KR20180006579A

KR20180006579A - 생물전환공정을 이용한 2'-데옥시시티딘의 제조방법

Info

Publication number: KR20180006579A
Application number: KR1020160086971A
Authority: KR
Inventors: 임근조; 노갑수; 김병균; 최강현
Original assignee: 에스티팜 주식회사
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2018-01-18
Also published as: KR101877120B1

Abstract

본 발명은 2'-데옥시시티딘(2'-deoxycytidine)의 제조 방법에 관한 것으로서, 티미딘(thymidine)을 출발물질로 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제(N-deoxyribosyltransferase)를 과 발현 시킨 대장균 균체를 사용하여 2-데옥시리보스(2-deoxyribose)를 시토신(cytosine)에 전이하는 효소합성법에 의한 2'-데옥시시티딘의 효율적 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 대장균 고유의 시토신 탈아민효소(cytosine deaminase)와 시티딘 탈아민효소(cytidine deaminase) 유전자를 분자생물학적으로 제거하여 제작한 대장균을 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과 발현시키기 위한 숙주로 사용함으로써 반응의 출발물질인 시토신과 생성물인 2'-데옥시시티딘의 탈 아민 반응을 원천적으로 억제함에 따라 부반응에 의한 불순물 없이 우수한 전환률을 특징으로 하는 2'-데옥시시티딘의 제조방법에 관한 것이다.

Description

생물전환공정을 이용한 2'-데옥시시티딘의 제조방법{Process for preparing 2'-Deoxycytidine using bioconversion}

본 발명은 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 사용한 하기 화학식 1의 2'-데옥시시티딘의 제조방법에 관한 것이다. 2'-데옥시시티딘 및 그 유사체 화합물은 항바이러스 의약품, 항암 의약품 또는 안티센스 의약품 등의 원료로서 사용된다.

[화학식 1]

뉴클레오시드(nucleoside)는 뉴클레오티드(nucleotide)에서 인산(phosphate)을 제외한 염기(base)와 오탄당(ribose or deoxyribose)로 구성된다. 이는 데옥시리보 핵산(deoxyribonucleic acid; DNA)이나 리보 핵산(ribonucleic acid; RNA)을 이루는 원료가 되는 물질로써 뉴클레오시드 유사체 의약품, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 약물(안티센스(antisense), 앱타머(aptamer), siRNA, micro-RNA 등), 유전자 칩, PCR(Polymerase Chain Reaction), 게노믹스(genomics) 등의 분야에 상업화하여 사용되고 있다.

생체 내에 존재하는 천연형 뉴클레오시드는 염기에 따라 5종류로 구분되며 또한 오탄당의 2'에 하이드록실(hydroxyl) 그룹 유무에 따라 데옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside)와 리보뉴클레오시드(ribonucleoside) 두 종류로 구분된다. 데옥시뉴클레오시드의 다양한 유기합성 제조방법이 개발되어짐에 따라 티미딘(thymidine) 및 2'-데옥시우리딘(2'-deoxyuridine)은 비교적 저가에 효율적으로 제조할 수 있게 되었으나, 2'-데옥시아데노신(2'-deoxyadenosine), 2'-데옥시구아노신(2'-deoxyguanosine) 및 2'-데옥시시티딘(2'-deoxycytidine)의 경우 상대적으로 긴 공정단계와 낮은 수율로 인해 제조비용이 높아지고 또한 품질면에서도 문제점이 드러나 이를 대체할 수 있는 가장 효율적인 방법으로 효소를 사용한 생물전환방법의 필요성이 요구되어져 왔다(Boryski J., 2008, Curr. Org. Chem., 12:309-325, Condezo. L. A., et al., Enzymatic Synthesis of Modified Nucleoside, 2007, p. 401-423).

이러한, 2'-데옥시시티딘의 산업적 제조를 위한 효소적 방법으로는 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제(N-deoxyribosyltransferase, EC 2.4.2.6)에 의한 당 전이 방법과 뉴클레오시드 포스포릴라아제(nucleoside phosphorylase, EC 2.4.2.1)에 의한 당 전이 방법이 사용될 수 있다. 이 중에서, 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의한 2'-데옥시시티딘의 효소적 제조방법은 2-데옥시리보스-1-인산(2-deoxyribose-1-phosphate)과 시토신(cytosine)의 두 기질간의 N-글리코시딕 결합(N-glycosidic linkage)으로 설명할 수 있다(U.S Pat. No. 6,858,721). 그러나 2-데옥시리보스-1-인산은 비교적 고가의 원료이며, 2-데옥시리보스(2-deoxyribose)와 인산(phosphate)으로 쉽게 분해되는 단점을 갖고 있다(U.S. Pat. No. 6,620,596). 이에 반하여, N-데옥시리보실트랜스퍼라아제는 시토신을 포함하여 아데닌(adenine) 및 2,6-디아미노푸린(2,6-diaminopurine)등의 염기와 저가의 공급이 용이한 티미딘을 사용하여 당 전이 반응이 가능하다는 장점이 있다. 이러한 예로 Okuyama 등(K. Okuyama, et. al, 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:989-995)은 5ml의 반응액에 0.25mmol(50mM)의 티미딘, 0.25mmol(50mM)의 시토신과 0.595 unit의 Lactobacillus helveticus ATCC 8018 유래 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 무세포추출물을 첨가하여 pH 6.4 및 40℃ 조건에서 20시간 반응결과 49.8%의 몰 수율로 0.1245mmol의 2'-데옥시시티딘을 효소전환한 사실을 보고한 바 있다. 또한, 일본 공개특허 2002-51781에서는 1ml의 반응액에 20umol(20mM)의 2'-데옥시우리딘(2'-deoxyuridine), 20umol(20mM)의 시토신과 Lactobacillus helveticus ATCC8018 유래의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 사용하여 제작한 재조합 대장균(JM09[pTrc-T2F4]) 배양액 2.5㎕ 상당한 무세포 추출물을 첨가하여 37℃조건에서 18시간 반응결과 65%의 몰 수율로 13.5umol의 2'-데옥시시티딘을 효소전환 한 사실을 보고한 바 있다.

그러나, 이처럼 개발된 방법은 2'-데옥시시티딘의 효소전환율이 낮고(티미딘 기준 49.8%, 2'-데옥시우리딘 기준 65% 몰 수율), 주 원료인 티미딘이나, 2'-데옥시우리딘의 낮은 농도(20~50mM)조건에 의해 설비 효율성이 저하되며, 재조합 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 추출과정이 별도로 필요하다는 등의 문제점이 있었다. 특히, 재조합 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 추출과정이 별도로 필요하다는 등의 문제점이 있으며 이는 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 숙주 미생물로 사용한 대장균 유래의 시티딘 탈아민효소(cytidine deaminase)와 시토신 탈아민효소(cytosine deaminase)에 의해 기질인 시토신과 생성물인 2'-데옥시시티딘이 각각 우라실(uracil)과 2'-데옥시우리딘(2'-deoxyuridine)으로 탈아민 반응을 최소화 하기 위함일 것으로 추정한다. 일본 공개특허 2002-51781에서는 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 무세포 추출물을 효소원으로 사용 시 반응시간이 길지 않아 상기 부산물이 관찰되지 않았다고 주장하나, 무세포 추출물을 제작한다 하더라도 숙주대장균에서 유래하는 탈아민효소를 완전히 제거할 수는 없으며, 이는 산업적 공정에 적용 시 공정 안정성에 위험성을 갖는 요인이므로 반드시 개선해야 할 부분이다. 2'-데옥시시티딘의 제조에 있어서, 특히 의약품의 제조를 위한 경우에 미량의 부산물의 혼합되는 것은 정제단계에서의 부담을 주어 최종적으로 제품 회수율을 저하시키므로 이러한 목적으로 효소 조제물로부터 탈 아민 효소의 활성을 완전히 제거하여야만 한다. 이러한 탈아민 부 반응을 억제하기 위한 노력으로 미생물을 20시간동안 60℃ 열처리하여 시티딘 탈아민효소의 활성을 제거 후 90% 농도의 메탄올에서 1시간 추가 처리하여 시토신 탈아민효소의 활성을 제거하였다는 보고가 있다(U.S. Pat. No. 6,858,721). 하지만 이러한 열처리 및 유기용매 처리방법은 필연적으로 공정기간 장기화 및 균체 회수의 어려움이 있으며, 탈 아민효소의 활성을 100% 제거할 수도 없는 문제점이 있다. 한편 한국 공개특허 2015-0131501에서는 대장균의 시티딘 탈아민효소 유전자(cytidine deaminase gene, cdd)와 시토신 탈아민효소 유전자(cytosine deaminase gene, cod)를 제거하여 발효 시 부산물인 2'-데옥시우리딘 및 우라실의 생성량이 뚜렷히 감소되었다고 보고한 바 있다. 하지만 이러한 대사공학적 균주개발 노력에도 불구하고 발효에 의한 2'-데옥시시티딘의 생산능력은 52시간 발효 시 577mg/L에 불과하며 배양액 내에는 여전히 2'-데옥시우리딘, 우라실등을 포함한 핵산 성분과 배지성분이 다량 잔존함에 따라 산업적으로 적용하기에는 부적합하다. 또한 시티딘 탈아민효소 유전자와 시토신 탈아민효소 유전자의 제거를 생물전환효소의 숙주인 대장균에 적용하여 그 효과를 확인한 자료는 찾을 수 없으므로 상기 두 가지 유전자의 제거 만으로 2'-데옥시우리딘과 우라실을 포함하는 부산물의 생성을 완전히 제거할 수 있는지는 알 수 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 2'-데옥시시티딘을 보다 효율적으로 제조하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 탈아민 반응을 유도하는 시티딘 탈아민효소 유전자와 시토신 탈아민효소 유전자를 제거한 숙주 대장균에 Lactobacillus delbrueckii KCCM35470의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과발현시키는 재조합 대장균에 의한 생물전환공정을 이용할 경우, 2'-데옥시시티딘을 부 반응에 의한 불순물 없이 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산업적으로 저가로 공급이 용이한 티미딘과 시토신을 기질로 하여 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 반응을 통해 높은 전환률의 2'-데옥시시티딘의 생물전환조건을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 추가적인 목적은 미생물 균체 혹은 재조합 미생물을 생 촉매로 사용 시 생성되는 시토신 염기의 탈 아민 부반응 원천적으로 제거하여 불필요한 부산물의 생성이 이루어지지 않도록 하는 것이다.

본 발명은 (a) 시티딘 탈아민효소 및 시토신 탈아민 효소 활성이 제거된 대장균을 유전자 재조합 숙주세포로 사용하고, 상기 숙주세포에 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 유래 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환체를 제작하는 단계; 및 (b) 상기 제작된 형질전환체의 배양을 통해 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 발현시켜 수득한 균체에 기질인 티미딘과 시토신을 부가하여 반응시킴으로써, 하기 화학식 1의 2'-데옥시시티딘을 제조하는 단계를 포함하는 2'-데옥시시티딘의 제조 방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명자들은 상기의 목적을 달성하기 위해 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) KCCM35470 유래의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 DNA를 분리하고, 그 DNA를 포함하는 재조합 DNA를 제조하였다. 더불어 시티딘 탈아민효소 및 시토신 탈아민효소 유전자를 제거한 대장균을 제작한 후 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 포함하는 재조합 DNA를 도입하여 재조합 대장균을 제작하였다. N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과 발현한 재조합 대장균을 사용하여 티미딘과 시토신을 2'-데옥시시티딘으로 전환시켜 발명을 완성하였다(도 1).

N-데옥시리보실트랜스퍼라아제는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주에서 처음 발견되었고, 두 가지 class로 분류가 된다. class I은 두 개의 푸린(purine)사이에서 데옥시리보스의 전달반응을 촉매하고, class II는 염기의 구별없이 데옥시리보스의 전달반응을 촉매한다. N-데옥시리보실트랜스퍼라아제는 대부분 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 아에로코커스(Aerococus) 속 등과 같은 유산균 계열의 세균에서 주로 발견되어왔다. 이들 중 유전자 염기서열을 포함하여 비교적 연구가 많이 진행된 미생물로는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 레이크마니(Lactobacillus leichmanii) 등이 있으며 데옥시리보스의 전달반응 시 베타-아노머(β-anomer)만을 생성한다는 보고가 있다(N. Hicks, et. al 1992. Antiviral Chem. Chemother., 3:153-156).

생물전환효소로 사용되는 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제는 분리 정제된 효소, N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 활성을 갖는 미생물균체 또는 미생물균체의 처리물로 이루어진 그룹에서 선택되어질 수 있다.

본 발명에서는 문헌 검색결과 효소활성이 가장 우수하다고 알려진락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 선택하여 사용하였으나(W. S. Beck, M. Levin, 1963. J. Biol. Chem., 1963, 238:702-709) 티미딘에서 2'-데옥시시티딘을 생성할 수 있는 활성을 가지고 있으면 어떠한 종류 및 기원의 것이어도 상관없다. 예를 들어, 본 발명에서는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자로부터 발현되거나 또는 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성된 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 사용하였다.

최근의 분자 생물학 및 유전자 공학의 진보에 의해 미생물 유래 특정 효소의 분자 생물학적인 성질 또는 아미노산 서열 등을 해석함으로써 그 효소를 코딩하는 유전자를 미생물로부터 취득하여 유전자 및 발현에 필요한 제어 영역이 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하고, 이것을 임의의 숙주에 도입한 유전자 재조합균을 만들어 내는 것이 가능해지고, 또한 비교적 용이해지기도 하였다. 이러한 기술 수준에 비추어 이러한 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자를 임의의 숙주에 도입한 유전자 재조합균도 본 발명의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 발현하고 있는 미생물에 포함되는 것으로 한다.

여기에서 말하는 발현에 필요한 제어 영역이란 프로모터 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다), 리보좀 결합 서열(SD 서열), 전사 종결 서열 등을 나타내고 있다. 프로모터 서열의 구체예로서는 대장균 유래의 트립토판오페론의 trp 프로모터, 락토스오페론의 lac 프로모터, 람다 파지 유래의 프로모터 또는 고초균 유래의 글루콘산 합성 효소 프로모터 (gnt), 알칼리 프로테아제 프로모터(apr) ·중성 프로테아제 프로모터(npr) α-아밀라제 프로모터(amy) 등을 들 수 있다. 또, tac 프로모터와 같이 독자적으로 개변·설계된 서열도 이용할 수 있다. 리보좀 결합 서열로서는 대장균 유래 또는 고초균 유래의 서열을 들 수 있지만 대장균이나 고초균 등의 목적으로 하는 숙주내에서 기능하는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 16S 리보좀 RNA의 3' 말단 영역에 상보적인 서열이 4염기 이상 연속된 콘센서스 서열을 DNA 합성에 의해 제조하여 이것을 이용하여도 좋다. 전사종결 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만 ρ 인자 비의존성인 것, 예를 들면 리포프로테인 터미네이터, trp 오페론 터미네이터 등을 이용할 수 있다. 이들 제어 영역의 재조합 플라스미드상에서의서열 순서는 5' 말단측 상류부터 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열, N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자, 전사종결 서열의 순으로 배열하는 것이 바람직하다.

여기에서 말하는 플라스미드의 구체예로서는 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, pSC101 또는 고초균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1ㅡ φ105 등을 벡터로서 이용할 수가 있다. 또한, 2종류 이상의 숙주내에서의 자율 복제가 가능한 플라스미드의 예로서 pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7을 벡터로서 이용할 수가 있다. 본 발명에서는 당사에서 제조한 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)를 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 발현시키기 위한 벡터로 이용하였다.

여기에서 말하는 임의의 숙주로는 후술하는 실시예와 같이 대장균(Escherichia coli)이 일반적이지만 특별히 대장균으로 한정되는 것은 아니며, 고초균(Bacillus subtilis) 등의 바실루스속균, 효모나 방선균 등의 다른 미생물 균주도 포함된다. 본 발명에서는 앞서 언급한 대장균 유래의 탈아민 효소에 의한 기질로 사용되는 시토신과 생물전환에 의해 생성된 2'-데옥시시티딘의 탈 아민반응을 막기 위한 원인규명 연구를 수행하였다. 그 결과, 시토신과 2'-데옥시시티딘의 탈아민 반응을 매개하는 효소가 각각 시토신 탈아민효소와 시티딘 탈아민효소임을 알았고, 두 효소를 코딩하는 유전자를 제거한 대장균을 재조합 대장균의 숙주로 사용할 경우 2'-데옥시시티딘의 생물전환 반응에서 불필요한 탈 아민 반응이 완전히 제거되고, 이에 따라, 2'-데옥시시티딘의 제조수율이 증가되며, 반응 후 불순물의 발생량이 최소화 되어 후속 정제에 유리함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 용어 "시티딘 탈아민효소(cytidine deaminase)"란, 시티딘 탈아미노효소라고도 호칭되는 가수분해 효소의 일종으로서, 시티딘의 C4위치의 아미노기를 탈락시킴으로서, 시티딘을 우리딘으로 변환시키는 효소를 의미한다. 상기 시티딘 탈아민효소의 유전자 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 대장균에서 제거한 시티딘 탈아민효소 유전자 서열은 NCBI GenBank Acession NO. AP009048.1, 염기번호 2235178에서 2236062까지이다.

본 발명의 용어 "시토신 탈아민효소(cytosine deaminase)"란, 시토신 탈아미노효소라고도 호칭되는 가수분해 효소의 일종으로서, 시토신과 물을 반응시켜 우라실과 아민을 생성하는 효소를 의미한다. 상기 시토신 탈아민효소 유전자의 서열정보는 미국 국립생물정보센터 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 시토신 탈아민효소 유전자 서열은 NCBI GenBank Acession NO. AP009048.1, 염기번호 355395에서 356678까지 이다.

본 발명에서는 시티딘 디아미나아제 유전자와 시토신 디아미나아제 유전자가 제거된 대장균에 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 발현시킬수 있는 유전자를 도입하였으며, 상기 형질전환체를 E. coli E205라 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터 (Korea culture center of microorganisms, KCCM)에 기탁하였다(기탁번호 KCCM11792P).

본 발명에서의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 또는 이 효소 활성을 갖는 미생물로서는 효소 활성을 갖는 미생물 균체 및 균체 처리물 또는 이들의 고정화물 등을 사용할 수 있다. 균체 처리물이란, 예를 들면 아세톤 건조균체 나 기계적 파괴, 초음파 파쇄, 동결 융해 처리, 가압 감압 처리, 침투압 처리, 자기 소화, 세포벽 분해 처리, 계면 활성제 처리 등에 의해 제조한 균체 파쇄물 등이고, 또한 필요에 따라 황산암모늄 침전 또는 아세톤 침전, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제를 거듭한 것을 이용할 수도 있다.

본 발명에서는 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 활성을 갖도록 형질을 전환한 재조합 대장균 균체인 E coli E205를 증식 가능한 배지안에서 증식시키고 균체내에 상기 효소가 대량으로 축적할 때까지 배양을 수행한다. 형질전환체의 배양은 탄소원, 질소원 등의 미생물의 증식에 필요한 영양원을 함유하는 배지를 이용하고 일정한 규칙에 따라 수행하면 좋다. 예를 들어 LB배지 등의 대장균 배양에 상용되고 있는 배지를 이용해 37℃의 배양온도에서 필요에 따라 통기교반을 통해 배양 할 수 있다. 배양 중 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 발현을 유도하기 위해 이소프로필-β-D-티오 갈락토피라노시드를 적당 양 첨가한다. 이와 같이 해 조제한 배양물로부터 막 분리 혹은 원심분리 처리 등에 의해 균체를 회수하여 그 자체를 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 효소원으로 이용하였다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 티미딘과 시토신을 2'-데옥시시티딘과 티민으로의 최적의 생물전환 조건을 제공한다.

실시예에서 후술하듯이, 본 발명의 2'-데옥시시티딘의 제조를 위한 최적의 생물전환 조건은 총 반응액 기준 2.5 내지 20 g/L 농도의 E. coli E205 습균체를 사용하여, 바람직하게는 0.5M 이상, 보다 바람직하게는 0.5~1.4M, 가장 바람직하게는 1M 농도가 되도록 티미딘과 시토신을 정제수에 현탁시키고 바람직하게는 30~40℃, 보다 바람직하게는 35℃의 온도 조건하에서 바람직하게는 pH 5.5~6.5, 보다 바람직하게는 pH 5.5 조건에서 반응하는 것이며, 상기 조건 하에 바람직하게는 1시간 이상, 보다 바람직하게는 5시간 동안 반응시킨 후 전환율을 평가한 결과, 약 76.8%의 전환율로 티미딘이 2'-데옥시시티딘으로 전환되었음을 확인하였다.

본 발명은 2'-데옥시시티딘의 생물전환효소로써 시티딘 탈아민효소 및 시토신 탈아민효소의 유전자가 제거된 숙주 대장균을 사용하여 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과 발현 시킨 균체의 제조방법을 제시한다. 2'-데옥시시티딘을 제조함에 있어 이러한 균체를 사용함으로써 반응에 사용되는 기질인 시토신과 생성물인 시티딘의 탈아민 반응을 원천적으로 제거할 수 있었다.

또한, 본 발명은 2'-데옥시시티딘을 제조하기 위한 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 최적 반응 조건 연구를 통해, 기존 공지된 2'-데옥시시티딘의 효소 전환률 보다 현저히 우수한 전환율(75% 이상)을 갖는 반응 조건을 제시하였다.

따라서, 산업적으로 저가에 공급이 가능한 티미딘과 시토신을 기질로 하여 우수한 효소 전환율로 기질 및 생성물의 분해가 없는 2'-데옥시시티딘의 산업적 제조방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 2'-데옥시시티딘의 제조과정의 개요를 나타내는 개략도이다.
도 2는 시티딘 탈아민효소 유전자에 FRT 카세트(cassette)가 삽입됨을 나타내는 전기영동 사진 및 개략도로서, (a)는 cdd-F 와 cdd-R 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이고, (b)는 cdd-F 와 cdd-FRT-R 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이며, (c)는 시티딘 탈아민효소 유전자에 FRT 카세트가 삽입됨을 보여주는 개략도이고, (d)는 E. coli JM109의 시티딘 탈아민효소 유전자의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 3은 FRT 카세트를 사용하여 시티딘 탈아민효소 유전자를 제거 후 FRT 카세트를 다시 제거한 결과를 나타내는 전기영동 사진 및 개략도로서, (a)는 cdd-F 와 cdd-R 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이고, (b)는 시티딘 탈아민효소 유전자에 FRT 카세트가 제거됨을 보여주는 개략도이며, (c)는 E. coli JM109의 시티딘 탈아민효소 유전자의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 4는 시토신 탈아민효소 유전자에 FRT 카세트(cassette)가 삽입됨을 나타내는 전기영동 사진 및 개략도이다.
도 5는 FRT 카세트를 사용하여 시토신 탈아민효소 유전자를 제거 후 FRT 카세트를 다시 제거하였음을 나타내는 전기영동 사진 및 개략도로서, (a)는 cod-F 와 cod-R 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이고, (b)는 시토신 탈아민효소 유전자에 FRT 카세트가 제거됨을 보여주는 개략도이며, (c)는 E. coli JM109/△cdd의 시토신 탈아민효소 유전자의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 6은 실시예 1-3의 HPLC 분석차트로서, (A)는 시토신과 E. coli JM109를 반응한 결과 탈아민현상에 의해 우라실이 생성됨을 나타내고, (B)는 2'-데옥시시티딘과 E. coli JM109를 반응한 결과 탈아민현상에 의해 2'-데옥시우리딘이 생성되고, 대장균 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의해 상기 생성된 2'-데옥시우리딘이 우라실과 2-데옥시리보오스로 분해됨을 나타내며, (C)는 시티딘 탈아민효소가 제거된 대장균에서 시토신의 탈아민효소 활성을 확인한 결과이고, (D)는 시티딘 탈아민효소가 제거된 대장균에서는 시티딘의 탈아민 활성이 제거되지만, 대장균 유래의 뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의해 시토신이 일부 생성되고, 이에 의하여 우라실이 생성됨을 나타내며, (E) 및 (F)는 두 가지 효소가 모두 제거된 경우에, 시토신과 2'-데옥시시티딘의 탈아민 반응이 수행되지 않음을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 사용된 발현 벡터 pFRPT-NDT의 구조를 나타내는 벡터맵이다.
도 8은 본 발명의 형질전환체에 시토신과 티미딘을 가하고 pH 5.5로 적정한 다음, 35℃에서 5 시간 동안 반응시켜서 제조한 2'-데옥시시티딘의 수준을 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 차트이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 시티딘 탈아민효소와 시토신 탈아민효소 유전자 제거 균주 제조

실시예 1-1: 시티딘 탈아민효소 유전자 제거 균주 제조

N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과 발현시킬 숙주 대장균의 시티딘 탈아민효소 및 시토신 탈아민효소 활성을 제거하기 위해 먼저 시티딘 탈아민효소 유전자(cdd, Genebank Accession 번호 제 AP009048.1호, 코딩영역은 염기번호 2235178에서 2236062)를 넉아웃(knock-out)시킴으로써, 시티딘 탈아민효소 유전자가 결손된 돌연변이(이하 JM109/△cdd로 기재) 대장균 균주를 제작하였다.

유전자 제거 변이주 제작은 Gene Bridges 사(독일, www.genebridges.com)의 Quick & Easy E. coli gene deletion kit(cat. no. K006)를 이용하여 Red/ET 재조합(recombination) 시스템을 사용하였다. 총 855 bp의 시티딘 탈아민효소 유전자의 일부분(154~732 bp, 총 579 bp)을 제거하여 시티딘 탈아민효소의 활성을 제거하기 위해 시티딘 탈아민효소 유전자 서열 104~153 bp(총 50 bp)와 733~782 bp(총 50 bp)를 사용하여 하기 유전자 제거 프라이머(gene deletion primers)를 제작하였다.

cdd-FRT-F:

5'-gggagcaagtctcatcgctgaagagcgcaacggggctggacgaagacgcgAATTAACCCTCACTAAA GGGCGG-3'(서열번호 1)

cdd-FRT-R:

5'-accgcgcgctggatatccgggtaatcataacccttgagattcaacagaatTAATACGACTCACTATAG GGCTC-3'(서열번호 2)

상기 소문자는 시티딘 탈아민효소 유전자 염기서열을 나타내고, 대문자는 FRT 염기서열을 나타낸다.

상기 프라이머 세트(primer set, cdd-FRT-F 와 cdd-FRT-R)를 사용하고 FRT-neo-FRT 카세트(cassette)을 주형으로 Phusion DNA Polymerase(Thermo Fisher 사, 미국, www.fishersci.com, cat. n. F534S)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 Red/ET 재조합효소(recombinase)을 발현하는 pRedET 벡터(vector)가 형질전환된 E. coli JM109 균주(strain)에 전기천공법(electroporation)으로 형질전환한 후 카나마이신(kanamycin) 저항성 균주만을 선택하였다. 이 내성 균주는 시티딘 탈아민효소 유전자 부위에 FRT-neo-FRT 카세트가 삽입된 상태임을 PCR 단편의 염기서열 분석으로 확인할 수 있었다. 염기서열 확인에 사용한 하기 프라이머 세트는 시티딘 탈아민효소 유전자의 5' 과 3' 말단의 유전자 염기서열을 사용하여 제작하였다.

cdd-F: 5'-atgcatccacgttttcaaaccg-3'(서열번호 3)

cdd-R: 5'-ttaagcgagaagcactcggt-3'(서열번호 4)

추가적으로, cdd-FRT-R을 사용하여 재확인 하였다(도 2). 상기 균주에서 FRT-neo-FRT 카세트 부위(region)를 제거한 균주 제작을 위해 FLPe 재조합효소(recombinase) 발현 벡터(707-FLPe)를 다시 형질전환한 후 카나마이신 내성이 제거된 균주(JM109/△cdd)를 선택하였다. 그리고, 카나마이신 내성이 제거된 균주(JM109/△cdd)에서 FRT-neo-FRT 카세트가 제거된 것을 프라이머(primer)(cdd-F와 cdd-R)를 사용하고 JM109/△cdd 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 염기서열 분석에서 예상한 대로 시티딘 탈아민효소 유전자 내의 579 bp의 염기서열이 제거되고 일부 FRT 서열이 포함된 306 bp의 염기서열만 남아있었다(도 3).

실시예 1-2: 시티딘 탈아민효소 유전자 제거 균주에서 시토신 탈아민효소 유전자의 제거

상기 실시예 1-1에서 제작한 JM109/△cdd 균주의 시토신 탈아민효소 유전자(cod, Genebank Accession 번호 제 AP009048.1호, 코딩영역은 염기번호 355395에서 356678)를 넉아웃(knock-out)시킴으로써, 시토신 탈아민효소 유전자가 추가적으로 결손된 돌연변이(이하 JM109/△cdd, △cod로 기재) 대장균 균주를 제작하였다.

총 1284 bp의 시토신 탈아민효소 유전자의 일부분(111~1187 bp, 총 1078 bp)을 제거하여 시토신 탈아민효소의 활성을 제거하기 위해 시토신 탈아민효소 유전자 서열 61~110bp(총 50bp)와 1188~1238bp(총 50bp)를 사용하여 하기 유전자 제거 프라이머를 제작하였다.

cod-FRT-F:

5'-gggagcaagtctcatcgctgaagagcgcaacggggctggacgaagacgcgAATTAACCCTCACTAAA GGGCGG-3'(서열번호 5)

cod-FRT-R:

5'-gtttgtgccggttgtgtgctggcaatcaccttgccgccacgtaccgaataTAATACGACTCACTATA GGGCTC-3'(서열번호 6)

상기 프라이머 세트(primer set, cod-FRT-F 와 cod-FRT-R)를 사용하고 FRT-neo-FRT 카세트(cassette)을 주형으로 Phusion DNA Polymerase를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 Red/ET 재조합효소를 발현하는 pRedET 벡터가 형질전환된 JM109/△cdd 균주에 전기천공법으로 형질전환한 후 카나마이신 저항성 균주만을 선택하였다. 이 내성 균주는 시토신 탈아민효소 유전자 부위에 FRT-neo-FRT 카세트가 삽입된 상태임을 PCR 단편의 염기서열 분석으로 확인할 수 있었다. 염기서열 확인에 사용한 프라이머 세트는 시토신 탈아민효소 유전자의 5' 말단의 유전자 염기서열을 이용하여 제작한 하기 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 사용하였다(도 4).

cod-F: 5'-gtgtcgaataacgctttaca-3'(서열번호 7)

상기 균주에서 FRT-neo-FRT 카세트 부위(region)를 제거한 균주 제작을 위해 FLPe 재조합효소(recombinase) 발현 벡터(707-FLPe)를 다시 형질전환한 후 카나마이신 내성이 제거된 균주(JM109/△cdd, △cod)를 선택하였다. 그리고, 카나마이신 내성이 제거된 균주(JM109/△cdd, △cod)에서 FRT-neo-FRT 카세트가 제거된 것을 프라이머(primer)(cod-F와 cod-R)를 사용하고 JM109/△cdd, △cod 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 염기서열 분석에 사용한 프라이머 중 하기 서열번호 8의 프라이머는 시토신 탈아민효소의 종결코돈을 포함하여 제작하였다.

cod-R : 5'-tcaacgtttgtaatcgatgg-3'(서열번호 8)

염기서열 분석에서 예상한 대로 시토신 탈아민효소 유전자 내의 1078 bp의 염기서열이 제거되고 일부 FRT 서열이 남아있는 327 bp의 염기서열만 남아있었다(도 5).

실시예 1-3: 시티딘 탈아민효소 유전자 제거 균주(JM109/△cdd) 및 시티딘 탈아민효소와 시토신 탈아민효소제가 모두 제거된 균주(JM109/△cdd, △cod)의 2'-데옥시시티딘과 시토신에 대한 탈아민 활성 확인

JM109, JM109/△cdd 및 JM109/△cdd, △cod의 배양에 사용한 배지조성은 하기 표 1과 같다.

배지의 조성

배지성분	농도
효모엑기스(Yeast extract, cat. # 288620, Difco, 미국, www.bdbiosciences.com)	1%
글리세린(Glycerine, cat. # 4066-4405, 대정화금, 한국, www.daejung.kr)	0.5%
염화나트륨(sodium chloride, cat. # 7548-4105, 대정화금, 한국, www.daejung.kr)	0.5%

상기 표 1의 배지 25ml이 담긴 3개의 250mL 삼각플라스크에 JM109, JM109/△cdd 및 JM109/△cdd, △cod를 각각 1백금이 접종하고 37 ℃ 에서 240rpm으로 하룻밤 동안 진탕 배양한 배양액 2mL씩을 상기 표 1의 배지 200mL이 들어있는 3개의 1L 삼각플라스크에 각각 무균적으로 접종 후 37 ℃에서 240rpm으로 8시간동안 진탕 배양하여 얻어진 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고 이를 20mL의 10mM 인산 완충액으로 세척하여 JM109, JM109/△cdd 및 JM109/△cdd, △cod 습균체를 회수하였다.

회수한 습균체의 시토신 및 2'-데옥시시티딘에 대한 탈아민 활성을 측정하기 위해 하기 표 2와 같이 6종의 반응액을 제조하여 3시간 동안 40℃ 항온수조에 정치반응을 하여 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 분석하였으며(도 6), 그 결과는 하기 표 3과 같다.

JM109/△cdd 및 JM109/△cdd, △cod의 탈 아민 활성 확인을 위한 반응액의 제조

	A	B	C	D	E	F
균주	JM109		JM109/△cdd		JM109/△cdd, △cod
시토신	10mM		10mM		10mM
2'-데옥시시티딘		10mM		10mM		10mM
기타	* 반응에 사용된 균체의 농도는 OD_600nm = 1 이 되도록 희석하여 투입 * 반응 부피는 1mL이며, 인산완충용액의 농도는 50mM이 되도록 함, pH 8)

JM109/△cdd 및 JM109/△cdd, △cod의 탈 아민 활성 분석

	A	B	C	D	E	F
균주	JM109		JM109/△cdd		JM109/△cdd, △cod
전환율	47%	99%	50%	0%	0%	0%

상기 표 3의 탈 아민 반응의 전환율은 아래와 같이 계산하였다.

전환율 = (반응 후 생성물의 농도 X 100) ÷ (반응에 투입한 기질 농도)

HPLC 분석은 하기 표 4의 조건에 의해 실시하였다.

HPLC 분석 조건

컬럼	Inertsil ODS-3(5μm, 직경 4.6mm, 길이 150mm, GL science사제)
이동상	10% 메탄올함유 10mM 인산칼륨 완충액(pH7.4)
검출	자외선 254nm

상기 시토신 및 2'-데옥시시티딘에 대한 유전자 조작균주의 탈 아민 반응 실험결과 본 발명자들의 예상대로 시티딘 탈아민 효소 유전자를 제거한 대장균을 첨가 시 시토신의 우라실로의 탈 아민 반응은 진행되나, 2'-데옥시시티딘의 2'-데옥시우리딘으로의 탈 아민 활성은 제거되었음을 확인 할 수 있었으며, 시티딘 탈아민효소 와 시토신 탈아민 효소 유전자를 모두 제거한 경우에는 시토신과 2'-데옥시시티딘에 대한 탈 아민 활성이 모두 사라졌음을 알 수 있었다. 비교예로 사용한 E. coli JM109의 경우 2'-데옥시시티딘이 모두 2'-데옥시우리딘으로 전환 된 후 E. coli JM109 유래의 뉴클레오시드 포스포릴라아제(nucleoside phosphorylase)에 의하여 2'-데옥시우리딘이 다시 우리딘과 2-데옥시리보스-1-인산(2-deoxyribose-1-phosphate)으로의 분해가 약 10% 정도 진행됨이 관찰되었다. 이와 대비하여 시티딘 탈아민효소 와 시토신 탈아민 효소 유전자를 모두 제거한 경우에는 2'-데옥시시티딘에서 시토신과 2-데옥시리보스-1-인산으로의 분해가 약 2% 정도 진행됨이 관찰되었다.

실시예 2. Lactobacillus delbrueckii KCCM35470 N- 데옥시리보실트랜스퍼라 아제 발현 균주 제조

당 전이(transglycosylation)에 사용할 Lactobacillus delbrueckii KCCM35470 유래 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과 발현하는 유전자 재조합 대장균은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

한국종균협회(한국, www.kccm.or.kr)에서 구입한 Lactobacillus delbrueckii KCCM35470 균주를 Lactobacilli MRS 배지(Lactobacilli MRS Broth, cat. # 288130, Difco, 미국, www.bdbiosciences.com) 3ml에 접종하여 에 접종하여 37℃, 200rpm, pH6.5 조건에서 하룻밤 동안 배양 한 후 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확한 미생물을 게놈 정제 키트(Genome purification kit, cat. # A1120, Promega, 미국, www.promega.com)을 사용하여 게놈 DNA를 분리 하였으며 이를 PCR의 주형으로 사용하였다.

Lactobacillus delbrueckii KCCM35470의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자를 클로닝하기 위해 사용된 프라이머는 Cook등이 보고한 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 아미노산 서열을 참고하여 설계하였으며(Cook, W.J., Short, S. A., Ealick, S. E., (1990) J. Biol. Chem. 265, 2682-2683), 각각의 서열은 다음과 같다.

NDT-f: 5'-TAYAARGARGCNATGGARGC-3'(서열번호 9)

NDT-r: 5'-GGYTTRTTRAARTTRAARTC-3'(서열번호 10)

NDT-start: 5'-GATGCCNAARAARACNAT-3'(서열번호 11)

NDT-stop: 5'-TTARTANACNGCNCCYTC-3'(서열번호 12)

NDT-3: 5'-CTTGGCTCAAGGCGTAAC-3'(서열번호 13)

N = A,G,T or C; R = A or G; Y = T or C

상기와 같이 설계한 올리고 뉴클레오타이드(oligo nucleotide)는 위탁제조사인 바이오닉스사(한국, www.bionicsro.co.kr)에서 제조하여 사용하였으며, N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자 유전자의 취득, 재조합 플라스미드 및 형질전환 미생물 제조에 필요한 조작은 [Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Sambrook J., Russell D. W., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001]에 기재된 방법에 따라 실시하였다.

N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 조건은 0.2ug의 게놈 DNA, 100pmol primer set, 200umol dNTPs, 5 unit Ex Taq polymerase(TaKaRa 사, 일본, www.takara-bio.com, cat. no. RR001A)를 100㎕의 반응용액[10mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.1% gelatin]에 넣고 94℃에서 5분간 게놈 DNA를 denaturation한 후, 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 72℃에서 30초의 조건으로 33회 PCR을 수행한 후 72℃에서 7분간 incubation 하였다.

먼저, NDT-f와 NDT-r 프라이머로 PCR을 수행하여 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자의 일부를 클로닝하고 이 PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열로부터 NDT-3라는 새로운 프라이머를 만들고, NDT-start와 NDT-3 primer를 이용하여 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자의 N-말단 부위를 클로닝 하였다. 상기 두 PCR 산물의 DNA 이중결합을 분리 및 재 결합하여 연결한 후 게놈 DNA와 함께 PCR의 주형으로 하여 NDT-start와 NDT-stop 프라이머를 이용하여 PCR하고, 이를 pKF3 벡터(TaKaRa 사, cat. no. 3100)의 SmaI 단일 절단자리에 클로닝하여(pKF3-NDT) 전체 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자를 확보하였다.

이어, 당사에서 제조한 대장균용 발현 벡터 pFRPT(대한민국 특허 제 0449639호)에 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자를 삽입하기 위해, 10 ㎍의 pFRPT를 10 U의 BglII(TaKaRa 사, cat. no. 1021A)와 10 U의 HindIII(TaKaRa 사, cat. no. 1060A)가 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 절단된 플라스미드를 아가로즈 젤 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 분석하여, 6.40 kbp의 절편을 파워 젤 추출 키트 (power gel extraction kit) (다인바이오사, 대한민국, 성남, www.dynebio.co.kr)을 사용하여 젤로부터 해당 DNA를 회수하였다.

한편, pKF3-NDT 10 ㎍을 10 U의 BamHI(TaKaRa 사, cat. no. 1010A)과 10 U의 HindIII가 함유된 반응액 20㎕에서 절단하고 상기와 같이 아가로스 전기영동법으로 분석하여 598bp의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자 절편을 파워 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 방법을 통해 얻은 두 DNA 절편을 3 U의 T4 DNA 리가아제(T4 DNA ligase, TaKaRa 사, cat. no. 2011A)와 1X 리가아제 완충액이 함유된 반응액에 첨가하여 16 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액으로 JM109 대장균 세포를 형질전환시킨 후 이를 배양하여 얻은 대장균 집락으로부터 플라스미드를 추출하고, 목적의 DNA 절편이 삽입된 플라스미드를 pFRPT-NDT라 명명하였다(도 7).

클로닝한 pFRPT-NDT의 염기서열을 확인하기 위하여 pFRPT의 클로닝 위치의 상류 및 하류의 염기서열을 바탕으로 하기 서열번호 14 및 15의 올리고 뉴클레오티드를 위탁제조사인 바이오닉스사(대한민국, 서울, www.bionicsro.co.kr)에서 제조하였다. 동일 업체에 pFRPT-NDT를 주형으로 상기의 올리고 뉴클레오티드를 이용한 염기서열 해독을 의뢰하여 서열번호 16의 염기서열을 갖는 유전자가 클로닝 되었음을 확인하였다.

pFRPT-F: 5'-GAGCGGATAACAATTCCCACC-3'(서열번호 14)

pFRPT-R: 5'-ACTCATCCGCCAAAACAGCCA-3'(서열번호 15)

이렇게 제조된 형질전환 균주를 E. coli E205라 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터 (Korea culture center of microorganisms, KCCM)에 기탁하였다(기탁번호 KCCM11792P).

한편, 서열번호 16의 유전정보를 분석한 결과 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 유전자(Genebank Accession 번호 제CP000156호, 코딩영역은 염기번호 158845에서 159318)와 97% (458bp/474bp)유전자 상동성을 가지며, 아미노산 서열 번역 분석 결과 Cook등이 보고한 Lactobacillus delbrueckii의 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제의 아미노산 서열(Cook, W.J., Short, S. A., Ealick, S. E., (1990) J. Biol. Chem. 265, 2682-2683, GenPept Accession 번호 제 1F8X_A호)과 100% (157/157) 일치함을 확인하였다. 비록 클로닝된 유전자의 5'-말단과 3'-말단은 degenerate PCR 프라이머를 사용한 관계로 Lactobacillus delbrueckii의 원래 염기서열은 다를 수 있으나 아미노산 서열은 동일함을 알 수 있었다.

실시예 3: E. coli E205 습균체의 제조

상기 표 1의 배지를 제조하고, 이 배지 200mL을 1L 삼각플라스크에 넣고, 멸균한 후 카나마이신의 농도가 25ug/mL이 되도록 첨가하고 상기 실시예 2에서 제조한 형질전환 균주 E. coli E205를 접종하여, 37℃에서 4시간 진탕 배양 후 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Carbosynth 사, 영국, www.carbosynth.com, cat. no. EI07011) 200ug/mL를 첨가하고, 10시간 진탕 배양 하였다.

배양액으로부터 균체의 회수는 고속 원심분리기(Beckman, 미국, www.beckmancoulter.com)에 JA-14 로터를 사용하여 4℃, 8000rpm으로 20분간 원심분리하여 회수하였으며 일주일 내 사용하는 경우는 4℃에 보관하고 장기 보관할 경우는 -20℃에 얼려 보관하였다.

실시예 4: 2 '- 데옥시시티딘의 최적 효소반응 조건 탐색

실시예 4- 1: 2 '- 데옥시시티딘 효소전환을 위한 최적 반응 pH 조건 탐색

3개의 100mL 삼각플라스크에 1.11g의 시토신(1.0M), 2.42g의 티미딘(1.0M), 10ml 정제수를 함유하는 기질용액에 투입하고 0.1g의 E. coli E205 습균체를 혼합 후 pH5.5~pH7.5로 pH 조건을 변화하여 40℃ 조건에서 17시간 동안 진탕 교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 2'-데옥시시티딘의 전환율은 하기 표 5와 같다.

2'-데옥시시티딘의 전환율

	1 시간 반응 후 전환율(%)	2 시간 반응 후 전환율(%)	17 시간 반응 후 전환율(%)
pH 5.5	70.14	72.86	73.49
pH 6.5	70.08	72.01	72.53
pH 7.5	63.23	63.91	64.85

2'-데옥시시티딘의 전환율은 아래와 같이 계산하였다.

(반응 후 2‘-데옥시시티딘의 몰 농도 X 100) ÷ (반응에 투입한 티미딘의 몰 농도)

상기 실험 결과 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 이용한 2‘-데옥시시티딘 생물전환의 최적 pH는 5.5임을 알 수 있었다.

실시예 4- 2: 2 '- 데옥시시티딘 효소전환을 위한 최적 기질 농도 조건 탐색

시토신과 티미딘의 기질 간 몰 비율을 1:1로 고정하여 4 개의 100mL 삼각플라스크에 시토신을 각각 0.56(0.5M), 1.11(1.0M), 1.33(1.2M), 1.56g(1.4M)씩 투입하고 여기에 티미딘을 각각 1.21(0.5M), 2.42(1.0M), 2.91(1.2M), 3.39g(1.4M)씩 투입하였다. 각 반응액은 염산을 사용하여 pH를 5.5로 조절 후 E. coli E205 습균체를 각각 0.05, 0.1, 0.12, 0.14g 씩 투입하여 기질 1 몰 당 E . coli E205 습균체 투입량이 10g이 되도록 하였고, 40℃ 조건에서 17시간 동안 진탕 교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 2'-데옥시시티딘의 전환율은 하기 표 6과 같다.

2'-데옥시시티딘의 전환율

기질농도	1 시간 반응 후 전환율(%)	2 시간 반응 후 전환율(%)	17 시간 반응 후 전환율(%)
0.5	70.26	72.12	73.29
1.0	71.07	72.69	73.43
1.2	70.93	72.45	73.31
1.4	70.86	72.57	73.28

상기 실험 결과 기질농도 0.5M 이상의 반응액에서 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제 반응의 속도 및 최대 전환률은 큰 차이가 없었다. 실제 산업화에 있어 설비 효율성을 고려 시 기질의 농도가 높을수록 유리한 측면이 있으나, 반응액의 교반성을 고려하여 이 후 기질의 농도는 1.0M로 정하였다.

실시예 4- 3: 2 '- 데옥시시티딘 효소전환을 위한 최적 기질 비율 조건 탐색

3개의 100mL 삼각플라스크에 2.42g의 티미딘(1.0M)와 10ml 정제수를 혼합한 용액을 투입하고 시토신을 1.11g(1.0M), 1.33g(1.2M) 및 1.56g(1.4M)로 변화하여 각각 투입하였다. 여기에 염산을 사용하여 pH5.5로 조절 후 0.1g의 E. coli E205 습균체를 각각 투입 후 40℃ 조건에서 17시간 동안 진탕 교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 2'-데옥시시티딘의 전환율은 하기 표 7과 같다.

2'-데옥시시티딘의 전환율

티미딘:시토신	1 시간 반응 후 전환율(%)	2 시간 반응 후 전환율(%)	17 시간 반응 후 전환율(%)
1:1	68.83	71.24	73.91
1:1.2	70.70	71.24	73.80
1:1.4	70.57	72.92	73.69

상기 실험 결과 티미딘 대비 시토신의 비율을 높여주어도 2'-데옥시시티딘으로의 전환속도 및 최종 전환율에 큰 차이가 없음을 알 수 있었고, 이 후 2'-데옥시시티딘 생물전환에는 티미딘 대비 시토신의 기질 비율을 1:1 비율로 결정하였다.

실시예 4- 4: 2 ‘- 데옥시시티딘 효소전환을 위한 최적 반응 온도 조건 탐색

5개의 100mL 삼각플라스크에 1.11g의 시토신(1.0M), 2.42g의 티미딘(1.0M), 10ml 정제수를 함유하는 기질용액을 각각 투입하고 염산을 사용하여 pH5.5로 조절하였다. 여기에 각각 0.1g의 E. coli E205 습균체를 혼합 후 35℃~50℃로 온도 조건을 변화하여 2 시간 동안 진탕 교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 2'-데옥시시티딘의 전환율은 하기 표 8와 같다.

2'-데옥시시티딘의 전환율

반응온도(℃)	2 시간 반응 후 전환율(%)
30	72.96
35	75.06
40	72.71
45	70.99
50	57.08

상기 실험 결과 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 이용한 2'-데옥시시티딘 생물전환의 최적 온도는 35℃임을 알 수 있었다.

실시예 4- 5: 2 ‘- 데옥시시티딘 효소전환을 위한 기질 대비 적정 효소 투입량 탐색

4개의 100mL 삼각플라스크에 1.11g의 시토신(1.0M), 2.42g의 티미딘(1.0M), 10ml 정제수를 함유하는 기질용액 투입 후 염산을 사용하여 pH5.5로 조절하였다. 여기에 E. coli E205 습균체의 무게를 0.025~0.2g(2.5~20g/L)으로 변화하여 각각 혼합 후 35℃에서 5 시간 동안 진탕 교반하였다. 반응액을 HPLC로 분석한 결과 2'-데옥시시티딘의 전환율은 하기 표 9와 같다.

2'-데옥시시티딘의 전환율

반응액 내 E. coli E205 습균체 농도(g/L)	2 시간 반응 후 전환율(%)	5 시간 반응 후 전환율(%)
2.5	68.00	69.77
5	75.26	75.83
10	75.29	76.21
20	75.31	76.18

상기 실험 결과 2'-데옥시시티딘 생물전환반응에 필요한 E. coli E205 습균체의 농도는 5g/L로 결정하였으며, 더 이상 습균체의 농도를 높이더라도, 최대 전환율을 더 이상 높일 수는 없음을 알 수 있었다.

실시예 5: 2 '- 데옥시시티딘의 효소전환

500mL 삼각플라스크에 22.94g의 시토신(1.0M), 50g의 티미딘(1.0M), 206mL의 정제수를 함유하는 기질용액 투입 후 염산을 사용하여 pH 5.5로 조절하였다. 여기에 E. coli E205 습균체 1g을 혼합 후 35℃에서 5시간 동안 진탕 교반한 후 HPLC로 분석한 결과 2'-데옥시시티딘의 전환율은 76.8%임을 확인하였다(도 8).

한국미생물보존센터

KCCM11792P

20151209

<110> ST Pharm Co., Ltd. <120> Process for preparing 2'-Deoxycytidine using bioconversion <130> KPA151385-KR <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggagcaagt ctcatcgctg aagagcgcaa cggggctgga cgaagacgcg aattaaccct 60 cactaaaggg cgg 73 <210> 2 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 accgcgcgct ggatatccgg gtaatcataa cccttgagat tcaacagaat taatacgact 60 cactataggg ctc 73 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgcatccac gttttcaaac cg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttaagcgaga agcactcggt 20 <210> 5 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gggagcaagt ctcatcgctg aagagcgcaa cggggctgga cgaagacgcg aattaaccct 60 cactaaaggg cgg 73 <210> 6 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtttgtgccg gttgtgtgct ggcaatcacc ttgccgccac gtaccgaata taatacgact 60 cactataggg ctc 73 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtgtcgaata acgctttaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcaacgtttg taatcgatgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tayaargarg cnatggargc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggyttrttra arttraartc 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gatgccnaar aaracnat 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttartanacn gcnccytc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cttggctcaa ggcgtaac 18 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gagcggataa caattcccac c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 actcatccgc caaaacagcc a 21 <210> 16 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant N-deoxyribosyltransferase <400> 16 atgcctaaga aaacgatcta cttcggtgcc ggctggttca ctgaccgcca aaacaaagcc 60 tacaaggaag ccatggaagc cctcaaggaa aacccaacga ttgacctgga aaacagctac 120 gttcccctgg acaaccagta caagggtatc cgggttgatg aacacccgga atacctgcat 180 gacaaggttt gggctacggc cacctacaac aacgacttga acgggatcaa gaccaacgac 240 atcatgctgg gtgtctacat ccctgacgaa gaagacgtcg gcctgggcat ggaactgggt 300 tacgccttga gccaaggcaa gtacgtcctt ttggtcatcc cggacgaaga ctacggcaag 360 ccgatcaacc tcatgagctg gggcgtcagc gacaacgtga tcaagatgag ccagctgaag 420 gacttcaact tcaacaagcc gcgcttcgac ttctacgagg gtgccgttta ttaa 474 <210> 17 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant N-deoxyribosyltransferase <400> 17 Met Pro Lys Lys Thr Ile Tyr Phe Gly Ala Gly Trp Phe Thr Asp Arg 1 5 10 15 Gln Asn Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Met Glu Ala Leu Lys Glu Asn Pro 20 25 30 Thr Ile Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Asp Asn Gln Tyr Lys 35 40 45 Gly Ile Arg Val Asp Glu His Pro Glu Tyr Leu His Asp Lys Val Trp 50 55 60 Ala Thr Ala Thr Tyr Asn Asn Asp Leu Asn Gly Ile Lys Thr Asn Asp 65 70 75 80 Ile Met Leu Gly Val Tyr Ile Pro Asp Glu Glu Asp Val Gly Leu Gly 85 90 95 Met Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Lys Tyr Val Leu Leu Val 100 105 110 Ile Pro Asp Glu Asp Tyr Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met Ser Trp Gly 115 120 125 Val Ser Asp Asn Val Ile Lys Met Ser Gln Leu Lys Asp Phe Asn Phe 130 135 140 Asn Lys Pro Arg Phe Asp Phe Tyr Glu Gly Ala Val Tyr 145 150 155

Claims

(a) 시티딘 탈아민효소 및 시토신 탈아민 효소 활성이 제거된 대장균을 유전자 재조합 숙주세포로 사용하고, 상기 숙주세포에 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 유래 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환체를 제작하는 단계; 및
(b) 상기 제작된 형질전환체의 배양을 통해 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과발현 시킨 후 수득한 균체에 기질인 티미딘과 시토신을 부가하여 반응시킴으로써, 하기 화학식 1의 2'-데옥시시티딘을 제조하는 단계를 포함하는 2'-데옥시시티딘의 제조 방법.

[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자로부터 발현되거나 또는 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 형질전환체는 기탁번호 KCCM11792P로 기탁된 형질전환 대장균인 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 반응의 기질인 티미딘과 시토신의 투입 농도가 0.5M 이상인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 반응은 pH 5.5 내지 pH 6.5 및 30℃ 내지 40℃의 조건에서 1시간 이상 수행하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 형질전환체에서 시티딘 탈아민효소 유전자와 시토신 탈아민효소 유전자가 제거되어, 원료인 시토신과 생성물인 2'-데옥시시티딘의 탈아민 반응이 방지되고, 이로 인하여 2'-데옥시시티딘의 제조수율이 증가되며, 반응 후 불순물의 발생량을 최소화 하는 것인, 방법.
시티딘 탈아민효소 및 시토신 탈아민 효소 활성이 제거된 대장균을 유전자 재조합 숙주세포로 사용하고, 상기 숙주세포에 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 유래 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자가 도입되어, 상기 N-데옥시리보실트랜스퍼라아제를 과 발현시킬 수 있는 형질전환체.
제7항에 있어서,
상기 형질전환체는 기탁번호 KCCM11792P로 기탁된 형질전환 대장균인 것인, 형질전환체.