JP2007068532A - デオキシリボヌクレオシド一リン酸からのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】デオキシリボヌクレオシド一リン酸(dNMP)のリン酸化によってデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)を製造する際に、
(1)ヌクレオシド一リン酸(NMP)キナーゼ遺伝子を有する組換えベクターを有し、かつ該遺伝子に基づくヌクレオシド一リン酸キナーゼを有する微生物形質転換体の存在下で、dNMPにATPを反応させてデオキシリボヌクレオシド二リン酸(dNDP)を得る第1のリン酸化工程と、
(2)ヌクレオシド二リン酸(NDP)キナーゼの存在下で、前記dNDPにATPを反応させてdNTPを得る第2のリン酸化工程と、
を有する方法を用いる。
【選択図】なし
Description
(1)ヌクレオシド一リン酸(NMP)キナーゼ遺伝子を有する組換えベクターを有し、かつ該遺伝子に基づくヌクレオシド一リン酸キナーゼを有する微生物形質転換体の存在下で、dNMPにATPを反応させてデオキシリボヌクレオシド二リン酸(dNDP)を得る第1のリン酸化工程と、
(2)ヌクレオシド二リン酸(NDP)キナーゼの存在下で、前記dNDPにATPを反応させてdNTPを得る第2のリン酸化工程と、
を有し、
前記第1のリン酸化工程において用いられるdNMPとNMPキナーゼ遺伝子とが、以下の(a)〜(d)のいずれか1つの組合せである
(a)デオキシアデノシン一リン酸とアデニレートキナーゼ遺伝子(adk)の組合せ、
(b)デオキシグアノシン一リン酸とグアニレートキナーゼ遺伝子(gmk)の組合せ、
(c)デオキシシチジン一リン酸とシチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)の組合せ、
(d)デオキシチミジン一リン酸とチミジレートキナーゼ遺伝子(tmk)の組合せ、
ことを特徴とするデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法である。
dAMP用:アデニレートキナーゼ
dGMP用:グアニレートキナーゼ
dCMP用:シチジレートキナーゼ
dTMP用:チミジレートキナーゼ
上記の各酵素をそれぞれの基質としてのdNMPに作用させることで、デオキシアデノシン二リン酸(dADP)、デオキシグアノシン二リン酸(dGDP)、デオキシシチジン二リン酸(dCDP)及びデオキシチミジン二リン酸(dTDP)をそれぞれ得ることができる。
(NMPキナーゼ遺伝子あるいはNDPキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成)
大腸菌由来のdNMPからdNTPへの変換に関わる遺伝子(adk, gmk, cmk, tmk, ndk)を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のadk塩基配列(GenBank accession No. X03038)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(adk(F)及びadk(R)(シグマジェノシスジャパン(株)で合成))によるPCR法を行い、アデニレートキナーゼ(adk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれXbaI(adk(F))及びHindIII(adk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
adk(R):5'−CTAAGCTTTATCCGGCCTGAGATTGC−3'(26mer)(配列番号:2)
PCRによるadk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(62℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のgmk塩基配列(GenBank accession No. M84400)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(g(F)及びg(R)(インビトロジェン(株)で合成))によるPCR法を行い、グアニレートキナーゼ(gmk)遺伝子を含む約1.0kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (g(F))及びHindIII(g(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
g(R):5'−TTAAGCTTGCAGCGCGATTACAGTGG−3'(26mer)(配列番号:4)
PCRによるgmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(56℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のcmk塩基配列(GenBank accession No. D90729)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ck(F)及びck(R)(シグマジェノシスジャパン(株)で合成))によるPCR法を行い、シチジレートキナーゼ(cmk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (ck(F))及びHindIII(ck(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
ck(R):5'−CGAAGCTTATTTAACGTCCACCTGGC−3'(26mer)(配列番号:6)
PCRによるcmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のtmk塩基配列(GenBank accession No. U41456)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(tk(F)及びtk(R)(シグマジェノシスジャパン(株)で合成))によるPCR法を行い、チミジレートキナーゼ(tmk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (tk(F))及びHindIII(tk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
tk(R):5'−ATAAGCTTAGCATCATCGCCCATGCC−3'(26mer)(配列番号:8)
PCRによるtmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(62℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のndk塩基配列(GenBank accession No. X57555)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ndk(F)及びndk(R)(シグマジェノシスジャパン(株)で合成))によるPCR法を行い、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(ndk)遺伝子を含む約0.6kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれXbaI (ndk(F))及びHindIII(ndk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
ndk(R):5'−TAAAGCTTAGAAACGCCCCGGTGAGC−3'(26mer)(配列番号:10)
PCRによるndk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(62℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。増幅断片をXbaI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素XbaI及びHindIII で切断したプラスミドpUC18(タカラバイオ(株))とLigation-Convenience Kit((株)ニッポンジーン)を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109(タカラバイオ(株))を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地(Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%)で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。
エシェリヒア・コリ NCR-1001:NITE P-102
エシェリヒア・コリ NCR-1002:NITE P-103
エシェリヒア・コリ NCR-1003:NITE P-104
エシェリヒア・コリ NCR-1004:NITE P-105
エシェリヒア・コリ NCR-1005:NITE P-106
(アデニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成)
大腸菌由来のdAMPからdADPへの変換に関わる遺伝子(adk)と大腸菌由来のdADPからdATPへの変換に関わる遺伝子(ndk)の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。
先に構築したプラスミドpUC-ADKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のadk塩基配列(GenBank accession No. X03038)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(adk(F2)及びadk(R2)(インビトロジェン(株)で合成))によるPCR法を行い、アデニレートキナーゼ(adk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれBamHI(adk(F2))及びSalI(adk(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。また、先に構築したプラスミドpUC-NDKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のndk塩基配列(GenBank accession No. X57555)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ndk(F2)及びndk(R2)(インビトロジェン(株)で合成))によるPCR法を行い、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(ndk)遺伝子を含む約0.6kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれSalI (ndk(F2))及びSphI(ndk(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
adk(R2):5'−TTGTCGACTATCCGGCCTGAGATTGC−3'(26mer)(配列番号:12)
ndk(F2):5'−GCGTCGACATCAATAGTCAACGGCCC−3'(26mer)(配列番号:13)
ndk(R2):5'−TTGCATGCAGAAACGCCCCGGTGAGC−3'(26mer)(配列番号:14)
PCRによるadk遺伝子およびndk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
大腸菌由来のdGMPからdGDPへの変換に関わる遺伝子(gmk)と大腸菌由来のdGDPからdGTPへの変換に関わる遺伝子(ndk)の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。
先に構築したプラスミドpUC-GMKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のgmk塩基配列(GenBank accession No. M84400)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(g(F)及びg(R2)(インビトロジェン(株)で合成))によるPCR法を行い、グアニレートキナーゼ(gmk)遺伝子を含む約1.0kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (g(F))及びXbaI(g(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
g(R2):5'−GGTCTAGAGCAGCGCGATTACAGTGG−3'(26mer)(配列番号:15)
PCRによるgmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
大腸菌由来のdCMPからdCDPへの変換に関わる遺伝子(cmk)と大腸菌由来のdCDPからdCTPへの変換に関わる遺伝子(ndk)の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。
先に構築したプラスミドpUC-CMKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のcmk塩基配列(GenBank accession No. D90729)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ck(F) (シグマジェノシスジャパン(株)で合成))及びck(R2) (インビトロジェン(株)で合成))によるPCR法を行い、シチジレートキナーゼ(cmk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (ck(F))及びXbaI(ck(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
ck(R2):5'−GCTCTAGAATTTAACGTCCACCTGGC−3'(26mer)(配列番号:16)
PCRによるcmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
大腸菌由来のdTMPからdTDPへの変換に関わる遺伝子(tmk)と大腸菌由来のdTDPからdTTPへの変換に関わる遺伝子(ndk)の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。
先に構築したプラスミドpUC-TMKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のtmk塩基配列(GenBank accession No. U41456)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(tk(F2)及びtk(R2) (インビトロジェン(株)で合成))によるPCR法を行い、チミジレートキナーゼ(tmk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれBamHI (tk(F2))及びXbaI(tk(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
tk(R2):5'−ATTCTAGAAGCATCATCGCCCATGCC−3'(26mer)(配列番号:18)
PCRによるtmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
エシェリヒア・コリ NCR-1006:NITE AP-196 (受領番号);2月21日(受領日)
エシェリヒア・コリ NCR-1007:NITE AP-197 (受領番号);2月21日(受領日)
エシェリヒア・コリ NCR-1008:NITE AP-213 (受領番号);2月28日(受領日)
エシェリヒア・コリ NCR-1009:NITE AP-199 (受領番号);2月21日(受領日)
(使用するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの特性)
ATPを再生し、反応系にATPを供給する微生物としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170を使用した。但し、ATP再生系をもち、反応系にATPを供給できる微生物であれば、本菌株にこだわるものではない。
本特許に記載の組換えエシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(以下「コリネ菌」と略す)の培養菌体は、以下の方法で作成する。
アンピシリン100μg/mlを含有するLB斜面培地(バクトトリプトン1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl 1.0%;pH7.0(NaOH添加による))で37℃、一晩培養したものを種菌とした。これを、同LB培地(アンピシリン含有)3mLに一白金耳接種し、37℃にて24時間振とうしながら一次培養を行った。一次培養液2mLを 200mLの同LB培地(アンピシリン含有、500mL容坂口フラスコを使用)に接種し、37℃で振とう培養(回転数130rpm)した。培養2時間後にIPTGを終濃度0.5mMとなるように添加後、20時間培養した。
アンピシリン100μg/mlを含有するLB斜面培地(バクトトリプトン1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl 1.0%;pH7.0(NaOH添加による))で37℃、一晩培養したものを種菌とした。これを、同LB培地(アンピシリン含有)3mLに一白金耳接種し、37℃にて24時間振とうしながら一次培養を行った。一次培養液2mLを 200mLの同LB培地(アンピシリン含有、500mL容坂口フラスコを使用)に接種し、37℃で振とう培養(回転数130rpm)した。培養2時間後にIPTGを終濃度0.5mMとなるように添加後、20時間培養した。
肉エキス・ブイヨン斜面培地(肉エキス0.3%、ペプトン0.3%;pH6.8)で30℃、1〜2日間培養したものを種菌とした。これをグルコース・ブイヨン培地(ペプトン1.0%、酵母エキス0.2%、グルコース1.0%、MgSO4・7H2O 0.1%、ビオチン100μg/L;初発pH7.0(NaOH添加による);500mL容坂口フラスコ使用)3mLに一白金耳接種し、30℃にて24時間振とうしながら一次培養を行った。一次培養液2.5mLを75mLのグルコース・ブイヨン培地(ペプトン 1.0%、酵母エキス 0.2%、肉エキス 1.0%、尿素 0.4%、グルコース 5.0%、MgSO4・7H2O 0.1%、(NH4)2SO4 1.0%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4 0.2%、MnSO4・2H2O 1mg/L、FeSO4・7H2O 1mg/L、CaCl2・2H2O 10mg/L、ビオチン 100μg/L;初発pH 7.0 (NaOH溶液による);500mL容バッフル付き三角フラスコを使用)に接種し、30℃で24時間、回転数170rpmで振とう培養した。
コリネ菌 15g/l、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1005) 1(〜3)g/l に相当する遠心分離菌体、アデニレートキナーゼ、グアニレートキナーゼ、シチジレートキナーゼ、あるいはチミジレートキナーゼの何れか一つを高生産するエシェリヒア・コリ(NCR-1001, NCR-1002, NCR-1003, NCR-1004) 1g/l に相当する遠心分離菌体、グルコース 5% KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/Lからなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3(KOH溶液により調整)でスターラー攪拌しながら反応させた。
コリネ菌 20g/l、アデニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1006)、グアニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1007)、シチジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1008)、あるいはチミジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1009) 1(〜6)g/l に相当する遠心分離菌体、グルコース 5%、KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/Lからなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3(KOH溶液により調整)でスターラー攪拌しながら反応させた。
dTMP(10mM)、チミジレートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1004 培養菌体(1g/L)、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1005 培養菌体(1g/L)、コリネ菌(ATCC-21170)培養菌体(15g/L)で前述の反応条件下15時間反応させた。最終反応液中の生成したdTTPは4.4 mM、副生成物のdTDPは 2.8 mMであった。
実施例1と同様な手順で、dAMP、dGMP、dCMPを原料とし、組換えエシェリヒア・コリを下表の組合わせで実施した。反応条件は前述の条件で実施した。
dTMP(10mM)、チミジレートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1004 培養菌体(1g/L)、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1005 培養菌体(1g/L)、ATP(10mM)で前述の反応条件下8時間反応させた。最終反応液中の生成したdTTPは1.9mM、副生成物のdTDPは5.0mMであった。
実施例3と同様な手順で、dAMP、dGMP、dCMPを原料として反応を行った。組換えエシェリヒア・コリの組合わせは実施例2と同様の組合せで実施した。原料となる各dNMP10mMから得られた反応生成物を下表に示す。
dTMP(20mM)、チミジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1009)培養菌体(3g/L)、コリネ菌(ATCC-21170)培養菌体(20g/L)で前述の反応条件下12時間反応させた。最終反応液中の生成したdTTPは6.8 mM、副生成物のdTDPは 7.0 mMであった。
実施例5と同様な手順で、dAMPを原料とした場合はアデニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1006)、dGMPを原料とした場合はグアニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1007)、dCMPを原料とした場合はシチジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1008)を用い、前述の反応条件で実施した。原料となる各dNMP20mMから得られた反応生成物を下表に示す。
(白子由来DNA加水分解物の調製)
ここで示す実施例は、公知のデオキシリボヌクレオシド一リン酸(dNMP)の調製を示すものである。白子より抽出したDNA-Na溶液に市販酵素ヌクレアーゼを添加し、60℃で15時間反応させた。反応終了後冷却し、メンブランフィルターにてろ過を行い、このDNA-Na酵素分解液を陰イオン交換樹脂カラムに通液し4種のdNMPを吸着した。カラムを水洗後、希塩酸で溶出し、4種のdNMP画分を取得した。各画分についてHPLCにより分析した結果、それぞれ純度は98%以上であった。
原料dAMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したdAMPである以外、実施例2と同様にして反応を実施し、原料dAMP 70mMからdATP14.2 mM、副生成物としてdADP 23.6 mM得られた。
原料dGMP、dCMP及びdTMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したでdGMP、dCMP及びdTMPある以外、実施例1及び2と同様にして反応を実施し、実施例1及び2と同様な結果を得た。
原料dAMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したdAMPである以外、実施例6と同様にして反応を実施し、原料dAMP 65mMからdATP14.7 mM、副生成物としてdADP 18.2 mM得られた。
原料dGMP、dCMP及びdTMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したdGMP、dCMP及びdTMPである以外、実施例5及び6と同様にして反応を実施し、実施例5及び6と同様な結果を得た。
(dATPの精製)
ここで示す実施例は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の公知の方法を利用した精製を示すもので、精製法はこの実施例に限定されるものではない。実施例4で行った最終反応液(dATP7.8g/L、dADP12.5g/L、dAMP9.5g/l)を加熱することで反応を停止し、遠心分離及びろ過を行うことで菌体及び不溶物を除去せしめた。この反応液400mlを100mlの陰イオン交換樹脂カラムに通液しdATPを吸着した。カラムを水洗後、0.025N-HClを通液しdAMP、dADP等の不純物を除去した。さらに0.05N-HCl+0.15N-NaClで溶出しdATP画分を取得する。dATP画分をHPLCにより分析した結果、純度99%以上(対dATP+dADP+dAMP)のdATPが2.0g含まれることを確認した。得られたdATP画分にはNaClが含まれているが、メタノールを用いた晶析を行うことで、dATP-2Na塩の結晶を得ることが出来る。
Claims (7)
- デオキシリボヌクレオシド一リン酸(dNMP)のリン酸化によってデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)を製造する方法において、
(1)ヌクレオシド一リン酸(NMP)キナーゼ遺伝子を有する組換えベクターを有し、かつ該遺伝子に基づくヌクレオシド一リン酸キナーゼを有する微生物形質転換体の存在下で、dNMPにATPを反応させてデオキシリボヌクレオシド二リン酸(dNDP)を得る第1のリン酸化工程と、
(2)ヌクレオシド二リン酸(NDP)キナーゼの存在下で、前記dNDPにATPを反応させてdNTPを得る第2のリン酸化工程と、
を有し、
前記第1のリン酸化工程において用いられるdNMPとNMPキナーゼ遺伝子とが、以下の(a)〜(d)のいずれか1つの組合せである
(a)デオキシアデノシン一リン酸とアデニレートキナーゼ遺伝子(adk)の組合せ、
(b)デオキシグアノシン一リン酸とグアニレートキナーゼ遺伝子(gmk)の組合せ、
(c)デオキシシチジン一リン酸とシチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)の組合せ、
(d)デオキシチミジン一リン酸とチミジレートキナーゼ遺伝子(tmk)の組合せ、
ことを特徴とするデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法。 - 前記第2のリン酸化が、NDPキナーゼ(ndk遺伝子)を有する微生物の存在下で行なわれる請求項1に記載の製造方法。
- 前記NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体が、前記NDPキナーゼを共有するものであり、該微生物形質転換体を前記第1及び第2のリン酸化工程の両方に用いる請求項2に記載の製造方法。
- 前記NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体と、該微生物形質転換体と異なるNDPキナーゼを有する微生物と、を前記第1及び第2のリン酸化工程のそれぞれにおいて用いる請求項2に記載の製造方法。
- 前記NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体が静止菌体の状態で用いられる請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 前記NDPキナーゼを有する微生物が静止菌体の状態で用いられる請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- 前記第1及び第2のリン酸化工程の少なくとも一方において用いられるATPが、ATP生産能がある微生物によってリン酸化工程に供給される請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
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