되어 있다.

예컨대 본 발명에 따른 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, FMN, FAD, 피리독살 포스페이트 또는 이들의 하나 이상의 유도체 같은 발효 생성물의 생명공학적 생성 방법은 상기 기재된 전체 세포 발효 공정으로 한정되지는 않으며, 예를 들어 투과성(permeabilized) 숙주 세포, 조질 세포 추출물, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 세포 찌꺼기로부터 정제된 세포 추출물, 또는 단리된 효소를 사용하여 재구성된 반응 경로도 사용할 수 있다. 또한, 이러한 공정의 조합도 본 발명의 영역에 속한다. 세포-비함유 생합성(예컨대, 재구성된 반응 경로)의 경우, 단리된 효소가 숙주 세포에 의해 제조되고 숙주 세포로부터 단리되었는지, 시험관내 전사/번역에 의해 생성되었는지, 또는 또 다른 수단에 의해 생성되었는지의 여부는 관계없다.

발효 배지는 적합한 탄소 기질을 함유해야 한다. 적합한 기질은 글루코즈 또는 프룩토스 같은 모노사카라이드, 락토즈 또는 슈크로즈 같은 올리고사카라이드, 전분 또는 셀룰로즈 같은 폴리사카라이드 또는 이들의 혼합물 및 재생가능한 공급원료로부터의 정제되지 않은 혼합물을 포함할 수 있지만 이들로 국한되지는 않는다. 본 발명에서 사용되는 탄소 공급원은 다양한 탄소 함유 기질을 포괄할 수 있고 생물체의 선택에 의해서만 한정되는 것으로 생각된다.

본원에 기재된 본 발명의 다양한 실시양태를 교차 조합할 수 있다.

이제, 하기 비한정적인 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 예시한다. 이들 실시예는 도면을 참조하여 기재된다.

구체적으로, 도 1은 에스케리치아 콜라이(TKT_ECOLI), 바실러스 서브틸리스(TKT_BACSU), 바실러스 리케니포미스(TKT_BACLD), 바실러스 할로두란스(TKT_BACHD), 코리네박테리움 글루타미쿰(TKT_CORGL), 사카로마이세스 세레비지애(TKT_YEAST) 및 아시비아 고씨피(TKT_ASHGO)로부터의 트랜스케톨라제 아미노산 서열의 프로그램 클러스탈W(1.83)에 의해 계산된 다중 서열 배열을 도시한다. 하기 실시예중 하나에 논의되는 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제의 아미노산 잔기 357에 일치하는/상응하는 위치는 굵은 글씨로 표시된다. 이러한 위치에 사용되는 번호는 바실러스 서브틸리스 야생형 아미노산 서열에 따라 매겨진다. 이러한 유형의 배열은 표준 매개변수를 사용하는 클러스탈(CLUSTAL) 또는 파일업(PILEUP)으로 수행될 수 있다. 도시되는 바와 같이, 트랜스케톨라제의 아미노산 서열은 고도로 보존성이다. 특히, 도시된 모든 트랜스케톨라제 및 도시되지 않은 훨씬 더 많은 트랜스케톨라제에서, 아르기닌 357(바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제에 따라 번호매겨짐)은 보존된다. 그러므로, 본원에 보고된 개념 및 돌연변이를 사용하는 유형의 실험은 또한 리보플라빈, 리보플라빈 유도체 또는 전구체로서 리보즈-5-포스페이트, 자일룰로즈-5-포스페이트 또는 리불로즈-5-포스페이트를 갖는 화합물의 생성을 개선시키기 위하여 아시비아 고씨피 같은 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제의 아미노산 서열의 위치 357에 일치하는 위치에 아르기닌을 갖는 다른 트랜스케톨라제를 사용하여 수행될 수 있다. 생물체의 원래 트랜스케톨라제 유전자를, DNA 서열을 새로운 생물체에 적합화시키거나 시키지 않고서 위치 357에서 돌연변이된 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제 돌연변이 유전자로 대체시킬 수도 있다. 트랜스케톨라제 돌연변이 유전자가 반드시 곧 도입하려고 하는 생물체로부터 유래되어야 하는 것은 아니다. 다른 숙주 생물체에 요구되는 실제 단계는 공개되어 있고 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 다른 곳에 개략적으로 기재되어 있다.

도 1a 내지 1c는 상기 이미 언급된 바와 같이 변형되지 않은 트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 예를 도시한다.

도 2는 프라이머 세트를 도시한다.

실시예 1: 바실러스 서브틸리스로부터의 게놈 DNA 의 단리

공급처의 설명에 따라 퀴아젠(Qiagen)[퀴아젠 게엠베하(QIAGEN GmbH), 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재]으로부터의 디엔이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit)를 사용하여 gDNA를 제조하였다. 37℃(250rpm)에서 배양된 VY 액체 배지[벡턴 디킨슨(Becton Dickinson), 미국 메릴랜드주 21152 스팍스 소재]중의 바실러스 서브틸리스의 하룻밤 배양액 3ml중 1ml를 세균 세포의 공급원으로서 사용하였다. 마지막으로, AE 완충액(키트로부터 공급됨) 200㎕에 gDNA를 용리시켰다.

실시예 2: 바실러스 서브틸리스로부터의 트랜스케톨라제 유전자의 증폭

tkt 유전자의 증폭에 바실러스 서브틸리스 PY79로부터의 gDNA를 사용하였다[영맨(P. Youngman), 퍼킨스(J. Perkins) 및 로식(R. Losick), (1984), Construction of a cloning site near one end of Tn917 into which foreign DNA may be inserted without affecting transposition in Bacillus subtilis or expression on the transposon-borne erm gene. Plasmid 12:1-9; 실시예 1 참조]. 게놈 DNA 서열에 따라, tkt 유전자는 그의 코딩 서열(서열 번호:1)의 내부에 하나의 Eco RI 부위를 함유한다. pQE80(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재) 같은 에스케리치아 콜라이 발현 벡터 내로 클로닝하는데 Eco RI 제한 부위를 일반적으로 사용하기 때문에, C315를 T로 대체함으로써(이는 TTC로부터 TTT로 페닐알라닌 코돈을 변화시키는 침묵 돌연변이임) 부위를 결실시켰다. 이를 위해, 두 별도의 PCR A 및 B를 수행하였다. PCR A에 하기 PCR 조건을 사용하였다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 tkt 1S(서열 번호:3에 따라, 또한 도 2 참조) 및 tkt 2AS(서열 번호:4에 따라, 도 2) 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정(proof-reading) DNA 폴리머라제[스트라타젠(Stratagene), 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재] 2.5U, 게놈 DNA(실시예 1) 100ng.

온도 조절은 다음과 같았다:

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 52℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 30초

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 35회 반복하였다.

하기 조건하에서 PCR B를 수행하였다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 tkt 2S(서열 번호:8에 따라, 도 2) 및 tkt 1AS(서열 번호:13에 따라, 도 2) 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, 게놈 DNA(실시예 1) 100ng.

온도 조절은 다음과 같았다:

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 52℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 2분

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 35회 반복하였다.

아가로즈 겔 전기 영동 및 퀴아젠(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재) 제품인 민일루트 겔 익스트랙션 키트(MinElute Gel Extraction Kit)를 사용하는 겔로부터의 후속 추출에 의해 두 PCR 생성물 A 및 B를 정제시켰다. PCR 생성물 A 및 B의 중첩 영역을 사용하여, 하기 제 3 PCR에 의해 이들을 조합할 수 있었다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 Rpi MutS(서열 번호:5에 따라, 도 2) 및 tkt 1ASohne(서열 번호:6에 따라, 도 2) 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, PCR 생성물 A 및 PCR 생성물 B 100ng.

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 53℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 2.5분

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 35회 반복하였다.

퀴아젠 PCR 정제 키트(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재)의 도움으로 PCR 생성물을 정제시키고, 50㎕ 용리 완충액 중에 용리시켰다. Eco RI 소화에 의해 PCR 생성물을 확인하였다. 추가 확인을 위하여, 이를 프라이머 tkt 1S, tkt 2S, tkt 2AS, tkt 3S(서열 번호:9에 따라, 도 2), tkt 4S(서열 번호:10에 따라, 도 2), tkt 5S(서열 번호:11에 따라, 도 2), tkt 6S(서열 번호:12에 따라, 도 2), tkt 1AS로 서열 결정하였다.

실시예 3: tkt 돌연변이체의 구축

효모 트랜스케톨라제의 기질 결합에 대한 영향을 나타내는 돌연변이의 선택과 함께 효모 트랜스케톨라제의 3D 구조를 이용할 수 있었으며[닐슨(Nilsson, U.), 메샬키나(L. Meshalkina), 린드크비스트 및 슈나이더, 1997, At position R359 (number 357 in the B. subtilis transketolase)], 원래의 아르기닌을 거의 모든 다른 아미노산으로 대체하였다. 돌연변이의 구축은 기본적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 효모, 바실러스 서브틸리스 및 다른 생물체로부터의 트랜스케톨라제를 포함하는 아미노산 서열 배열이 도 1에 도시된다.

템플레이트로서 Eco RI-비함유 tkt 유전자를 사용하여(실시예 2), Eco RI 부위의 결실에 대해 이미 기재된 바와 같이 돌연변이를 도입하였다. PCR A 및 B에 하기 PCR 조건을 사용하였다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 Rpi MutS (A) 또는 tkt 357nnn-S (B) 및 tkt 357AS (A)(서열 번호:14에 따라, 도 2) 또는 tkt 1ASohne (B) 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, Eco RI-비함유 tkt 유전자(실시예 2) 100ng. PCR B의 경우, 도입된 아미노산에 따라 센스 프라이머를 선택하였다: 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제의 위치 357에서 아스파라긴의 경우 tkt 357N-S(서열 번호:15에 따라, 도 2), 글루타민의 경우 tkt 357Q-S(서열 번호:16에 따라, 도 2), 알라닌의 경우 tkt 357A-S(서열 번호:17에 따라, 도 2), 리신의 경우 tkt 357K-S(서열 번호:18에 따라, 도 2), 세린의 경우 tkt 357S-S(서열 번호:19에 따라, 도 2), 트레오닌의 경우 tkt 357T-S(서열 번호:20에 따라, 도 2), 히스티딘의 경우 tkt 357H-S(서열 번호:21에 따라, 도 2), 발린의 경우 tkt 357V-S(서열 번호:22에 따라, 도 2), 아이소류신의 경우 tkt 357I-S(서열 번호:23에 따라, 도 2), 류신의 경우 tkt 357L-S(서열 번호:24에 따라, 도 2), 메티오닌의 경우 tkt 357M-S(서열 번호:25에 따라, 도 2), 및 글라이신의 도입의 경우 tkt 357G-S(서열 번호:26에 따라, 도 2).

온도 조절은 다음과 같았다:

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 52℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 60초

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 35회 반복하였다.

아가로즈 겔 전기 영동 및 퀴아젠(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재) 제품인 민일루트 겔 익스트랙션 키트를 사용하는 겔로부터의 후속 추출에 의해 두 PCR 생성물 A 및 B를 정제시켰다. 하기 제 3 PCR에서 PCR 생성물 A 및 B를 조합하였다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 Rpi MutS 및 tkt 1ASohne 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, PCR 생성물 A 및 PCR 생성물 B 100ng.

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 53℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 2.5분

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 35회 반복하였다.

퀴아젠 PCR 정제 키트(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재)로 트랜스케톨라제의 PCR 생성물을 정제시키고, 50㎕ 용리 완충액 중에 용리시켰다. 바실러스 서브틸리스의 형질전환에 PCR 생성물을 사용하였다.

실시예 4: 트랜스케톨라제 -결핍 바실러스 서브틸리스 균주의 구축

바실러스 서브틸리스 게놈의 원래 tkt 위치 내로 돌연변이된 트랜스케톨라제 유전자를 마커 없이 도입하기 위하여, 트랜스케톨라제-결핍 균주를 구축하였다. 바실러스 서브틸리스 트랜스케톨라제 유전자(서열 번호:2)의 염기쌍 452 내지 1042 및 염기쌍 1562 내지 2001을 포함하는 PCR에 의해 수득된 두 DNA 단편을 네오마이신 내성 유전자 카세트와 조합하였다[이타야(M. Itaya), 곤도(K. Kondo) 및 다나카(T. Tanaka), 1989, A neomycin resistance gene cassette selectable in a single copy state in the Bacillus subtilis chromosome, Nucleic Acids Res 17:4410]. PCR A에 하기 PCR 조건을 사용하였다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 tkt Rec1S(서열 번호:27에 따라, 도 2) 및 tkt Rec1AS(서열 번호:28에 따라, 도 2) 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, 실시예 2의 증폭된 tkt 유전자 100ng.

온도 조절은 다음과 같았다:

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 52℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 30초

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 30회 반복하였다.

하기 조건하에서 PCR B를 수행하였다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 tkt Rec 2S(서열 번호:29에 따라, 도 2) 및 tkt Rec 2AS(서열 번호:30에 따라, 도 2) 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, 실시예 2에서 증폭된 tkt 유전자 100ng.

온도 조절은 다음과 같았다:

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 52℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 2분

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 30회 반복하였다.

아가로즈 겔 전기 영동 및 퀴아젠(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재) 제품인 민일루트 겔 익스트랙션 키트를 사용하는 겔로부터의 후속 추출에 의해 두 PCR 생성물 A 및 B를 정제시켰다. 네오마이신 내성 카세트의 서열과 두 PCR 생성물 A 및 B의 중첩 영역 덕분에, 하기 제 3 PCR에 의해 이들을 조합할 수 있다: DNA 폴리머라제와 함께 공급되는 적절한 완충액중 프라이머 tkt Rec 1S 및 tkt Rec 2AS 2μM, 각 뉴클레오타이드(ATP, GTP, TTP, CTP) 0.2mM, 교정 DNA 폴리머라제(스트라타젠, 네덜란드 1101 씨비 암스테르담 쥐두스트 게보우 캘리포니아 소재) 2.5U, PCR 생성물 A 100ng, PCR 생성물 B 100ng 및 네오마이신 내성 카세트 100ng.

단계 1: 95℃에서 3분

단계 2: 95℃에서 30초

단계 3: 55℃에서 30초

단계 4: 72℃에서 2.5분

단계 5: 72℃에서 5분

단계 2 내지 4를 35회 반복하였다.

5개의 조합 PCR을 모으고 퀴아젠 PCR 정제 키트(퀴아젠 게엠베하, 독일 40724 힐덴 퀴아젠 스트라세 1 소재)로 정제시킨 후, 50㎕ 용리 완충액 중에 용리시켰다. 아가로즈 겔 전기영동에 의해 올바른 PCR 생성물을 확인하고, 바실러스 서브틸리스 PY79의 형질전환에 사용하였다. 쿤스트(Kunst) 등의 문헌[쿤스트, 드바보일(M. Debarbouille), 사덱(T. Msadek), 영(M. Young), 마우엘(C. Mauel), 카라마타(D. Karamata), 클리어(A. Klier), 라포포트(G. Rapoport) 및 드돈더(R. Dedonder), 1988, Deduced polypeptides encoded by the Bacillus subtilis sacU locus share homology with two-component sensor-regulator system, J Bacteriol 170:5093-101]에 따라 경쟁적인 바실러스 서브틸리스 세포를 제조하였다. MNGE+박토 카사미노 산(CAA) 2ml, MN-배지(13.6g/l K₂HPO₄, 6.0g/l KH₂PO₄, 0.88g/l 시트르산나트륨*2H₂O) 9ml, 글루코즈(20%) 1ml, 글루탐산칼륨(40%) 40㎕, 암모늄 아이언(III) 시트레이트(2.2mg/l, 새로 제조됨) 50㎕, 트립토판(8mg/l) 100㎕, MgSO₄(1M) 30㎕, 박토 카사미노 산[20%, 벡턴 디킨슨 아게(Becton Dickinson AG), 스위스 체하-4002 바젤 포스트파흐 소재] +/- 50㎕를 단일 콜로니에 접종하고 37℃ 및 250rpm에서 하룻밤동안 배양하였다. 이 배양액을 사용하여 10ml MNGE+CAA(0.1의 출발 OD_500nm)를 접종하고 1.3의 OD_500nm에 도달할 때까지 쉐이킹하면서(250rpm) 37℃에서 배양하였다. 배양액을 동일 부피의 MNGE w/o CAA로 희석시키고 추가로 1시간동안 배양하였다. 원심분리 단계(10분, 4000rpm, 20℃) 후, 상청액을 멸균 관에 따라내었다. 펠렛을 유지된 상청액의 1/8에 재현탁시켰다. 세포 300㎕를 1.7ml MN(1×), 43㎕ 글루코즈(20%) 및 34㎕ MgSO₄(1M)에 희석시켰다. 제조된 PCR 생성물 10 및 20㎕를 희석된 경쟁 세포 400㎕에 첨가하고 37℃에서 30분간 쉐이킹시켰다. 발현 혼합물[5% 효모 추출물(벡턴 디킨슨 아게, 스위스 체하-4002 바젤 포스트파흐 소재) 500㎕, CAA(20%) 125㎕, 선택을 위해 사용되는 경우 최종 항생제 농도(2㎍/ml 네오마이신)의 1/100, 및 멸균 정제수 750㎕] 100㎕를 첨가하고 세포를 37℃에서 1시간동안 쉐이킹하였다. 마지막으로, 세포를 회전 침강시키고 상청액 200㎕에 현탁시킨 다음, 2㎍/ml의 네오마이신을 함유하는 TBAB 플레이트(벡턴 디킨슨 아게, 스위스 체하-4002 바젤 포스트파흐 소재)에 평판 배양시켰다.

두 형질전환체를 VY 배지[효모 추출물(벡턴 디킨슨 아게, 스위스 체하-4002 바젤 포스트파흐 소재) 5g/l, 송아지 주입액(시그마(Sigma)) 25g/l]에서 생육시켰다. 형질전환체중 하나(BS3402로 지칭됨)로부터, 실시예 1에 기재된 바와 같이 게놈 DNA를 단리하고, 염기쌍 1043 내지 1561로부터의 트랜스케톨라제 DNA 단편이 네오마이신 유전자 카세트에 의해 올바르게 대체되었는지를, 프라이머로서 tkt Rec 1S 및 tkt Rec 2AS를 사용하는 표준 PCR에 의해 확인하였다. 트랜스케톨라제 결실 돌연변이체에서 예측되는 바와 같이, 균주는 유일한 탄소 공급원으로서의 리보즈 또는 글루콘에이트 상에서 생육할 수 없었고, 생육을 위해 3가지 방향족 아미노산 모두 또는 시킴산을 필요로 하였다.

실시예 5: 트랜스케톨라제 변이체의 유전자를 사용한 트랜스케톨라제 -결핍 바실러스 서브틸리스 균주 BS3402 의 형질전환

증폭된 트랜스케톨라제 유전자 및 그의 변이체(실시예 2 및 3)의 DNA 0.5 및 1㎍을 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 BS3402를 형질전환시켰다. 최소 배지[SMS-배지((NH₄)₂SO₄ 2g/l, K₂HPO₄ 14g/l, KH₂PO₄ 6g/l, 시트르산삼나트륨 1g/l, MgSO₄*7H₂O 0.2g/l; 1.5% 한천(벡턴 디킨슨 아게, 스위스 체하-4002 바젤 포스트파흐 소재) 및 미량 원소(500배 농도: MnSO₄×1H₂O 5.0g/l, CoCl₂*6H₂O 2.0g/l, (NH₄)₆Mo₇O₂₄*4H₂O 0.75g/l, AlCl₃*6H₂O 0.5g/l, CuCl*2H₂O 0.375g/l))중 글루코즈 및 솔비톨 2g/l]에서 생육시킴으로써 양성 콜로니를 확인하였다. 24 내지 48시간 후에는 콜로니를 볼 수 있었다. 모든 형질전환체는 네오마이신에 대해 감수성이어서, 네오마이신 유전자가 도입된 야생형 및 돌연변이된 tkt 유전자로 대체되었음을 나타내었다. 형질전환체로부터 게놈 DNA를 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 tkt 유전자를 증폭시켰다. 서열 결정에 의해 도입된 돌연변이를 확인하였다. 더 이상의 뉴클레오타이드 교환은 관찰되지 않았다. 생성된 바실러스 서브틸리스 균주는 다음과 같이 칭해졌다: R357A-BS3403, R357H-BS3482, R357K-BS3484, R357G-BS3512, R357V-BS3487, R357I-BS3509, R357L-BS3507, R357T-BS3492, R357S-BS3490, R357M-BS3505, R357N-BS3486, R357Q-BS3488.

실시예 6: 트랜스케톨라제 -결핍 야생형 균주 BS3402 의 박테리오파지 PBS -1 용해물 을 사용한 바실러스 서브틸리스 RB50 ::[ pRF69 ]( EP 0405 370 호)의 형질 도입

파지 PBS-1을 사용한 형질 도입 연구는 헨킨(Henkin) 등의 문헌[헨킨 및 챔블리스(G. H. Chambliss), 1984, Genetic mapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4. Mol Gen Genet 193:364-9]에 기재된 바와 같이 수행하였다. PBS-1 용해물의 제조를 위해, 균주 BS3402를 37℃에서 하룻밤동안 TBAB 플레이트(5㎍/ml 네오마이신) 상에서 생육시켰다. 세포를 사용하여 LB 배지(벡턴 디킨슨 아게, 스위스 체하-4002 바젤 포스트파흐 소재) 25ml에 클레트(Klett) 20 내지 30의 OD(녹색 필터 사용)까지 접종하였다. 세포의 50%가 운동성일 때, PBS-1 파지 용해물[헨킨 및 챔블리스, 1984, Genetic mapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4. Mol Gen Genet 193:364-9] 0.2ml를 배양액 0.8ml에 첨가하였다. 쉐이킹하에 37℃에서 30분간 배양한 후, LB 배지 9ml를 첨가하였다. 이어, 37℃에서 추가로 30분간 배양하였다. 이어, 클로르암페니콜 4㎍/ml를 첨가하고 추가로 2시간동안 계속 배양하였다. 마지막으로, 관을 37℃의 건조 배양기 내로 옮기고, 여기에 하룻밤동안 놓아두었다. 다음날 아침, 배양액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고 4℃에서 저장하거나 형질 도입을 위해 바로 사용하였다.

리보플라빈 과생성 균주 RB50::[pRF69]의 형질 도입을 위하여, 균주를 TBAB 플레이트 상에서 37℃에서 하룻밤동안 생육시켰다. 이 플레이트의 세포를 사용하여 LB-배지 25ml에 접종시켰다(클레트 20 내지 30). 배양액이 클레트 175에 도달하면, 세포 0.8ml를 상기에서와 같이 제조된 균주 BS3402로부터의 PBS-1 파지 용해물 0.2ml와 혼합하였다. 쉐이킹하에 37℃에서 30분간 배양한 후, 세포를 회전 침강시키고 VY 배지 1ml에 현탁시켰다. 이에 이어, 동일한 조건하에서 1시간동안 배양하였다. 형질 도입된 세포 200 내지 1000㎕를, 네오마이신 2㎍/ml를 함유하는 선택 플레이트 상에 평판 배양시켰다. 생육된 콜로니를 네오마이신 내성에 대해 시험하였다. gDNA 단리(실시예 1) 후, 프라이머 tkt 1S 및 Rec 2AS를 사용하는 표준 PCR을 수행하여, tkt 야생형 유전자가 실시예 4의 구축물로 대체되었음을 확인하였다. 확인된 균주를 BS3523이라고 칭하였다.

실시예 7: 변형된 트랜스케톨라제 유전자의 균주 BS3523 내로의 도입

균주 BS3403, BS3482, BS3484, BS3486, BS3490 및 BS3512의 PBS-1 용해물을 제조하기 위하여, 각각의 균주를 TBAB 플레이트(5㎍/ml 네오마이신) 상에서 37℃에서 하룻밤동안 생육시켰다. 이들 플레이트로부터의 세포를 사용하여 LB 배지 25ml에 클레트 20 내지 30의 OD(녹색 필터 사용)까지 접종시켰다. 세포의 50%가 운동성일 때(약 클레트 150), PBS-1 파지 용해물(헨킨 및 챔블리스, 1984, Genetic mapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4. Mol Gen Genet 193:364-9) 0.2ml를 배양액 0.8ml에 첨가하였다. 약한 쉐이킹 또는 터닝(turning)(롤러 드럼)하에 37℃에서 30분간 배양한 후, LB-배지 9ml를 세포에 첨가하였다. 이들을 동일한 조건하에서 추가로 30분간 배양하였다. 클로르암페니콜을 4㎍/ml의 농도까지 첨가하고, 추가로 2시간동안 계속 배양하였다. 관을 쉐이킹시키지 않으면서 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 다음날 아침, 0.45㎛ 필터를 통해 배양액을 여과하고 4℃에서 저장하거나 후속 형질 도입을 위해 바로 사용하였다. 이를 위하여, 트랜스케톨라제-결핍 균주 BS3523(실시예 6 참조)을 TBAB 플레이트 상에서 37℃에서 하룻밤동안 생육시켰다. 플레이트로부터의 세포를 사용하여 LB-배지 25ml에 접종하였다(클레트 20 내지 30). 배양액을 쉐이킹하에 37℃에서 배양하였다. 배양액이 클레트 175에 도달하면, 세포 0.8ml를 상기 기재된 바와 같이 각 균주 BS3403, BS3482, BS3484, BS3486, BS3490 및 BS3512의 PBS-1 파지 용해물 0.2ml와 혼합하였다. 쉐이킹하에 37℃에서 30분간 배양한 후, 세포를 회전 침강시키고 VY 배지 1ml에 현탁시켰다. 동일한 조건하에서 1시간동안 배양한 다음, 세포를 다시 회전 침강시키고 1×SMS 배지 0.2ml에 현탁시키고 선택 플레이트 상으로 평판 배양시켰다(글루코즈 1g/l, 솔비톨 1g/l 및 15% 아가로즈를 갖는 1×상기 기재된 SMS). 생육된 콜로니를 네오마이신 내성 상실에 대해 시험하였다. gDNA를 단리한(실시예 1) 후, 프라이머 tkt 1S 및 Rec 2AS를 사용하는 표준 PCR을 수행하여 게놈 DNA로부터 tkt 유전자를 증폭시켰다. 불활성화된 tkt 유전자가 완전한 유전자로 대체된 콜로니의 tkt 유전자를 서열 결정하여 돌연변이의 존재를 확인하였다. 생성된 균주는 BS3525(BS3484 용해물), BS3528(BS3482 용해물), BS3530(BS3486), BS3534(BS3403 용해물), BS3535(BS3490 용해물), BS3541(BS3512 용해물)로 칭하였다.

실시예 8: 글루코즈 및 글루콘에이트 상에서의 트랜스케톨라제 돌연변이 균주의 생육

바실러스 서브틸리스의 활력 및 생육에 대한 트랜스케톨라제 돌연변이의 효과를 평가하기 위하여, 2g/l 글루코즈 또는 글루콘에이트 상에서 생성된 균주의 최대 생육 속도를 결정하였다. 하기 배지를 사용하였다: 1×SMS((NH₄)₂SO₄ 2g/l, K₂HPO₄ 14g/l, KH₂PO₄ 6g/l, 시트르산삼나트륨 1g/l, MgSO₄*7H₂O 0.2g/l), 글루코즈 또는 글루콘에이트 2g/l, 효모 추출물 500㎍/l 및 실시예 5에 기재된 미량 원소 용액. 배플을 갖는 300ml들이 플라스크 내의 상기 기재된 배지 25ml에 하룻밤 배양액(5ml VY, 1ml의 새로운 VY에 재현탁됨)을 클레트 20 내지 30의 OD까지 접종하였다. 이들을 쉐이킹(220rpm)하에 37℃에서 배양하였다. 배양액의 OD를 잠복기 동안 1시간의 간격으로 측정하였다. 대수기동안 간격을 30분으로 감소시켰다. 대수기 동안 적어도 4개의 데이터 지점을 사용하여 최대 생육 속도를 결정하였다.

야생형 균주 PY79는 예측된 바와 같이 두 기질 상에서 최고 생육 속도를 나타내었다. 트랜스케톨라제 위치 357에서의 상이한 돌연변이의 도입에 의해, 글루콘에이트 상에서의 생육은 예측된 바와 같이 글루코즈 상에서의 생육보다 훨씬 더 많이 영향을 받았다. 글루콘에이트 상에서의 최대 생육 속도의 감소를, 비-산화 펜토즈 포스페이트 전환을 통한 흐름 및 펜토즈 포스페이트의 축적에 대한 트랜스케톨라제 돌연변이의 효과의 척도로서 사용하였다. 도시된 돌연변이는 광범위한 생육 속도를 망라하였다.

실시예 9: 쉐이킹되는 플라스크에서의 리보플라빈 생성

클로르암페니콜(10㎍/ml)을 함유하는 VY 5ml를 리보플라빈 생성 균주 RB50::[pRF69], BS32525, BS3528, BS34530, BS3434, BS34335 및 BS3441(실시예 7 참조)로 접종하였다. 하룻밤동안 배양한 후, 세포를 회전 침강시키고(15분, 4000rpm), 선별 배지(2×SMS, 글루코즈 10g/l, 효모 추출물 1g/l 및 실시예 5에 기재된 바와 같은 미량 원소) 1ml에 현탁시켰다. 선별 배지 25ml를 함유하는 배플이 있는 200ml들이 플라스크를 재현탁된 세포 0.25ml로 접종하였다. 배양액을 수-포화된 대기에서 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 48시간의 배양시간(그 동안 공급된 글루코즈는 모든 배양액에서 다 사용되었음) 후, 배양액으로부터 0.5ml 샘플을 취하고 4N NaOH 35㎕를 첨가한 다음, 혼합물을 1분간 휘저었다. 1M 인산칼륨 완충액(pH 6.8) 465㎕를 그 직후에 첨가하였다. 14000rpm에서 5분간 원심분리[에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 5415D]시킴으로써 혼합물을 정제하였다. 상청액을 새로운 관으로 옮겨넣었다. 리보플라빈을 결정하는 두 가지 상이한 방법을 이용하였다. 열량 측정의 경우, 상청액 200㎕를 물 800㎕로 희석시켰다. 444nm에서의 흡광도를 0.03305의 계수와 곱하여 배지 1리터당 리보플라빈의 그램수를 수득하였다. 최종 결과를 위해, 수득된 값을 부피 차이에 대해 보정하였다. 또한, 실시예 10에 따라 HPLC에 의해서도 리보플라빈 농도를 결정하였다. 결과는 표 2에 기재된다.

트랜스케톨라제 돌연변이를 함유하는 거의 모든 바실러스 균주는 명확하게 증가된 리보플라빈 생성을 나타낸 반면, 트랜스케톨라제 음성 균주는 대조용 균주보다 적은 리보플라빈을 생성시켰다. R357H 돌연변이의 경우에는, 리보플라빈의 농도가 거의 2배였다.

실시예 10: 리보플라빈 발효

EP 405370 호에 기재된 바와 같이 발효를 수행하였다.

균주 (1) RB50::[pRF69], (2) BS3534(R357A), 및 (3) BS3528(R357H)을 사용하여 발효를 수행하였다. 24시간 및 48시간의 발효 시간 후에, 배양액중 리보플라빈 및 생물량(세포 건조 중량)의 농도를 측정하였다. 표 3에 기재되는 바와 같이, 모 균주 RB50::[pRF69]는 48시간 내에 9.8g/l의 리보플라빈을 생성시켜 기질에 대해 3.59%(w/w)의 수율을 나타내었다. 20.3%(w/w)의 기질에 대한 수율로 생물량을 생성시켰다. 변형된 트랜스케톨라제 유전자를 발현하는 RB50::[pRF69]의 유도체는 리보플라빈 생성에서 상당한 증가를 나타내었다. BS3528 및 BS3534는 각각 11.7g/l 및 14.6g/l를 생성시켰다. 이는 BS3528의 경우 4.23%의 글루코즈 상에서의 수율 및 BS3534의 경우 5.14%의 수율에 각각 상응한다(표 3). 이들 결과는 트랜스케톨라제 활성의 변화가 리보플라빈 생산성의 증가로 이어짐을 입증한다.

실시예 11: 리보플라빈을 결정하기 위한 분석 방법

리보플라빈을 결정하기 위하여, 하기 분석 방법을 이용할 수 있다[브레첼(Bretzel) 등, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999].

크로마토그래피 시스템은 이중 펌프, 칼럼 열전쌍 및 냉각되는 자동 샘플러가 설치된 휴렛-팩커드(Hewlett-Packard) 1100 시스템이었다. 다이오드 어레이 검출기 및 형광 검출기를 인라인으로 사용하였다. 2개의 신호, 즉 280nm에서의 UV 및 여기 446nm, 방출 520nm에서의 형광 추적을 기록하였다.

가드 카트리지와 함께 스테인레스-강 슈퍼코실(Supercosil) LC-8-DB 칼럼(150×4.6mm, 3㎛ 입자 크기)을 사용하였다. 이동상은 100mM 아세트산(A) 및 메탄올(B)이었다. 하기 계획에 따른 구배 용리를 이용하였다:

시간[분]	% A	% B
0	98	2
6	98	2
15	50	50
25	50	50

칼럼 온도는 20℃로 설정하였고, 유속은 1.0ml/분이었다. 실행 시간은 25분이었다.

발효 샘플을 희석 및 여과하고, 추가로 처리하지 않고 분석하였다. 외부 기준물과 비교함으로써 리보플라빈을 정량하였다. 계산은 280nm에서의 UV 신호에 기초하였다. 플루카(Fluka)(스위스 9471 부흐스 소재)에서 구입한 리보플라빈을 기준 물질(순도≥99.0%)로서 사용하였다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Modified transketolase and use thereof <130> 24818 <160> 30 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2004 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 1 atggatacaa ttgaaaagaa atcagttgct accattcgca cactgtcaat agacgctatt 60 gaaaaagcaa attctggtca cccagggatg ccgatgggag ccgctccaat ggcatacacg 120 ctgtggacaa aatttatgaa cgtaagtccg gcaaaccctg gctggtttaa ccgtgaccgt 180 tttgttttat ctgctggaca cgggtcagca ctattataca gcatgcttca tttaagcggg 240 tttgatctta gtattgaaga tcttaaggga ttccgccagt ggggcagcaa aacaccagga 300 catccggaat tcggacatac tgccggtgtt gatgctacaa caggtccgct tggccaagga 360 attgccatgg cagtcggtat ggcaattgct gaacgccatt tagcggaaac atacaaccgc 420 gattcattta acgtagtcga tcattataca tacagtattt gcggtgatgg tgatttaatg 480 gaaggtattt cttctgaagc cgcttcactc gcaggccatc ttcagcttgg ccgtctgatc 540 gtactatacg attctaatga catctctctt gatggagacc tcgaccgttc attctctgaa 600 aacgtgaaac agcgttttga agcaatgaat tgggaagttc tttatgttga ggatggaaac 660 aatattgaag aattaacagc ggctatcgaa aaagcacgcc aaaatgaaaa gaaacctaca 720 ttaattgaag tgaaaacgac aatcggattc ggttcaccta accgtgccgg tacatccggt 780 gttcacggtg cgccgcttgg taaagaagaa agcaaattaa caaaagaagc ttacgcgtgg 840 acatatgaag aagacttcta cgttccgtca gaagtttatg agcatttcgc tgtagctgtt 900 aaagaatcag gtgagaaaaa agaacaagaa tggaatgctc aattcgctaa atataaagaa 960 gtttatcctg aacttgctga acagcttgaa ctggcaatca aaggagagct tccgaaggac 1020 tgggatcaag aggttcctgt gtatgaaaaa ggaagcagtt tggcatcccg tgcatcttcc 1080 ggtgaagttc tcaacggact tgcgaaaaaa attcctttct ttgtcggagg ttctgctgac 1140 ctagcgggat cgaacaaaac gactattaaa aatgccggtg attttacagc ggttgattac 1200 tcaggcaaaa acttctggtt tggtgtacgt gaatttgcga tgggtgcggc cttaaacggt 1260 atggcgcttc atggcggtct tcgtgtattc ggcggaactt tctttgtctt ctctgattac 1320 ctgcgtcctg cgattcgcct tgcagcgtta atgggccttc ctgtgacata tgtcttcaca 1380 catgacagta ttgcggttgg tgaagacggt ccgacgcacg agcctgttga acagcttgct 1440 tcactccgtg cgatgcctaa cctttctttg atccgtccag cagacggcaa tgagacagca 1500 gcagcatgga agcttgcagt gcaaagcact gaccacccaa cagcgctagt gcttacacgt 1560 caaaaccttc ctaccatcga tcaaacatct gaagaagcat tggcaggagt agaaaaaggt 1620 gcatatgtcg tttctaaatc taaaaacgaa acacccgacg ctcttctcat cgcttccgga 1680 tcagaggtag gtcttgcaat tgaagcgcag gctgaattgg caaaagaaaa tatcgatgtt 1740 tctgttgtca gcatgccttc aatggaccgt tttgagaaac aatctgatga atacaaaaac 1800 gaagtccttc ctgcagatgt gaaaaaacgt cttgcaattg aaatgggctc atcatttgga 1860 tggggcaaat acacggggct tgaaggtgac gttctcggca tagaccgatt cggtgcatct 1920 gctcctggtg aaaccatcat taacgaatac ggcttctcag ttccgaacgt agtgaatcga 1980 gttaaggcat taatcaataa gtaa 2004 <210> 2 <211> 667 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Asp Thr Ile Glu Lys Lys Ser Val Ala Thr Ile Arg Thr Leu Ser 1 5 10 15 Ile Asp Ala Ile Glu Lys Ala Asn Ser Gly His Pro Gly Met Pro Met 20 25 30 Gly Ala Ala Pro Met Ala Tyr Thr Leu Trp Thr Lys Phe Met Asn Val 35 40 45 Ser Pro Ala Asn Pro Gly Trp Phe Asn Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser 50 55 60 Ala Gly His Gly Ser Ala Leu Leu Tyr Ser Met Leu His Leu Ser Gly 65 70 75 80 Phe Asp Leu Ser Ile Glu Asp Leu Lys Gly Phe Arg Gln Trp Gly Ser 85 90 95 Lys Thr Pro Gly His Pro Glu Phe Gly His Thr Ala Gly Val Asp Ala 100 105 110 Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Met Ala Val Gly Met Ala 115 120 125 Ile Ala Glu Arg His Leu Ala Glu Thr Tyr Asn Arg Asp Ser Phe Asn 130 135 140 Val Val Asp His Tyr Thr Tyr Ser Ile Cys Gly Asp Gly Asp Leu Met 145 150 155 160 Glu Gly Ile Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ala Gly His Leu Gln Leu 165 170 175 Gly Arg Leu Ile Val Leu Tyr Asp Ser Asn Asp Ile Ser Leu Asp Gly 180 185 190 Asp Leu Asp Arg Ser Phe Ser Glu Asn Val Lys Gln Arg Phe Glu Ala 195 200 205 Met Asn Trp Glu Val Leu Tyr Val Glu Asp Gly Asn Asn Ile Glu Glu 210 215 220 Leu Thr Ala Ala Ile Glu Lys Ala Arg Gln Asn Glu Lys Lys Pro Thr 225 230 235 240 Leu Ile Glu Val Lys Thr Thr Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Arg Ala 245 250 255 Gly Thr Ser Gly Val His Gly Ala Pro Leu Gly Lys Glu Glu Ser Lys 260 265 270 Leu Thr Lys Glu Ala Tyr Ala Trp Thr Tyr Glu Glu Asp Phe Tyr Val 275 280 285 Pro Ser Glu Val Tyr Glu His Phe Ala Val Ala Val Lys Glu Ser Gly 290 295 300 Glu Lys Lys Glu Gln Glu Trp Asn Ala Gln Phe Ala Lys Tyr Lys Glu 305 310 315 320 Val Tyr Pro Glu Leu Ala Glu Gln Leu Glu Leu Ala Ile Lys Gly Glu 325 330 335 Leu Pro Lys Asp Trp Asp Gln Glu Val Pro Val Tyr Glu Lys Gly Ser 340 345 350 Ser Leu Ala Ser Arg Ala Ser Ser Gly Glu Val Leu Asn Gly Leu Ala 355 360 365 Lys Lys Ile Pro Phe Phe Val Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser 370 375 380 Asn Lys Thr Thr Ile Lys Asn Ala Gly Asp Phe Thr Ala Val Asp Tyr 385 390 395 400 Ser Gly Lys Asn Phe Trp Phe Gly Val Arg Glu Phe Ala Met Gly Ala 405 410 415 Ala Leu Asn Gly Met Ala Leu His Gly Gly Leu Arg Val Phe Gly Gly 420 425 430 Thr Phe Phe Val Phe Ser Asp Tyr Leu Arg Pro Ala Ile Arg Leu Ala 435 440 445 Ala Leu Met Gly Leu Pro Val Thr Tyr Val Phe Thr His Asp Ser Ile 450 455 460 Ala Val Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Glu Pro Val Glu Gln Leu Ala 465 470 475 480 Ser Leu Arg Ala Met Pro Asn Leu Ser Leu Ile Arg Pro Ala Asp Gly 485 490 495 Asn Glu Thr Ala Ala Ala Trp Lys Leu Ala Val Gln Ser Thr Asp His 500 505 510 Pro Thr Ala Leu Val Leu Thr Arg Gln Asn Leu Pro Thr Ile Asp Gln 515 520 525 Thr Ser Glu Glu Ala Leu Ala Gly Val Glu Lys Gly Ala Tyr Val Val 530 535 540 Ser Lys Ser Lys Asn Glu Thr Pro Asp Ala Leu Leu Ile Ala Ser Gly 545 550 555 560 Ser Glu Val Gly Leu Ala Ile Glu Ala Gln Ala Glu Leu Ala Lys Glu 565 570 575 Asn Ile Asp Val Ser Val Val Ser Met Pro Ser Met Asp Arg Phe Glu 580 585 590 Lys Gln Ser Asp Glu Tyr Lys Asn Glu Val Leu Pro Ala Asp Val Lys 595 600 605 Lys Arg Leu Ala Ile Glu Met Gly Ser Ser Phe Gly Trp Gly Lys Tyr 610 615 620 Thr Gly Leu Glu Gly Asp Val Leu Gly Ile Asp Arg Phe Gly Ala Ser 625 630 635 640 Ala Pro Gly Glu Thr Ile Ile Asn Glu Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn 645 650 655 Val Val Asn Arg Val Lys Ala Leu Ile Asn Lys 660 665 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 aggagaaatc atatggatac aattgaaaag aaatcag 37 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ggacatactg ccggtgttga 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ggatgccaaa ctgcttcc 18 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 agcagtttgg catccaacgc atcttccggt gaagttc 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 agcagtttgg catcccaagc atcttccggt gaagttc 37 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 agcagtttgg catccgcagc atcttccggt gaagttc 37 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 18 agcagtttgg catccaaagc atcttccggt gaagttc 37 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 19 agcagtttgg catcctcagc atcttccggt gaagttc 37 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 20 agcagtttgg catccacagc atcttccggt gaagttc 37 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 21 agcagtttgg catcccatgc atcttccggt gaagttc 37 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 22 agcagtttgg catccgtggc atcttccggt gaagttc 37 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> 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Claims (20)

1. 서열 번호:2에 나타낸 위치 357에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이를 함유하는 아미노산 서열을 갖는 변형된 트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 유전공학적으로 처리된 바실러스(Bacillus)로부터 선택된 리보플라빈-생성 미생물로서, 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원 상에서의 상기 미생물의 생육 속도가 변형되지 않은 트랜스케톨라제를 함유하는 바실러스에 비해 10 내지 90% 감소되고, 상기 미생물이 방향족 아미노산에 대해 독립 영양성(prototrophic)을 유지하는, 리보플라빈-생성 미생물.
2. 제 1 항에 있어서,

   트랜스케톨라제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 서열 번호:1에 나타낸 것인, 리보플라빈-생성 미생물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 리보플라빈-생성 미생물을, 변형된 트랜스케톨라제의 발현을 허용하는 조건하에 배지에서 배양시키고, 배지로부터 발효 생성물을 분리함을 포함하는, 리보즈-5-포스페이트, 리불로즈-5-포스페이트 또는 자일룰로즈-5-포스페이트가 생합성 전구체인 물질을 생성시키는 방법.
4. 제 3 항에 있어서,

   발효 생성물이 리보플라빈, 리보플라빈 전구체, 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD), 피리독살 포스페이트 및 이들의 하나 이상의 유도체로부터 선택되는, 방법.
5. 변형된 트랜스케톨라제를 사용하여 미생물에서 리보플라빈을 생성시키는 방법으로서, 상기 변형된 트랜스케톨라제의 아미노산 서열이 서열 번호:2에 나타낸 위치 357에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이를 함유하고, 펜토즈 포스페이트 경로에 의해서만 대사되는 탄소 공급원 상에서의 상기 미생물의 생육 속도가 변형되지 않은 트랜스케톨라제를 함유하는 바실러스에 비해 10 내지 90% 감소되고, 상기 미생물이 방향족 아미노산에 대해 독립 영양성을 나타내는, 방법.
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