JPH044882A - ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 〈産業上の利用分野〉 本発明は、バシラス属に属する好熱菌由来のヌクレオシ
ド・ホスホリラーゼをコードするＤＮＡ断片等に関する
ものである。

〈従来の技術〉 核酸系化学療法剤は、抗腫瘍、免疫抑制、抗ウィルス等
の種々の用途に使用されている。

近年、エイズの流行とともにヌクレオシドアナログの抗
ウィルス作用が注目され、種々のヌクレオシドアナログ
の抗ウィルス活性が試験されている（たとえば、化学と
生物、第２７巻、第６号、第３５６〜３６６頁（１９８
９年）など参照）。

従来、これらのヌクレオシドアナログは化学的に合成さ
れていたが、４５℃以上の温度条件下でヌクレオシド・
ホスホリラーゼを利用することにより数々のヌクレオシ
ドアナログを収率よく調製することができることが判明
するに至り、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを利用した
ヌクレオシドアナログの合成はヌクレオシドアナログを
調製するための重要な技術となっている（たとえば、発
酵と工業、第３９巻、第１０号、第９２７〜９３７頁（
１９８１年）参照）。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼは、動物、微生物などの
種々の生物に存在することが確認されており、そのいく
つかは単離精製されて、酵素学的諸性質が報告されてい
る（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　Ｖｏｌ、　Ｌｌ、　４２３〜４５８　、同５１
７〜５４２（１９７Ｂ）参照）。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼの調製源とじては微生物
が合判であり、バシラス属に属する好熱菌の−・種であ
るバシラス・ステアロサーモフィラスについてもヌクレ
オシド・ホスホリラーゼの存在か確認されている。すな
わち、ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ（Ｅ
、　　Ｃ，２，４゜２．２）、プリン・ヌクレオシド・
ホスホリラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，４，２，１）ともバシ
ラス・ステアロサーモフィラスから単離精製され、その
諸性質か報告されているとともに（Ｊ、　Ｂｊｏ、　Ｃ
ｈｃｍ、。

２４４　、３０９１〜’３８９７（１９１３９）　、Ａ
ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ。

５３、２２０５〜２２１０（１９８９）、Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ、、　５３３２１９〜３２２４
（１９８９）参照）、それらの酵素を利用してのヌクレ
オシドおよびそのアナログの調製およびその６１能性も
報告されている（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　５３．１９７〜２０２（１９８９）　、
特開昭５６−１６６１９９号公報、特開昭５６−１６４
７９３号公報、特開平１−３２０９９５号公報など参照
）。

また、ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードする遺伝
子の解析に関しては、以下の報告がなされている。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｊ、、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、、　８０（１４）。

４２８１〜４２８５　（１９８３）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　＋２（１４）、　５７７９
〜５７８７　（１９１１１４）　、Ｇｏｎｇｙｅ　Ｗｅ
ｉｓｈｅｎｇｖｎ。

１９（４）　１〜５（１９８９）　、ＧｅｎｅＬｉｋａ
、　１９（６）、　８８１〜８８７　（１９８３）。

本発明者は、先に、バシラス属に属する好熱菌から、耐
熱性があって比活性の高いヌクレオシド・ホスホリラー
ゼを大量に発現する菌株群を見出し、それらからヌクレ
オシド・ホスホリラーゼを単離するの、に成功した（日
本農芸化学会誌、第６３巻、第３号（１９８９年度大会
講演要旨集）、第２８３頁参照）。

〔発明の概要〕

〈発明が解決しようとする課題〉 上記の本発明者の見出した酵素は極めてすぐれた酵素で
あると解されるが、酵素源としてバシラス属の微生物菌
体を使用する場合は、胞子形成に伴う自己溶解により反
応液中に酵素が脱落して、ヌクレオシドの連続的合成反
応に悪影響を及ぼすという欠点を有していた。また、固
定化酵素等の形態で使用する場合には、微生物菌体から
の酵素の調製が複雑でかつ収率よく回収するのが困難で
あるという欠点も有していた。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らは上記問題点を解決すべく種々研究を重ねた
結果、上記ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を特定することに成功し、
該ＤＮＡ断片を使用すれば細菌を宿主として大量に上記
ヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現させることができ
ること、さらには宿主からの当該ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼの抽出も容易に行なえることを見出して、本発
明を完成させた。

すなわち、本発明によるＤＮＡ断片は、バシラス属に属
する好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子
を含みかつ下記の制限酵素地図の（１）、（２）または
（３）で示される、大きさがそれぞれ約２，８ｋｂ、約
２．６ｋｂまたは約４．６ｋｂである、ものである。

（ここで、Ｅｌは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を、ＥＶ
は制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位を、Ｐｓは制限酵素Ｐｓ
ｔｌ認識部位を、ｓｐは制限酵素５ｐｈｌ認識部位を、
Ｐｖは制限酵素ＰｖｕＩＩ認識部位を、Ｓｃは制限酵素
５ａｃｌ認識部位を、それぞれ示す） 本発明は、また、これらのいずれかのＤＮＡ断片を細菌
内で複製可能なベクターに組込んでなる組換えプラスミ
ドにも、この組換えプラスミドで形質転換体された形質
転換体を培養して当該ヌクレオシド・ホスホリラーゼを
発現させてなるバシラス属に属する好熱菌由来のヌクレ
オシド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体を含有する
培養物にも、そして、このｆ９ｆ、物から分離したバシ
ラス属に属する好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼを含有する菌体、またはその菌体処理物にも、関す
るものである。

〈発明の効果〉 本発明によるＤＮＡ断片は、これを用いれば、大腸菌等
の他の宿主においてもヌクレオシド・ホスホリラーゼを
大量に発現させることができるので、この酵素を調製す
るための道具として有用である。特に、バシラス属の微
生物そのものからこの酵素を調製する場合と比較すれば
、本発明のＤＮＡ断片を使用することにより、下記の（
イ）および（ロ）の利点が得られる。

（イ）　微生物からの酵素の抽出が容易になる。

従来のバシラス・ステアロサーモフィラスからの酵素の
抽出は極めて困難であったが、大腸菌を宿主として利用
する場合にはりゾチーム法等の極めて容易な操作で収率
よく本発明のＤＮＡ断片のコードするヌクレオシド・ホ
スホリラーゼを回収することができる。すなわち、本発
明の遺伝子を発現させる際は、宿主の修飾（分泌）系を
介して膜近く　（ダラム陰性細菌の場合はべりブラズム
）に本発明のＤＮＡ断片のコードするヌクレオシド・ホ
スホリラーゼの多くが移行するので、宿主に生育阻害等
の悪影響を及ぼすことなく大量発現がなされる。また、
該酵素の回収はりゾチーム法等細菌で一般的に用いられ
る簡便な方法によりなされ、かつ該酵素が耐熱性を有す
ることから熱処理によって比活性の向上も効率よく行な
うことができる。

（ロ）　胞子形成に伴う自己溶解による酵素の漏出、失
活等のデメリットがなくなる。

バシラス属微生物は胞子を形成する際に自己溶解して、
酵素の漏出、失活等がみられ、これが生閑体を酵素源と
して使用して連続反応を行う際のデメリットとなってい
たのであるが、大腸菌を宿主とすることにより上記デメ
リットを克服することができる。

また、本発明のＤＮＡ断片中の発現関連領域は外来遺伝
子を発現させるのにも好適であり、宿主に対する影響を
最少限に抑えながら効率的な異種タンパク質の発現が期
待される。

〔発明の詳細な説明〕

＜ＤＮＡ断片〉 本発明によるＤＮＡ断片は、パラシス属に属する好適菌
由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子を含み、下
記の制限酵素地図の（１）、（２）または（３）で示さ
れて、大きさが約２．８ｋｂ（制限酵素地図（１））　
、約２．　６ｋｂ　（制限酵素地図（２））または約４
．６ｋｂ　（制限酵素地図（３））のものである。

ここで、記号は、下記の通りの制限酵素認識部位を示す
。

記号　　　　制限酵素 ＥＩ　　　　　　ＥｃｏＲＩ ＥＶ　　　　　ＥｃｏＲＶ Ｐｓ　　　　　　Ｐｓｔｌ Ｐｖ　　　　　ＰｖｕＩＩ ｓｐ　　　　　５ｐｈｌ Ｓｃ　　　　　　５ａｃ１ 本発明によるＤＮＡ断片はバシラス属に属する好熱菌由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子を含むもので
あることは前記したところであるが、ここで「バシラス
属に属する好熱菌由来」ということは塩基配列がバシラ
ス属に属する好熱菌の遺伝子のそれと実質的に同じであ
るということを意味するものであって、必ずしも本発明
によるＤＮＡ断片がバシラス属に属する好熱菌から抽出
されたものに限定されることを意味するものではない。

なお、「塩基配列が実質的に同じ」ということは、ヌク
レオシド・ホスホリラーゼとしての遺伝情報が維持され
ている限り、いくつかの単位ヌクレオチド（塩基）の置
換、欠失および（または）付加があってもよいことを意
味する。

また、「バシラス属に属する好熱菌由来Ｊということは
、バシラス属に属する好熱菌に属する合目的的なすべて
の菌株を対象とするものである。

ここで、バシラス属に属する好熱菌としては、バシラス
・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓｓｔ
ｃａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓ）　、バシラス・シ
エレゲリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｃｈｌｅｇｅｌｉ）　
、バシラス・アンドヵルダリアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａｃｊｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ　）などの中等度好熱菌
が例示される。

なお、本発明によるＤＮＡ断片は上記の制限酵素地図の
（１）、（２）または（３）で示される所定の大きさの
ものであるが、本発明によるこのＤＮＡ断片はそれ自身
としての存在に限定されない。すなわち、本発明による
ＤＮＡ断片は、基本的なそれ自身としての存在の外に、
その上流および（または）下流側に希望するＤＮＡ鎖が
結合している形態ならびに所定ＤＮＡ鎖中に介在ないし
組込まれている形態であってもよい。

後者の所定ＤＮＡ鎖中に介在している形態の一例は、プ
ラスミドであって、所定宿主細胞に対する発現ベクター
に組込まれてなるプラスミドは本発明によるＤＮＡ断片
の有用性が現実のものとなるという点で本発明ＤＮＡ断
片の好ましい具体例である。発現ベクター中に適当なシ
グナルペプチド遺伝子を結合させてあれば、発現酵素の
菌体外ないしペリプラズム中への分泌が促進される。

本発明によるＤＮＡ断片の一つは、前記制限酵素地図の
（１）、すなわちＥｌ−Ｐｓの部分、に対応するもので
ある。このＤＮＡ断片がコードするヌクレオシド・ホス
ホリラーゼは、ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼ（Ｐｙｒｉｌｄｊｎｅｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　：　Ｐ　ｙ　Ｎ　Ｐ　ａ　ｓ
　ｅ　）である。以下においては、このＤＮＡ断片をＤ
ＮＡ断片（１）と呼ぶ。

本発明によるＤＮＡ断片の他の一つは、前記制限酵素地
図の（２）、すなわちＥＶ−５ｃの部分、に対応するも
のである。このＤＮＡ断片がコードするヌクレオシド拳
ホスホリラーゼは、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼ（Ｐｕｒｉｎｅｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｙｌａｓｅ　：　Ｐ　ｕ　Ｎ　Ｐ　ａ　ｓ　ｅ　
）である。以下においては、このＤＮＡ断片をＤＮＡ断
片（２）と呼ぶ。

本発明によるＤＮＡ断片のさらに他の一つは、前記制限
酵素地図の（３）、すなわちＥｌ−３ｃの部分、に対応
するものである。このＤＮＡ断片がコードするヌクレオ
シド・ホスホリラーゼは、ピリミジンφヌクレオシド・
ホスホリラーゼおよびプリン・ヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼである。

この両ヌクレオシド・ホスホリラーゼはＤＮＡ断片（１
）および（２）に対応する遺伝情報の寄与によって発現
した可能性が考えられる。以下においては、このＤＮＡ
断ハをＤＮＡ断片（３）と呼ぶ。

＜ＤＮＡ断片の作成／取得〉 本発明によるＤＮＡ断片は、希望するならばその鎖中の
全部または一部を化学合成することによって得ることが
できるが、その鎖長ががなり長いことを考慮すれば、バ
シラス属に属する好熱菌の染色体を適当な制限酵素で一
段ないし多段に分解して得ることが好ましい。

バシラス属に属する好熱菌からのＤＮＡ断片の調製は、
既に知られている合目的的な任意の方法によって行なう
ことができる。具体的な方法は、たとえば、下記の通り
である。

染色体ＤＮＡを取得するための微生物としてはバシラス
属に属する好熱菌に属し、目的とする酵素を発現してい
るものであれば、ある特定の株に制限されないことは前
記したところであるが、具体的にはバシラス・ステアロ
サーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）
、同Ｐ−２１、同Ｐ−２３ならびにＡＴＣＣ８００５、
同１０１４９、同１２０１６、同１２９７６、同１２９
７８、同１２９８０、同１５９５２、同２１３６５、同
２９６０９などを例示することができる。ＴＨ６−２、
Ｐ−２１およびＰ−２３は本発明者の見出した株であっ
て、本発明で対象とするのに好ましいものの具体例であ
るが、これらの微生物、就中特に好ましいＴＨ６−２の
詳細、特に菌学的性質は特願平１−２０３５５６号明細
書に記載されている。

バシラス属に属する好熱菌からの染色体ＤＮＡの調製は
、菌体の溶菌、タンパク質の除去、およびＲＮＡの除去
の工程を順次または同時に行うことにより実施すること
ができる。より具体的には、Ｍａｒｍｕｒ法（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　３　、２０８　（１９８１））、ＴｈｏｒＡ
ａｓ法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１１．４７６　
（１９６５））、Ｓａｉ　ｔｏ−Ｍｉｕｒａ　　法　（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　八ｃＬａ、
　　７２６１９（１９６３））、　Ｓｍ１Ｌｈ　　法　
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
　。

Ｖｏｌ、　１２．　Ｐａｒｔ＾、　５４５　（１９６７
）　）　、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　法（Ｊ、　Ｈｏｔ、　
Ｅｖｏｌ、、　３　、２３９（＋９７４）　、Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、。

８９、１０６５　（１９６５）　、Ｄａｖｅｒｎ法（Ｐ
ｒｏｅ、　Ｎａ１１．　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　５５．７９２　（１９６６）、Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２１９　、１２５１（１９６８））　、
Ｋａｖｅｎｏｌ’ｆ’法（Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｌｏｌ、
、　７２．８０１（１９７２））　、％（ｏｒｅｅｌ−
Ｂｕｒｇｌ法（Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、、　７１゜
１２７　（１９７２）、Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｌｏｌ、、
　８２．９１　（１９７４）　）などの各法に記載の方
法を適宜応用することにより染色体ＤＮＡを調製すれば
よい。

得られた染色体ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、
Ｈｉｎｄｍなどの適当な制限酵素で分解した後、ショ糖
密度勾配遠心法（たとえば、生化学実験講座２「核酸の
化学Ｉ」第３２３〜３３３頁（東京化学同人１９７５年
発行）など参照）にて５〜１５ｋｂのＤＮＡ断片を分画
採取する。

分画して得られたＤＮＡ断片とＤＮＡ断片を調製する際
に使用した制限酵素もしくは同じ粘着末端を生じる制限
酵素で分解したプラスミドＤＮＡとを連結し、これを大
腸菌等の宿主菌内に導入して、宿主菌を形質転換させる
。

使用できるプラスミドとしては、通常使用されているＣ
ｏ　ＩＥＩの系統、ｐＭＢ９の系統、ｐＢＲ３２２の系
統、ｐｓｃｌｏｌの系統、Ｒ６にの系統などいずれであ
ってもよい。具体的にはｐＢＲ３２２、ｐｓｃｌｏｌ、
ｐＵｃ１１８、ｐＵｃ１１９、ｐＢＲ３２５などが例示
される。

染色体ＤＮＡから切り出したＤＮＡ断片とプラスミドＤ
ＮＡ断片との連結は制限酵素で切断したプラスミドＤＮ
Ａ断片を必要によりアルカリホスファターゼ処理（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、　１９６．１３１３（１９７７））　して
からリガーゼで結合する方法により行うことができる。

ハイブリッドプラスミドによる宿主菌の形質転換は、常
法に準じて行なえばよく、たとえば宿主として大腸菌（
たとえば、Ｋ−１２株　Ｃ−６００）を使用する場合に
は塩化カルシウムを用いる方法によればよい（たとえば
、「分子生物実験マニュアル」第１５９〜１６１頁（講
談柱１９８３年発行）など参照）。宿主菌は通常使用さ
れている細菌であればいずれをも使用することができ、
必ずしも大腸菌に限られるものでもない。

具体的には、大腸菌等のダラム陰性細菌、枯華菌等のグ
ラム陽性細菌等があるが、大腸菌が使用に便利であるの
で好ましいといえる。

このようにして得られた形質転換体は、まず上述のハイ
ブリッドプラスミドを有する形質転換体を選別後、ヌク
レオシド・ホスホリラーゼ誘導培地中で培養し、溶菌液
の酵素活性を調べて、ヌクレオシド・ホスホリラーゼ生
産能を有する株を選択する。

第一次の選別は、通常、使用したプラスミドの保持する
抗生物質（たとえば、アンピシリン、テトラサイクリン
等）等の薬剤耐性の有無による判別によって行なうこと
ができる。

薬剤耐性株を培養するのに用いるヌクレオシド・ホスホ
リラーゼ誘導培地は大腸菌等の宿主菌が生育可能な培地
であればよく、具体的には、実施例に示したように、ペ
プトン、酵母エキス、肉汁、食塩等を含有する培地を用
いればよい。

また、溶菌液中の酵素活性の測定は、大腸菌等の宿主由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼと本発明のＤＮＡ断
片のコードするヌクレオシド・ホスホリラーゼとを区別
するため、宿主由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの
失活する温度（７５〜８５℃）条件下で行えばよい。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性陽性の菌株は、菌体
からプラスミドＤＮＡを抽出後、再度上述と同様の方法
により宿主に導入して、酵素活性を確認することが望ま
しい。

プラスミドの抽出はアルカリ溶菌法等（Ｎｏ　Ｉ　ｃ−
ｅｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　ｐ３６［１−３６
９，Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｏｒ１、
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））　、精製は塩化セシ
ウム−エチジウムプロミドを用いる方法（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｉ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　５７．１５１４　（１９６７）な
ど参照）、などの常法により行なうことができる。

活性が確認された菌株からプラスミドを再度抽出し、制
限酵素（たとえばｓｐｈ　Ｉなど）を用いて染色体由来
のＤＮＡ断片を小型化してから、本発明のＤＮＡ断片を
得ることができる。すなわち、ＤＮＡ断片（１）を得る
ためにはＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで、ＤＮＡ断片（２
）を得るためにはＥｃｏＲＶおよび５ａｃｌて、ＤＮＡ
断片（３）を得るにはＥｃｏＲＩおよび５ａｃｌで、そ
れぞれこの抽出プラスミドを消化すれば、それぞれのＤ
ＮＡ断片を得ることができる。また、ＤＮＡ断片（３）
をＰｓｔｌて、あるいはＥｃｏＲＶで、消化すれば、Ｄ
ＮＡ断片（１）および（２）がそれぞれ得られる。

上記の方法のうち、好ましい態様をフローシートで示せ
ば、下記の通りである。

プラスミドｐＢＲ３２２ ＴＨ６−２株染色体全ＤＮＡ ↓ Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２株　Ｃ−６００に導入↓ アンピシリンにより選択 ↓ 酵素誘導培地で生育 ↓ 溶菌（リゾチーム法）・ＰｕＮＰａ５ｅ及びＰｙＮＰａ
ｓｅ活性７ＴｌｌＩ定 ↓ 活性陽性株取得 ↓ プラスミド抽出（ｐＰＹＲｌ） ↓ 再度Ｃ−６００に導入７両酵素活性確認↓ を含むＥｃｏＲＩ−５ａ　ｌ　１　（７ｋｂ余り）断片
をｐＢＲ３２２に再度結合） ＜ＤＮＡ断片の利用〉 本発明のＤＮＡ断片は、少なくともバシラス属に属する
好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの構造遺伝
子領域と構造遺伝子を発現させるのに必要な領域（発現
関連領域）の２つの領域を含有する。

したがって、本発明によるＤＮＡ断片は、それが担う遺
伝情報を利用すべく、たとえばバシラス属に属する好熱
菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーセヲ発現させ、該
酵素を利用してヌクレオシド類を合成したり、または本
発明のＤＮＡ断片中の発現関連領域を利用して他の外来
遺伝子を発現させるべく、分子生物学ないし遺伝子工学
技術に従って、各種の利用が可能である。

本発明によるＤＮＡ断片の利用を、本発明のＤＮＡ断片
を細菌内で複製可能なベクターに組み込んでなる組換え
プラスミド、数組換えプラスミドを用いて形質転換させ
た形質転換体および該形質転換体の利用について具体的
に説明すれば、下記の通りである。

（１）組換えプラスミド 本発明がＤＮＡ断片（１）、（２）または（３）を宿主
菌内で複製可能なベクターに組込んでなる組換えプラス
ミドにも関することは前記したところである。ＤＮＡ断
片（１）〜（３）は、その一つが組込まれていても、そ
の二つまたは三つが組込まれていてもよい（本発明は、
組換えプラスミドに関しては、そのように解釈するもの
とする）。

このような組換えプラスミドの一例は、それに必要な宿
主菌内で複製可能なベクターと共に、ＤＮＡ断片取得の
観点で前記した通りであるが、本発明による組換えプラ
スミドは調製後のＤＮＡ断片をあらためて発現プラスミ
ドに組込んで得たものであってもよいことはいうまでも
ない。

この後者の場合は、ＤＮＡ断片（１）〜（３）の末端の
制限酵素認識配列を考慮して、必要に応じて適当なリン
カ−の介在ないし読み枠の調節等を行なって、発現プラ
スミドに組込めばよく、その場合の技術は既に分子生物
学において慣用されたものである。

このような組換えプラスミドによる宿主菌の形質転換も
慣用技術であって、合口的的な任意の方法によって実施
することができる。

宿主菌としては、大腸菌等のダラム陰性菌、枯草菌等の
ダラム陽性菌が例示されるが、好ましいのは大腸菌であ
る。大腸菌を具体的に例示すれば、たとえば、Ｋ−１２
株（たとえばＣ−６００゜ＭＣ１０６１）、等の各種菌
株が使用可能である。

（２）形質転換体およびその利用 本発明が上記のようにして得られる形質転換体を培養し
てヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現させてバシラス
属に属する好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ
を含有する細菌菌体を含む培養物、該培養物から分離し
て得られる菌体、およびその処理物にも関することは前
記したところである。

本発明によるＤＮＡ断片から上記培養物を得るには、上
述と同様に適当なプラスミドに本発明のＤＮＡ断片を導
入後、大腸菌等の宿主を形質転換させ、該形質転換体を
宿主の増殖しうる培地成分を含有する培地中で培養すれ
ばよい。

培養に使用する培地成分としては炭素源（グルコース、
フラクトース、グリセロール、シュクロースなど）、窒
素源（塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、尿素などの無機態窒素、酵母エキス、ペプト
ン、ポリペプトン、肉エキス、などの有機態窒素）、そ
の他の微量成分（塩化ナトリウム（食塩）、塩化マグネ
シウム、塩化マンガンなどの金属塩、ビオチン、ビタミ
ンＢ１２などのビタミン類など）などを使用すればよい
。

培養条件は、培養温度２０〜４０℃、ｐＨ５〜１０、期
間１日〜１５［１間程度、の範囲内より適宜選定するこ
とができる。

このようにして得られたバシラス属に属する好熱菌由来
のヌクレオシド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体を
含む培養物は、ヌクレオシドアナログを調製するための
酵素源として有用である。

また、培養物以外にも、この培養液から分離した菌体、
菌体の処理物（菌体破壊物、変性菌体、粗酵素、精製酵
素、固定化酵素（菌体））なども酵素源として有用であ
る。これらの酵素源は常法に従って調製することができ
る。たとえば、培養菌体からのバシラス属に属する好熱
菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの抽出および精
製は、リゾチーム法、ガラスピーズ法、浸透圧ショック
法、その他、好ましくはりゾチーム法、により抽出した
酵素活性画分について酵素の通常の単離精製手段（たと
えば塩析処理（硫安分画など）、各種クロマトグラフィ
ー法、各ｆ！Ｉ！電気泳動法など）を適宜組み合わせて
行なえばよい。また、大腸菌由来のタンパク質を除去す
る目的で酵素の単離精製の前処理として熱処理（６０〜
８０℃で１〜１０分間加熱）を追加するとより効率的で
ある。

〈実施例〉 下記の実施例は、バシラス・ステアロサーモフィラスＴ
Ｈ６−２の染色体ＤＮＡよりＤＮＡ断片（３）を調製す
る方法を示すものである。ＤＮＡ（３）をＰｓｔｌで消
化すればＤＮＡ断片（１）が、ＥｃｏＲＶで消化すれば
ＤＮＡ断片（２）が、それぞれ得られる。

本実施例における各種制限酵素、およびＴ４ＤＮＡリカ
ーゼはすべて宝酒造■から入手し、酵素の反応条件はｒ
Ｍｏｌｃｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　　（Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ（１９８２））の記載に従った。

実施例１ ＴＨ６−２株のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
（ＰｕＮＰａｓｅ）およびピリミジン・ヌクレオシド・
ホスホリラーゼ（ＰｙＮＰａ　ｓ　ｅ）活性を有するＤ
ＮＡのショットガン・クローニングを下記の通りに行な
った。

（イ）　　ＴＨ６−２株染色体ＤＮＡの取得バシラス・
ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株をスラントから５
００ｍ１容三角フラスコ中のＶＹ培地１００ｍ１に接種
した後、４８℃で１６時間振盪培養し、菌体を集めた。

この菌体を、２０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５０ｍｌで洗浄し、同緩衝
液２０ｍ１に懸濁させ、リゾチーム（シグマ社製、グレ
ードＩ）粉体４０ｍｇとりボヌクレアーゼＡ（ＲＮａ　
ｓ　ｅＡ）（シグマ社製、タイプＸＩＩ−Ａ）溶液を終
濃度２０μｇ／ｍｌで加え、３７℃に３０分装いた後、
１０％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（終濃
度０．　５％）を加えてよく混合し、プロテイナーゼＫ
（シグマ社製、プロテアーゼタイプＸＩ）溶液（終濃度
１００．ｃｚｇ／ｍ＋）を加えて３７℃で更に４５分間
保温した。この溶菌液に等量のフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール（２５：　２４　：　１）溶
液を加えて、フェノール処理を行なった。フェノール処
理は、続けて２回行なった。回収した水層に２倍容の冷
エタノールを加え、析出した高分子ＤＮＡを巻き取り法
により回収し、室温エタノールで洗浄した後、１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）（以下ＴＥ緩衝液と略す）に対して一晩透析を行な
って、染色体ＤＮＡを透析内液として得た。

なお、ｖＹ培地は次の組成のものである。

ヴイール・インフュージョン（デイフコ社製）２．５酵
母エキス　　　　（ｌ）　　０．５ （ｐＨ７，０、単位は％（重量／体積）、以降の培地組
成中に用いる％も同じ意味を示す。）（ロ）　　ＤＮＡ
のショットガン・クローニング前記ＴＨ６−２株の染色
体ＤＮＡを常法により（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｃ
ｒｊａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｐ２２０−２３０．　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　（１９８０）等参照）、制限酵素Ｈｉｎｄ
Ｉ［Ｉで完全分解した。これを１０−４０％蔗糖密度勾
配溶液層（蔗糖はＴＥ緩衝液に溶解）に重層し、２万６
千回転／２０℃で１８時間遠心して、分画した。５〜１
５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を含有する両分を合わせて
、ＴＥ緩衝液に対して透析した。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造観製）をＨｉｎ
ｄＩＩｒで分解後、アルカリホスファターゼ（宝酒造■
製、大腸菌Ｃ７５株由来）処理、次いでフェノール処理
した後、エタノールを加えて、ＤＮＡを回収した。両者
のＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した
。

このＤＮＡで、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊ
ｎｇ。

ｐ２５０−２５１．　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

（１９８２））に従って、大腸菌に一１２株Ｃ−６００
（微工研菌寄第８０３７号）を形質転換させた。培地は
、２５μｇ／ｍ＋のアンピシリンを含むし一培地（１％
バクトドリブトン（デイフコ社製）、０．５％酵母エキ
ス、０．５％食塩、０．１％グルコース、ｐＨ７，２）
を使用した。得られたアンピシリン耐性形質転換体を１
２．５μｇ　／　ｍｌのテトラサイクリンを含むし一培
地にレプリカし、テトラサイクリン耐性を示すものはｐ
ＢＲ３２２に目的のＤＮＡ断片が挿入されていないもの
として除外した。選択された形質転換体を、滅菌楊子で
誘導培地（バクトペブトン（デイフコ社製）１．０％、
肉エキス０．　７％、酵母エキス０．５２６、食塩０．
　３％、ｐＨ７，５）５ｍｌに移して、３７℃、−夜培
養した。

得られた菌体を１ｍｌの溶菌緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、
０．１％トリトンＸ−１００（シグマ社製）を含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，７））に懸濁させ、
終濃度０．　２ｎｇ／ｍｌのリゾチームを加えて、３７
℃に１時間保った。この溶菌液を１万６千回転／３℃で
１０分間遠心し、上清を回収した。この上清をサンプル
液として、以下の活性測定を行なった。

１ｍｌの基質溶液（ＰｕＮＰａ　ｓ　ｅの場合０．１Ｍ
リン酸二水素カリウムを含む２０ｍＭイノシン溶液（ｐ
Ｈ８，０）　、ＰｙＮＰａ　ｓ　ｅの場合０゜１Ｍリン
酸二水素カリウムを含む２０ｍＭウリジン溶液（ｐＨ８
，０））に１０μｌのサンプル液を加え、それぞれ８０
℃及び７５℃で１０分反応後、０．１ｍｌの２規定塩酸
水溶液を加えて反応を停止し、遠心後、上清を希釈して
、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）法（カ
ラム：　ＹＭＣＡ−３１２（■山村化学研究新製、溶出
剤ニアセトニトリル５．０％含有２０ｍＭトリスー塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）　、検出：２６０ｎ＊）により、
分解された塩基の有無を調べた。約３，５００株の候補
株より両酵素ともに陽性の株１株が見出された。陽性様
よりアルカリ溶菌法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎ
ｇ、　　ｐ３６Ｂ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（＋９８２））により
プラスミドを粗精製し、再度大腸菌に一１２株Ｃ−６０
０に導入して活性を確認後、大全の培養菌体よりアルカ
リ溶菌法、エチジウムプロミドを含む塩化セシウム密度
勾配遠心法によりプラスミドを精製した。得られたプラ
スミドをｐＰＹＲｌと名付けた。このプラスミドは、ｐ
ＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位に１２ｋｂのＤＮ
Ａ断片が挿入されたものであることがわかった。その各
種制限酵素に対する切断部位は、第１図に示す通りであ
った。この挿入ＤＮＡがＴＨ６−２株の染色体ＤＮＡか
ら、欠失や断片の再結合をともなうことなく、そのまま
の形でクローニングされていることは、サザン・ハイブ
リダイゼーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎ
ｇ　ｐ３８２−３８９．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９ｇ２））によ
り確認された。なお第１図で、太線部分はＴＨ６−２株
由来のＤＮＡを示す。Ａｍｐ’　はアンピシリン耐性遺
伝子を示し、ＨｄはＨｉｎｄｍ、Ｓｌは５ａｌＩを示す
（その他の記号は、前記の通りである）。

実施例２ ｐＵＣプラスミドへの挿入、生成りＮＡのサブクローニ
ング、ならびに両酵素遺伝子のコードされる断片の限定
操作を下記の通りに行なった。

精製したｐＰＹＲｌのＥｃｏＲＩと５ａｌｌて得られる
ＴＨ６−２株由来のＤＮＡ断片（約７ｋｂ）をアガロー
スゲル電気泳動法で精製し、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ
及び５ａｌｌで切断してからアルカリホスファターゼ処
理したものに加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて連
結処理して、両酵素の活性を有するプラスミドｐＰＹＲ
２（第２図）を得た。第２図中、太線はＴＨ６−２株由
来のＤＮＡを示し、その他の部分はｐＢＲ３２２由来の
ＤＮＡを示す。

更に、各種制限酵素の組み合わせによる切断によって得
られる好熱菌由来の断片をｐＵｃ１１９プラスミド（宝
酒造■製）のポリリンカ一部位に挿入したプラスミドを
作成し、これらのプラスミドによって形質転換された大
腸菌より得られる溶菌液の両酵素活性を調べることによ
り、両酵素遺伝子のコードされる領域を限定した。各断
片と酵素活性との相関は、下に示す通りであった。Ｓｌ
は５ａｌＩを示す。Ｅｌ−８１間は約７ｋｂである。

その結果、両酵素遺伝子を自む断片として上図に示す４
．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−３ａｃｌ切断断片が限定された
。また、ＰｕＮＰａ５ｄ遺伝子およびＰｙＮＰａｓｅ遺
伝子は、それぞれ４．６ｋｂ断片の中のＥｃｏＲＶおよ
び５ａｃｌで切断される２、６ｋｂの断片内に、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＰｓｔｌで切断される２、８ｋｂの断片内に
、コードされることが明らかとなった。

実施例３ 両酵素遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−８ａｃ　ｌ切断断片を
プラスミドｐＵｃ１１９のポリリンカ一部位に挿入して
得られたプラスミドｐＵｃ１１９ＰＹＲ２・Ｅｌ−３（
第３図）で大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１を形質転換し
た。第３図中、太線はＴＨ６−２株由来のＤＮＡを示し
、その他の部分はｐＵｃ１１９由来ＤＮＡを示す。得ら
れた形質転換体を　５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む５ｍｌの誘導培地に接種し、３７℃で１６時間培養し
た。得られた菌体を０．　５１１１ｇ／ｍｌのリゾチー
ムを含む溶菌緩衝液１ｍｌに懸濁させて３７℃に５０分
保った。この溶菌液を遠心して得た上清を被験液として
、ＰｕＮＰａ　ｓ　ｅＳＰｙＮＰａ　ｓ　ｅ両酵素活性
を測定した。

また、対照としてプラスミドｐＵｃ１１９による大腸菌
に一１２株ＭＣ１０６１の形質転換体を上記と同じ方法
により培養および溶菌して、活性を測定した。活性の測
定法は、実施例１と同一である。両形質転換体のＰｕＮ
Ｐａ５−ｅ。

ＰｙＮＰａｓｅ両活性の測定結果は表１に示す通りであ
った。

表−１ ＊Ｕは、酵素Ｈ１ｍｌ当り、１分間に１マイクロモルの
ヒポキサンチンまたはウラシルが生成する酵素皿、と定
義したものである。

実施例４ 粗酵素液の熱処理によるバシラス・ステアロサーモフィ
ラス由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの選択的回収
は、下記の通りに行なった。

実施例３で得られた、ｐＵｃ１１９ＰＹＲ２・Ｅｌ−３
で形質転換された大腸菌に−１２株ＭＣ１０６１の溶菌
液の熱処理（５０℃、１０分間）上清を更に６０℃及び
７０℃にてそれぞれ１０分処理し、その遠心上清をＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｕｒｅ、　
Ｖｏｌ、　２２７．　ｐ６８０−６８５　（１９７０）
）に供した。対照として、ｐｕｃ１１９で形質転換され
た大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１の溶菌液の熱処理上清
も同時に電気泳動に付した。なおサンプル、対照ともに
５０℃熱処理上滑時の蛋白質総量は約４５μｇに調製し
、分析に供した。プリン・ヌクレオシド・ホスホリラゼ
及びピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼのＴＨ
６−２株からの精製標品も同時に泳動し、両者とも０．
８μｇ蛋白をゲルに乗せた。分子量マーカーにはファル
マシア社の低分子ｆｆｉマーカーを用い、ル−ン当たり
総量で約３０μｇを供した。その結果、ＴＨ６−２株由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼは失活せずに上清に
残留するのに対して、大腸菌由来のタンパク質は変性し
て沈殿部に移行することが確認できた。

なお、当然のことながら、ｐＵｃ１１９ＰＹＲ２・Ｅｌ
−３で形質転換した大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１から
得られたヌクレオシド・ホスホリラーゼの酵素学的性質
はバシラスーステアロサーモフィラスＴＨ６−”から得
られたヌクレオシド・ホスホリラーゼと同じであって、
以下の性質を示すものであった。

（Ａ）プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ（１）作
用 プリン・ヌクレオシド＋リン酸 ＝プリン塩基士ペントースー１−リン酸本発明のプリン
・ヌクレオシド・ホスホリラーゼは、上記の加リン酸分
解反応を蝕媒する。従って、この酵素は国際酵素分類の
Ｅ、　　Ｃ，２，４゜２．１に属する。

（２）基質特異性 各種のプリン・ヌクレオシドを基質に加リン酸分解反応
をｊＴわせだ結果は、表２に示す通りであった。

表−２ 表２より、本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼは、試験した範囲内においてはイノシン、２′デオ
キシイノシン、グアノシンおよび２′　−デオキシグア
ノシンに特異的である。

（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 至適ｐＨはｐ）Ｉ７〜８、安定ｐＨ１ｉ１囲はｐＨ５〜
っである（第４図参照）。

（４）至適温度および温度安定性 至適温度は６０〜８０℃、安定温度範囲６０℃までであ
る（第５図参照）。

（５）分子量 ５ＤＳ−ボアクリルアミドケル電気泳動法で測定した分
子量は、約４５０００である。

（６）力１ｉｔａｉ（比活性） ８０％の酵素の精製度合で比活性は４００（Ｕ／ｎｇ）
以上を示し、９０％の酵素の精製度合で４５０　（Ｕ／
ｒＡｇ）を示す。

（Ｂ）ピリミジンφヌクレオシド・ホスホリラーゼ （１）作用 ピリミジン・ヌクレオシド＋リン酸 ＝ピリミジン塩基＋ペントース−１ リン酸 本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼは
、上記の加リン酸分解反応を蝕媒する。

従って、この酵素は国際酵素分類のＥ、　　Ｃ，２゜４
．２．２に属する。

（２）基質特異性 各種のピリミジン・ヌクレオシドを基質に加リン酸分解
反応を行わせた結果は、表３に示す通りであった。

表−３ 表３より、本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼは、試験した範囲内においてはウリジン、２′
デオキシウリジン、リボフラノシルチミン、チミジンに
特異的である。

（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 至適ｐＨはｐＨ７〜９、安定ｐＨ範囲はｐＨ５〜９であ
る（第６図参照）。

（４）至適温度および温度安定性 至適温度は６０〜７０’Ｃ，安定温度範囲６０℃までで
ある（第７図参照）。

（５）分子量 ５ＤＳ−ボアクリルアミド電気泳動法で測定した分子量
は、約３１０００である。

（６）力価（比活性） ８０％の酵素の精製度合で比活性は２５０（Ｕ／＋ａｇ
）以上を示し、９０％の酵素の精製度合で２９７（Ｕ／
ｎｇ）を示す。

なお、上記の酵素的性質は以下の示す方法でｉ’ｌＦＩ
定したものである。

■　力価の測定 プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性基質溶液（
２０ｍＭイノシンおよび０．１Ｍリン酸二水素カリウム
を含有するｐＨ３，０の水溶液）１．０ｍｌに酵素溶液
（精製酵素として１μｇを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６，０）２０μｌを加えて５０℃で１０分間反応
させた後、塩酸を最終濃度で０．ＩＮになるように加え
て反応停止させるとともに０℃で１０分間冷却する。

次に、反応液を遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ法
（カラム：ＹＭＣＡ−３１２（■山村化学研究新製）、
溶出剤ニアセトニトリル５．０％含有２０ｍＭ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、検出：２６０ｎｍ）で生成
するヒポキサンチンを定量する。１分間に１μｍｏｌの
ヒポキサンチンを生成する酵素量を１単位（ｒＵＪ　）
とする。

ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性 基質溶液中のイノシンの代わりにウリジンを使用し、Ｈ
ＰＬＣ法でウラシルを定量する以外は上記のプリン・ヌ
クレオシド・ホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして
行う。１分間に１μｍｏｌのウラシルを生成する酵素量
を１中位とする。

■　基質特異性 基質溶液として１０ｍＭの各種ヌクにオシドおよび５０
　ｍ　Ｍのリン酸二水素カリウムを自白゛するｐＨ８，
０の水溶液を使用し、５０℃で１０分間反応させ、反応
後、ＨＰＬＣ法で各種ヌクレオシドの塩話を定量する以
外はプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性の測定
法と同様にして行う。

■　至適ｐＨ ヌクレオシド（２０ｍＭのイノシンまたはウリジン）お
よび０．１Ｍのリン酸二水素カリウムを溶解させ、希塩
酸または希水酸化ナトリウムの各水溶液でｐＨ４〜１０
に調整した基質溶液を使用した以外はプリン・ヌクレオ
シド・ホスホリラーゼ活性の１ｌＰ１定法と同様にして
行う。

■　安定ｐＨ ０２２Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３，５〜６）およびトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）中で３７℃で１６時間保持
した酵素溶液を使用した以外は、プリン・ヌクレオシド
・ホスホリラーゼ活性またはピ曹ノミジン・ヌクレオシ
ド拳ホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。

■　至適温度 反応を３０〜８０℃の各温度で行う以外はプリン・ヌク
レオシド・ホスホリラーゼ活性またはピリミジン・ヌク
レオシド・ホスホリラーゼ活性の測定法と同様して行う
。

■　安定温度範囲 ３０〜８０℃で１５分間加熱した酵素溶液を使用する以
外は、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性また
はピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性の測
定法と同様にして行う。

く微生物の寄託〉 プラスミドｐＵｃ１１９にＤＮＡ断片（３）を組込んで
なる組換えプラスミドｐＵＣＰＹＲ２・Ｅｌ−９を保持
する大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１は、ニジエリシア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａｃｏｌｉ）ＫＹ−２（
ｐＵｃｌ　１ＱＰＹＲ２−ＥＩ　−８）という名称で平
成２年１月１６日に工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されて、微工研菌寄第１１１９７号の受託番号を得
ている。なお、寄託された微生物の菌学的性質はパンラ
ス・ステアロサーモフィラス由来のヌクレオシド−ホス
ホリラーゼを含有している点を除けば大腸菌に１２株Ｍ
Ｃ１０６１と同じであって、この形質転換株は大腸菌に
分類される。

パンラス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２は、平成
元年２月４０に同様に寄託されて、微工研条寄第２７５
８号の受託番号を得ている。また、大腸菌に一１２株Ｃ
６００は、昭和６０年１月７０に同様に寄託されて、微
工研菌寄第８０３７号の受託番号を得ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＰＹＲ１の制限酵素地図を示す
説明図である。 第２図は、プラスミドｐＰＹＲ２の制限酵素地図を示す
説明図である。 第３図は、プラスミドｐＵｃ１１９ＰＹＲ２・Ｅｌ−３
制限酵素地図を示す説明図である。 第４図は、本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を示したものである
。 第５図は、本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼの至適温度および安定温度範囲を示したものである
。 第６図は、本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を示したもので
ある。 第７図は、本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼの至適温度および安定温度範囲を示したもので
ある。 −１ｖ 馬１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシラス属に属する好熱菌由来のヌクレオシド・ホ
   スホリラーゼ遺伝子を含みかつ下記の制限酵素地図の（
   １）、（２）または（３）で示される、大きさがそれぞ
   れ約２．８ｋｂ、 約２．６ｋｂまたは約４．６ｋｂである、ＤＮＡ断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｅ I は制限酵素ＥｃｏＲ I 認識部位を、Ｅ
   Ｖは制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位を、Ｐｓは制限酵素Ｐ
   ｓｔ I 認識部位を、Ｓｐは制限酵素Ｓｐｈ I 認識部位
   を、Ｐｖは制限酵素ＰｖｕII認識部位を、Ｓｃは制限酵
   素Ｓａｃ I 認識部位を、それぞれ示す） ２、ヌクレオシド・ホスホリラーゼが下記の特性を有す
   るものである、請求項１記載の（１）で示される大きさ
   が約２．８ｋｂのＤＮＡ断片。 作用： ピリジンヌクレオシド＋リン酸 ■ピリジン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： ウリジン、２′−デオキシウリジン、リボフラノシルチ
   ミン、チミジンに特異的である。 至適温度： ６０〜７０℃ 安定温度： ６０℃まで安定 ３、ヌクレオシド・ホスホリラーゼが下記の特性を有す
   るものである、請求項１記載の（２）で示される大きさ
   が約２．６ｋｂのＤＮＡ断片。 作用： プリンヌクレオシド＋リン酸 ■プリン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性。 イノシン、２′−デオキシイノシン、グアノシン、２′
   −デオキシグアノシンに特異的である。 至適温度： ６０〜８０℃ 安定温度： ６０℃まで安定 ４、バシラス属に属する好熱菌がバシラス属に属する中
   等度好熱菌である、請求項１記載のＤＮＡ断片。 ５、バシラス属に属する好熱菌がバシラス・ステアロサ
   ーモフィラスである、請求項１記載のＤＮＡ断片。 ６、請求項１記載のＤＮＡ断片を細菌内で複製可能なベ
   クターに組込んでなる、組換えプラスミド。 ７、請求項６記載の組換えプラスミドで形質転換された
   形質転換体を培養して当該ヌクレオシド・ホスホリラー
   ゼを発現させてなる、バシラス属に属する好熱菌由来の
   ヌクレオシド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体を含
   む培養物。 ８、請求項７記載の培養物から分離したバシラス属に属
   する好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼを含有
   する菌体、またはその処理物。