JPH05192164A - 組換えｄｎａおよびその用途 - Google Patents
組換えｄｎａおよびその用途Info
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- JPH05192164A JPH05192164A JP16161291A JP16161291A JPH05192164A JP H05192164 A JPH05192164 A JP H05192164A JP 16161291 A JP16161291 A JP 16161291A JP 16161291 A JP16161291 A JP 16161291A JP H05192164 A JPH05192164 A JP H05192164A
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- bacterium
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 発酵法によるイノシンやグアノシンのような
核酸関連物質の製造法、それに使用する新規微生物およ
び該新規微生物を作出するのに用いる新規組換えＤＮＡ
を提供する。 【構成】 バチルス属菌のホスホリボシルピロホスフェ
ート・シンセターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ、リボソー
ム結合部位を含むＤＮＡおよびバチルス属菌内で発現可
能なプロモータ配列を含むＤＮＡからなり、これらのＤ
ＮＡ配列がホスホリボシルピロホスフェート・シンセタ
ーゼ遺伝子の発現を高めるように改変されてなる組換え
ＤＮＡ、それを用いて形質転換したバチルス属菌および
それを培地に培養し、核酸関連物質を生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする核酸関連物質の製造
法。
核酸関連物質の製造法、それに使用する新規微生物およ
び該新規微生物を作出するのに用いる新規組換えＤＮＡ
を提供する。 【構成】 バチルス属菌のホスホリボシルピロホスフェ
ート・シンセターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ、リボソー
ム結合部位を含むＤＮＡおよびバチルス属菌内で発現可
能なプロモータ配列を含むＤＮＡからなり、これらのＤ
ＮＡ配列がホスホリボシルピロホスフェート・シンセタ
ーゼ遺伝子の発現を高めるように改変されてなる組換え
ＤＮＡ、それを用いて形質転換したバチルス属菌および
それを培地に培養し、核酸関連物質を生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする核酸関連物質の製造
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるイノシンや
グアノシンのような核酸関連物質の製造法、その製造に
用いられる新規微生物および該新規微生物を作出するの
に用いられる新規組換えＤＮＡに関する。
グアノシンのような核酸関連物質の製造法、その製造に
用いられる新規微生物および該新規微生物を作出するの
に用いられる新規組換えＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸関連物質の製造に関しては、微生物
を用いる発酵法が有利であると考えられ、数多くの製造
法が提案され、実施されている。今日までの核酸発酵に
関する多くの研究の結果、核酸およびその関連物質は、
生体にとって必須な一次代謝産物あるいはその関連物質
であって、微生物によって普遍的に生合成されてはいる
が、同時に過剰に生産されることがないよう、その生成
量は巧妙に制御されていることが知られている。このよ
うな知見に基づいて、発酵法を用いて、核酸およびその
関連物質を過剰生産させるには、最終産物による生合成
経路の制御を解除した変異株を用いるのが有利であると
考えられている。例えば、プリンヌクレオチド関連物質
であるイノシンやグアノシンの生産に関しては、プリン
ヌクレオチド生合成経路の最終産物であるアデニン系物
質(アデノシンあるいはそのリン酸化合物である、例え
ば、５'−アデニル酸)、あるいはグアニン系物質(グア
ノシンあるいはそのリン酸化合物である、例えば、５'
−グアニル酸)によってフィードバック制御を受けてい
ることが知られている。
を用いる発酵法が有利であると考えられ、数多くの製造
法が提案され、実施されている。今日までの核酸発酵に
関する多くの研究の結果、核酸およびその関連物質は、
生体にとって必須な一次代謝産物あるいはその関連物質
であって、微生物によって普遍的に生合成されてはいる
が、同時に過剰に生産されることがないよう、その生成
量は巧妙に制御されていることが知られている。このよ
うな知見に基づいて、発酵法を用いて、核酸およびその
関連物質を過剰生産させるには、最終産物による生合成
経路の制御を解除した変異株を用いるのが有利であると
考えられている。例えば、プリンヌクレオチド関連物質
であるイノシンやグアノシンの生産に関しては、プリン
ヌクレオチド生合成経路の最終産物であるアデニン系物
質(アデノシンあるいはそのリン酸化合物である、例え
ば、５'−アデニル酸)、あるいはグアニン系物質(グア
ノシンあるいはそのリン酸化合物である、例えば、５'
−グアニル酸)によってフィードバック制御を受けてい
ることが知られている。
【０００３】そこで、発酵法によるプリンヌクレオチド
関連物質の生産に際しては、アデニン系物質によるこれ
らのプリンヌクレオチド生合成経路の制御を避ける目的
で、発酵液中のアデニン系物質の量を低い状態に保つた
めに培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、ア
デニロコハク酸合成酵素を欠損したアデニン要求性変異
株を用いるのが通例である[ワイ・ナカオ、マイクロバイ
アル・テクノロジー(Ｙ．Ｎakao, Ｍicrobial Ｔechno
logy), Ｖol．１，p３１１〜３５４、エイチ・ジェイ・
ペプラーおよびディ・パールマン編、ニューヨーク、ア
カデミック・プレス(edited by Ｈ．Ｊ．Ｐeppler a
nd Ｄ．Ｐerlman, Ａcademic Ｐress, Ｎew Ｙor
k)]。また、さらにアデニン要求性に加えて、いわゆる
核酸アナログをはじめとする各種の薬剤耐性を付与する
ことによって、イノシンおよび／またはグアノシンを有
利に生産するバチルス属菌(特公昭５５−２９５６号、
特公昭５７−１４１６０号、特公昭５７−４１９１５
号、特開昭５９−４２８９５号、特公昭５４−１７０３
３号、特公昭５５−４５１９９号)やブレビバクテリウ
ム属菌(特公昭５１−５０７５号、特公昭５８−１７５
９２号)等を用いる方法が知られている。また、クロー
ン化された核酸生合成に関与する酵素の遺伝子をベクタ
ーに連結し、宿主菌に導入して、いわゆる遺伝子増幅効
果によって核酸関連物質を過剰生産させる方法も提案さ
れている(特開昭５９−２８４７０号、特開昭６０−１
５６３８８号)。
関連物質の生産に際しては、アデニン系物質によるこれ
らのプリンヌクレオチド生合成経路の制御を避ける目的
で、発酵液中のアデニン系物質の量を低い状態に保つた
めに培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、ア
デニロコハク酸合成酵素を欠損したアデニン要求性変異
株を用いるのが通例である[ワイ・ナカオ、マイクロバイ
アル・テクノロジー(Ｙ．Ｎakao, Ｍicrobial Ｔechno
logy), Ｖol．１，p３１１〜３５４、エイチ・ジェイ・
ペプラーおよびディ・パールマン編、ニューヨーク、ア
カデミック・プレス(edited by Ｈ．Ｊ．Ｐeppler a
nd Ｄ．Ｐerlman, Ａcademic Ｐress, Ｎew Ｙor
k)]。また、さらにアデニン要求性に加えて、いわゆる
核酸アナログをはじめとする各種の薬剤耐性を付与する
ことによって、イノシンおよび／またはグアノシンを有
利に生産するバチルス属菌(特公昭５５−２９５６号、
特公昭５７−１４１６０号、特公昭５７−４１９１５
号、特開昭５９−４２８９５号、特公昭５４−１７０３
３号、特公昭５５−４５１９９号)やブレビバクテリウ
ム属菌(特公昭５１−５０７５号、特公昭５８−１７５
９２号)等を用いる方法が知られている。また、クロー
ン化された核酸生合成に関与する酵素の遺伝子をベクタ
ーに連結し、宿主菌に導入して、いわゆる遺伝子増幅効
果によって核酸関連物質を過剰生産させる方法も提案さ
れている(特開昭５９−２８４７０号、特開昭６０−１
５６３８８号)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、プリン
ヌクレオチドの生合成・分解にかかわる従来の菌株育種
法によって得られた変異株は、核酸関連物質の食品や医
薬品などの原料としての重要性からすれば、必ずしも満
足できるものではなく、さらに有利な製造法が望まれて
いる。
ヌクレオチドの生合成・分解にかかわる従来の菌株育種
法によって得られた変異株は、核酸関連物質の食品や医
薬品などの原料としての重要性からすれば、必ずしも満
足できるものではなく、さらに有利な製造法が望まれて
いる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な現状に鑑み、核酸関連物質の効率的生産に関与する因
子を鋭意検索した結果、これらの生合成の原料となる生
合成中間体であるフォスフォリボシルピロフォスフェー
ト(ＰＲＰＰ)の生成に関与する酵素であるフォスフォリ
ボシルピロフォスフェート・シンセターゼ(ＰＲＰＰシ
ンセターゼ)の活性を上昇させることが重要であること
を見出した。すなわち、ＰＲＰＰシンセターゼをコード
するprs遺伝子が、高発現が期待されるプロモータの下
流に連結された構造を有する新規組換えＤＮＡを取得す
ることに成功し、さらに、該組換えＤＮＡを用いて、バ
チルス属細菌の内から適当に選ばれた受容菌を形質転換
し、ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子が安定的に高発現する
新規微生物を作出することに成功した。この手法を用
い、バチルス属菌から選ばれた微生物を受容菌として誘
導された該新規微生物は多量の核酸関連物質を安定して
蓄積することを見出した。
な現状に鑑み、核酸関連物質の効率的生産に関与する因
子を鋭意検索した結果、これらの生合成の原料となる生
合成中間体であるフォスフォリボシルピロフォスフェー
ト(ＰＲＰＰ)の生成に関与する酵素であるフォスフォリ
ボシルピロフォスフェート・シンセターゼ(ＰＲＰＰシ
ンセターゼ)の活性を上昇させることが重要であること
を見出した。すなわち、ＰＲＰＰシンセターゼをコード
するprs遺伝子が、高発現が期待されるプロモータの下
流に連結された構造を有する新規組換えＤＮＡを取得す
ることに成功し、さらに、該組換えＤＮＡを用いて、バ
チルス属細菌の内から適当に選ばれた受容菌を形質転換
し、ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子が安定的に高発現する
新規微生物を作出することに成功した。この手法を用
い、バチルス属菌から選ばれた微生物を受容菌として誘
導された該新規微生物は多量の核酸関連物質を安定して
蓄積することを見出した。
【０００６】本発明はこのような知見に基づいて完成さ
れたもので、バチルス属細菌のＰＲＰＰシンセターゼ構
造遺伝子を含むＤＮＡと、リボソーム結合部位を含むＤ
ＮＡと、バチルス属細菌内で発現可能なプロモータ配列
を含むＤＮＡとからなり、かつ、これらが、バチルス属
細菌内で該酵素遺伝子の発現を高めるように改変・配置
されてなる組換えＤＮＡを提供するものである。更に詳
しくは、ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のオープン・リー
ディング・フレームの上流にリボソーム結合部位を含む
ＤＮＡが該遺伝子のオープン・リーディング・フレーム
に隣接して、更にその上流に該リボソーム結合部位に隣
接してプロモータ配列を含むＤＮＡが各々配置されてな
るＤＮＡである。
れたもので、バチルス属細菌のＰＲＰＰシンセターゼ構
造遺伝子を含むＤＮＡと、リボソーム結合部位を含むＤ
ＮＡと、バチルス属細菌内で発現可能なプロモータ配列
を含むＤＮＡとからなり、かつ、これらが、バチルス属
細菌内で該酵素遺伝子の発現を高めるように改変・配置
されてなる組換えＤＮＡを提供するものである。更に詳
しくは、ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のオープン・リー
ディング・フレームの上流にリボソーム結合部位を含む
ＤＮＡが該遺伝子のオープン・リーディング・フレーム
に隣接して、更にその上流に該リボソーム結合部位に隣
接してプロモータ配列を含むＤＮＡが各々配置されてな
るＤＮＡである。
【０００７】また、本発明は、該改変された組換えＤＮ
Ａが組み込まれたベクター、該組換えＤＮＡまたはベク
ターで形質転換された核酸関連物質生産能を有する新規
バチルス属菌および該バチルス属菌を用いる核酸関連物
質の製造法も提供するものである。
Ａが組み込まれたベクター、該組換えＤＮＡまたはベク
ターで形質転換された核酸関連物質生産能を有する新規
バチルス属菌および該バチルス属菌を用いる核酸関連物
質の製造法も提供するものである。
【０００８】本発明に用いられるＰＲＰＰシンセターゼ
構造遺伝子を含むＤＮＡは、該酵素遺伝子をコードする
全てのＤＮＡ部分と、さらにその前後に若干の５'−お
よび／または３'−隣接領域を含んでいるＤＮＡである
ことが望ましいが、該酵素遺伝子の一部あるいは、該酵
素遺伝子の一部とその５'−または３'−隣接領域を含ん
でいるＤＮＡであっても差し支えない。かかるＤＮＡは
微生物の染色体ＤＮＡより組換えＤＮＡ技法を用いて単
離するのが簡便であり、この目的に用いられる宿主ベク
ター系としては通常用いられるＥＫ系、すなわち、宿主
としてはエシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)Ｋ−
１２株由来の、例えば、エシェリヒア・コリ(Ｅscheric
hia coli)Ｃ６００[ティ・マニアティスら、「モレキュ
ラー・クローニング」(Ｔ．Ｍaniatis et al., Ｍolecul
ar Ｃloning, Ａ．ＬaboratoryＭanual, Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratory), 東大出版会刊 １９８２年,第
５０４頁]、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)
ＪＡ２２１(ＩＦＯ １４３５９、ＡＴＣＣ３３８７
５)、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＭＭ
２９４(ＡＴＣＣ ３３６２５)[プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ー・エス・エイ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ),
７３, ４１７４(１９７６)]あるいはその誘導体が好適
に用いられ、また、ベクターとしては、pＢＲ３２２、p
ＡＣＹＣ１８４、pＡＣＹＣ１７７、pＵＣ１８、pＵＣ
１９、pＨＳＧ３９６、pＨＳＧ２９８などが好適に用い
られる。
構造遺伝子を含むＤＮＡは、該酵素遺伝子をコードする
全てのＤＮＡ部分と、さらにその前後に若干の５'−お
よび／または３'−隣接領域を含んでいるＤＮＡである
ことが望ましいが、該酵素遺伝子の一部あるいは、該酵
素遺伝子の一部とその５'−または３'−隣接領域を含ん
でいるＤＮＡであっても差し支えない。かかるＤＮＡは
微生物の染色体ＤＮＡより組換えＤＮＡ技法を用いて単
離するのが簡便であり、この目的に用いられる宿主ベク
ター系としては通常用いられるＥＫ系、すなわち、宿主
としてはエシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)Ｋ−
１２株由来の、例えば、エシェリヒア・コリ(Ｅscheric
hia coli)Ｃ６００[ティ・マニアティスら、「モレキュ
ラー・クローニング」(Ｔ．Ｍaniatis et al., Ｍolecul
ar Ｃloning, Ａ．ＬaboratoryＭanual, Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratory), 東大出版会刊 １９８２年,第
５０４頁]、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)
ＪＡ２２１(ＩＦＯ １４３５９、ＡＴＣＣ３３８７
５)、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＭＭ
２９４(ＡＴＣＣ ３３６２５)[プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ー・エス・エイ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ),
７３, ４１７４(１９７６)]あるいはその誘導体が好適
に用いられ、また、ベクターとしては、pＢＲ３２２、p
ＡＣＹＣ１８４、pＡＣＹＣ１７７、pＵＣ１８、pＵＣ
１９、pＨＳＧ３９６、pＨＳＧ２９８などが好適に用い
られる。
【０００９】また、シャロン(Ｃharon)４Ａ(「モレキュ
ラー・クローニング」第３１頁)やＥＭＢＬ ３、ＥＭＢ
Ｌ ４[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.), １７０, ８２７]などのファージ
ベクターをベクターとし、エシェリヒア・コリ(Ｅscher
ichia coli)ＤＰ５０supＦ(「モレキュラー・クローニ
ング」第５０４頁)、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia
coli)ＮＭ５３８、ＮＭ５３９[ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.), 170,
８２７]、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)Ｌ
Ｅ３９２[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.), ２１８, ９７]などを宿主とす
る宿主ベクター系も用いることができる。また当然のこ
とながら、バチルス属菌、例えば、バチルス・ズブチリ
ス(Ｂacillus subtilis)ＭＩ１１４[ジーン(Ｇene), ２
４, ２５５]あるいはそれから誘導された変異株を宿主
として、バチルス属菌内で自律複製能を有するプラスミ
ドpＵＢ１１０、pＣ１９４、pＥ１９４、pＳ１９４、p
ＳＡ２１００、pＨＹ３００ＰＬＫなどをベクターとす
るような宿主ベクター系も用いることができる。
ラー・クローニング」第３１頁)やＥＭＢＬ ３、ＥＭＢ
Ｌ ４[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.), １７０, ８２７]などのファージ
ベクターをベクターとし、エシェリヒア・コリ(Ｅscher
ichia coli)ＤＰ５０supＦ(「モレキュラー・クローニ
ング」第５０４頁)、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia
coli)ＮＭ５３８、ＮＭ５３９[ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol.), 170,
８２７]、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)Ｌ
Ｅ３９２[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.), ２１８, ９７]などを宿主とす
る宿主ベクター系も用いることができる。また当然のこ
とながら、バチルス属菌、例えば、バチルス・ズブチリ
ス(Ｂacillus subtilis)ＭＩ１１４[ジーン(Ｇene), ２
４, ２５５]あるいはそれから誘導された変異株を宿主
として、バチルス属菌内で自律複製能を有するプラスミ
ドpＵＢ１１０、pＣ１９４、pＥ１９４、pＳ１９４、p
ＳＡ２１００、pＨＹ３００ＰＬＫなどをベクターとす
るような宿主ベクター系も用いることができる。
【００１０】ＰＲＰＰシンセターゼ構造遺伝子を含むＤ
ＮＡの供与菌は、該菌株のＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子
の塩基配列が後記の受容菌として用いられるバチルス属
菌の染色体上のＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子の塩基配列
との相同性が高いものであれば、原則としてその由来に
ついては特別な制限はなく、どのような微生物でも供与
菌として用いることができる。とりわけ、バチルス属菌
を用いれば、いわゆるセルフクローニングとなり、取扱
いのうえからも好ましく、また、得られた形質転換株も
安定であることが期待される。また、該供与菌は必ずし
も核酸関連物質を生産する能力を有している必要はな
い。このようなＤＮＡ供与菌としては、バチルス・ズブ
チリス(Ｂacillus subtilis)、バチルス・プミルス(Ｂ
acillus pumilus)あるいはバチルス・リケニフォルミ
ス(Ｂacillus licheniformis)のようなバチルス属菌が
挙げられる。例えば、次のような菌株が例示される。 バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)Ｎo.１６
８(ＢＧＳＣ １Ａ１) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)Ｎo.１１
５(ＩＦＯ １４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２７) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＭＩ１１
４[ジーン(Ｇene), ２４,２５５] バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)ＡＴＣＣ ７
０６１ バチルス・リケニホルミス(Ｂacillus licheniformis)
ＡＴＣＣ １４５８０ ＢＧＳＣ: ザ・バチルス・ジェネティック・ストック・
センター(ＴheBacillus Ｇenetic Ｓtock Ｃenter) ＩＦＯ: 財団法人発酵研究所 ＡＴＣＣ: ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション(ＴheＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)
ＮＡの供与菌は、該菌株のＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子
の塩基配列が後記の受容菌として用いられるバチルス属
菌の染色体上のＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子の塩基配列
との相同性が高いものであれば、原則としてその由来に
ついては特別な制限はなく、どのような微生物でも供与
菌として用いることができる。とりわけ、バチルス属菌
を用いれば、いわゆるセルフクローニングとなり、取扱
いのうえからも好ましく、また、得られた形質転換株も
安定であることが期待される。また、該供与菌は必ずし
も核酸関連物質を生産する能力を有している必要はな
い。このようなＤＮＡ供与菌としては、バチルス・ズブ
チリス(Ｂacillus subtilis)、バチルス・プミルス(Ｂ
acillus pumilus)あるいはバチルス・リケニフォルミ
ス(Ｂacillus licheniformis)のようなバチルス属菌が
挙げられる。例えば、次のような菌株が例示される。 バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)Ｎo.１６
８(ＢＧＳＣ １Ａ１) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)Ｎo.１１
５(ＩＦＯ １４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２７) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＭＩ１１
４[ジーン(Ｇene), ２４,２５５] バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)ＡＴＣＣ ７
０６１ バチルス・リケニホルミス(Ｂacillus licheniformis)
ＡＴＣＣ １４５８０ ＢＧＳＣ: ザ・バチルス・ジェネティック・ストック・
センター(ＴheBacillus Ｇenetic Ｓtock Ｃenter) ＩＦＯ: 財団法人発酵研究所 ＡＴＣＣ: ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション(ＴheＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)
【００１１】供与菌からの染色体ＤＮＡの調製法として
は、公知の方法、例えば、フェノールを用いて染色体Ｄ
ＮＡを抽出する方法[エイチ・サイトウおよびケイ・ミ
ウラ、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
(Ｈ．Ｓaito and Ｋ．ＭiuraＢiochim．Ｂiophy．Ａc
ta), ７２, ６１９]が用いられる。かくして得られた染
色体ＤＮＡは適宜選択された制限酵素で切断され、ＤＮ
Ａリガーゼを用いてベクターと連結され、この連結反応
液を用いてＰＲＰＰシンセターゼ欠損性の宿主菌を形質
転換し、該欠損性が相補された形質転換株を選択するこ
とによって、ＰＲＰＰシンセターゼ構造遺伝子を含むＤ
ＮＡを得ることもできるし、あるいはまた、公知のバチ
ルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)のＰＲＰＰシン
セターゼ構造遺伝子の塩基配列[デイ・ニルソンら、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Ｄ．
Ｎilsson et al., Ｍol．Ｇen．Ｇenet.), ２１８, ５
６５(１９８９)]の一部をプローブとして、コロニー・
ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法を用いて、ＰＲＰＰシンセターゼ構造遺伝子
を含むＤＮＡをクローン化することができる。宿主菌の
形質転換は、宿主菌がエシェリヒア・コリ(Ｅscherichi
a coli)の場合には公知の方法、例えば、エス・エヌ・
コーエン(Ｓ．Ｎ．Ｃohen.)らの方法[プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユー・エス・エイ(Ｐro．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ), ６９, ２１１０]に従って、また、バチルス属菌の
場合には、公知の方法、例えば、エス・チャンおよびエ
ス・エヌ・コーエン(Ｓ．Ｃhang and Ｓ．Ｎ．Ｃohe
n)の方法[モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス(Ｍol．Ｇen．Ｇenet.), １６８, １１５]に
従って行うことができる。かくして得られた形質転換株
より該遺伝子を含むＤＮＡを大量に得るには、前記の
「モレキュラー・クローニング」第８６頁〜第９３頁に記
載の方法に従って行うことができる。
は、公知の方法、例えば、フェノールを用いて染色体Ｄ
ＮＡを抽出する方法[エイチ・サイトウおよびケイ・ミ
ウラ、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
(Ｈ．Ｓaito and Ｋ．ＭiuraＢiochim．Ｂiophy．Ａc
ta), ７２, ６１９]が用いられる。かくして得られた染
色体ＤＮＡは適宜選択された制限酵素で切断され、ＤＮ
Ａリガーゼを用いてベクターと連結され、この連結反応
液を用いてＰＲＰＰシンセターゼ欠損性の宿主菌を形質
転換し、該欠損性が相補された形質転換株を選択するこ
とによって、ＰＲＰＰシンセターゼ構造遺伝子を含むＤ
ＮＡを得ることもできるし、あるいはまた、公知のバチ
ルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)のＰＲＰＰシン
セターゼ構造遺伝子の塩基配列[デイ・ニルソンら、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Ｄ．
Ｎilsson et al., Ｍol．Ｇen．Ｇenet.), ２１８, ５
６５(１９８９)]の一部をプローブとして、コロニー・
ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法を用いて、ＰＲＰＰシンセターゼ構造遺伝子
を含むＤＮＡをクローン化することができる。宿主菌の
形質転換は、宿主菌がエシェリヒア・コリ(Ｅscherichi
a coli)の場合には公知の方法、例えば、エス・エヌ・
コーエン(Ｓ．Ｎ．Ｃohen.)らの方法[プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユー・エス・エイ(Ｐro．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ), ６９, ２１１０]に従って、また、バチルス属菌の
場合には、公知の方法、例えば、エス・チャンおよびエ
ス・エヌ・コーエン(Ｓ．Ｃhang and Ｓ．Ｎ．Ｃohe
n)の方法[モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス(Ｍol．Ｇen．Ｇenet.), １６８, １１５]に
従って行うことができる。かくして得られた形質転換株
より該遺伝子を含むＤＮＡを大量に得るには、前記の
「モレキュラー・クローニング」第８６頁〜第９３頁に記
載の方法に従って行うことができる。
【００１２】かくして得られたＰＲＰＰシンセターゼ遺
伝子を含むＤＮＡから本発明の新規組換えＤＮＡを作成
単離するには、公知の組換えＤＮＡ技法が簡便に適用で
き、例えば、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)
の宿主ベクター系を用いて概略次のような手順で作成単
離することができる。なお、以後のエシェリヒア・コリ
(Ｅscherichia coli)中での本発明の組換えＤＮＡの作
成過程においては、実験の便宜上、ＤＮＡ断片を新しい
ベクターにサブクローン化したり、ポリリンカーを利用
して連結するのが好都合であることが多い。この目的の
ために、例えば、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia c
oli)のベクターであるpＵＣ１１８やpＵＣ１１９のポリ
リンカー部分を利用してサブクローニングを行えば、新
規組換えＤＮＡの作成の際にも、また、塩基配列決定の
際にも好都合である。
伝子を含むＤＮＡから本発明の新規組換えＤＮＡを作成
単離するには、公知の組換えＤＮＡ技法が簡便に適用で
き、例えば、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)
の宿主ベクター系を用いて概略次のような手順で作成単
離することができる。なお、以後のエシェリヒア・コリ
(Ｅscherichia coli)中での本発明の組換えＤＮＡの作
成過程においては、実験の便宜上、ＤＮＡ断片を新しい
ベクターにサブクローン化したり、ポリリンカーを利用
して連結するのが好都合であることが多い。この目的の
ために、例えば、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia c
oli)のベクターであるpＵＣ１１８やpＵＣ１１９のポリ
リンカー部分を利用してサブクローニングを行えば、新
規組換えＤＮＡの作成の際にも、また、塩基配列決定の
際にも好都合である。
【００１３】ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子を含むプラス
ミドから適当な制限酵素と、必要に応じて、二本鎖ＤＮ
Ａを末端から順次消化するエキソヌクレアーゼ活性を有
する酵素、例えば、ＢＡＬ３１を用いて、該遺伝子のオ
ープン・リーディング・フレームのＮ末端側、開始コド
ンの５'−上流域を切断削除し、これに受容菌の１６Ｓ
リボソームＲＮＡとの結合に関与する配列であるリボソ
ーム結合部位をオープン・リーディング・フレームの開
始コドンの５'−上流側に方向を合わせて結合し、さら
に、その５'−上流側にバチルス属菌で高発現可能なプ
ロモータ活性を有するプロモータ配列を連結せしめるこ
とによって本発明の組換えＤＮＡを得ることができる。
ミドから適当な制限酵素と、必要に応じて、二本鎖ＤＮ
Ａを末端から順次消化するエキソヌクレアーゼ活性を有
する酵素、例えば、ＢＡＬ３１を用いて、該遺伝子のオ
ープン・リーディング・フレームのＮ末端側、開始コド
ンの５'−上流域を切断削除し、これに受容菌の１６Ｓ
リボソームＲＮＡとの結合に関与する配列であるリボソ
ーム結合部位をオープン・リーディング・フレームの開
始コドンの５'−上流側に方向を合わせて結合し、さら
に、その５'−上流側にバチルス属菌で高発現可能なプ
ロモータ活性を有するプロモータ配列を連結せしめるこ
とによって本発明の組換えＤＮＡを得ることができる。
【００１４】リボソーム結合部位としては、後記の受容
菌に使用する場合、3’OHＵＣＵＵＵＣＣＵＣＣ5’を相
補する配列を有するいずれのＤＮＡでもよい。3'OH Ｕ
ＣＵＵＵＣＣＵＣＣ 5'の配列はバチルス属菌の１６Ｓ
リボソームのメッセンジャーＲＮＡ結合部位である。こ
の配列は、バチルス属菌の染色体ＤＮＡからクローンし
たり、合成することにより得ることができる。また、ク
ローン化されたＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のオープン
・リーディング・フレーム上流に存在している配列をそ
のまま利用してもよい。
菌に使用する場合、3’OHＵＣＵＵＵＣＣＵＣＣ5’を相
補する配列を有するいずれのＤＮＡでもよい。3'OH Ｕ
ＣＵＵＵＣＣＵＣＣ 5'の配列はバチルス属菌の１６Ｓ
リボソームのメッセンジャーＲＮＡ結合部位である。こ
の配列は、バチルス属菌の染色体ＤＮＡからクローンし
たり、合成することにより得ることができる。また、ク
ローン化されたＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のオープン
・リーディング・フレーム上流に存在している配列をそ
のまま利用してもよい。
【００１５】ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のオープン・
リーディング・フレームのみを残したＤＮＡを得る場
合、あるいは、オープン・リーディング・フレームと、
さらに、その５'−上流側に存するリボソーム結合部位
を残したＤＮＡを得る場合には、それぞれ用いる制限酵
素の種類およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の
量、反応時間を適宜変えて、削られた部分の種類、大き
さが種々異なったＤＮＡ断片を得、その内から後記する
ような適当な手段、例えば、該断片の塩基配列決定の結
果により、目的とするＤＮＡ断片を選び出せばよい。塩
基配列の決定は該ＤＮＡ断片を塩基配列決定に用いられ
るベクター、例えば、Ｍ１３、pＵＣ１１８あるいはpＵ
Ｃ１１９などにサブクローン化した後、公知の方法、例
えばエフ・サンガー(Ｆ．Ｓangar)らの方法[プロシーテ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エイ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．ＵＳＡ), ７４, ５４６３]を用いて行うことができ
る。
リーディング・フレームのみを残したＤＮＡを得る場
合、あるいは、オープン・リーディング・フレームと、
さらに、その５'−上流側に存するリボソーム結合部位
を残したＤＮＡを得る場合には、それぞれ用いる制限酵
素の種類およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の
量、反応時間を適宜変えて、削られた部分の種類、大き
さが種々異なったＤＮＡ断片を得、その内から後記する
ような適当な手段、例えば、該断片の塩基配列決定の結
果により、目的とするＤＮＡ断片を選び出せばよい。塩
基配列の決定は該ＤＮＡ断片を塩基配列決定に用いられ
るベクター、例えば、Ｍ１３、pＵＣ１１８あるいはpＵ
Ｃ１１９などにサブクローン化した後、公知の方法、例
えばエフ・サンガー(Ｆ．Ｓangar)らの方法[プロシーテ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エイ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．ＵＳＡ), ７４, ５４６３]を用いて行うことができ
る。
【００１６】用いるプロモータ配列は後に用いる宿主菌
内で発現可能なＤＮＡ配列を有するものであればいずれ
でもよく、その由来は原核生物、真核生物、あるいは、
合成ＤＮＡであるとを問わない。例えば、バチルス属菌
の染色体由来、バチルス属菌のファージ由来またはバチ
ルス属菌体内で自律増殖可能なプラスミド由来のプロモ
ータが挙げられる。このようなプロモータの例として
は、具体的には、例えば、 などが挙げられる。これらのプロモータは、該プロモー
タを含むＤＮＡ(プラスミド)から適当な制限酵素を用い
て切り出して、例えば、アガロース・ゲル電気泳動、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分別の後、回収して用
いることもできるし、また、市販のＤＮＡ合成装置[例
えばアプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosys
tems)社製]を用いて、そのプロトコールに従って、フォ
スフォアミダイド法によって前記プロモータの塩基配列
を有するＤＮＡを合成し、これを用いることもできる。
内で発現可能なＤＮＡ配列を有するものであればいずれ
でもよく、その由来は原核生物、真核生物、あるいは、
合成ＤＮＡであるとを問わない。例えば、バチルス属菌
の染色体由来、バチルス属菌のファージ由来またはバチ
ルス属菌体内で自律増殖可能なプラスミド由来のプロモ
ータが挙げられる。このようなプロモータの例として
は、具体的には、例えば、 などが挙げられる。これらのプロモータは、該プロモー
タを含むＤＮＡ(プラスミド)から適当な制限酵素を用い
て切り出して、例えば、アガロース・ゲル電気泳動、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分別の後、回収して用
いることもできるし、また、市販のＤＮＡ合成装置[例
えばアプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosys
tems)社製]を用いて、そのプロトコールに従って、フォ
スフォアミダイド法によって前記プロモータの塩基配列
を有するＤＮＡを合成し、これを用いることもできる。
【００１７】かくして、本発明の組換えＤＮＡが作成さ
れ、受容菌の形質転換に供せられるが、本発明の組換え
ＤＮＡにさらにバチルス属菌内で発現可能なマーカー遺
伝子、例えば、薬剤耐性遺伝子を連結しておけば、後記
するバチルス属菌の受容菌の形質転換株選択の際に好都
合なことがある。また、この際、連結されたプロモータ
の５'−上流にＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子の５'−隣接
領域の一部を連結しておけば、後記する受容菌の染色体
上での組換えの際にダブルクロスオーバー型の組換えを
起こすので好都合である。本発明の新規組換えＤＮＡを
大量に得るには、前記のＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結さ
せた反応液を用いて、宿主菌を形質転換し、選択培地、
例えば、薬剤耐性を選択マーカーにした場合には、該薬
剤を含有する培地に生育してきた株を取得し、この形質
転換株から自体公知の方法、例えば前記の「モレキュラ
ー・クローニング」第８６頁〜第９３頁に記載の方法に
従って行うことができる。
れ、受容菌の形質転換に供せられるが、本発明の組換え
ＤＮＡにさらにバチルス属菌内で発現可能なマーカー遺
伝子、例えば、薬剤耐性遺伝子を連結しておけば、後記
するバチルス属菌の受容菌の形質転換株選択の際に好都
合なことがある。また、この際、連結されたプロモータ
の５'−上流にＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子の５'−隣接
領域の一部を連結しておけば、後記する受容菌の染色体
上での組換えの際にダブルクロスオーバー型の組換えを
起こすので好都合である。本発明の新規組換えＤＮＡを
大量に得るには、前記のＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結さ
せた反応液を用いて、宿主菌を形質転換し、選択培地、
例えば、薬剤耐性を選択マーカーにした場合には、該薬
剤を含有する培地に生育してきた株を取得し、この形質
転換株から自体公知の方法、例えば前記の「モレキュラ
ー・クローニング」第８６頁〜第９３頁に記載の方法に
従って行うことができる。
【００１８】次に、かくして得られた新規組換えＤＮＡ
を用いて受容菌を形質転換させ、新規微生物を作出する
方法について説明する。この形質転換に用いられる受容
菌としては、菌体外に与えられたＤＮＡを取り込み、染
色体上において該ＤＮＡの塩基配列と相同性の高い部分
で組換えを起こし、形質が変化する性質、いわゆる形質
転換能を有する菌であればよく、その染色体ＤＮＡのＰ
ＲＰＰシンセターゼ遺伝子の塩基配列が供与ＤＮＡに含
まれているＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のものと高い相
同性を示しているものであれば、必ずしも供与菌と同一
である必要はない。核酸関連物質生産能の高い形質転換
株を得る目的からは、プリンヌクレオチド関連物質（例
えば、イノシン、グアノシン等）、およびピリミジンヌ
クレオチド関連物質（例えば、ウリジン、シチジン等）
を蓄積することが知られており、形質転換能を有し、病
原性がなく、工業的にも安全に使用されてきたという観
点から、バチルス属菌、特にバチルス・ズブチリス(Ｂa
cillus subtilis)、バチルス・プミルス(Ｂacillus p
umilus)あるいはバチルス・リケニホルミス(Ｂacillus
licheniformis)などの菌が好適である。また、例え
ば、これらの菌に、さらに、核酸関連物質の蓄積に有利
とされている公知の性質、例えば、８−アザグアニン耐
性などの核酸アナログ耐性、ヌクレオシドホスフォリラ
ーゼ欠損性、５'−グアニル酸還元酵素欠損性、葉酸拮
抗剤耐性などが１つまたは２つ以上付与されたものを受
容菌として用いると、核酸関連物質生産性の向上のため
に一層好適な結果を得ることが多い。
を用いて受容菌を形質転換させ、新規微生物を作出する
方法について説明する。この形質転換に用いられる受容
菌としては、菌体外に与えられたＤＮＡを取り込み、染
色体上において該ＤＮＡの塩基配列と相同性の高い部分
で組換えを起こし、形質が変化する性質、いわゆる形質
転換能を有する菌であればよく、その染色体ＤＮＡのＰ
ＲＰＰシンセターゼ遺伝子の塩基配列が供与ＤＮＡに含
まれているＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子のものと高い相
同性を示しているものであれば、必ずしも供与菌と同一
である必要はない。核酸関連物質生産能の高い形質転換
株を得る目的からは、プリンヌクレオチド関連物質（例
えば、イノシン、グアノシン等）、およびピリミジンヌ
クレオチド関連物質（例えば、ウリジン、シチジン等）
を蓄積することが知られており、形質転換能を有し、病
原性がなく、工業的にも安全に使用されてきたという観
点から、バチルス属菌、特にバチルス・ズブチリス(Ｂa
cillus subtilis)、バチルス・プミルス(Ｂacillus p
umilus)あるいはバチルス・リケニホルミス(Ｂacillus
licheniformis)などの菌が好適である。また、例え
ば、これらの菌に、さらに、核酸関連物質の蓄積に有利
とされている公知の性質、例えば、８−アザグアニン耐
性などの核酸アナログ耐性、ヌクレオシドホスフォリラ
ーゼ欠損性、５'−グアニル酸還元酵素欠損性、葉酸拮
抗剤耐性などが１つまたは２つ以上付与されたものを受
容菌として用いると、核酸関連物質生産性の向上のため
に一層好適な結果を得ることが多い。
【００１９】バチルス属の受容菌としては次のものが例
示される。 バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３
２(ＩＦＯ １４５５９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４２) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)１Ａ３(Ｂ
ＧＳＣ Ｎo.１Ａ３) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−６０
１１(ＩＦＯ １４１８９、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−６０
１２(ＩＦＯ １４１９０、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−６１
２８(ＩＦＯ １４３７３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−７８
２１(ＩＦＯ １４３６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＡＴＣＣ
１９２２１ バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＡＴＣＣ
１４６６２ バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)(ＦＥＲＭ Ｐ
−２１１６) バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)(ＦＥＲＭ Ｐ
−４８３２) バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)(ＦＥＲＭ Ｐ
−４８２９) バチルス・リケニホルミス(Ｂacillus licheniformis)
ＩＦＯ １２４８５
示される。 バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３
２(ＩＦＯ １４５５９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４２) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)１Ａ３(Ｂ
ＧＳＣ Ｎo.１Ａ３) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−６０
１１(ＩＦＯ １４１８９、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−６０
１２(ＩＦＯ １４１９０、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−６１
２８(ＩＦＯ １４３７３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＮＡ−７８
２１(ＩＦＯ １４３６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＡＴＣＣ
１９２２１ バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＡＴＣＣ
１４６６２ バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)(ＦＥＲＭ Ｐ
−２１１６) バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)(ＦＥＲＭ Ｐ
−４８３２) バチルス・プミルス(Ｂacillus pumilus)(ＦＥＲＭ Ｐ
−４８２９) バチルス・リケニホルミス(Ｂacillus licheniformis)
ＩＦＯ １２４８５
【００２０】本発明の新規組換えＤＮＡはバチルス属菌
の形質転換に用いられ、この場合、プラスミドに組み込
んだ状態で利用に供することも可能であるし、また、プ
ラスミドを開裂させた線状ＤＮＡで、あるいは本発明の
ＤＮＡを切り出して用いることも可能である。該ＤＮＡ
断片を用いてのバチルス属菌の形質転換は公知の方法
[シイ・アナグノストポウロスおよびジェイ・スピツァ
イツェン、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｃ.
Ａnagnostopoulos and Ｊ.Ｓpizizen, Ｊ. Ｂacterio
l.)，８１，７４１(１９６１)]等を用いて行うことがで
きる。形質転換株の選択は、例えば、薬剤耐性遺伝子を
選択マーカーとしたときには対応する薬剤を含有する寒
天平板を用いることによって容易に行うことができる。
このようにして得られた形質転換株が、目的通りの特徴
を有する新規微生物であるか否かは、ＰＲＰＰシンセタ
ーゼ活性を測定することによって容易に判定できる。す
なわち、ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子発現が高められた
本発明の組換えＤＮＡで形質転換された新規微生物は、
その親株に比し、高いＰＲＰＰシンセターゼ活性を有す
る。このような本発明の形質転換株の代表的な例として
は、後記の実施例で得られた、バチルス・ズブチリス
(Ｂacillus subtilis)ＢＭ３０３２(ＩＦＯ １５０５
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９８７)が挙げられる。
の形質転換に用いられ、この場合、プラスミドに組み込
んだ状態で利用に供することも可能であるし、また、プ
ラスミドを開裂させた線状ＤＮＡで、あるいは本発明の
ＤＮＡを切り出して用いることも可能である。該ＤＮＡ
断片を用いてのバチルス属菌の形質転換は公知の方法
[シイ・アナグノストポウロスおよびジェイ・スピツァ
イツェン、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｃ.
Ａnagnostopoulos and Ｊ.Ｓpizizen, Ｊ. Ｂacterio
l.)，８１，７４１(１９６１)]等を用いて行うことがで
きる。形質転換株の選択は、例えば、薬剤耐性遺伝子を
選択マーカーとしたときには対応する薬剤を含有する寒
天平板を用いることによって容易に行うことができる。
このようにして得られた形質転換株が、目的通りの特徴
を有する新規微生物であるか否かは、ＰＲＰＰシンセタ
ーゼ活性を測定することによって容易に判定できる。す
なわち、ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子発現が高められた
本発明の組換えＤＮＡで形質転換された新規微生物は、
その親株に比し、高いＰＲＰＰシンセターゼ活性を有す
る。このような本発明の形質転換株の代表的な例として
は、後記の実施例で得られた、バチルス・ズブチリス
(Ｂacillus subtilis)ＢＭ３０３２(ＩＦＯ １５０５
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９８７)が挙げられる。
【００２１】勿論、プロモータや受容菌を選ぶことによ
って、本明細書に記載の方法に従って、同様に種々の形
質転換株を容易に作出することができる。本発明で得ら
れた形質転換株を用いて核酸関連物質を製造するには、
従来の核酸関連物質生産菌の培養方法と同様の方法が用
いられる。核酸関連物質の例としては、プリンヌクレオ
チド関連物質（例えば、イノシン、グアノシン等）、ピ
リミジンヌクレオチド関連物質（例えば、ウリジン、シ
チジン等）等が挙げられる。培養に用いる培地として
は、炭素源、窒素源、金属イオン類のほか、必要に応じ
てアミノ酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する
培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、
糖蜜などが用いられる。窒素源としては、ペプトン、コ
ーンスティープリカー、大豆粉、乾燥酵母、尿素などの
有機窒素源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのア
ンモニウム塩やアンモニアガス、アンモニア水などの無
機窒素源がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。
その他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機
塩類、アミノ酸類、ビタミン類、核酸類などが適宜選択
の上、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。さら
に、培地には必要に応じてシリコーンオイル、ポリアル
キレングリコールエーテルなどの消泡剤や界面活性剤な
どを添加することができる。
って、本明細書に記載の方法に従って、同様に種々の形
質転換株を容易に作出することができる。本発明で得ら
れた形質転換株を用いて核酸関連物質を製造するには、
従来の核酸関連物質生産菌の培養方法と同様の方法が用
いられる。核酸関連物質の例としては、プリンヌクレオ
チド関連物質（例えば、イノシン、グアノシン等）、ピ
リミジンヌクレオチド関連物質（例えば、ウリジン、シ
チジン等）等が挙げられる。培養に用いる培地として
は、炭素源、窒素源、金属イオン類のほか、必要に応じ
てアミノ酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する
培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、
糖蜜などが用いられる。窒素源としては、ペプトン、コ
ーンスティープリカー、大豆粉、乾燥酵母、尿素などの
有機窒素源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのア
ンモニウム塩やアンモニアガス、アンモニア水などの無
機窒素源がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。
その他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機
塩類、アミノ酸類、ビタミン類、核酸類などが適宜選択
の上、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。さら
に、培地には必要に応じてシリコーンオイル、ポリアル
キレングリコールエーテルなどの消泡剤や界面活性剤な
どを添加することができる。
【００２２】培養は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部
培養などの好気条件下に行われる。培地のpＨは通常、
４〜９の範囲が好ましい。培養中にpＨの変動が観察さ
れる場合は、これを好ましい範囲に修正するために硫
酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガ
ス、アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温度
は通常、２０℃〜４５℃の範囲から、使用される微生物
の生育および核酸関連物質の蓄積に好適な温度が選択さ
れる。培養は実質的に核酸関連物質の蓄積量が最大にな
るまで行われるが、通常、２４時間〜１４４時間の培養
で目的を達することができる。培養物から核酸関連物質
を分離採取するには、公知の通常の精製手段、例えば沈
澱法、イオン交換樹脂クロマトグラフィー法、活性炭ク
ロマトグラフィー法などの分離精製法が用いられる。
培養などの好気条件下に行われる。培地のpＨは通常、
４〜９の範囲が好ましい。培養中にpＨの変動が観察さ
れる場合は、これを好ましい範囲に修正するために硫
酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガ
ス、アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温度
は通常、２０℃〜４５℃の範囲から、使用される微生物
の生育および核酸関連物質の蓄積に好適な温度が選択さ
れる。培養は実質的に核酸関連物質の蓄積量が最大にな
るまで行われるが、通常、２４時間〜１４４時間の培養
で目的を達することができる。培養物から核酸関連物質
を分離採取するには、公知の通常の精製手段、例えば沈
澱法、イオン交換樹脂クロマトグラフィー法、活性炭ク
ロマトグラフィー法などの分離精製法が用いられる。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明する。ただし、以下の実施例における操作は特に
記載する場合を除き、次の(１)〜(８)の方法に従った。 (１) 制限酵素によるＤＮＡの消化 制限酵素(宝酒造(株)製)の緩衝液は酵素メーカー推薦の
ものを用い、消化条件は１０単位／μgＤＮＡの酵素を
用いて、３７℃で６０分間保温した。次いで、ＴＥ緩衝
液(１０mＭのトリス塩酸(pＨ７.５)、１mＭのＥＤＴＡ)
で飽和したフェノールで抽出し、１／１０倍容の３Ｍの
酢酸ナトリウム(pＨ６)を加え、２.５倍容のエタノール
を加えて遠心分離してＤＮＡを回収した。
に説明する。ただし、以下の実施例における操作は特に
記載する場合を除き、次の(１)〜(８)の方法に従った。 (１) 制限酵素によるＤＮＡの消化 制限酵素(宝酒造(株)製)の緩衝液は酵素メーカー推薦の
ものを用い、消化条件は１０単位／μgＤＮＡの酵素を
用いて、３７℃で６０分間保温した。次いで、ＴＥ緩衝
液(１０mＭのトリス塩酸(pＨ７.５)、１mＭのＥＤＴＡ)
で飽和したフェノールで抽出し、１／１０倍容の３Ｍの
酢酸ナトリウム(pＨ６)を加え、２.５倍容のエタノール
を加えて遠心分離してＤＮＡを回収した。
【００２４】(２) プラスミドの大量抽出法「 モレキュラー・クローニング」第８６〜９３頁に記載の
方法に従った。すなわち、プラスミドＤＮＡを含むエシ
ェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)を２５０mlのＬＢ
培地(バクトトリプトン１０g／リットル、酵母エキス５
g／リットル、塩化ナトリウム５g／リットル)に接種
し、一夜培養後、集菌し、ＴＥ緩衝液で洗浄した。次
に、洗浄菌体にリゾチームを加え、さらに１％ラウリル
硫酸ナトリウムを含む０.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を
加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウムを加えた後、遠心分離
によりプラスミドを含む上澄液を得た。上澄液に０.６
容のイソプロパノールを加え、プラスミドＤＮＡを沈澱
させ、エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液に溶解し
た。これに比重が１.６０となるように塩化セシウムを
加え、終濃度が６００μg／mlとなるようにエチジウム
・ブロマイドを加えた。超遠心機(ロータＶ65Ｔi)を用
いて２０℃で５０,０００rpmにて１２時間遠心分離し、
紫外線によって検出されるプラスミドのバンドを取り、
n−ブタノールを用いてエチジウム・ブロマイドを抽出
除去した後、エタノール沈澱を行った。
方法に従った。すなわち、プラスミドＤＮＡを含むエシ
ェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)を２５０mlのＬＢ
培地(バクトトリプトン１０g／リットル、酵母エキス５
g／リットル、塩化ナトリウム５g／リットル)に接種
し、一夜培養後、集菌し、ＴＥ緩衝液で洗浄した。次
に、洗浄菌体にリゾチームを加え、さらに１％ラウリル
硫酸ナトリウムを含む０.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を
加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウムを加えた後、遠心分離
によりプラスミドを含む上澄液を得た。上澄液に０.６
容のイソプロパノールを加え、プラスミドＤＮＡを沈澱
させ、エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液に溶解し
た。これに比重が１.６０となるように塩化セシウムを
加え、終濃度が６００μg／mlとなるようにエチジウム
・ブロマイドを加えた。超遠心機(ロータＶ65Ｔi)を用
いて２０℃で５０,０００rpmにて１２時間遠心分離し、
紫外線によって検出されるプラスミドのバンドを取り、
n−ブタノールを用いてエチジウム・ブロマイドを抽出
除去した後、エタノール沈澱を行った。
【００２５】(３) エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia
coli)の形質転換「 モレキュラー・クローニング」第２５０頁に記載の方法
に従った。３mlのＬＢ培地にエシェリヒア・コリ(Ｅsch
erichia coli)を植菌し、一夜培養し、該培養ブロスの
１mlを１００mlのＬＢ培地に植え、３７℃で菌量が約５
×１０7セル／mlになるまで振盪培養した。次に、集菌
し、氷冷した５０mＭの塩化カルシウムと１０mＭのトリ
ス塩酸(pＨ８)を含む滅菌水溶液を５０ml加え、懸濁し
て１５分間氷冷した。遠心により集菌した菌体を再び上
記の水溶液の６.７mlに懸濁し、この０.２mlにＤＮＡを
加え、３０分間氷冷した。これに０.８mlのＬＢ培地を
添加し、３７℃で１時間培養し、薬剤を含むＬＢ寒天平
板培地に塗布し、３７℃で一夜培養した。
coli)の形質転換「 モレキュラー・クローニング」第２５０頁に記載の方法
に従った。３mlのＬＢ培地にエシェリヒア・コリ(Ｅsch
erichia coli)を植菌し、一夜培養し、該培養ブロスの
１mlを１００mlのＬＢ培地に植え、３７℃で菌量が約５
×１０7セル／mlになるまで振盪培養した。次に、集菌
し、氷冷した５０mＭの塩化カルシウムと１０mＭのトリ
ス塩酸(pＨ８)を含む滅菌水溶液を５０ml加え、懸濁し
て１５分間氷冷した。遠心により集菌した菌体を再び上
記の水溶液の６.７mlに懸濁し、この０.２mlにＤＮＡを
加え、３０分間氷冷した。これに０.８mlのＬＢ培地を
添加し、３７℃で１時間培養し、薬剤を含むＬＢ寒天平
板培地に塗布し、３７℃で一夜培養した。
【００２６】(４) Ｂal３１エキソヌクレアーゼ消化処
理 ＤＮＡの二本鎖とも両末端から消化するためにＢal３１
消化処理を行った。すなわち、制限酵素処理した１０μ
gのＤＮＡを１００μlのＢal３１緩衝液(１２mＭの塩化
カルシウム、１２mＭの塩化マグネシウム、２００mＭの
塩化ナトリウム、２０mＭのトリス塩酸(pＨ８)、２mＭ
のＥＤＴＡ)に溶解し、１単位のＢal３１エキソヌクレ
アーゼ(宝酒造(株)製)を加え、３０℃で保温した。反応
後フェノール抽出、エタノール沈澱を行った。次に、消
化したＤＮＡの付着末端を平滑化するために上記のＤＮ
Ａを２０μlのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液(３３m
Ｍのトリス酢酸(pＨ７.９)、１０mＭの酢酸マグネシウ
ム、０.５mＭのジチオスレイトール６６mＭの酢酸カリ
ウム、０.０１％のＢＳＡ、各０.１mＭのdＡＴＰ、dＧ
ＴＰ、dＣＴＰ、dＴＴＰを含む)に懸濁し、５単位のＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼ(宝酒造(株)製)を加え、３７℃
で３０分間保温した。反応後、フェノール抽出、エタノ
ール沈澱を行った。
理 ＤＮＡの二本鎖とも両末端から消化するためにＢal３１
消化処理を行った。すなわち、制限酵素処理した１０μ
gのＤＮＡを１００μlのＢal３１緩衝液(１２mＭの塩化
カルシウム、１２mＭの塩化マグネシウム、２００mＭの
塩化ナトリウム、２０mＭのトリス塩酸(pＨ８)、２mＭ
のＥＤＴＡ)に溶解し、１単位のＢal３１エキソヌクレ
アーゼ(宝酒造(株)製)を加え、３０℃で保温した。反応
後フェノール抽出、エタノール沈澱を行った。次に、消
化したＤＮＡの付着末端を平滑化するために上記のＤＮ
Ａを２０μlのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液(３３m
Ｍのトリス酢酸(pＨ７.９)、１０mＭの酢酸マグネシウ
ム、０.５mＭのジチオスレイトール６６mＭの酢酸カリ
ウム、０.０１％のＢＳＡ、各０.１mＭのdＡＴＰ、dＧ
ＴＰ、dＣＴＰ、dＴＴＰを含む)に懸濁し、５単位のＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼ(宝酒造(株)製)を加え、３７℃
で３０分間保温した。反応後、フェノール抽出、エタノ
ール沈澱を行った。
【００２７】(５) ＤＮＡの連結反応 ２〜３種のＤＮＡ断片の連結にはＤＮＡライゲーション
・キット(宝酒造(株)製)を用いた。連結条件はメーカー
指定の方法に従った。 (６) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)の形
質転換 デュブノー(Ｄubnou)らの方法に従った。すなわち、５m
lのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜培養し、この０.５
mlを２０mlのＳＰＩ培地(１.４％のリン酸二カリウム、
０.６％のリン酸一カリウム、０.２％の硫酸アンモニウ
ム、０.１％のクエン酸ナトリウム、０.０２％の硫酸マ
グネシウム、０.５％のグルコース、０.０２％のカザミ
ノ酸、０.１％の酵母エキス、５０μg／mlのトリプトフ
ァン、５０μg／mlのロイシンを含む)に移し、３７℃で
４時間培養した。次に、この１０mlの培養ブロスを１０
０mlのＳＰII培地(１.４％のリン酸二カリウム、０.６
％のリン酸一カリウム、０.２％の硫酸アンモニウム、
０.１％のクエン酸ナトリウム、０.０２％の硫酸マグネ
シウム、０.５％のグルコース、７５μg／mlの塩化カル
シウム、５０８μg／mlの塩化マグネシウムを含む)に移
し、３７℃で９０分間培養した。この菌懸濁液１mlにＤ
ＮＡ１μgを加え、３７℃で３０分間振盪した後、薬剤
を含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３７℃で一夜培養し
た。
・キット(宝酒造(株)製)を用いた。連結条件はメーカー
指定の方法に従った。 (６) バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)の形
質転換 デュブノー(Ｄubnou)らの方法に従った。すなわち、５m
lのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜培養し、この０.５
mlを２０mlのＳＰＩ培地(１.４％のリン酸二カリウム、
０.６％のリン酸一カリウム、０.２％の硫酸アンモニウ
ム、０.１％のクエン酸ナトリウム、０.０２％の硫酸マ
グネシウム、０.５％のグルコース、０.０２％のカザミ
ノ酸、０.１％の酵母エキス、５０μg／mlのトリプトフ
ァン、５０μg／mlのロイシンを含む)に移し、３７℃で
４時間培養した。次に、この１０mlの培養ブロスを１０
０mlのＳＰII培地(１.４％のリン酸二カリウム、０.６
％のリン酸一カリウム、０.２％の硫酸アンモニウム、
０.１％のクエン酸ナトリウム、０.０２％の硫酸マグネ
シウム、０.５％のグルコース、７５μg／mlの塩化カル
シウム、５０８μg／mlの塩化マグネシウムを含む)に移
し、３７℃で９０分間培養した。この菌懸濁液１mlにＤ
ＮＡ１μgを加え、３７℃で３０分間振盪した後、薬剤
を含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３７℃で一夜培養し
た。
【００２８】(７) コロニーハイブリダイゼーション 形質転換されたコロニーを５０μg／mlのアンピシリン
を含むＬＢ寒天平板培地上にのせたナイロンフィルター
(コロニー／プラークスクリーンＮＥＦ−９７８Ｘ、デ
ュポン(株)製)上と、マスタープレートとからなるアン
ピシリンを含むＬＢ寒天平板培地上にそれぞれ並べて菌
を植え、３７℃で一夜培養した。次に、このナイロンフ
ィルターを平板培地よりはがし、０.５Ｎの水酸化ナト
リウム水溶液中に１０分間浸し、続いて、１Ｍのトリス
塩酸(pＨ７.５)に１０分間浸した後、フィルターを室温
で乾燥した。その一方で、プローブの作製を行った。作
製にはＭＥＧＡＬＡＢＥＬ(宝酒造(株)製)を用い、方法
はメーカーの指定するプロトコールに従った。ハイブリ
ダイゼーションの方法は、ナイロンフィルター指定のプ
ロトコールに従った。
を含むＬＢ寒天平板培地上にのせたナイロンフィルター
(コロニー／プラークスクリーンＮＥＦ−９７８Ｘ、デ
ュポン(株)製)上と、マスタープレートとからなるアン
ピシリンを含むＬＢ寒天平板培地上にそれぞれ並べて菌
を植え、３７℃で一夜培養した。次に、このナイロンフ
ィルターを平板培地よりはがし、０.５Ｎの水酸化ナト
リウム水溶液中に１０分間浸し、続いて、１Ｍのトリス
塩酸(pＨ７.５)に１０分間浸した後、フィルターを室温
で乾燥した。その一方で、プローブの作製を行った。作
製にはＭＥＧＡＬＡＢＥＬ(宝酒造(株)製)を用い、方法
はメーカーの指定するプロトコールに従った。ハイブリ
ダイゼーションの方法は、ナイロンフィルター指定のプ
ロトコールに従った。
【００２９】(８) 塩基配列決定 ＤＮＡの塩基配列の決定には、シークエナーゼ(東洋紡
(株)製)を用いた。方法は、メーカー指定の方法を用い
た。なお、以下の微生物に付されているＩＦＯ番号は財
団法人発酵研究所への、またＦＥＲＭ ＢＰ番号はブタ
ペスト条約に基づく工業技術院微生物工業技術研究所
(ＦＲＩ)への寄託番号を示す。
(株)製)を用いた。方法は、メーカー指定の方法を用い
た。なお、以下の微生物に付されているＩＦＯ番号は財
団法人発酵研究所への、またＦＥＲＭ ＢＰ番号はブタ
ペスト条約に基づく工業技術院微生物工業技術研究所
(ＦＲＩ)への寄託番号を示す。
【００３０】実施例１ (１)染色体ＤＮＡの調製 バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis) Ｎo.１１５[ＩＦＯ １４１８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３
２７(寄託日:１９８７年３月２８日)]を４０mlのＬＢ培
地に接種し、３７℃で一夜培養し、フェノールを用いる
染色体ＤＮＡ抽出法によって５mgの染色体ＤＮＡを得
た。
２７(寄託日:１９８７年３月２８日)]を４０mlのＬＢ培
地に接種し、３７℃で一夜培養し、フェノールを用いる
染色体ＤＮＡ抽出法によって５mgの染色体ＤＮＡを得
た。
【００３１】(２)ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子（prs）
のクローニング 前記(１)項で調製した染色体ＤＮＡの１０μgをＢclＩ
で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画し、約３.６
〜４.５kbに相当するＤＮＡをユニディレクショナル・
エレクトロエルータ[インターナショナル・バイオテク
ノロジーズ・インコーポレイテッド(Ｉnternational Ｂ
iotechnologies Ｉnc.)製]を用いて回収した。一方、
０.５μｇのpＵＣ１９をＢamＨＩで消化し、上記のＤＮ
Ａ断片と混合し、連結して、エシェリヒア・コリ(Ｅsch
erichia coli)ＪＭ１０９(宝酒造(株)製)を形質転換し
て、アンピシリン耐性株を選択した。約２００株のコロ
ニーを選び、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド
(５'−ＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＣ
ＧＴＧＣＣＣＧＣ−３')を用いて、コロニーハイブリダ
イゼーション実験を行った。プローブとハイブリダイズ
するコロニーのうちの１株[エシェリヒア・コリ(Ｅsche
richia coli)ＪＭ１０９(pＰＲＳ１)]より、プラスミ
ドpＰＲＳ１を得た。このpＰＲＳ１の制限酵素地図を第
１図に示す。
のクローニング 前記(１)項で調製した染色体ＤＮＡの１０μgをＢclＩ
で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画し、約３.６
〜４.５kbに相当するＤＮＡをユニディレクショナル・
エレクトロエルータ[インターナショナル・バイオテク
ノロジーズ・インコーポレイテッド(Ｉnternational Ｂ
iotechnologies Ｉnc.)製]を用いて回収した。一方、
０.５μｇのpＵＣ１９をＢamＨＩで消化し、上記のＤＮ
Ａ断片と混合し、連結して、エシェリヒア・コリ(Ｅsch
erichia coli)ＪＭ１０９(宝酒造(株)製)を形質転換し
て、アンピシリン耐性株を選択した。約２００株のコロ
ニーを選び、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド
(５'−ＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＣ
ＧＴＧＣＣＣＧＣ−３')を用いて、コロニーハイブリダ
イゼーション実験を行った。プローブとハイブリダイズ
するコロニーのうちの１株[エシェリヒア・コリ(Ｅsche
richia coli)ＪＭ１０９(pＰＲＳ１)]より、プラスミ
ドpＰＲＳ１を得た。このpＰＲＳ１の制限酵素地図を第
１図に示す。
【００３２】(３)欠失プラスミド、pＰＲＳ１５０５の
作製 前記(２)項で得た１０μgのpＰＲＳ１をＫpnＩで
消化した後、１０分間のＢal３１消化処理を行った。次
に、ＸbaＩで完全消化し、これをアガロースゲル電気泳
動で分画し、約３.０kbに相当するＤＮＡを回収した。
このＤＮＡをＳmaＩとＸbaＩで二重消化した０.５μgの
pＨＳＧ３９８(宝酒造(株)製)に連結し、エシェリヒア
・コリ(Ｅscherichia coli)ＪＭ１０９を形質転換し、
クロラムフェニコール(３０μg／ml)耐性株を選択し
た。この結果、第２図に示すようなプラスミドpＰＲＳ
１５０５を得た。
作製 前記(２)項で得た１０μgのpＰＲＳ１をＫpnＩで
消化した後、１０分間のＢal３１消化処理を行った。次
に、ＸbaＩで完全消化し、これをアガロースゲル電気泳
動で分画し、約３.０kbに相当するＤＮＡを回収した。
このＤＮＡをＳmaＩとＸbaＩで二重消化した０.５μgの
pＨＳＧ３９８(宝酒造(株)製)に連結し、エシェリヒア
・コリ(Ｅscherichia coli)ＪＭ１０９を形質転換し、
クロラムフェニコール(３０μg／ml)耐性株を選択し
た。この結果、第２図に示すようなプラスミドpＰＲＳ
１５０５を得た。
【００３３】(４)pＰＳＣ３２の作製 前記(３)項で作製したpＰＲＳ１５０５の１μgをＫpnＩ
で消化した後、ＨindIIIで部分消化することによって約
３.０kbを、一方でpＳＰ１９(特願平１−２０４１４０
号)の０.５μgのＥcoＲＩとＫpnＩで二重消化し、約０.
１kbを、pＣＡＴ１５(特開昭６２−８２０９６号)の０.
５μgをＨindIIIとＢamＨＩで二重消化し、約１.０kb
を、pＢＲ３２２の０.５μgをＥcoＲＩとＢamＨＩで二
重消化し、約３.９kbのＤＮＡをそれぞれアガロースガ
ス電気泳動で分画して、回収した。次に、これら４断片
を混合し、連結して、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichi
a coli)ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株を
選択し、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＪＭ
１０９(pＰＳＣ３２)を得た。そのプラスミド、pＰＳＣ
３２の制限酵素地図を第３図に示す。
で消化した後、ＨindIIIで部分消化することによって約
３.０kbを、一方でpＳＰ１９(特願平１−２０４１４０
号)の０.５μgのＥcoＲＩとＫpnＩで二重消化し、約０.
１kbを、pＣＡＴ１５(特開昭６２−８２０９６号)の０.
５μgをＨindIIIとＢamＨＩで二重消化し、約１.０kb
を、pＢＲ３２２の０.５μgをＥcoＲＩとＢamＨＩで二
重消化し、約３.９kbのＤＮＡをそれぞれアガロースガ
ス電気泳動で分画して、回収した。次に、これら４断片
を混合し、連結して、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichi
a coli)ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株を
選択し、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＪＭ
１０９(pＰＳＣ３２)を得た。そのプラスミド、pＰＳＣ
３２の制限酵素地図を第３図に示す。
【００３４】実施例２ (１)pＰＳＣ３２によるイノシン・グアノシン生産株バ
チルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２
の形質転換 実施例１の(４)項で作製したpＰＳＣ３２の１μgをバチ
ルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２
(ＩＦＯ １４４５９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４２)を形
質転換し、クロラムフェニコール(１０μg／ml)耐性株
を得、そのうちの１株をバチルス・ズブチリス(Ｂacill
us subtilis)ＢＭ３０３２と命名した。この株は１９
９０年６月２０日にＩＦＯ １５０５８の寄託番号で発
酵研究所へ、また１９９０年６月２５日にＦＥＲＭＢＰ
−２９８７の寄託番号でブタペスト条約の下、工業技術
院微生物工業技術研究所へ寄託されている。
チルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２
の形質転換 実施例１の(４)項で作製したpＰＳＣ３２の１μgをバチ
ルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２
(ＩＦＯ １４４５９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４２)を形
質転換し、クロラムフェニコール(１０μg／ml)耐性株
を得、そのうちの１株をバチルス・ズブチリス(Ｂacill
us subtilis)ＢＭ３０３２と命名した。この株は１９
９０年６月２０日にＩＦＯ １５０５８の寄託番号で発
酵研究所へ、また１９９０年６月２５日にＦＥＲＭＢＰ
−２９８７の寄託番号でブタペスト条約の下、工業技術
院微生物工業技術研究所へ寄託されている。
【００３５】(２)バチルス・ズブチリス(Ｂacillus su
btilis)ＢＭ３０３２によるイノシンおよびグアノシン
生産性 ５mlのＬＢ培地にバチルス・ズブチリス(Ｂacillus su
btilis)ＢＭ３０３２の１白金耳を表１に示すような培
地の２０mlに植え、３７℃で５３時間培養した。発酵終
了時における培養ブロス中のイノシンおよびグアノシン
の蓄積量を高速液体クロマトグラフィーで定量したとこ
ろ、１４mg／mlのイノシンと２.５mg／mlのグアノシン
が蓄積していた。それに対して、バチルス・ズブチリス
(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２を上記と同一条件
で培養したところ、培養ブロス中に８.０mg／mlのイノ
シンと１.１mg／mlのグアノシンが蓄積したにすぎなか
った。
btilis)ＢＭ３０３２によるイノシンおよびグアノシン
生産性 ５mlのＬＢ培地にバチルス・ズブチリス(Ｂacillus su
btilis)ＢＭ３０３２の１白金耳を表１に示すような培
地の２０mlに植え、３７℃で５３時間培養した。発酵終
了時における培養ブロス中のイノシンおよびグアノシン
の蓄積量を高速液体クロマトグラフィーで定量したとこ
ろ、１４mg／mlのイノシンと２.５mg／mlのグアノシン
が蓄積していた。それに対して、バチルス・ズブチリス
(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２を上記と同一条件
で培養したところ、培養ブロス中に８.０mg／mlのイノ
シンと１.１mg／mlのグアノシンが蓄積したにすぎなか
った。
【００３６】
【表１】
【００３７】試験例 ＰＲＰＰシンセターゼ活性の測定 バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis)ＢＭ３０３
２をアデニンを含むＳＰＩ培地で一夜培養し、集菌洗浄
した。その後、菌体を破壊し、その上澄液を用いてＰＲ
ＰＰシンセターゼ活性をケイ・エフ・ジェンセン(Ｋ.
Ｆ.Ｊensen)らの方法（ケイ・エフ・ジェンセン(Ｋ.Ｆ.
Ｊensen）ら、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａnalytical Ｂiochemistry，９８，２５４〜２６３
（１９７９))に従って測定した。その結果、本発明形質
転換株であるバチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtili
s)ＢＭ３０３２は、対照としたバチルス・ズブチリス
(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２に比べ、２.８倍の
酵素活性を示した。
２をアデニンを含むＳＰＩ培地で一夜培養し、集菌洗浄
した。その後、菌体を破壊し、その上澄液を用いてＰＲ
ＰＰシンセターゼ活性をケイ・エフ・ジェンセン(Ｋ.
Ｆ.Ｊensen)らの方法（ケイ・エフ・ジェンセン(Ｋ.Ｆ.
Ｊensen）ら、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａnalytical Ｂiochemistry，９８，２５４〜２６３
（１９７９))に従って測定した。その結果、本発明形質
転換株であるバチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtili
s)ＢＭ３０３２は、対照としたバチルス・ズブチリス
(Ｂacillus subtilis)ＢＭ１０３２に比べ、２.８倍の
酵素活性を示した。
【００３８】
【発明の効果】本発明によると呈味性物質として工業上
重要な５'−イノシン酸、５'−グアニル酸の原料である
イノシンおよび／またはグアノシンを収率よく工業的に
有利に製造することができる。すなわち、核酸関連物質
を生産する能力を有するバチルス属菌を受容菌として本
発明のＤＮＡを用いて形質転換することにより、核酸関
連物質生合成の重要な中間体であるフォスフォリボシル
ピロフォスフェートの合成に関与する酵素ＰＲＰＰシン
セターゼ活性が上昇した新規微生物を得ることができ
る。該新規微生物は、核酸関連物質をきわめて安定的に
多量に生産することができる。
重要な５'−イノシン酸、５'−グアニル酸の原料である
イノシンおよび／またはグアノシンを収率よく工業的に
有利に製造することができる。すなわち、核酸関連物質
を生産する能力を有するバチルス属菌を受容菌として本
発明のＤＮＡを用いて形質転換することにより、核酸関
連物質生合成の重要な中間体であるフォスフォリボシル
ピロフォスフェートの合成に関与する酵素ＰＲＰＰシン
セターゼ活性が上昇した新規微生物を得ることができ
る。該新規微生物は、核酸関連物質をきわめて安定的に
多量に生産することができる。
【図１】 実施例１(２)で得られたＰＲＰＰシンセター
ゼをコードする遺伝子(prs)を含む組換えプラスミドpＰ
ＲＳ１の制限酵素切断地図を表わす。図中の実線部分は
prsを含む挿入ＤＮＡ断片を、白ヌキの部分はpＵＣ１９
を表わす。
ゼをコードする遺伝子(prs)を含む組換えプラスミドpＰ
ＲＳ１の制限酵素切断地図を表わす。図中の実線部分は
prsを含む挿入ＤＮＡ断片を、白ヌキの部分はpＵＣ１９
を表わす。
【図２】 実施例１(３)で得られた欠失プラスミドpＰ
ＲＳ１５０５の制限酵素切断地図を表わす。図中の実線
はprs遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断片を、また白ヌキ部分
はベクターpＨＳＧ３９８を表わす。また両者の連結部
分の塩基配列決定結果を併せて示す。
ＲＳ１５０５の制限酵素切断地図を表わす。図中の実線
はprs遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断片を、また白ヌキ部分
はベクターpＨＳＧ３９８を表わす。また両者の連結部
分の塩基配列決定結果を併せて示す。
【図３】 実施例１(４)で得られたpＰＳＣ３２の制限
酵素切断地図を示す。図中、実線部分はprs遺伝子を含
むＤＮＡ断片を、黒塗りの部分はＳＰプロモータを、斜
線部分はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子(cat)を、また白ヌキ部分はpＢＲ３２２を表
わす。
酵素切断地図を示す。図中、実線部分はprs遺伝子を含
むＤＮＡ断片を、黒塗りの部分はＳＰプロモータを、斜
線部分はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子(cat)を、また白ヌキ部分はpＢＲ３２２を表
わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (14)
- 【請求項１】 バチルス属菌のホスホリボシルピロホス
フェート・シンセターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ、リボ
ソーム結合部位を含むＤＮＡおよびバチルス属菌内で発
現可能なプロモータ配列を含むＤＮＡからなり、プロモ
ータ配列を含むＤＮＡがリボソーム結合部位を含むＤＮ
Ａの上流に隣接して連結され、これらのＤＮＡ配列がホ
スホリボシルピロホスフェート・シンセターゼ遺伝子の
発現を高めるように改変されてなる組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 改変されるＤＮＡ配列部分が、リボソー
ム結合部位である請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項３】 改変されるＤＮＡ配列部分が、プロモー
タ配列である請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 プロモータ配列が、発現可能な他のプロ
モータ配列で交換されている請求項３記載の組換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】 他のプロモータ配列が、バチルス属菌の
染色体ＤＮＡ由来またはバチルス属菌のファージ由来の
プロモータ配列である請求項４記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】 バチルス属菌がバチルス・ズブチリス
（Ｂacillus subtilis)である請求項５記載の組換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項７】 バチルス・ズブチリス（Ｂacillus subt
ilis）がバチルス・ズブチリス（Ｂacillus subtilis）
Ｎo.１１５である請求項６記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項１、２、３、４、５、６または７
記載の組換えＤＮＡが組み込まれたベクター。 - 【請求項９】 請求項１、２、３、４、５、６または７
記載の組換えＤＮＡあるいは請求項８記載のベクターで
形質転換された核酸関連物質を生産する能力を有するバ
チルス属菌。 - 【請求項１０】 バチルス・ズブチリス（Ｂacillus su
btilis）である請求項９記載のバチルス属菌。 - 【請求項１１】 バチルス・ズブチリス（Ｂacillus su
btilis）がバチルス・ズブチリス（Ｂacillus subtili
s）ＢＭ３０３２である請求項１０記載のバチルス属
菌。 - 【請求項１２】 請求項９記載のバチルス属菌を培地に
培養し、核酸関連物質を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする核酸関連物質の製造法。 - 【請求項１３】 バチルス属菌がバチルス・ズブチリス
（Ｂacillus subtilis）である請求項１２記載の製造
法。 - 【請求項１４】 バチルス・ズブチリス（Ｂacillus su
btilis）がバチルス・ズブチリス（Ｂacillus subtili
s）ＢＭ３０３２である請求項１３記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16161291A JPH05192164A (ja) | 1990-07-03 | 1991-07-02 | 組換えｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-176632 | 1990-07-03 | ||
| JP17663290 | 1990-07-03 | ||
| JP16161291A JPH05192164A (ja) | 1990-07-03 | 1991-07-02 | 組換えｄｎａおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192164A true JPH05192164A (ja) | 1993-08-03 |
Family
ID=26487681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16161291A Withdrawn JPH05192164A (ja) | 1990-07-03 | 1991-07-02 | 組換えｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192164A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
-
1991
- 1991-07-02 JP JP16161291A patent/JPH05192164A/ja not_active Withdrawn
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8236531B2 (en) | 2006-04-24 | 2012-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8409563B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
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