BR112021009177A2 - Produção aprimorada de riboflavina - Google Patents
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Abstract
produção aprimorada de riboflavina. a presente invenção se refere a um processo aprimorado para produção de vitamina b2 usando uma célula hospedeira geneticamente manipulada compreendendo uma enzima heteróloga com atividade de piridoxal fosfatase. ao usar a dita célula hospedeira modificada, o rendimento de produção de riboflavina poderia ser aumentado em pelo menos cerca de 5 %.
Description
[0001] A presente invenção se refere a um processo aprimorado para produção de vitamina B2 usando uma célula hospedeira geneticamente manipulada compreendendo uma enzima heteróloga com atividade de piridoxal fosfatase. Ao usar a dita célula hospedeira modificada, o rendimento de produção de riboflavina poderia ser aumentado em pelo menos cerca de 5 %.
[0002] A riboflavina é sintetizada por todas as plantas e muitos microrganismos, mas não é produzida por animais superiores. A riboflavina é essencial para metabolismo básico, devido ao fato de ser um precursor de coenzimas como dinucleotídeo de flavina adenina e mononucleotídeo de flavina que são exigidos na oxidação enzimática de carboidratos. Em animais superiores, o suprimento de riboflavina insuficiente pode causar perda de pelo, inflamação da pele, deterioração de visão e falha de crescimento.
[0003] A biossíntese de riboflavina começa a partir de trifosfato de guanosina (GTP) e ribulose-5-fosfato. Os genes envolvidos na biossíntese de riboflavina são conhecidos a partir de várias fontes, como, por exemplo, Bacillus subtilis, Ereothecium ashbyii, Ashbya gossypii, Candida flareri, Saccharomyces cerevisiae, E. coli (consulte, por exemplo, o documento EP405370, a Figura 2 no documento EP1186664 ou Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7ª Edição, 2007, Capítulo Vitamins).
[0004] O estabelecimento de um processo de produção industrial que usa microrganismos, como, por exemplo, cepas de Bacillus, exige alguma modificação da cepa hospedeira e/ou das condições de processo (consulte, por exemplo, Kil et al., Mol Gen Genet 233, 483-486, 1992; Mack et al., J. Bacteriol., 180:950-955, 1998). O fluxo metabólico para o interior e através da via biossintética de riboflavina precisa ser mantido em um alto nível ao manter as concentrações intracelulares de ribulose-5-fosfato acima ou o mais próximo possível da concentração de substrato de saturação da 3,4-di-hidroxi-2-butanona 4-fosfato sintase, uma enzima limitante de taxa presumida para a via biossintética de riboflavina.
[0005] A transcrição do operon de riboflavina do promotor rib (Prib) é controlada por um riboswitch que envolve uma região líder reguladora não traduzida de quase 300 nucleotídeos localizados na região 5' do operon rib entre o início de transcrição e o códon de início de tradução do primeiro gene no operon, ribG. O alongamento do RNA de riboflavina nascente é dependente da presença ou ausência de FMN ou FAD: na presença desses efetores, um grampo de terminação de transcrição é formado (assim chamado terminador rib), em que, em sua ausência, a formação de um assim chamado antiterminador resulta em transcrição através de leitura do operon rib.
[0006] Assim, o estabelecimento de um processo industrial que usa microrganismos envolve um processo multienzimático altamente sofisticado com vários gargalos, como, por exemplo, a manutenção de um fluxo metabólico direto eficaz ao longo de todo o processo.
[0007] Surpreendentemente, constatou-se que uma fosfatase específica conhecida a partir da via biossintética de vitamina B6 desempenha um papel importante na produção fermentativa de riboflavina, levando a pelo menos cerca de 5 % de aumento em rendimento.
[0008] Particularmente, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de riboflavina, como, por exemplo, uma célula hospedeira (recombinante) compreendendo (e que expressa) genes biossintéticos de riboflavina, particularmente, um Bacillus que produz riboflavina, compreendendo uma enzima heteróloga com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74].
[0009] De acordo com a presente invenção, uma célula hospedeira produtora de riboflavina pode ser qualquer célula hospedeira adequada que tem capacidade de produzir riboflavina, isto é, que compreende (e que expressa) genes biossintéticos de riboflavina. Preferencialmente, os genes biossintéticos de riboflavina são de Bacillus, particularmente, de Bacillus subtilis, incluindo, por exemplo, genes biossintéticos de riboflavina ribG (ribD), ribB (ribE), ribA e ribH.
[0010] A enzima heteróloga com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74] presente na célula hospedeira produtora de riboflavina como definido no presente documento pode ser obtenível a partir de várias fontes, como, por exemplo, animais, plantas, microrganismos incluindo bactérias ou fungos incluindo levedura. Em uma modalidade, a enzima heteróloga com a atividade como definido no presente documento é selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 70 %, como, por exemplo, 75, 80, 85, 90, 95, 98 % ou até 100 % de identidade com SEQ ID NO:2, que pode ser expressa por um polinucleotídeo de acordo com SEQ ID
NO:1.
[0011] O polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:2 foi isolado a partir de IFO 14782 de Sinorhizobium meliloti (consulte o nº de acesso UniProt A7BK78). Fontes adicionais para o polipeptídeo com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO:2 que poderiam ser usadas em uma célula hospedeira produtora de riboflavina como definido no presente documento incluem, mas sem limitação a, cepas de Rhizobia, como, por exemplo, RAC02 de Sinorhizobium sp., cepa USDA1021-ATCC 14580 de Sinorhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum (nº de acesso GenBank WP_018068721), BL225C de Sinorhizobium meliloti; nº de acesso GenBank AEG03018.1) ou as de acordo com a Tabela 4.
[0012] Uma célula hospedeira produtora de riboflavina compreendendo genes biossintéticos de riboflavina, como, por exemplo, um microrganismo, em particular, Bacillus, preferencialmente, Bacillus subtilis, compreendendo uma enzima heteróloga como definido no presente documento com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74], particularmente, uma enzima heteróloga/polipeptídeo com pelo menos cerca de 70 % de identidade com SEQ ID NO:2 é referida no presente documento como célula hospedeira "modificada" ou "recombinante".
[0013] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira produtora de riboflavina "não modificada" ou "do tipo selvagem" é uma célula que compreende genes biossintéticos de riboflavina, como, por exemplo, um microrganismo, particularmente, Bacillus, preferencialmente, Bacillus subtilis, mas que não compreende (expressa) uma enzima com a atividade da enzima heteróloga como definido no presente documento.
[0014] Como usado no presente documento, o termo "enzima heteróloga" se refere a uma enzima que não é uma enzima endógena da respectiva célula hospedeira, isto é, célula hospedeira produtora de riboflavina. A fim de ser expresso na célula hospedeira, o DNA correspondente que codifica a dita enzima precisa ser introduzido em uma célula hospedeira produtora de riboflavina adequada, como, por exemplo, Bacillus. Assim, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira produtora de riboflavina, particularmente, Bacillus, preferencialmente, B. subtilis, em que um polinucleotídeo que codifica uma enzima com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO:2 que tem atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74] foi introduzido e, adicionalmente, o dito polinucleotídeo é expresso (e ativo) na célula hospedeira.
[0015] A introdução de uma sequência de DNA que codifica tal enzima como definido no presente documento pode ocorrer, por exemplo, através de adição ou inserção de uma sequência de DNA por transformação, conjugação ou transdução no cromossomo de uma célula hospedeira ou as sequências de DNA podem ser introduzidas em DNA plasmídico replicado, isto é, em um vetor de expressão adequado. A dita adição ou inserção pode ocorrer por recombinação de DNA que também pode resultar ou não em uma remoção ou deleção de nucleotídeos de DNA cromossômicos. Os métodos pelos quais a introdução de sequências de DNA em uma célula hospedeira, por exemplo, microrganismos, é alcançada, especialmente, por introdução específica de sítio, são bem conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e em Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.). O termo célula hospedeira "modificada" ou "transformada" pode ser usado intercambiavelmente no presente documento. O técnico no assunto conhece os métodos e/ou vetor de expressão adequados a serem usados para geração de uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento.
[0016] De acordo com uma modalidade da presente invenção, uma ou mais cópias de enzima heteróloga como definido no presente documento, preferencialmente, um polipeptídeo com pelo menos cerca de 70 % de identidade com SEQ ID NO:2 com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74], como, por exemplo, um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO:1 podem ser introduzidas e expressas na célula hospedeira modificada como definido no presente documento, como, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais cópias. O polinucleotídeo que codifica a enzima heteróloga como definido no presente documento e de acordo com um aspecto da presente invenção pode estar sob controle de um promotor forte e/ou constitutivo ou induzível ou pode ser modificado adicionalmente, como, por exemplo, através de mutação do gene que codifica a enzima heteróloga ou através de introdução e/ou modificações genéticas de um regulador transcricional e/ou traducional, incluindo inativação de inibidores transcricionais e/ou traducionais. Essas técnicas são conhecidas por aqueles técnicos no assunto.
[0017] Os promotores constitutivos úteis para a realização da presente invenção incluem, como, por exemplo, Pveg associado a um sítio de ligação ao ribossomo procariota
(RBS), como o RBS de gene spoVG de B. subtilis, por exemplo, nucleotídeos correspondentes respectivamente às posições 1 a 46 de SEQ ID NO:3 (ATG-71bp a ATG-26bp) e às posições 55 a 71 de SEQ ID NO:3 (ATG-17bp a ATG-1bp). Um promotor forte útil adicional é Pspo15. A introdução de tal promotor forte em uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento pode resultar e um aumento em produção de riboflavina que é pelo menos 50 %, 75 %, 100 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 500 % ou ainda mais que 1000 % em comparação com o uso de uma célula hospedeira não modificada como definido no presente documento. Assim, em uma modalidade, a enzima heteróloga como definido no presente documento é usada em conjunto com um promotor específico, incluindo, mas sem limitação a, Pveg associado a um RBS.
[0018] Em uma modalidade, a célula hospedeira modificada tem capacidade de produção de riboflavina em que o rendimento de riboflavina é aumentado em pelo menos cerca de 5 %, como pelo menos cerca de 7, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50 % ou mais em comparação com uma célula hospedeira não modificada.
[0019] Em uma modalidade, a atividade do gene ribC (endógeno) na célula hospedeira modificada que produz riboflavina como definido no presente documento é reduzida ou abolida, em particular, como reduzida em pelo menos cerca de 20 %, preferencialmente, como pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90 %, com máxima preferência, em que a atividade de ribC é abolida, isto é, reduzida à atividade zero. Isso pode ser alcançado ao, por exemplo, silenciar o gene ribC ou partes do gene como descrito no presente documento (consulte, por exemplo, o documento US5837528).
[0020] O técnico no assunto sabe como manipular ou modificar geneticamente tal célula hospedeira, por exemplo, resultando em redução ou abolição de atividade de ribC. Isso inclui, mas sem limitação a, por exemplo, substituição de gene, amplificação de gene, disrupção de gene, transfecção, transformação usando plasmídeos, vírus ou outros vetores.
[0021] As modificações com a finalidade de que a célula hospedeira produza menos cópias ou nenhuma cópia do gene ribC e/ou proteína podem incluir o uso de um promotor fraco, ou a mutação (por exemplo, inserção, deleção ou mutação de ponto) do gene ribC (partes de) (como descrito no presente documento), em particular, seus elementos reguladores. Adicionalmente, a redução ou abolição de atividade específica de ribC pode ser alcançada ao colocar ribC em contato com inibidores específicos ou outras substâncias que interagem especificamente com ribC. Esses métodos que são conhecidos na técnica poderiam ser usados para gerar uma célula hospedeira produtora de riboflavina em que a atividade de ribC é reduzida ou abolida e que compreende um polipeptídeo heterólogo com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74] como descrito no presente documento.
[0022] A célula hospedeira modificada como definido no presente documento pode carregar modificações adicionais, como, por exemplo, superexpressão de um ou mais genes biossintéticos de riboflavina, em particular, ribA ou introdução de múltiplas cópias do operon rib na célula hospedeira, como implementada na cepa RB50 de B. subtilis (consulte, por exemplo, documento EP 405370). Em comparação com a produção de riboflavina em RB50 de B. subtilis, a produção de riboflavina pode ser aumentada em pelo menos 100 %, 200 %, 250 %, 500 % ou ainda mais que 750 % ao alterar geneticamente um microrganismo de tal forma, isto é, através de fusionamento dos genes rib em um promotor forte. De acordo com um aspecto específico da presente invenção, um microrganismo que carrega uma enzima heteróloga com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74] como definido no presente documento opcionalmente combinada com a introdução de um promotor forte e/ou múltiplas cópias do operon rib pode ser alterado adicionalmente através de um desacoplamento de crescimento de produção de riboflavina, como, por exemplo, através de introdução de uma auxotrofia, como descrito no documento EP1186664 para, por exemplo, biotina, e/ou combinado adicionalmente com a introdução de gene de transcetolase modificado como, por exemplo, descrito no documento WO2007051552, e/ou combinado adicionalmente com o uso de sequências líderes de rib modificadas como, por exemplo, descrito no documento WO2010052319.
[0023] Uma cepa preferencial particular de acordo com a presente invenção que pode ser usada como hospedeira para a produção de riboflavina é B. subtilis. Uma cepa mais preferencial é a RB50 de B. subtilis: [pRF69]n que contém múltiplas (n) cópias (por exemplo, 5 a cerca de 20 cópias) de pRF69 que codifica um operon rib modificado com o promotor forte Pspo15 para melhorar a transcrição dos genes rib (consulte, por exemplo, o documento EP405370 e Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-18, 1999 para construção da cepa e condições de cultura para resultar na produção de riboflavina).
[0024] O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo que inclui, mas sem limitação a, transcrição, modificação pós-transcricional,
tradução, modificação pós-traducional e secreção.
[0025] Identidade de sequência ou homologia de sequência é usada intercambiavelmente no presente documento. A fim de determinar a porcentagem de identidade de sequência de duas sequências de aminoácido ou de duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas com propósitos de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos. A identidade de sequência é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências ao longo da região alinhada relatada. O percentual de identidade de sequência entre as duas sequências de aminoácidos ou entre as duas sequências de nucleotídeos pode ser determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Tanto as sequências de aminoácido quanto as sequências de nucleotídeos podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os propósitos da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P., Longden,I. e Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp. 276— 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Para as sequências de nucleotídeos, é usado EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados são uma penalidade de abertura de lacuna de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos. Após o alinhamento pelo programa NEEDLE, como descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada como a seguir: Número de posições correspondentes no alinhamento apresentando um aminoácido idêntico ou nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é marcada na saída do programa como “identidade mais longa”.
[0026] As sequências de proteínas e de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser adicionalmente usadas como uma "sequência de consulta", para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403—10. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas BLAST de proteínas são realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da invenção. Para obter alinhamentos espaçados para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizada como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Quando são usados os programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser usados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Consulte a página principal (homepage) do Centro Nacional de Informação em Biotecnologia [National Center for Biotechnology Information] em Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
[0027] Uma “molécula sintética” como descrito no presente documento, como um ácido nucleico sintético ou um polipeptídeo sintético, é produzida por síntese química ou enzimática in vitro. A mesma inclui, mas sem limitação a, ácidos nucleicos variantes feitos com uso de códon ideal para organismos hospedeiros de escolha.
[0028] Um ácido nucleico sintético pode ser otimizado para uso de códon, preferencialmente, de acordo com os métodos descritos no documento WO2006077258 e/ou WO2008000632, incluindo o método de otimização de par de códons. A otimização de par de códon é um método em que as sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que foi modificado em relação a seu uso de códon, em particular, os pares de códon que são usados, são otimizados para obter expressão aprimorada da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo e/ou produção aprimorada do polipeptídeo codificado. Os pares de códon são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação. Aqueles técnicos no assunto saberão que o uso de códon precisa ser adaptado dependendo da espécie hospedeira, resultando possivelmente em variantes com desvio de homologia significativo de SEQ ID NO:2, mas ainda codificando o polipeptídeo de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a sequências otimizadas por códon para serem heterólogas expressas na célula hospedeira produtora de riboflavina adequada. Um exemplo de tal sequência otimizada por códon adequada para expressão em Bacillus subtilis é mostrado em SEQ ID NO:4.
[0029] Como usado no presente documento, o termo "variante" ou "mutante" pode ser usado intercambiavelmente. O mesmo pode se referir a polipeptídeos ou polinucleotídeos. As variantes incluem substituições, inserções, deleções, truncamentos, transversões e/ou inversões, em uma ou mais localizações relativas a uma sequência de referência. As variantes podem ser feitas, por exemplo, por mutagênese de saturação de sítio, mutagênese de varredura, mutagênese de inserção, mutagênese aleatória, mutagênese de sítio dirigido e evolução dirigida, bem como várias outras abordagens de recombinação conhecidas a uma pessoa versada na técnica. Os genes variantes de ácidos nucleicos podem ser sintetizados artificialmente por técnicas conhecidas na técnica.
[0030] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteína em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em µmol de substrato consumido ou produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, µmol/min é abreviado por U (= unidade). Portanto, as definições de unidade para atividade específica de µmol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima é ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, na célula hospedeira como definido no presente documento ou em um sistema na presença de um substrato adequado. O técnico no assunto sabe como medir a atividade enzimática, em particular, atividade de piridoxal fosfatase ou enzimas biossintéticas de riboflavina como definido no presente documento. Métodos analíticos para avaliar a capacidade de uma enzima adequada como definido no presente documento incluindo isolamento e purificação são conhecidos na técnica.
[0031] A medição de aumento de atividade biológica de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74] específica pode ser feita como a seguir: antes da manipulação genética da célula hospedeira, a atividade específica da dita enzima é medida e definida como 100 %. A mesma medição é realizada após modificação/mutação da célula hospedeira resultando na atividade específica de enzima heteróloga, isto é, uma atividade de mais de 100 %, cuja medição é conhecida na técnica (como descrito em Sarge S, et al., Chembiochem. novembro de 2015;16(17):2466).
[0032] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne).
[0033] Como usado no presente documento, o termo "riboflavina" também inclui precursores de riboflavina, mononucleotídeo de flavina (FMN), dinucleotídeo de flavina adenina (FAD) e derivados dos mesmos. Os precursores de riboflavina e derivados de riboflavina, FMN ou FAD, incluem, mas sem limitação a: (3H)-pirimidinona-5'-fosfato de 2,5- diamino-6-ribosilamino-4 (DRAPP); (1H,3H)-pirimidinadiona- 5'-fosfato de 5-amino-6-ribosilamino-2,4; (3H)- pirimidinona-5'-fosfato de 2,5-diamino-6-ribitilamino-4; (1H,3H)-pirimidinadiona-5'-fosfato de 5-amino-6- ribitilamino-2,4; 5-amino-6-ribitilamino-2,4 (1H,3H)- pirimidinadiona; 6,7-dimetil-8-ribitilumazina (DMRL); e flavoproteínas. Os derivados de riboflavina incluem, mas sem limitação a: riboflavina-5-fosfato e sais do mesmo, como, por exemplo, riboflavina-5-fosfato de sódio.
[0034] Os termos "riboflavina" e "vitamina B2" são usados intercambiavelmente no presente documento. Os genes envolvidos na biossíntese de riboflavina bem como métodos para produção fermentativa de riboflavina, em particular, produção fermentativa usando cepas de Bacillus são conhecidos (consulte, por exemplo, o documento EP405370 ou Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7ª Edição, 2007, Capítulo Vitamins). Esses métodos também podem ser aplicados para produção de riboflavina usando células hospedeiras modificadas, particularmente, como Bacillus,
como descrito no presente documento.
[0035] A presente invenção se refere adicionalmente a um processo para produção de riboflavina, em que uma célula hospedeira produtora de riboflavina, como uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento, é incubada em um meio aquoso sob condições que permitem a produção de riboflavina a partir de um determinado substrato. Ao usar a dita célula hospedeira modificada em um processo para produção de riboflavina, o rendimento pode ser aumentado em pelo menos cerca de 5 %, como, por exemplo, pelo menos cerca de 7, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50 % ou mais em comparação com a riboflavina produzida com uma célula hospedeira não modificada.
[0036] Vários substratos podem ser usados como uma fonte de carbono em um processo da presente invenção, isto é, um processo para produção de riboflavina como mencionado acima. As fontes de carbono particularmente adequadas podem ser selecionadas a partir de compostos que consistem em 3, 5 ou 6 átomos de carbono, como, por exemplo, D-glicose, glicerol, suco espesso, dextrose, amido, sacarose ou ribose. Preferencialmente, a fonte de carbono é D-glicose. Os termos "fonte de carbono", "substrato" e "substrato de produção", em conjunto com o processo acima, são usados intercambiavelmente no presente documento.
[0037] Um meio como usado no presente documento para o processo acima que usa uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento pode ser qualquer meio adequado para a produção de riboflavina. Tipicamente, o meio é um meio aquoso compreendendo, por exemplo, sais, substrato (ou substratos) e um certo pH. O meio no qual o substrato é convertido em riboflavina também é referido como meio de produção. Um exemplo de um meio adequado para produção de riboflavina é descrito no documento WO2004113510 (meio VF), que é particularmente útil em relação a Bacillus e que pode ser usado para o propósito da presente invenção.
[0038] "Fermentação" ou "produção" ou "processo de fermentação" como usado no presente documento pode ser o uso de células em crescimento usando meios, condições e procedimentos conhecidos para o técnico no assunto, ou o uso das denominadas células em repouso que não estão em crescimento, após as mesmas terem sido cultivadas por uso de meios, condições e procedimentos conhecidos pelo técnico no assunto, sob condições apropriadas para a conversão de substratos adequados em riboflavina.
[0039] A riboflavina produzida pode ser recuperada a partir das células por quaisquer meios adequados. Recuperação significa, por exemplo, que a riboflavina produzida pode ser separada do meio de produção. Opcionalmente, o produto de fermentação assim produzido pode ser processado adicionalmente, por exemplo, purificado.
[0040] Em conjunto com o processo acima que usa uma célula hospedeira modificada que produz riboflavina como definido no presente documento, em um aspecto, a etapa de crescimento pode ser realizada em um meio aquoso, isto é, o meio de crescimento, suplementado com nutrientes apropriados para crescimento normalmente sob condições aeróbicas. O cultivo pode ser conduzido, por exemplo, no modo de batelada, batelada alimentada, semicontínuo ou contínuo, em que o modo de batelada alimentada ou semicontínuo é preferencial. Os métodos de fermentação detalhados são conhecidos pelo técnico no assunto ou, de outro modo, descritos, por exemplo, no documento EP405370.
[0041] O período de cultivo a ser usado para um processo de acordo com a presente invenção pode variar dependendo, por exemplo, do hospedeiro, pH, temperatura e meio de nutriente a ser usado, e pode ser, por exemplo, cerca de 10 h a cerca de 10 dias, preferencialmente, cerca de 4 a cerca de 7 dias, mais preferencialmente, cerca de 2 a cerca de 6 dias, dependendo do microrganismo. O técnico no assunto saberá as condições de cultura ideais de microrganismos adequados a serem usadas em conjunto com a presente invenção.
[0042] O cultivo pode ser conduzido, por exemplo, em um pH de cerca de 7,0, preferencialmente, na faixa de cerca de 6 a cerca de 8, mais preferencialmente, cerca de 6,5 a 7,5. Uma faixa de temperatura adequada para executar o cultivo pode ser, por exemplo, cerca de 13 °C a cerca de 70 °C, preferencialmente, cerca de 30 °C a cerca de 39 °C, mais preferencialmente, cerca de 35 °C a cerca de 39 °C, com máxima preferência, cerca de 36 °C a cerca de 39 °C. O meio de cultura para crescimento pode conter usualmente tais nutrientes como fontes de carbono assimiláveis, por exemplo, D-glicose, glicerol, suco espesso, dextrose, amido, sacarose ou ribose; e fontes de nitrogênio digeríveis, como substâncias orgânicas, por exemplo, peptona, extrato de levedura e aminoácidos. Os meios podem ser com ou sem ureia e/ou licor de maceração de milho e/ou fermento biológico. Várias substâncias inorgânicas também podem ser usadas como fontes de nitrogênio, por exemplo, nitratos e sais de amônio. Adicionalmente, o meio de crescimento pode conter usualmente sais inorgânicos, por exemplo, sulfato de magnésio, sulfato de manganês, fosfato de potássio e carbonato de cálcio. As células obtidas usando os procedimentos descritos acima podem, então, ser incubadas essencialmente nos mesmos modos, temperatura e condições de pH como descrito acima, na presença de substratos como descrito acima de tal forma que as mesmas convertam esses substratos no produto de fermentação desejado alvo. A incubação pode ser conduzida em um meio rico em nitrogênio, contendo, por exemplo, fontes de nitrogênio orgânicas, por exemplo, peptona, extrato de levedura, fermento biológico, ureia, aminoácidos e licor de maceração de milho, ou fontes de nitrogênio inorgânicas, por exemplo, nitratos e sais de amônio, em cujo caso as células terão capacidade de crescer adicionalmente enquanto produzem o produto de fermentação desejado. Alternativamente, a incubação pode ser conduzida em um meio pobre em nitrogênio, em cujo caso, as células não crescerão substancialmente e estarão em um modo de célula em repouso ou modo de biotransformação. Em todos os casos, o meio de incubação também pode conter sais inorgânicos, por exemplo, sulfato de magnésio, sulfato de manganês, fosfato de potássio e cloreto de cálcio. O técnico no assunto saberá quais condições aplicar dependendo da célula hospedeira.
[0043] O termo "produção" ou "produtividade" é reconhecido na técnica e inclui a concentração de riboflavina formada em um determinado tempo e um determinado volume de fermentação (por exemplo, kg de produto por hora por litro). O termo "eficiência de produção" inclui o tempo exigido para um nível particular de produção a ser alcançado (por exemplo, quanto tempo a célula leva para atingir uma taxa particular de produção de um produto de fermentação). O termo
"rendimento" é reconhecido na técnica e inclui a eficiência da conversão da fonte de carbono no produto (isto é, riboflavina). Isso é, em geral, escrito como, por exemplo, kg de produto por kg de fonte de carbono. Por "aumentar o rendimento e/ou produção/produtividade" do composto entende- se que a quantidade de moléculas recuperadas ou de moléculas recuperadas úteis desse composto em uma determinada quantidade de cultura em uma determinada quantidade de tempo é aumentada.
[0044] Os métodos analíticos para determinar o rendimento/produtividade de riboflavina são conhecidos na técnica. Tais métodos podem incluir, mas sem limitação a, HPLC ou ao uso de cepas indicadoras (consulte, por exemplo, Bretzel et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999). Figuras
[0045] Figura 1: Esquema de linhagem de cepa de B. subtilis.
[0046] Figura 2: Rendimentos de produção de riboflavina em % (eixo geométrico y) na presença (isto é, BS9646 ou BS8638) ou ausência (BS9645 ou BS4905) de gene pdxP. Para mais detalhes, consulte o Exemplo 4 (Tabela 3).
[0047] Os exemplos a seguir apenas são ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção de modo algum. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patente, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido, particularmente, os documentos EP405370, WO2007051552, US5837528, WO2006077258, WO2008000632, WO2017036903, WO2010052319, WO2004113510 e EP1186664 são incorporados a título de referência pelo presente documento.
Exemplos Exemplo 1: Métodos gerais, cepas e plasmídeos
[0048] Salvo se mencionado de outro modo, todos os meios e métodos gerais são revelados no documento WO2017036903. Os genótipos das cepas de B. subtilis usadas são listadas na Tabela 1.
[0049] Para isolamento de DNA plasmídico de B. subtilis, o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante, foi usado. As células foram colhidas por centrifugação a partir de uma cultura de 10 ml em VY suplementada com ampicilina (100 µg/ml final) e incubadas a 37 °C, 250 rpm até OD600nm ~0,8-1,2. O tampão de lise foi suplementado com lisozima (1 mg/ml f.c.) para degradar parede celular de B. subtilis por 10 minutos a 37 °C.
[0050] Para amplificação de DNA por PCR, 0,1 µg de DNA cromossômico de S. meliloti ou B. subtilis foi usado em um volume de reação de 50 µl contendo 25 µl de mistura PCR master de alta fidelidade 2X Phusion (New England Biolabs), 1 µl dos respectivos iniciadores (Tabela 2). A reação de PCR foi realizada em 29 ciclos de três etapas sequenciais: (i) etapa de desnaturação a 95 °C por 30 s; (ii) etapa de anelamento a 55 °C por 30 s; (iii) etapa de alongamento a 72 °C por 1 min por kb. Os ciclos de PCR foram precedidos por uma etapa de desnaturação a 95 °C por 2 min.
[0051] Para transdução de B. subtilis com lisato de bacteriófago SPP1, o lisato doador foi preparado ao inocular uma única colônia da cepa de doador em 3 ml de meio de VY. A cultura foi incubada durante a noite a 37 °C em um tambor giratório. No dia seguinte, 100 µl da pré-cultura foram misturados com 100 µl de VY fresco e 30 µl de lisato de bacteriófago SPP1. Após uma incubação de 15 minutos a 37 °C em um banho de água, 4 ml de VY fresco suplementado com CaCl2 (5 mM final) foram adicionados. A cultura infectada foi incubada durante 4 horas a 37 °C em um tambor giratório. A cultura lisada foi centrifugada e o sobrenadante foi esterilizado em filtro. O lisato doador resultante foi armazenado a +4 °C para uso adicional. A cepa receptora foi preparada ao inocular uma única colônia da cepa de doador em 3 ml de meio de VY. A cultura foi incubada durante a noite a 37 °C em um tambor giratório. No dia seguinte, 10 ml de meio de VY fresco foram inoculados com 500 µl da pré-cultura, e incubados a 37 °C, 250 rpm até OD600nm ~0,8-1,2. 900 µl da cultura foram, então, infectados com 10 ou 100 µl do lisato doador. 9 ml de VY fresco suplementado com MgSO4 (10 mM final) foram adicionados à cultura. Após uma incubação de 30 minutos a 37 °C em um banho de água, as células foram colhidas por centrifugação (10 min, 3500 rpm), suspensas em 150 µl de 1X SS e espalhadas em um meio de ágar seletivo, seguido por incubação a 37 °C por 1 dia.
[0052] O ensaio de produção de riboflavina em placas microtituladoras de poço profundo (MTP) foi realizado como a seguir: uma cultura durante a noite foi feita a partir de uma única colônia em 3 ml de VY contendo antibióticos seletivos quando apropriado. A pré-cultura foi incubada a 39 °C, 550 rpm, umidade a 80 %. No dia seguinte, 3 ml de RSM foram inoculados com a pré-cultura com uma OD600nm inicial de ~0,05. As culturas em MTP foram feitas em triplicata, cobrindo os poços com uma vedação com respiração. MTP foram incubadas a 39 °C, 550 rpm, umidade a 80 % por 48 horas. 250 µl da cultura de 48 horas foram tratados com 20 µl de solução de NaOH a 4M para solubilizar os cristais de riboflavina (agitados por 1 min a 300 rpm). 230 µl de um tampão de fosfato de potássio a 1 M com pH 6,8, foram adicionados (agitados por 1 min a 300 rpm). A riboflavina foi avaliada por HPLC usando um sistema de HPLC em série Agilent 1100 com uma bomba quaternária, um autoamostrador, um detector de UV e um detector de fluorescência.
A separação foi alcançada usando um Supelcosil LC-8 DB (150 mm x 4,6 mm x 5 µm). A temperatura de coluna ideal foi 20 °C.
A fase móvel foi um gradiente de 100 % de ácido acético a 0,1 M para 50/50 de ácido acético a 0,1 M/metanol em 15 minutos por um total de 33 minutos por série.
A taxa de fluxo foi 1,0 ml/min e o volume de injeção foi definido como 5 µl.
O sinal UV foi monitorado e usado para detecção.
A faixa de calibração de 0,1 µg/ml a 500 µg/ml.
Adicionalmente, o acúmulo potencial de glicose no caldo de cultura foi analisado por um sistema de HPLC Waters usando uma bomba binária, um autoamostrador, um detector de UV índice de refração.
A separação foi alcançada em uma coluna CAPCELL PAK NH2 UG80 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm; Shiseido). A temperatura de coluna ideal foi 40 °C.
A fase móvel foi uma mistura de acetonitrila e água deionizada em uma razão de 65:35. A taxa de fluxo foi 1,0 ml/min e o volume de injeção foi definido como 5 µl ou 10 µl.
O sinal de índice de refração foi monitorado e usado para detecção.
A faixa de calibração para cada composto foi de 0,3 mg/ml a 3 mg/ml.
Tabela 1: Cepas de Bacillus subtilis.
Cepa Genótipo relevante Referência BS168- CIP106309 Trp+ WO2017036903 SP1
Cepa Genótipo relevante Referência CIP106309 Trp+ vetor bifuncional BS9645 Esta patente de pBHA12 E. coli/B. Subtilis BS9646 CIP106309 Trp+ pBV213L (PamyQ_pdxP) Esta patente BS9502 CIP106309 Trp+ amyE:Pveg_pdxP* Esta patente CIP106309 Trp+ Pspo15_triple BS4905 WO2017036903 ribO_del mro175rib ribC820 CIP106309 Trp+ Pspo15_triple BS8638 ribO_del mro175rib ribC820 Esta patente amyE:Pveg_pdxP* Exemplo 2: Clonagem de pdxP de Sinorhizobium meliloti em um vetor replicativo e inserção em um hospedeiro de Bacillus subtilis
[0053] O gene pdxP de cepa IFO14782 de S. meliloti (SEQ ID NO:1) foi amplificado por PCR usando iniciadores P1 (SEQ ID NO:5) e P2 (SEQ ID NO:6). Esses oligos abrigam respectivamente sítios de restrição BamHI (GGATTC) e NheI (GCTAGC). O fragmento de 0,8-kb resultante foi purificado por eletroforese em gel de agarose e extraído do gel usando o Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen). O produto de PCR purificado foi clonado no BamHI e no NheI nos múltiplos sítios de clonagem do vetor bifuncional de pBHA12 E. coli/B. subtilis descrito no documento WO2008000632. Esse vetor permite a expressão de gene pdxP sob o controle de um promotor derivado do gene amyQ de Bacillus amyloliquefaciens. Durante o procedimento de clonagem e transformação de B. subtilis, E. coli foi usado como um hospedeiro intermediário. A transformação da mistura de ligação foi realizada primeiramente em E. coli Quimicamente
Competente TOP10 (Invitrogen). Várias colônias resistentes à ampicilina de E. coli foram isoladas e o plasmídeo recombinante pBV213L (consulte a Figura 1) foi extraído usando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). A cepa BS168- SP1 de Bacillus subtilis é um derivado prototrófico de triptofano da cepa Marburg 168 (Alemanha) que foi gerado ao substituir a mutação trpC2 por um gene trpC não mutado da cepa ATCC 6051 de B. subtilis.
A construção de BS168-SP1 é detalhada no documento WO2017036903. BS168-SP1 é a cepa naive em relação à superprodução de riboflavina.
Na próxima etapa, 10 µl de plasmídeo pBHA12 (documento WO2008000632) ou 10 µl de plasmídeo pBV213L foram transformados na cepa BS168-SP1 por transformação de célula competente, selecionando clones resistentes à canamicina (10 µg/ml f.c.) em placas de TBAB.
As cepas resultantes BS9645 e BS9646 foram confirmadas para abrigar respectivamente o vetor vazio pBHA12 (BS9645) ou o vetor recombinante pBV213L com gene pdxP de S. meliloti (BS9646). As sequências de nucleotídeos que mostram o códon de início das sequências de codificação são listadas na Tabela 2, com referência às SEQ ID NOs na listagem de sequências.
Tabela 2. Sequências de nucleotídeos de pdxP isoladas a partir de S. meliloti e otimizadas por códons para expressão em B. subtilis (pdxP*). O códon de início da sequência de codificação está sublinhado.
Para mais detalhes, consulte o texto e a listagem de sequências.
Nome Sequência 5' a 3' SEQ ID NO: pdxP ATGGCCAATCGGGTCGCAGGTGAACAAACCGTTTTG 1
TGCGCAGTGTGATTGTTTAA Pveg; TTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTA 3 spoVG CAATAAATGTTACTAGAGAAAGGTGGTGAACTACTA
Nome Sequência 5' a 3' SEQ ID NO: pdxP* ATGGCTAATCGTGTGGCGGGTGAACAGACGGTGCTG 4
TTACGGAGCGTGATTGTTTAA Exemplo 3: Inserção de pdxP de S. meliloti no cromossomo de um hospedeiro de B. subtilis que superproduz riboflavina
[0054] Um gene pdxP otimizado por códon (SEQ ID NO:4) que codifica a mesma proteína que o gene nativo foi inserido no local de amyE no cromossomo de cepa receptora BS168-SP1. Uma divisão por PCR de extensão saliente (SOEing) foi usada para gerar um fragmento de DNA que carrega o gene pdxP*, flanqueado por amyE-5’ e pelas sequências de DNA de amyE-3’ que permitem a inserção estável no cromossomo BS168-SP1 por cruzamento duplo.
Um módulo genético que abriga um gene de cloranfenicol acetiltransferase (E.C 2.3.1.28), que fornece uma resistência a antibióticos para cloranfenicol, também foi inserido entre o flanco de amy-E3’ e o gene pdxP* na orientação oposta ao pdxP*. Primeiramente, PCRs individuais foram realizados para amplificar: (i) a região de DNA de 1,9 kb que carrega o flanco de amyE-3’ e o cassete de cloranfenicol de plasmídeo pDG1662 (Bacillus Genetic Stock Center, Universidade Estadual de Ohio, EUA; GenBank U46197) usando um par de iniciadores P3 (SEQ ID NO:7) e P4 (SEQ ID NO:8); (ii) a região de DNA de 0,9 kb que carrega o gene pdxP* usando um par de iniciadores P5 (SEQ ID NO:9) e P6 (SEQ ID NO:10). A sequência de codificação de pdxP* de IFO14782 de S. meliloti (SEQ ID NO:4), cuja expressão é acionada por promotor veg de B. subtilis e spoVG RBS de B. subtilis (SEQ ID NO:3), foi feita sinteticamente e clonada no vetor pJET1.2 (Thermo Fisher Scientific) por Genscript, Piscataway, NJ, EUA.
Esse vetor recombinante foi usado como um modelo para o PCR; (iii) a região de DNA de 0,5 kb que carrega o flanco de amyE-5’ do plasmídeo pDG1662 usando um par de iniciadores P7 (SEQ ID NO:11) e P8 (SEQ ID NO:12). Os três produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose e extraídos do gel usando o Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen). Devido à sobreposição de regiões de DNA, as mesmas foram montadas em um fragmento de PCR SOEing de 3,2kb, usando um par de iniciadores P3 e P8. O produto de
PCR SOEing resultante foi purificado por eletroforese em gel de agarose e extraído do gel usando o Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen). 1 µg foi, então, usado para a transformação de BS168-SP1 de B. subtilis competente. As colônias resistentes a cloranfenicol (CmR) foram selecionadas em placas de TBAB contendo cloranfenicol a 5 µg/ml. A inserção de pdxP* no gene amyE cromossômico (alfa- amilase) de BS168-SP1 foi confirmada por um teste de hidrólise de amido usando coloração com iodo. O genótipo correto da cepa BS9502 resultante também foi confirmado por um PCR. A inserção de gene pdxP* no local de amyE cromossômico da cepa que superproduz riboflavina de BS4905 de B. subtilis (descrita no documento WO2017036903) foi, então, realizada com fago SPP1 de acordo com o método descrito acima, em que um lisato de BS9502 foi usado para transduzir a cepa BS4905 de B. subtilis. As colônias de CmR foram selecionadas em placas de TBAB contendo cloranfenicol a 5 µg/ml. A inserção de pdxP* no gene amyE cromossômico (alfa-amilase) de BS168-SP1 foi confirmada por um teste de hidrólise de amido usando coloração com iodo. O genótipo correto da cepa BS8638 resultante também foi confirmado por PCR. Exemplo 4: Ensaio de produção de riboflavina na presença/ausência de gene pdxP
[0055] O gene pdxP é superexpresso em um vetor replicativo na cepa BS9646 (consulte o Ex. 2) e através de inserção cromossômica na cepa BS8638 (consulte o Ex. 3). O ensaio de produção de riboflavina foi feito a partir de uma cultura com RSM em placas microtituladoras de poço profundo, como descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3: Produção de riboflavina com várias cepas de B. subtilis que têm diferentes genótipos como indicado. As cepas BS9645 e BS9646 de B. subtilis compartilham a mesma base genética de genótipo (exceto para inserção de pdxP), as cepas BS4905 e BS8638 de B. subtilis compartilham a mesma base genética de genótipo (exceto para inserção de pdxP). Para mais explicação, consulte o texto. Cepa Genótipo relevante Rendimento de Riboflavina (g/100 g de Glicose) BS168-SP1 tipo selvagem <0,003 BS9645 pBHA12 <0,003 BS9646 pBV213L (pBHA12 com 0,54 Pveg_pdxP) BS4905 superprodutor de 6,21 riboflavina BS8638 superprodutor de 7,11 riboflavina com Pveg_pdxP
[0056] O rendimento de produção de riboflavina de BS9646 foi aprimorado em pelo menos 18000 % em comparação com o seu parente direto BS9645 (consulte a Figura 2A). Já que nenhuma riboflavina pode ser detectada na cultura de BS9645, BS9646 foi comparada ao limite de detecção do nosso ensaio de riboflavina de HPLC (0,003 g/100 g de glucose). Ao realizar os experimentos em uma base genética de cepa que produz em excesso riboflavina, o rendimento de produção de riboflavina foi aprimorado em 14,5 % em comparação com o seu parente direto (BS8638 em comparação com a BS4902 (consulte a Tabela
3 e a Figura 2B). Esses resultados mostraram um impacto positivo da expressão de gene pdxP na produção de riboflavina tanto na cepa à base do tipo selvagem (base genética de cepa que produz em excesso) quanto na base genética de cepa que superproduz riboflavina de B. subtilis. Exemplo 5: Identificação e clonagem de homólogos de pdxP
[0057] Uma pesquisa de homologia usando o PdxP de S. meliloti revelou vários homólogos de pdxP de outras cepas de Rhizobium (consulte a Tabela 4). Tabela 4. Homologia (% de identidade) de sequência proteica de PdxP em várias espécies de Rhizobium. Espécie Rhizobium % de identidade Sinorhizobium meliloti sp. 97-100 % Sinorhizobium medicae 95 % Sinorhizobium saheli 91 % Sinorhizobium americanum sp. 90-91 % Sinorhizobium fredii sp. 89-90 % Rhizobium arenae 86 % Pararhizobium polinicum 84 % Rhizobium oryzae 78 % Rhizobium leguminosarum 74 %
[0058] Os homólogos são clonados formando um hospedeiro que produz riboflavina, como, por exemplo, B. subtilis, como descrito acima seguido por um ensaio de produção de riboflavina como descrito no Exemplo 4.
[0059] Ao usar os homólogos de pdxP, o rendimento de riboflavina pode ser aumentado na faixa de pelo menos 5 a 20 % em uma base genética de cepa que superproduz riboflavina, isto é, equivalente aos números mostrados na Tabela 3.
Claims (13)
1. Célula hospedeira produtora de riboflavina caracterizada por compreender genes biossintéticos de riboflavina (operon rib) e uma enzima heteróloga com atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74].
2. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender os genes biossintéticos de riboflavina de Bacillus.
3. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender um polipeptídeo com pelo menos cerca de 70 % de identidade com SEQ ID NO:2.
4. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por expressar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO:2.
5. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a enzima heteróloga é selecionada a partir de bactérias, preferencialmente, Rhizobia, mais preferencialmente, Sinorhizobium.
6. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a atividade do gene ribC endógeno foi reduzida.
7. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o rendimento de riboflavina é aumentado em pelo menos cerca de 5 % de uma determinada fonte de carbono em comparação com a produção de riboflavina usando uma célula hospedeira que não expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO:2.
8. Célula hospedeira produtora de riboflavina, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por ser selecionada a partir de Bacillus, Corynebacterium, Streptococcus, Clostridium, Lactococcus ou Streptomyces, preferencialmente, selecionada a partir do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Streptococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Clostridium acetobutylicum, Clostridium difficile, Lactococcus lactis, Streptomyces coelicolor, Corynebacterium diphteriae e Corynebacterium glutamicum.
9. Processo para produção de riboflavina caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira produtora de riboflavina conforme definida em qualquer das reivindicações anteriores é incubada em um meio aquoso sob condições que permitem a produção de riboflavina a partir de um determinado substrato.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o rendimento de riboflavina é aumentado em pelo menos 5 % em comparação com um processo em que a célula hospedeira não expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO:2.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por compreender as etapas de:
(a) fornecer uma célula hospedeira produtora de riboflavina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, (b) incubar a dita célula hospedeira em um meio aquoso sob condições que permitem a produção de riboflavina a partir de um determinado substrato e, opcionalmente, (c) isolar e purificar a riboflavina do meio de cultivo.
12. Uso de um polipeptídeo com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO:2 ou de uma célula hospedeira produtora de riboflavina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por ser em um processo para produção de riboflavina.
13. Célula hospedeira produtora de riboflavina caracterizada por compreender genes biossintéticos de riboflavina (operon rib) e uma enzima heteróloga que tem atividade de piridoxal fosfatase [EC 3.1.3.74] usada para um processo para produção de riboflavina.
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