CN107922464B

CN107922464B - 经改进的维生素生产

Info

Publication number: CN107922464B
Application number: CN201680047678.2A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·汉斯; 汉斯-彼得·霍曼; 马丁·莱玛恩; 塞巴斯蒂安·伯托特
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2036-08-25
Also published as: WO2017036903A1; CN107922464A

Abstract

本发明提供了经改进的核黄素(在本文中也称为维生素B2)的生物技术生产，其使用遗传工程微生物，特别是选自Bacillus的微生物，例如Bacillus subtilis。使用所述经修饰的微生物时，核黄素5产生的产率能够增加至少5％。本发明涉及经修饰的微生物、生成所述经修饰的微生物的方法及其用于生产核黄素的用途。

Description

经改进的维生素生产

本发明提供了经改进的核黄素(在本文中也称为维生素B2)的生物技术生产，其使用遗传工程微生物，特别是选自Bacillus的微生物，例如 Bacillus subtilis。使用所述经修饰的微生物时，核黄素产生的产率能够增加至少5％。本发明涉及经修饰的微生物、生成所述经修饰的微生物的方法及其用于生产核黄素的用途。

核黄素由所有植物和许多微生物合成，但是不被高等动物所生产。核黄素是基础代谢必需的，因为它是碳水化合物的酶促氧化中需要的辅酶(例如黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸)的前体。在高等动物中，核黄素供应不足可引起脱发、皮肤炎症、视力衰退和生长障碍(growth failure)。

核黄素的生物合成从三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖开始。参与核黄素生物合成的基因已知来自多种来源，例如Bacillus subtilis， Ereothecium ashbyii，Ashbyagossypii，Candida flareri，Saccharomyces cerevisiae，E.coli(见例如EP 405370、EP1186664中的图2或Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第7版,2007,维生素章节)。

以Bacillus subtilis中的情况作为产生核黄素的(微)生物的一个例子，参与核黄素生物合成的基因包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和 ribH。ribA基因编码两种酶活性，即催化核黄素生物合成中第一步的GTP 环式水解酶II和催化5-磷酸核酮糖转化成3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(DHBP) 的3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(DHBPS)。脱氨酶和还原酶由操纵子的第一个基因ribG(ribD)编码。核黄素生物合成的倒数第二步由2,4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶催化，所述2,4-二氧四氢蝶啶合酶是ribH的基因产物。催化途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因ribB(ribD)编码。位于rib操纵子3'端的ribT的功能目前是不清楚的；然而，其基因产物不是核黄素合成所必需的。

核黄素操纵子从rib启动子(P_rib)起的转录由核糖开关(riboswitch)控制，所述核糖开关涉及位于rib操纵子5'区中几乎300个核苷酸的非翻译调节前导区(下文中称作rib前导区)，其在转录起点和操纵子中第一个基因ribG的翻译起始密码子之间。新生核黄素RNA的延伸依赖于是否存在FMN或FAD：当这些效应物存在时，转录终止发夹形成(所谓的rib终止子)；当它们不存在时，形成所谓的反终止子，导致rib操纵子的读通转录。

使用微生物(例如Bacillus菌株)建立工业生产工艺需要对宿主菌株和/或工艺条件进行一些修饰(参见例如Kil等人,Mol Gen Genet 233,483- 486,1992；Mack等人,J.Bacteriol.,180:950-955,1998)。

最近，可以表明：rib前导区3’端的序列在核黄素生物合成中起重要作用。有趣的是，仅缺失所谓的终止子并没有使核黄素产生显著增加(参见 WO2010/052319)。

但是，仍然需要进一步优化通过发酵获得的核黄素的工业生产。

因此，持续需要寻找经改进的生产菌株，例如，Bacillus，优选B. subtilis菌株。

出乎意料地发现：转录终止因子Rho在核黄素的发酵生产中，特别是在使用Bacillus、优选B.subtilis菌株的方法中起着重要作用。

转录终止因子Rho(EC 3.6.4.-)是rho基因的产物，并且作为以开环结构组织的单多肽链的六聚体起作用。它分离自例如Bacillus subtilis 168，并且可以以例如UniProtKB-Q03222或BSU37080公开获得。Rho充当ATP依赖性解旋酶，能够结合新生RNA以干扰转录延伸复合物并促进终止。对Bacillus的其他物种进行的Blast搜索揭示了在DNA水平上79％ (B.clausii DSM-K16)至97％(B.licheniformis ATCC 14580；B.amyloliquefaciens FZB42)的同一性范围(参见表4)。

特别地，本发明涉及经遗传操作的产生核黄素的宿主细胞，例如，选自Bacillus的微生物，优选B.subtilis，其中Rho的活性已经降低或消除，例如通过rho基因的遗传修饰或突变，包括所述基因的敲除。

此外，开发出了一种新的方法，其中培养所述经修饰的宿主细胞，从而使得与其中使用未修饰的宿主细胞发酵产生核黄素的方法相比，通过生物技术产生的核黄素的产率提高至少5％，所述未修饰的宿主细胞携带编码具有Rho野生型活性的蛋白质的野生型rho基因，即，未修饰或未突变的Rho。

特别地，本发明涉及产生核黄素的宿主细胞，优选地选自Bacillus或Corynebacterium、更特别地选自B.subtilis的微生物，其中内源转录终止因子Rho的活性降低或消除。

根据本发明的合适的宿主细胞可以是编码内源转录终止因子Rho的任何已知的产生核黄素的菌株，所述宿主细胞能够将给定的碳源(例如葡萄糖)转化为核黄素，包括任何已知的其前体和/或衍生物，并且其中所述 Rho型转录调控物的活性降低或消除，使得所述宿主的核黄素产生增加。

优选地，宿主细胞选自产生核黄素的微生物，例如，Bacillus或 Corynebacterium的菌株，优选选自B.subtilis、B.atrophaeus、B. licheniformis、B.amyloliquefaciens、B.pumilus、B.infantis、B. coagulans、B.megaterium、B.thuringiensis、B.cereus、B.halodurans或C. glutamicum。更优选地，宿主细胞选自B.subtilis、B.licheniformis、B. amyloliquefaciens或B.megaterium，最优选地选自B.subtilis，特别是B. subtilis1A747或B.subtilis 168。这些微生物可从不同来源被公众所获得，例如菌种保藏中心(例如DSMZ、ATCC、NRRL、BGSC等)。

关于本发明应当理解，上述微生物还包括具有相同生理特性的此类物种的同物异名(synonyms)或有效名(basonyms)，如原核生物国际命名代码(International Code ofNomenclature of Prokaryotes)定义。本文使用的微生物的命名法是原核生物和细菌分类国际委员会(International Committee on Systematics of Prokaryotes and theBacteriology)和国际微生物协会的应用微生物部(Applied Microbiology Division ofthe International Union of Microbiological Societies)正式接受(在优先权申请的提交日)并由其官方出版媒介International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(IJSEM)公开的命名法。

因此，本发明优选涉及根据上文描述的宿主细胞，其中内源Rho的活性降低或消除，特别地降低至少20％，更优选地降低至少50％、60％、 70％、80％、90％，最优选地Rho活性消除，即降低至零活性。这可以通过例如本文所述敲除rho基因或部分该基因来实现。

在一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的产生核黄素的宿主细胞，例如Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中通过在核糖体结合位点中引入突变来降低Rho的活性(与未修饰的Rho的活性相比)。优选地，待突变的部分对应于推定的核糖体结合位点，例如，对应于SEQ ID NO:1的第-17至-6位(ATG-17bp至ATG-6bp)的核苷酸，优选地通过缺失所述核苷酸(Shaw等人,Biochim Biophys Acta.1729(1):10-3,2005)。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的产生核黄素的宿主细胞，例如Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中通过在冷休克结构域(例如对应于SEQ ID NO:1的第+160至+360位(ATG+160bp至ATG+ 360bp)的核苷酸)中引入突变，优选地通过缺失所述核苷酸，来降低 Rho的活性(与未修饰的Rho的活性相比)。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的产生核黄素的宿主细胞，例如Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中通过在RNA结合位点(例如对应于SEQ ID NO:1的第+174至+336位(ATG+174bp至ATG+ 336bp)的核苷酸)中引入突变，优选地通过缺失所述核苷酸，来降低 Rho的活性(与未修饰的Rho的活性相比)。在一个特别优选的实施方式中，经修饰的Rho转录调控物包含氨基酸替换，例如在对应于SEQ ID NO:2的第56位的氨基酸上的替换，优选将野生型氨基酸替换为天冬氨酸，更优选将对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置上的甘氨酸替换为天冬氨酸，即G56D突变，其导致无功能的Rho蛋白，即其中本文所述的宿主细胞中Rho的活性消除。

在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的产生核黄素的宿主细胞，例如Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中通过在ATP结合位点(例如对应于SEQ ID NO:1的第+538至+1062位(ATG+538bp至ATG+ 1062bp)的核苷酸)中引入突变，优选地通过缺失所述核苷酸，来降低 Rho的活性(与未修饰的Rho的活性相比)。

在一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的产生核黄素的宿主细胞，例如Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中通过在对应于SEQ ID NO:1的第+155至+165位(ATG+155bp至ATG+165bp)的DNA片段中进行突变，优选地通过缺失所述核苷酸，来降低Rho的活性(与未修饰的Rho的活性相比)。

此外，本发明涉及如本文所述的产生核黄素的宿主细胞，例如 Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中通过在启动子区(例如对应于SEQ ID NO:1的第-200至+1位(ATG-200bp至ATG+1)的核苷酸)中引入突变，优选地通过缺失所述核苷酸，来降低Rho的活性(与未修饰的Rho的活性相比)。

本领域技术人员知道如何遗传操作这种宿主细胞，从而导致Rho活性降低或消除。这些遗传操作包括但不限于，例如，基因置换，基因扩增，基因破坏，转染，使用质粒、病毒或其它载体转化。经遗传修饰的宿主/生物(例如经遗传修饰的微生物)也常被称为重组宿主/生物，例如，重组微生物。在这一点上，术语“经修饰的”、“突变的”或“重组的”在本文中可互换使用。此外，术语“宿主细胞”和“宿主生物”在本文中可互换使用。

为了使宿主细胞产生更少或不产生Rho基因的拷贝和/或蛋白质，修饰可以包括使用弱启动子，或(如本文所述的)(部分)Rho基因、特别是其调控元件的突变(例如插入、缺失或点突变)。这种遗传操作的例子可以例如影响与DNA的相互作用(通过Rho的N末端区域介导)或与其他效应分子的相互作用。特别地，如本文所述以及本领域所已知，可以在 Rho内的ATP结合位点、RNA结合位点、解旋酶活性区域或RNA依赖性 ATP酶活性区域中进行导致Rho比活性降低或消除的修饰。此外，可以通过使Rho与特异性抑制剂或与Rho特异性相互作用的其他物质接触来降低或消除Rho比活性。为了鉴定这种特异性抑制剂，可以表达Rho蛋白并在被怀疑抑制Rho活性的化合物存在的情况下检测其活性。潜在的抑制化合物可以是例如针对Rho蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。这种抗体可以通过合适实验室动物的常规免疫方案来获得。此外，可以在报告菌株中检测 Rho活性，其中将通过Rho的作用(凭借结合到Rho利用位点)来调控的基因与绿色荧光蛋白(GFP)融合。所述基因的转录可以使用抗GFP抗体在Western印迹法中测量。当Rho无活性时，GFP不翻译，因此在 Western印迹法中不能检测到信号。本领域技术人员知道如何进行这些实验以及选择哪些由Rho转录调节因子调控的基因。

术语“遗传操作的”宿主细胞指的是宿主细胞的遗传修饰或突变或遗传改变使得与在没有这种操作的相应宿主细胞中的内源调节活性相比，转录终止因子Rho的活性降低或消除。术语“遗传修饰”或“遗传工程”或“遗传改变”在本文中可互换使用。携带编码展示100％Rho比活性的转录终止因子 Rho的完整内源基因的宿主细胞被称为野生型或未修饰的/未突变的宿主细胞(相对于本文所述的经修饰的宿主细胞)。即携带未修饰的Rho。

出于本发明的目的，与Rho相关的术语“活性”特别指作为ATP依赖性解旋酶发挥功能与新生RNA结合和/或激活Rho的RNA依赖性ATP酶活性和/或从DNA模板释放mRNA的活性。Rho比活性可以通过测量转录，特别是所调控基因的转录延伸(例如，rib-操纵子基因的转录)来确定。测量Rho特异性生物活性的降低可以如下进行：在遗传操作宿主细胞之前，测量Rho比活性并设定为100％。在导致Rho比活性降低或消除(即活性小于100％)的宿主细胞的修饰/突变之后进行相同的测量，所述测量是本领域已知的(参见例如Yakhnin等人,JBacteriol.183(20):5918-26, 2001或Ingham等人,Mol Microbiol.31(2):651-63,1999)。

本文所述的产生核黄素的宿主细胞可以在DNA或蛋白质水平上携带额外的修饰，例如，用强(组成型或诱导型)启动子(例如，P_spo15或 P_veg)替换rib操纵子的天然启动子，只要这种修饰对通过各宿主从底物 (例如葡萄糖)产生核黄素的产率、生产和/或效率有直接的影响即可。此类强启动子的引入导致与仅携带经修饰的rho的微生物相比，核黄素产生提高至少50％、75％、100％、200％、250％、300％、350％、500％或甚至多于1000％。这可通过一个或多个rib基因、特别是ribA的过表达，或通过在宿主细胞中引入多个拷贝的rib操纵子被进一步提高，例如在B. subtilis菌株RB50中完成(见例如EP 405370)。与B.subtilisRB50中的核黄素产生相比，通过以这种方式遗传改变微生物(即，通过使rib基因与强启动子融合)，核黄素产生可以提高至少100％、200％、250％、 500％或甚至多于750％。可以如下所述进一步改变携带如本文所定义的经修饰的rho并任选地与引入强启动子和/或多个拷贝rib操纵子相结合的微生物：使生长与核黄素的生产解偶联(decoupling)，例如通过引入营养缺陷型(例如EP 1186664中针对例如生物素所述)；和/或进一步与引入经修饰的转酮酶基因相结合，例如WO 07/051552中所述；和/或进一步与使用经修饰的rib前导区序列相结合，例如WO2010/052319中所述；和/或进一步与编码黄素激酶的ribC基因的突变相结合，例如US 5837528中所述，所有文献都通过引用并入本文。

用于产生核黄素的一种特别优选的菌株是B.subtilis。一种更优选的菌株是含有多个(n)拷贝(例如约5到约20个拷贝)pRF69的B.subtilis RB50::[pRF69]_n，pRF69编码用强启动子P_spo15修饰的rib操纵子，以增强 rib基因的转录(菌株的构建和导致核黄素产生的培养条件见例如EP 405370和Perkins等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,22:8-18,1999)。B. subtilis RB50和质粒pRF69可分别得自NRRL(登记号B 18502)和ATCC (登记号ATCC 68338)。可如上所述进一步操作该菌株，从而导致Rho 活性降低或消除。

因此，如本文所述，本发明涉及产生核黄素的宿主细胞，并涉及所述宿主细胞用于生产核黄素的用途，例如Bacillus，特别地来自B.subtilis，其中与未修饰Rho的活性相比，Rho的活性(与未修饰Rho的活性相比) 降低或消除，所述内源rho基因包含选自以下的多核苷酸：

(a)包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸，

(b)编码根据SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸，

(c)编码由根据(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的多核苷酸，其中在所述片段或衍生物中，与所述多肽相比，一个或更多个氨基酸残基被保守性替换，并且所述片段或衍生物具有Rho比活性，

(d)多核苷酸，其互补链在严格条件下与(a)或(b)中所定义的多核苷酸杂交，且其编码具有Rho比活性的多肽，

(e)多核苷酸，其与(a)或(b)中所定义的多核苷酸的同一性为至少 75％，例如77％、78％、79％、80％、81％、82％、84％、85％、90％、 95％、97或98％，且其编码具有Rho比活性的多肽；

或这种多核苷酸的互补链。

本发明的核酸优选地以分离的方式提供，并优选地被纯化至同质。

术语“分离的”表示材料从其最初环境(例如在天然存在时为天然环境)中移出。例如，存在于活微生物中天然存在的多核苷酸不是分离的，但是与天然系统中一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸则是分离的。此类多核苷酸可以是载体的部分和/或此类多核苷酸可以是组合物的部分并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其天然环境的部分。

在本文中使用时，术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA 分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可被用于例如制备下述核酸，所述核酸具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性。

除非另有说明，通过对本文的DNA分子测序确定的所有核苷酸序列均使用自动DNA测序仪测定。因此，如本领域所已知的，对通过该自动化途径测定的任何DNA序列而言，本文测定的任何核苷酸序列可含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列通常地至少约90％相同，更通常地至少约95％到至少约99.9％相同。可以通过其它途径(包括本领域公知的手动DNA测序法)更精确地测定实际序列。

本领域技术人员能够鉴定此类被错误鉴定的碱基，并知道如何纠正此类错误。

术语“同源性”或“同一性百分比”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，其在本文被定义来测定两条核酸序列的同一性百分比，所述序列就最适比较的目的被比对(例如为了与第二核酸序列最适比对，可以向第一核酸序列的序列中引入缺口)。然后比较相应的位置上的核苷酸。当第一条序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两条序列之间的同一性百分比是所述序列共享的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数 (即重叠位置)x100)。优选两条序列有相同的长度。

技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序以测定两条序列之间的同源性。例如，可以使用数学算法完成两条序列之间的序列比较和同一性百分比测定。在一个优选的实施方式中，使用Needleman 和Wunsch(J.MoI.Biol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、 4、5或6的长度权重测定两条氨基酸序列之间的同一性百分比，所述 Needleman和Wunsch算法已经被整合进GCG软件包内的GAP程序中 (可得自http://www.accelrys.com)。技术人员应当知道：所有这些不同的参数会产生轻微差异的结果，但是使用不同算法时两条序列的整体同一性百分比不会被显著改变。

在另一实施方式中，使用GCG软件包(可得自http://www. accelrys.com)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、 60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条核苷酸序列之间的同一性百分比。在另一实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))，使用PAM120权重残表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分测定两条核苷酸序列的同一性百分比，所述E.Meyers和W.Miller算法已被整合进ALIGN程序 (2.0版)中(可得自http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。

在本发明的语境中，杂交的“严格条件”的含义可以是例如在42℃下在包含以下的溶液中过夜孵育(例如15小时)：50％甲酰胺、5×SSC(150 mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5× Denhardt's溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml变性的剪切的鲑精DNA，然后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤。更具体的条件是技术人员已知的并且描述于例如Sambrook等人,"Molecular Cloning",第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press1989,New York中。

本发明还涉及降低或消除内源Rho比活性的方法，如本文所述在合适宿主细胞(例如产生核黄素的微生物)中产生上文所定义的(经修饰的) 多核苷酸的方法，以及生成能够产生核黄素的所述经修饰的微生物的方法。

因此，根据本发明的一个目标，使用上述产生核黄素的宿主细胞来发酵生产核黄素，其中通过如上所述的rho基因内的遗传操作，与使用携带未修饰Rho的宿主细胞(展示出100％的Rho比活性)相比，核黄素的产率得到改善。

在本文中使用时，“经改善的核黄素产率”是指：与野生型宿主(例如微生物)(即编码未修饰的Rho的宿主)相比，增加至少5％，例如优选至少25％、30％、40％、50％、75％、100％、200％或甚至超过500％。

术语“核黄素”和“维生素B2”在本文中可互换使用。参与核黄素生物合成的基因以及用于发酵生产核黄素的方法，特别是使用Bacillus菌株的发酵生产是已知的(见例如EP405370或Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第七版,2007,维生素章节)。这些方法也可以用于使用包含本文所述经修饰的rib前导序列的突变体菌株来生产核黄素。

在本文中使用时，术语“核黄素”还包括核黄素前体、黄素单核苷酸 (FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及其衍生物。核黄素前体和核黄素、FMN或FAD的衍生物包括但不限于：DRAPP；5-氨基-6-核糖氨基- 2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸；2,5-二氨基-6-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'- 磷酸(2,5-diamino-6-ribitylamino-4(3H)-pyrimidinone-5'-phosphate)；5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸；5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4 (1H,3H)-嘧啶二酮；6,7-二甲基-8-核糖醇2,4-二氧四氢蝶啶(6,7-dimethyl- 8-ribityllumazine，DMRL)；和黄素蛋白。核黄素的衍生物包括但不限于：核黄素-5-磷酸及其盐，例如，核黄素-5-磷酸钠。

在本发明的方法(即如上文所述生产核黄素的方法)中可以使用若干底物作为碳源。特别合适的碳源可选自包含3、5或6个碳原子的化合物，例如D-葡萄糖、果糖、乳糖、纤维素、甘油、稠果汁、右旋糖、淀粉、蔗糖、核糖或来自可再生原料的未纯化的混合物。优选地，碳源是D- 葡萄糖。与上述方法相关的术语“碳源”、“底物”和“生产底物”可在本文中互换使用。

在本文中经修饰的微生物的上述方法中使用的培养基可以是生产核黄素的任何合适的培养基。典型地，培养基是包含例如盐、底物和特定pH 的水性培养基。其中底物被转化成核黄素的培养基也被称作生产培养基。 WO 04/113510中描述了用于生产核黄素的合适培养基的实例(VF培养基)，其对于Bacillus特别有用。

在本文中使用时，“发酵”或“生产”或“发酵方法”可以是在合适底物转化成核黄素的适当条件下，使用技术人员已知的培养基、条件和流程使用生长中的细胞，或者通过使用技术人员已知的培养基、条件和流程培养后使用非生长中的所谓的静息细胞。在本文中使用时，发酵不限于如上所述的全细胞发酵方法，而是还可以使用例如透化的宿主细胞，粗细胞提取物，通过例如离心或过滤从细胞残余物澄清的细胞提取物，或甚至利用经分离的酶重构的反应途径。这些方法的组合也在本发明的范围内。在无细胞生物合成(例如利用重构的反应途径)的情况下，参与核黄素产生方法的分离的酶是否已经通过宿主细胞制备并从宿主细胞中分离，通过体外转录/翻译或通过其它手段制备并不相干。WO 04/113510中描述了用于生产核黄素的合适培养基的实例(VF培养基)，其对于Bacillus特别有用。

可以通过任何合适的手段从细胞中回收所生产的核黄素。回收表示例如所生产的核黄素可与生产培养基分离。任选地，如此生产的发酵产物可以被进一步加工，例如纯化。

与使用微生物的上述方法有关时，在一个方面中，生长步骤可以在补充有在需氧条件下正常生长所用合适营养物的水性培养基(即生长培养基)中进行。培养可以例如以分批、补料分批、半连续或连续模式进行，其中补料分批或半连续模式是优选的。详细的发酵方法是本领域技术人员已知的，或描述于例如EP 405370中。

培养周期可根据例如使用的宿主、pH、温度和营养培养基而异，并可以是例如根据微生物约10小时到约10天，优选地约4天到约7天，更优选地约2天到约6天。技术人员应当知道合适微生物的最佳培养条件。

培养可例如在约7.0的pH下进行，优选地在约6到约8范围内，更优选地约6.5到7.5的pH下进行。进行培养的合适温度范围可以例如是从约 13℃到约70℃，优选地从约35℃到约39℃，更优选地从约30℃到约 39℃，最优选地从约36℃到约39℃。生长培养基通常可含有此类营养物，如可同化的碳源，例如D-葡萄糖、甘油、稠果汁、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖；和可消化的氮源，例如有机物质，例如胨、酵母提取物和氨基酸。培养基可以含有或不含尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。多种无机物质也可以被用作氮源，例如硝酸盐和铵盐。另外，生长培养基通常可含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。使用上述流程获得的细胞可在与上文所述基本相同的模式、温度和pH条件下，在存在例如上述的底物时进一步孵育，孵育方式使得它们将这些底物转化成想要的目标发酵产物。孵育可在富含氮的培养基中进行，所述培养基含有例如有机氮源，例如胨、酵母提取物、烘焙酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液，或无机氮源，例如硝酸盐和铵盐，在这种情况下细胞将能够进一步生长同时生产想要的发酵产物。或者，孵育可以在缺乏氮的培养基(nitrogen-poor medium)中进行，在这种情况下细胞基本上不生长，并且会处于静息细胞的模式或生物转化的模式。在所有情况下，孵育培养基也可以含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和氯化钙。

术语“生产”或“生产力”是本领域公知的，并且包括在给定时间和给定发酵体积内形成的核黄素的浓度(例如每小时每升的kg产物)。术语“生产效率”包括达到具体生产水平所需的时间(例如，细胞达到具体的发酵产物输出速率花费的时间)。术语“产率”是本领域公知的，并且包括将碳源转化成产物(即核黄素)的效率。这通常被描述成例如每kg 碳源的kg产物。“提高化合物的产率和/或生产/生产力”表示在给定量的时间期间给定量的培养物中，回收的分子或所述化合物的有用的回收分子的量增加。

测定核黄素产率/生产力的分析方法是本领域已知的。此类方法可包括但不限于HPLC或指示菌株的使用(见例如Bretzel等人,J.Ind.Microbiol. Biotechnol.22,19-26,1999)。

因此，本发明包括但不限于产生核黄素的宿主细胞，所述宿主细胞选自Bacillus或Corynebacterium的菌株，优选地选自B.subtilis、B. atrophaeus、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens、B.pumilus、B. infantis、B.coagulans、B.megaterium、B.thuringiensis、B.cereus、B. halodurans或C.glutamicum，更优选地选自B.subtilis、B.licheniformis、B. amyloliquefaciens或B.megaterium，最优选地选自B.subtilis，特别是B. subtilis 1A747或B.subtilis 168，其中与未修饰的Rho的活性相比，Rho的活性降低或消除，优选降低至少20％，更优选地降低至少50％、60％、 70％、80％、90％，最优选地降低100％(即Rho活性消除)；其中，特别地

(1)通过下述来降低Rho的活性：在核糖体结合位点中引入突变，优选地在对应于SEQ ID NO:1的第-17至-6位(ATG-17bp至ATG-6bp) 的核苷酸中引入一个或更多个突变，更优选地缺失所述结构域；和/或

(2)通过下述来降低Rho的活性：在冷休克结构域中引入突变，优选地在对应于SEQID NO:1的第+160至+360位(ATG+160bp至ATG+ 360bp)的核苷酸中引入一个或更多个突变，更优选地缺失所述结构域；和/或

(3)通过下述来降低Rho的活性：在RNA结合位点中引入突变，优选地在对应于SEQID NO:1的第+174至+336位(ATG+174bp至ATG+ 336bp)的核苷酸中引入一个或更多个突变，更优选地缺失所述结构域；和/或

(4)通过下述来降低Rho的活性：在ATP结合位点中引入突变，优选地在对应于SEQID NO:1的第+538至+1062位(ATG+538bp至ATG+ 1062bp)的核苷酸中引入一个或更多个突变，更优选地缺失所述结构域；和/或

(5)通过下述来降低Rho的活性：在启动子区中引入突变，优选地在对应于SEQ IDNO:1的第-200至+1位(ATG-200bp至ATG+1)的核苷酸中引入一个或更多个突变，更优选地缺失所述结构域；和/或

(6)通过下述来降低Rho的活性：在对应于SEQ ID NO:1的第+155 至+165位(ATG+155bp至ATG+165bp)的核苷酸中引入一个或更多个突变，更优选地缺失所述核苷酸；和/或

(7)通过下述来降低Rho的活性：在对应于SEQ ID NO:2的第56位残基中进行氨基酸替换，优选地将野生型氨基酸替换为天冬氨酸，更优选地将对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置上的甘氨酸替换为天冬氨酸，即G56D突变；和/或

(8)通过下述来降低Rho的活性：缺失对应于根据SEQ ID NO:1的 rho基因的核苷酸。

此外，本发明涉及一种方法，其中产生核黄素的宿主细胞选自 Bacillus或Corynebacterium的菌株，优选地选自B.subtilis、B. atrophaeus、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens、B.pumilus、B. infantis、B.coagulans、B.megaterium、B.thuringiensis、B.cereus、B. halodurans或C.glutamicum，更优选地选自B.subtilis、B.licheniformis、B. amyloliquefaciens或B.megaterium，最优选地选自B.subtilis，特别是B. subtilis 1A747或B.subtilis 168，其中与未修饰的Rho的活性相比，Rho的活性降低或消除，优选降低至少20％，更优选地降低至少50％、60％、 70％、80％、90％，最优选地降低100％(即Rho活性消除)；其中，特别地，通过上述实施方式(1)至(8)之一来降低Rho的活性。

附图

图1：B.subtilis菌株构建的方案。

图2：在rho基因存在(即BS4912或BS7307)或不存在(BS7301或 BS7309)的情况下，以％表示的核黄素产生产率(y轴)。更多细节请特别参见实施例10(表3)。

图3：使用默认设置的ClustalW2生成的比对。ECOLI:E.coli K12 (P0AG30)，PSEPU:Pseudomonas putida S16(F8FZD7)，BACSU:B.subtilis 168(Q03222)，STAAE:Staphylococcus aureus Newman(A6QIW5)，DEIRA: Deinococcus radiodurans(P52153)。B.subtilis Rho第56位的氨基酸(甘氨酸)加下划线。

以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。本申请通篇引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请(特别是EP 405370、WO 04/106557、WO 07/051552和EP1186664)的内容通过引用并入本文。

实施例

使用了在实施例中所提及的以下培养基和通用方法：

VY培养基：酵母提取物(Becton-Dickinson)(5g/l)，小牛浸液培养基(Sigma)(25g/l)。

TBAB培养基：33g/l胰蛋白胨血琼脂培养基(Becton Dickinson)。

10X Spizizen盐(SS)：20g/l(NH₄)₂SO₄；140g/l K₂HPO₄；60g/l KH₂PO₄；10g/l柠檬酸三钠；2g/l MgSO₄·7H₂O。

10X BSS：20g/l(NH₄)₂SO₄；140g/l K₂HPO₄；60g/l KH₂PO₄；2g/l MgSO₄·2H₂O；pH6.8。

100X微量元素溶液：12.5g/l MgCl₂·6H₂O；0.55g/l CaCl₂；1.35g/l Fe(III)Cl₃·6H₂O；0.1g/l MnCl₂·4H₂O；0.17g/l ZnCl₂；0.043g/l CuCl₂·2 H₂O；0.06g/l CoCl₂·6H₂O；0.06g/l Na₂MoO₄·2H₂O。

Spizizen基本培养基(SMM)：100ml 10X SS，10ml 100X微量元素溶液，10ml 50％葡萄糖溶液。H₂O加到1000ml。对于固体培养基，加入终浓度为1.5％的琼脂(BectonDickinson)。

核黄素筛选培养基(RSM)：100ml 10X BSS；10ml 100X微量元素溶液；50mg/l酵母提取物(Merck)，补充有一个6mm的缓慢释放葡萄糖FeedBeads(KühnerAG，Birsfelden，瑞士)。

10X MN培养基：136g/l K₂HPO₄；60g/l KH₂PO₄；8.8g/l柠檬酸钠·2 H₂O。

MNGE培养基：0.9ml 10X MN培养基，400ml 50％葡萄糖溶液，50 μl 40％谷氨酸钠溶液，50μl柠檬酸铁(III)铵溶液(2.2mg/l)，30μl 1M MgSO₄溶液。在制备B.subtilis感受态细胞的第一阶段，该培养基补充有 100μl 10％酪蛋白氨基酸(CAA)溶液(BectonDickinson)。

表达混合物(EM)：7.5ml 10％酵母提取物；3.75ml 10％CAA； 18.75ml H₂O。

从B.subtilis中分离基因组DNA：使用高纯度PCR模板制备试剂盒 (High PurePCR Template Preparation Kit，Roche，Switzerland)并根据制造商的说明制备基因组DNA。使用在37℃(250rpm)下孵育的3ml在 VY液体培养基中的B.subtilis的过夜培养物中的1ml作为细菌细胞的来源。最后，在200μl Tris-HCl缓冲液(随试剂盒提供)中洗脱基因组DNA。

在B.subtilis中转化：用单个菌落接种2ml补充有CAA的MNGE培养基，并在37℃下以180rpm孵育过夜。第二天，将培养物用于接种10 ml补充有CAA的MNGE至起始

在37℃(180rpm)下孵育稀释的培养物至达到

用相同体积的不含CAA的MNGE稀释培养物并孵育另外一小时。离心步骤(5分钟，4000rpm，RT)后，将上清液倒入无菌管中。将沉淀物悬浮在1/9保存的上清液中。使用新制备的或冷冻的感受态细胞进行转化。冷冻时，向细胞中加入甘油至浓度为 13％。在-80℃下冷冻400μl等分试样。在37℃下解冻感受态细胞等分试样，并悬浮在1.7ml 1X MN、100μl 50％葡萄糖溶液、34μl 1MMgSO₄中。将待转化的DNA加入感受态细胞中，然后在37℃下以180rpm孵育 30分钟。加入100μl EM，并在37℃下以180rpm孵育细胞1小时。将细胞涂布在适当的选择性琼脂板上(当选择原养型恢复时，之前进行使用1 ml 1X SS的两个洗涤步骤)。

用PBS1噬菌体裂解物转导B.subtilis：通过在10ml VY培养基中接种供体菌株的单个菌落来制备供体裂解物。在30℃下孵育培养物过夜，并缓慢搅拌。第二天，用这100μl预培养物接种10ml VY培养基，并在 37℃、120rpm下孵育至

然后用750μl PBS1噬菌体裂解物感染该培养物。在37℃、120rpm下孵育感染的培养物6小时，并在室温下裂解过夜，不搅拌。第二天，将裂解的培养物离心并将上清液过滤灭菌。将得到的供体裂解物储存在+4℃备用。通过在10ml VY培养基中接种供体菌株的单个菌落来制备受体菌株。在30℃下孵育培养物过夜，并缓慢搅拌。第二天，用100μl预培养物接种10ml VY培养基，并在37℃、120rpm下孵育至

然后用150μl供体裂解物感染2ml培养物，并在37℃、100rpm下摇动30分钟。然后通过离心(15分钟，3500 rpm)收集细胞，并用10ml 1X SS洗涤两次。将沉淀物悬浮在150μl 1×SS中，并涂布在选择性琼脂培养基上，然后在37℃下孵育1-2天。

深孔微量滴定板(MTP)中核黄素产生的试验：从3ml的在适当时含有选择性抗生素的VY中的单个菌落制备过夜培养物。在39℃、550 rpm、80％湿度下孵育预培养物。第二天，用预培养物接种3ml RSM，起始

一式三份地制备MTP中的培养物，用呼吸封条(seal) 覆盖孔。在39℃、550rpm、80％湿度下孵育MTP 48小时。用20μl 4M NaOH溶液处理250μl 48小时的培养物以溶解核黄素晶体(以300rpm摇动1分钟)。加入230μl pH 6.8的1M磷酸钾缓冲液(以300rpm摇动1 分钟)。通过测量合适稀释物的OD_444nm来检测核黄素。一单位的OD_444nm对应于33.05mg/l核黄素。此外，通过使用四元泵、自动进样器、UV-和折射率检测器的Agilent 1100系列HPLC系统来分析培养液中葡萄糖的潜在积累。在CAPCELL PAK NH2UG80柱(4.6mm×250mm，5μ； Shiseido)上实现了分离。最佳柱温为35℃。流动相是比例为65:35的乙腈和去离子水的混合物。流速为1.0ml/min，注射体积被设定为5μl。监测折射率信号并用于检测。每种化合物的校准范围为0.5mg/ml-30 mg/ml。

用于B.subtilis菌株构建的引物描述于实施例中，并列于表1中。更多信息请查看实施例中的相应文本。

表1：本发明中使用的序列，包括SEQ ID NO和名称(“P”表示引物；“rho”表示rho的多核苷酸序列；“Rho”表示Rho蛋白的氨基酸序列)。

在整个发明中生成了以下微生物(参见表2)。

表2：用于进行本发明的微生物的构建。

实施例1：生成核黄素原养型菌株

为了构建光养型菌株，首先通过用未突变的trpC基因替换trpC2突变来生成Bacillus subtilis BS168-SP1(Marburg菌株168的色氨酸原养型衍生物)，所述未突变的trpC基因是通过PCR在分离自菌株B.subtilis ATCC 6051的DNA上扩增的，所述菌株B.subtilis ATCC 6051获自美国典型培养物保藏中心(ATCC),邮箱1549,Manassas,VA20108 USA。如下产生 DNA片段：将1μl引物P1和引物P2的100μM溶液加入50μl反应体积中的0.1μg B.subtilis ATCC 6051染色体DNA中，所述反应体积含有1μl 10mM dNTPs、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)。以三个连续步骤的35个循环进行PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30 秒；(ii)53℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)72℃下的延伸步骤，持续2分钟。PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化1425bp长的trpC PCR产物，并使用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。根据上述方法，用1μg ATCC6051的trpC PCR产物转化源自巴斯德研究所(巴黎)的菌株保藏中心的菌株B.subtilis 168(CIP106309)。在SMM琼脂板上选择色氨酸原养型(Trp+)转化体。其中一个转化体(命名为BS168-SP1)被确认为色氨酸原养型，因为它能够在SMM琼脂板上生长，即使没有补充20μg/ml的色氨酸亦是如此。另外，通过对BS168-SP1进行测序来确认基因型。

实施例2：构建核黄素-营养缺陷型B.subtilis BS168-SP1

使用分离自菌株RB55(描述于US20030232403中)的基因组DNA 来构建核黄素-营养缺陷型BS168-SP1菌株(参见实施例1)。在RB55 中，将含有rib操纵子(ribG、ribB、ribA、ribH和ribT)及其前导区的 7.2kb区段移除，并基本上用氯霉素抗性(cat)盒替换。用1μgRB55基因组DNA来转化感受态B.subtilis BS168-SP1(参见实施例1)。在含有5 μg/ml氯霉素的TBAB板上选择氯霉素抗性(Cmr)转化体。其中一个转化体(命名为BS4842)被确认为核黄素营养缺陷型，因为只有SMM琼脂板补充有500μM核黄素，它才能在其上生长。使用引物P3和P4，以及 BS4842的染色体DNA作为模板DNA，通过PCR来确认核黄素营养缺陷型和CmrBS4842菌株的正确基因型。使用如上所述的标准反应条件进行 PCR反应。

实施例3：在B.subtilis BS4842中用强组成型启动子替换天然rib启动子

为了用修饰版本的rib前导区(Pspo15_三ribO_delmro175)和 ribGBAHT基因替换菌株B.subtilis BS4842中的cat基因(参见实施例 2)，从而导致rib操纵子组成型表达，使用1μg分离自菌株BS3922(描述于WO10052319中)的基因组DNA来转化感受态B.subtilisBS4842细胞。将细胞铺板到补充有100μg/ml玫瑰黄色素的SMM板上。其中一个转化体(命名为BS4903)被确认为核黄素原养型，因为它能够在SMM琼脂板上生长，即使没有补充500μM核黄素亦是如此。BS4903仅在不含5 μg/ml氯霉素的TBAB琼脂板上生长。另外，通过对BS4903的衍生菌株 BS4912(参照实施例6)进行测序来确认基因型。

实施例4：在B.subtilis BS4903的ribC基因中引入ribC820损伤

在菌株B.subtilis BS4903(参见实施例3)的染色体中插入最初在过量产生核黄素的突变体(Mack等人,J Bacteriol.180(4):950-5,1998)中鉴定的ribC820损伤。首先，将来自从美国俄亥俄州立大学的芽孢杆菌遗传库存中心(The Bacillus Genetic StockCenter)获得的质粒pMUTIN4的红霉素抗性标记(erm)(Vagner等人,J Bacteriol.180(4):950-5,1998)插入 ribC基因和rpsO基因之间的基因间区域，紧邻ribC下游(序列2)。使用长侧翼同源聚合酶链式反应(LFH-PCR)来产生含有1163bp erm抗性盒的DNA片段，所述erm抗性盒侧翼是ribC基因的1183bp上游区域和编码序列(5'侧翼)以及ribC基因的660bp下游区域(3'侧翼)。因此，首先通过PCR扩增5'侧翼、erm抗性盒和3'侧翼这3个DNA片段：对于5' 侧翼(带有ribC820)，将1μl 100μM引物P5的溶液和引物P6的溶液加入50μl反应体积中的0.1μg B.subtilis BS3922(描述于WO10052319 A1 中)染色体DNA中，所述反应体积含有1μl10mM dNTPs、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)；对于erm抗性盒，将引物P7和引物 P8加入如前所述的50μl反应体积中的0.1μg pMUTIN2质粒DNA中；对于3'侧翼，将1μl 100μM引物P9的溶液和引物P10的溶液加入如前所述的50μl反应体积中的0.1μgB.subtilis BS168-SP1(参见实施例1)染色体 DNA中。以三个连续步骤的35个循环进行PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)53℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)72℃下的延伸步骤，持续2分钟。PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离三种PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。由于5'侧翼和3'侧翼与红霉素盒的重叠区域，可以通过最终的LFH-PCR反应来组装它们：加入1μl 100μM引物 P5和引物P10的溶液、2μl 5'侧翼PCR产物、2μl 3'侧翼PCR产物和2μl erm抗性盒以得到50μl终反应体积，其含有1μl 10mM dNTPs、5μl 10X 缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Roche)。以三个连续步骤的10个循环进行 LFH-PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)63℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续4分钟，然后进行三个连续步骤的20个循环：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii) 63℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续4分钟，增加20秒/循环。PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化组装的LFH-PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。使用纯化的LFH-PCR产物(1μg)来转化感受态B.subtilis BS4903(参见实施例3)。在含有1μg/ml红霉素和25 μg/ml林可霉素的TBAB板上选择红霉素抗性(Erm)转化体。使用引物 P5和引物P10，通过PCR反应来确认一些Erm转化体的正确基因型(通过与对BS168-SP1基因组DNA产生的相同扩增物相比，比Erm转化体产生的短1.1kb)。使用如上所述用于LFH-PCR的标准反应条件进行PCR 反应。对于其中一个转化体(命名为BS4905)，由于在使用引物P11和 P12生成的PCR片段中相关地产生了AluI限制性位点，所以ribC820损伤的存在得以控制(通过与对BS168-SP1基因组DNA制备的相同扩增物相比，所述基因组DNA不包含AluI限制性位点)。15μl限制性混合物含有 10μl PCR片段、1.5μl 10X缓冲液和1.5μl AluI限制性酶(New England Biolabs，USA)，将其在37℃下孵育1小时。另外，通过对BS4905的衍生株BS4912(参见实施例6)进行测序来确认基因型。

实施例5：构建转酮酶缺陷的B.subtilis BS4905菌株

在将突变的转酮酶基因无标记地引入B.subtilis基因组的原始tkt基因座中之前，构建转酮酶缺陷型菌株。如下产生在B.subtilis转酮酶基因的第1043和1561个碱基对之间含有来自pUB110的新霉素抗性盒(Itaya等人,Nucleic Acids Res.17(11):4410,1989)的PCR片段：将1μl引物P13和引物P14的100μM溶液加入50μl反应体积中的0.1μgB.subtilis BS3402 (描述于WO2007051552中)染色体DNA中，所述反应体积含有1μl 10 mMdNTP、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Roche)。以三个连续步骤的10个循环进行PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒； (ii)63℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续4 分钟，然后进行三个连续步骤的20个循环：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)63℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续4分钟，增加20秒/循环。PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化5kb长的tkt::neo PCR产物，并使用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。根据上述方法，用1μg BS3402的tkt::neo PCR产物转化菌株B.subtilis BS4905(参见实施例 4)。在补充有500μg/ml莽草酸(Sigma)的含有5μg/ml新霉素的TBAB 板上选择新霉素抗性(Nmr)转化体。对于其中一个Nmr转化体(命名为 BS4909)，如先前所述分离基因组DNA，并使用引物P13和引物P14，通过标准PCR来确认第1043至1561碱基对的转酮酶DNA片段被新霉素抗性盒正确置换。正如对于转酮酶缺失突变体所预期的那样，BS4909菌株只有在SMM琼脂板补充有500μg/ml莽草酸时，才能在其上生长。

实施例6：在菌株B.subtilis BS4909的转酮酶基因中引入tktR357A损伤

如下产生含有经修饰的转酮酶基因(导致突变R357A)的PCR片段：将1μl 100μM引物P13和引物P14的溶液加入50μl反应体积中的 0.1μg B.subtilis BS3922(描述于WO2010052319中)染色体DNA中，所述反应体积含有1μl 10mM dNTP、5μl 10X缓冲液和0.5μlPfu聚合酶 (Stratagene)。以三个连续步骤的35个循环进行PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)53℃下的退火步骤，持续30秒；(iii) 72℃下的延伸步骤，持续3分钟。PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化3kb长的tktR357APCR产物，并使用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。根据上述方法，用 1μgBS3922的tktR357A PCR产物转化菌株B.subtilis BS4909(参见实施例5)。将细胞铺板在SMM板上。其中一个转化体(命名为BS4912)被确认为原养型，因为它能够在SMM琼脂板上生长，即使没有补充500 μg/ml莽草酸亦是如此。BS4912仅在不含5μg/ml新霉素的TBAB琼脂板上生长。另外，通过对BS4912进行测序来确认基因型。

实施例7：在菌株B.subtilis BS4912中缺失rho基因

rho-无效(null)突变体中阻止了BS4912中Rho蛋白的产生。通过用来自pUB110的新霉素抗性盒(Itaya等人，见上文)替换B.subtilis BS4912菌株中的rho基因来构建菌株。新霉素抗性盒的染色体整合导致 rho基因从起始密码子上游的5个碱基对到终止密码子下游的11个碱基对 (序列3)完全缺失。使用长侧翼同源聚合酶链式反应(LFH-PCR)来产生含有1234bp新霉素抗性盒的DNA片段，所述新霉素抗性盒侧翼是rho 基因的499bp上游区域(5'侧翼)和515bp下游区域(3'侧翼)。因此，首先通过PCR扩增5'侧翼、新霉素抗性盒和3'侧翼这3个DNA片段：对于5'侧翼，将1μl 100μM引物P15的溶液和引物P16的溶液加入50μl反应体积中的0.1μg B.subtilis BS168-SP1(参见实施例1)染色体DNA中，所述反应体积含有1μl 10mM dNTPs、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶 (Stratagene)；对于新霉素抗性盒，将引物P17和引物P18加入如前所述的50μl反应体积中的0.1μg B.subtilis BS3402(描述于WO2007051552/A1中)染色体DNA中；对于3'侧翼，将1μl 100μM引物P19的溶液和引物P20的溶液加入如前所述的50μl反应体积中的0.1μg B.subtilis BS168-SP1(参见实施例1)染色体DNA中。以三个连续步骤的 35个循环进行PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii) 53℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)72℃下的延伸步骤，持续2分钟。 PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离三种PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。由于5'侧翼和3'侧翼与新霉素抗性盒的重叠区域，可以通过最终的 LFH-PCR反应来组装它们：加入1μl 100μM引物P15和引物P20的溶液、2μl5'侧翼PCR产物、2μl 3'侧翼PCR产物和2μl neo抗性盒以得到 50μl终反应体积，其含有1μl10mM dNTPs、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu 聚合酶(Roche)。以三个连续步骤的10个循环进行LFH-PCR反应： (i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)63℃下的退火步骤，持续30 秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续3分钟，然后进行三个连续步骤的20 个循环：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)63℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续3分钟，增加20秒/循环。 PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化组装的LFH-PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。使用纯化的LFH-PCR产物(1μg)来转化感受态B.subtilis BS168-SP1(参见实施例1)。在含有5μg/ml新霉素的TBAB板上选择新霉素抗性(Nmr)转化体。如先前所述分离其中一个Nmr转化体(命名为 BS7180)的基因组DNA，并使用引物P20和引物P21，通过标准PCR来确认用新霉素抗性盒正确缺失了完整的rho编码序列。根据上述方法用 PBS1噬菌体进行rho缺失构建体的转导，其中使用BS7180的裂解物来转导菌株B.subtilis BS4912(参见实施例6)。在含有5μg/ml新霉素的 TBAB板上选择Nmr转导体。如先前所述分离其中一个Nmr转导体(命名为BS7301)的基因组DNA，并使用引物P20和引物P21，通过标准 PCR来确认用新霉素抗性盒正确缺失了完整的rho编码序列。

实施例8：在菌株B.subtilis BS5596中替换pRF69和pRF93

本发明中使用的菌株的实例来源于已知在优化的罐发酵条件下能够产生多于14.0g/l核黄素的腺嘌呤原养型B.subtilis菌株BS5596，又名 RB50::[pRF69]60::[pRF93]120(构建描述于EP821063和US6190888 中)。除了在每个质粒中组成型表达的rib操纵子的拷贝之外，pRF69含有氯霉素抗性(cat)盒，pRF93含有四环素(tet)抗性盒。在这种过量产生核黄素的菌株中，整合在rib基因座(染色体中的207.6°)的pRF69质粒和整合在bpr基因座(染色体中的136.5°)的pRF93质粒分别被BS3922 (描述于WO2010052319)的rib操纵子和氯霉素(cat)抗性盒替换，所述rib操纵子的表达由Pspo15_三ribO_del mro175前导区驱动。对于菌株构建，如上所述用spo0A基因中包含spo0A12无义突变(Hoch JA， 1971)的B.subtilis菌株BS3922(描述于WO10052319A1中)的衍生物 BS4664的PBS1裂解物感染BS5596。对于选择，将来自从美国俄亥俄州立大学的芽孢杆菌遗传库存中心获得的质粒pDG1728的壮观霉素(spec) 抗性盒(Guérout-Fleury等人，见上文)插入spo0A和yqiG基因之间的基因间区域中，spo0A下游221个碱基对(序列4)。在含有100μg/ml壮观霉素的TBAB琼脂板上选择由转导RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+和 BS4664裂解物而产生的壮观霉素抗性(Specr)克隆。作为用Pspo15_三 ribO_delmro175rib替换pRF69质粒的结果，在含有5μg/ml氯霉素的 TBAB琼脂板上筛选氯霉素敏感(CmS)转导体。所得菌株被命名为 BS7331。如前所述分离BS7331的基因组DNA，并使用引物P22和引物 P23，通过标准PCR来确认pRF69被Pspo15_三ribO_del mro175rib正确替换(通过与对BS168-SP1基因组DNA制备的相同扩增物相比，短 103bp)。为了使BS7331中仅具有一个拷贝的rib操纵子，用来自从美国俄亥俄州立大学的芽孢杆菌遗传库存中心获得的质粒pSac-Cm的氯霉素抗性(cat)盒替换BS7331染色体的bpr基因座处的pRF93质粒(Middleton 和Hofmeister,Plasmid.51(3):238-45,2004)。对于菌株构建，使用长侧翼同源聚合酶链式反应(LFH-PCR)来产生含有1035bp氯霉素抗性盒的 DNA片段，所述氯霉素抗性盒侧翼为bpr基因的581bp上游区域(5'侧翼)和564bp下游区域(3'侧翼)。因此，首先通过PCR扩增5'侧翼、cat 抗性盒和3'侧翼这3个DNA片段：对于5'侧翼，将1μl 100μM引物P24 的溶液和引物P25的溶液加入50μl反应体积中的0.1μg B.subtilis BS168- SP1(参见实施例1)染色体DNA中，所述反应体积含有1μl 10mMdNTPs、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)；对于cat抗性盒，将引物P26和引物P27加入如前所述的50μl反应体积中的0.1μg pSac-Cm质粒DNA中；对于3'侧翼，将1μl100μM引物P28的溶液和引物P29的溶液加入如前所述的50μl反应体积中的0.1μgB.subtilis BS168- SP1(参见实施例1)染色体DNA中。以三个连续步骤的35个循环进行PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)53℃下的退火步骤，持续30秒；(iii)72℃下的延伸步骤，持续2分钟。PCR循环之前是 95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离三种PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。由于5'侧翼和3'侧翼与氯霉素抗性盒的重叠区域，可以通过最终的LFH-PCR反应来组装它们：加入1μl 100μM引物P24和引物P29的溶液、2μl 5'侧翼 PCR产物、2μl 3'侧翼PCR产物和2μl cat抗性盒以得到50μl终反应体积，其含有1μl 10mM dNTPs、5μl 10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶 (Roche)。以三个连续步骤的10个循环进行LFH-PCR反应：(i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)63℃下的退火步骤，持续30秒；(iii) 68℃下的延伸步骤，持续3分钟，然后进行三个连续步骤的20个循环： (i)94℃下的变性步骤，持续30秒；(ii)63℃下的退火步骤，持续30 秒；(iii)68℃下的延伸步骤，持续3分钟，增加20秒/循环。PCR循环之前是95℃下的变性步骤，持续2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳纯化组装的 LFH-PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。使用纯化的LFH-PCR产物(1μg)来转化感受态B.subtilisBS168- SP1(参见实施例1)。在含有5μg/ml氯霉素的TBAB板上选择氯霉素抗性(Cmr)转化体。如先前所述分离其中一个Cmr转化体(命名为 BS4566)的基因组DNA，并使用引物P24和引物P30，通过标准PCR来确认用氯霉素抗性盒正确缺失了bpr编码序列。根据上述方法用PBS1噬菌体进行bpr缺失构建体的转导，其中使用BS4566的裂解物来转导菌株B. subtilisBS7331。在含有5μg/ml氯霉素的TBAB板上选择Cmr转导体。如先前所述分离其中一个Cmr转导体(命名为BS7307)的基因组DNA，并使用引物P24和引物P30，通过标准PCR来确认用氯霉素抗性盒正确缺失了bpr编码序列。

实施例9：在菌株B.subtilis BS7307中缺失rho基因

rho-无效突变体中阻止了BS7307中Rho蛋白的产生。通过用来自 pUB110的新霉素抗性盒(Itaya等人，见上文)替换B.subtilis BS7307菌株中的rho基因来构建菌株。新霉素抗性盒的染色体整合导致rho基因从起始密码子上游的5个碱基对到终止密码子下游的11个碱基对(序列3) 完全缺失。实施例7中详细描述了rho缺失的构建。根据上述方法，用PBS1噬菌体进行rho缺失构建体的转导，其中使用BS7301的裂解物转导菌株B.subtilisBS7307(参见实施例8)。在含有5μg/ml新霉素的TBAB 板上选择Nmr转导体。如先前所述分离其中一个Nmr转导体(命名为 BS7309)的基因组DNA，并使用引物P20和引物P21，通过标准PCR来确认用新霉素抗性盒正确缺失了完整的rho编码序列。

实施例10：存在/不存在rho基因时的核黄素产生试验

表3：具有所示不同基因型的各种B.subtilis菌株的核黄素产生。菌株B.subtilis BS4912和BS7301共享同一基因型背景(除了rho-缺失)，菌株B. subtilisBS7307和BS7309共享同一基因型背景(除了rho-缺失)。更多解释请参见文本。

与BS7301的直接亲本BS4912相比，BS7301的核黄素产生产率提高了约33％(见图2)。一致地，与BS7309的直接亲本BS7307相比， BS7309的核黄素产生产率提高了约36％(见图2)。这些结果显示：rho 基因缺失(即Rho蛋白质失活)对具有不同遗传背景的过量产生核黄素的 B.subtilis菌株中的核黄素产生有积极影响。

实施例11：菌株B.subtilis中rho基因的突变

根据实施例7和9中所述的rho缺失，在rho基因中引入部分缺失，即核糖体结合位点(对应于SEQ ID NO:1的第-17至-6位(ATG-17bp至 ATG-6bp)的核苷酸)、冷休克结构域(即对应于SEQ ID NO:1的第+160 至+360位(ATG+160bp至ATG+360bp)的核苷酸)、RNA-结合结构域(即对应于SEQ ID NO:1的第+174至+336位(ATG+174bp至ATG+ 336bp)的核苷酸)、ATP-结合位点(即对应于SEQ ID NO:1的第+538至 +1062位(ATG+538bp至ATG+1062bp)的核苷酸)、启动子区(即对应于SEQ ID NO:1的第-200至+1位(ATG-200bp至ATG+1)的核苷酸)的缺失，或对应于SEQ ID NO:1的第+155至+165位(ATG+155bp至 ATG+165bp)的片段的缺失，或导致对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置上的甘氨酸被替换为天冬氨酸(即G56D)的缺失。当检测黄素生产时，相较于内源rho基因未修饰的相应菌株，可以检测到20％至30％范围内的增加。

实施例12：生成用于核黄素产生的携带Rho突变的非B.subtilis的菌株

以上实施例中所述的构建体可用于鉴定/生成适用于核黄素产生的非B.subtilis的宿主菌株中的相应修饰。

如以上实施例中所述进行Rho突变/缺失的生成。下面描述了相似的 Bacillus种中的Rho蛋白的同一性。使用NCBI(美国国家生物技术信息中心)的BLAST(基本局部比对搜索工具)算法将B.subtilis rho编码序列与公共数据库进行比较，结果显示rho基因在Bacillus属中是高度保守的。此外，通过使用默认设置的ClustalW2生成的比对来检测非Bacillus 菌株，结果显示了在B.subtilis Rho中鉴定的G56的高度保守性。表4和图3列出了同源性的例子。

表4：各Bacillus种内的rho-编码序列的同源性。

Bacillus种	同一性百分比
		B.subtilis sp.	95-100％
B.atrophaeus	87％
		B.licheniformis	82％
B.amyloliquefaciens	84％
		B.pumilus	81％
B.infantis	80％
		B.coagulans	78％
B.megaterium	77％
		B.thuringiensis	75％
B.cereus	75％
		B.halodurans	75％

根据表4和图3的菌株可用于如本文所述的操作，特别是实施例7- 11。因此，构建了经遗传经修饰的菌株，其中如上文所例示，Rho的活性降低或消除。如所示进行核黄素产生的测量，核黄素产生按照表3所示的结果增加。

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 经改进的维生素生产

<130> CH 01239/15

<160> 32

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168

<400> 1

atgaaagacg tatctatttc ctctttggaa aatatgaaat tgaaagagct ttatgaactt 60

gcaagacatt ataaaatctc ctattacagc aaactgacaa aaaaagaact cattttcgcc 120

attctgaaag cgaatgcaga acaggaagat ctgctgttta tggaaggcgt tctcgagatc 180

atccagtctg aaggtttcgg attcctgaga ccgatcaact actctccaag ctcagaagac 240

atttacatct cagcttcaca aatccgccgt ttcgatttgc ggaacggaga caaagtatct 300

ggcaaggttc gcccgccaaa agaaaatgag cgttactatg gacttttgca cgttgaagca 360

gtaaatgggg atgatcccga atctgcaaaa gagcgtgtgc atttcccggc tcttacgcca 420

ctttatccgg atcgtcaaat ggtgcttgaa acaaagccga acttcttgtc tacaagaatt 480

atggacatga tggcgccggt tggatttggg cagcgcggat tgattgttgc gccgccgaaa 540

gccggaaaaa cgatgttgct gaaggaaatt gccaacagca ttacagcgaa ccagcctgaa 600

gcagagctga tcgtgctttt aattgacgaa agacctgagg aagtaaccga tatcgagcgc 660

tctgtagctg gggatgtcgt cagctcaacg tttgatgaag tgccggaaaa ccatatcaaa 720

gtggccgagc ttgtgcttga acgtgcgatg cgtctcgtgg aacacaaaaa agacgtcatt 780

atcctgatgg acagcatcac acgtcttgcc cgcgcctaca acttagtgat tccgccaagt 840

ggaagaacgc tttccggggg gattgaccca gcggcgttcc accgtccgaa acgcttcttt 900

ggggctgcga gaaatatcga agagggcggc agcttaacca tccttgctac ggctctggtc 960

gatacaggtt cacgtatgga tgatgtcatt tatgaagaat tcaagggaac aggcaacatg 1020

gagctccatc ttgaccgctc tcttgccgag cgccgcatct tccctgccat cgatatccgc 1080

cgttcaggaa cgcgcaaaga agagctgctt gtgcctaaag agcatcttga tcgtttatgg 1140

tctatccgca aaacgatgtc tgattcacct gatttcgcag aaaagttcat gagaaaaatg 1200

aaaaaaacca aaacaaacca ggaatttttc gatattctca atcaagaatg gaaacaggca 1260

aatctatcat ctgcaagaag gtaa 1284

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168

<400> 2

Met Lys Asp Val Ser Ile Ser Ser Leu Glu Asn Met Lys Leu Lys Glu

1 5 10 15

Leu Tyr Glu Leu Ala Arg His Tyr Lys Ile Ser Tyr Tyr Ser Lys Leu

20 25 30

Thr Lys Lys Glu Leu Ile Phe Ala Ile Leu Lys Ala Asn Ala Glu Gln

35 40 45

Glu Asp Leu Leu Phe Met Glu Gly Val Leu Glu Ile Ile Gln Ser Glu

50 55 60

Gly Phe Gly Phe Leu Arg Pro Ile Asn Tyr Ser Pro Ser Ser Glu Asp

65 70 75 80

Ile Tyr Ile Ser Ala Ser Gln Ile Arg Arg Phe Asp Leu Arg Asn Gly

85 90 95

Asp Lys Val Ser Gly Lys Val Arg Pro Pro Lys Glu Asn Glu Arg Tyr

100 105 110

Tyr Gly Leu Leu His Val Glu Ala Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ser

115 120 125

Ala Lys Glu Arg Val His Phe Pro Ala Leu Thr Pro Leu Tyr Pro Asp

130 135 140

Arg Gln Met Val Leu Glu Thr Lys Pro Asn Phe Leu Ser Thr Arg Ile

145 150 155 160

Met Asp Met Met Ala Pro Val Gly Phe Gly Gln Arg Gly Leu Ile Val

165 170 175

Ala Pro Pro Lys Ala Gly Lys Thr Met Leu Leu Lys Glu Ile Ala Asn

180 185 190

Ser Ile Thr Ala Asn Gln Pro Glu Ala Glu Leu Ile Val Leu Leu Ile

195 200 205

Asp Glu Arg Pro Glu Glu Val Thr Asp Ile Glu Arg Ser Val Ala Gly

210 215 220

Asp Val Val Ser Ser Thr Phe Asp Glu Val Pro Glu Asn His Ile Lys

225 230 235 240

Val Ala Glu Leu Val Leu Glu Arg Ala Met Arg Leu Val Glu His Lys

245 250 255

Lys Asp Val Ile Ile Leu Met Asp Ser Ile Thr Arg Leu Ala Arg Ala

260 265 270

Tyr Asn Leu Val Ile Pro Pro Ser Gly Arg Thr Leu Ser Gly Gly Ile

275 280 285

Asp Pro Ala Ala Phe His Arg Pro Lys Arg Phe Phe Gly Ala Ala Arg

290 295 300

Asn Ile Glu Glu Gly Gly Ser Leu Thr Ile Leu Ala Thr Ala Leu Val

305 310 315 320

Asp Thr Gly Ser Arg Met Asp Asp Val Ile Tyr Glu Glu Phe Lys Gly

325 330 335

Thr Gly Asn Met Glu Leu His Leu Asp Arg Ser Leu Ala Glu Arg Arg

340 345 350

Ile Phe Pro Ala Ile Asp Ile Arg Arg Ser Gly Thr Arg Lys Glu Glu

355 360 365

Leu Leu Val Pro Lys Glu His Leu Asp Arg Leu Trp Ser Ile Arg Lys

370 375 380

Thr Met Ser Asp Ser Pro Asp Phe Ala Glu Lys Phe Met Arg Lys Met

385 390 395 400

Lys Lys Thr Lys Thr Asn Gln Glu Phe Phe Asp Ile Leu Asn Gln Glu

405 410 415

Trp Lys Gln Ala Asn Leu Ser Ser Ala Arg Arg

420 425

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 3

cggatatgga tacatatcgg ttc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 4

cgactaaagc agaaagagga agag 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 5

ttcaactaac ggggcaggtt a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 6

ggttatcacc tgtgaaatag g 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 7

cagaggatca aaccggagaa acgg 24

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 8

gctcttggac ccgggatcct tatttccgca aattgctg 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 9

cagcaatttg cggaaataag gatcccgggt ccaagagc 38

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 10

tagaataaaa tttgcgtgcg ttgcaagcct tggaagctgt cagtagtata cc 52

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 11

ggtatactac tgacagcttc caaggcttgc aacgcacgca aattttattc ta 52

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 12

gtttcaacgg taagcgttct tccg 24

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 13

gcccacaggt gtatatg 17

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 14

gctcagttaa ttctttgatg cc 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 15

agagaatgaa gagactgcag agtg 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 16

ttctgcctcg taatctcccg aag 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 17

ctgaaagctt agttatccgt gc 22

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 18

gatctcgacc tgcagcccaa gccaccacgc ttttcatagt caatatc 47

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 19

cttggggctg caggtcgaga tc 22

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 20

gttcaaaatg gtatgcgttt tgacac 26

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 21

gtgtcaaaac gcataccatt ttgaacggca aatctatcat ctgcaagaag g 51

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 22

ctgatcagct cttcagattt cc 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 23

ctcaggtgga atcagattgg c 21

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 24

gattcggtct gtccttcg 18

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 25

acatattccc gttatgcatc g 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 26

actggcacgg ttgttgcgtc c 21

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 27

gataataagg gtaactattg ccgagtcgct ccagttgcaa acg 43

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 28

cggcaatagt tacccttatt atc 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 29

ttataaaagc cagtcattag gcc 23

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 30

gtttttatat tacagctcca gatcgctgga cggacgaaga aattg 45

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 31

catcctctac aacataaacg g 21

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 32

gatctggagc tgtaatataa aaac 24

Claims

1.一种利用宿主细胞生产核黄素的方法，其中所述宿主细胞是Bacillus subtilis，其携带特定的经修饰的rib前导序列triple ribO和 del mro175rib，以及内源Rho的失活，其中核黄素的产量与携带活性、未修饰的内源Rho基因的相应菌株相比增加了约30%。

2.权利要求1所述的方法，其中在rho基因中引入了部分缺失，所述部分缺失位于核糖体结合位点、冷休克结构域、RNA结合位点、ATP结合位点或启动子区，其中所述核糖体结合位点是对应于SEQ ID NO:1的第-17至-6位（ATG-17bp至ATG-6bp）的核苷酸，所述冷休克结构域是对应于SEQ ID NO:1的第+160至+360位（ATG + 160bp至ATG + 360bp）的核苷酸，所述RNA结合位点是对应于SEQ ID NO:1的第+174至+336位（ATG + 174bp至ATG + 336bp）的核苷酸，所述ATP结合位点是对应于SEQ ID NO:1的第+538 至+1062位（ATG +538bp至ATG +1062bp）的核苷酸，和所述启动子区是对应于SEQ ID NO:1的第-200至+1位（ATG-200bp至ATG + 1）的核苷酸。

3.权利要求2所述的方法，其中所述部分缺失是对应于所述核糖体结合位点、冷休克结构域、RNA结合位点、ATP结合位点或启动子区的核苷酸的缺失。

4.根据权利要求2所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:1的第+155至+165位（ATG +155bp至ATG + 165bp）的片段中引入了一个或更多个突变，其中所述片段被缺失。

5.根据权利要求1、2或4中任一项所述的方法，其包含将对应于SEQ ID NO:2的第56位的野生型氨基酸替换为天冬氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其包含将对应于SEQ ID NO:2的第56位的位置上的甘氨酸替换为天冬氨酸。

7.权利要求1所述的方法，其中通过敲除rho基因使得与未修饰Rho的活性相比Rho的活性消除。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述Bacillus subtilis菌株选自BS4912、BS7301、BS7307或BS7309。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括以下步骤：

（a）在适合核黄素生产的发酵条件下培养所述宿主细胞，并任选地

（b）从培养基中分离核黄素。