JP4486058B2 - デオキシウリジン5’−モノリン酸の製造法 - Google Patents
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反応系中で、dCMPデアミナーゼ活性を有する酵素及びATP生産能を持つコリネバクテリウム・アンモニアゲネスと、デオキシシチジン5'-トリリン酸(dCTP)の存在下で、デオキシシチジン5'-モノリン酸(dCMP)の脱アミノ反応を行い、デオキシウリジン5'-モノリン酸(dUMP)を生成させる工程を有し、
前記反応系中に、dCTP生成反応酵素を持った微生物を共存させて、デオキシシチジン5'-モノリン酸(dCMP)と前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネスにより生産されるATPとから前記脱アミノ反応に用いるデオキシシチジン5'-トリリン酸(dCTP)を生産させる
ことを特徴とするデオキシウリジン5'-モノリン酸(dUMP)の製造方法である。
(dCMPデアミナーゼ活性を有する菌株とその培養法)
(dCMPデアミナーゼ活性を有する菌株)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170を使用した。コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(以下「コリネ菌」と略す)の培養菌体は、以下の方法で作成する。
(コリネ菌の培養菌体の作成)
肉エキス・ブイヨン斜面培地(肉エキス0.3%、ペプトン0.3%;pH6.8)で30℃、1〜2日間培養したものを種菌とする。これをグルコース・ブイヨン培地(ペプトン1.0%、酵母エキス0.2%、グルコース 1.0%、MgSO4・7H2O 0.1%、ビオチン 100μg/L;初発pH7.0(NaOH添加による);500mL容坂口フラスコ使用)3mLに一白金耳接種し、30℃にて24時間振とうしながら一次培養を行う。一次培養液2.5mLを75mLのグルコース・ブイヨン培地(ペプトン 1.0%、酵母エキス 0.2%、肉エキス 1.0%、尿素 0.4%、グルコース 5.0%、MgSO4・7H2O 0.1%、(NH4)2SO4 1.0%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4 0.2%、MnSO4・2H2O 1mg/L、FeSO4・7H2O 1mg/L、CaCl2・2H2O 10mg/L、ビオチン 100μg/L;初発pH 7.0 (NaOH溶液による);500mL容バッフル付き三角フラスコを使用)に接種し、30℃で24時間、回転数170rpmで振とう培養し、dCMPデアミナーゼ活性を有するコリネ菌の培養菌体を含む培養液を得る。
(シチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)の取得と発現)
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のcmk塩基配列(GenBank accession No. D90729)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ck(F)及びck(R)(シグマジェノシスジャパン(株)で合成))によるPCR法を行い、シチジレートキナーゼ(cmk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (ck(F))及びHindIII(ck(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
ck(R):5'−CGAAGCTTATTTAACGTCCACGTGGC−3'(26mer)(配列番号:2)
PCRによるcmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP - TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のndk塩基配列(GenBank accession No. X57555)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ndk(F)及びndk(R)(シグマジェノシスジャパン(株)で合成))によるPCR法を行い、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(ndk)遺伝
子を含む約0.6kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれXbaI (ndk(F))及びHindIII(ndk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
ndk(R):5'−TAAAGCTTAGAAACGCCCCGGTGAGC−3'(26mer)(配列番号:4)
PCRによるndk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP - TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(62℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。増幅断片をXbaI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素XbaI及びHindIII で切断したプラスミドpUC18(タカラバイオ(株))とLigation-Convenience Kit((株)ニッポンジーン)を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109(タカラバイオ(株))を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地(Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%)で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。
また、プラスミドpUC-NDKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1005と命名した。
エシェリヒア・コリK12株(IFO3301)の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のcmk塩基配列(GenBank accession No. D90729)に基づいて設計した以下に示す2種類の両端プライマー(ck(F)及びck(R2)(インビトロジェン(株)で合
成))によるPCR法を行い、シチジレートキナーゼ(cmk)遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (ck(F))及びXbaI(ck(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。
ck(R2):5'−GCTCTAGAATTTAACGTCCACGTGGC−3'(26mer)(配列番号:5)
PCRによるcmk遺伝子の増幅は、反応液50μL(鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U))を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(TaKaRa PCR Thermal Cycler GP - TP500)にセットし、熱変性(94℃、0.5分)、アニーリング(60℃、0.5分)、伸長反応(72℃、1.0分)からなる反応ステップを30回繰り返し行った。増幅断片をEcoRI及びXbaIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びXbaI で切断したプラスミドpUC18(タカラバイオ(株))とLigation-Convenience Kit((株)ニッポンジーン)を用いて連結した(pUC-CMK2)。一方、既に構築したプラスミドpUC-NDKを制限酵素XbaI及びHindIIIで処理後、精製した遺伝子断片をヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子(ndk)として用い、この断片を同様の制限酵素で処理したプラスミド(pUC-CMK2)と連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109(タカラバイオ(株))を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地(Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%)で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。
エシェリヒア・コリ NCR-1003:NITE P-104(寄託日:2005年6月24日)
エシェリヒア・コリ NCR-1005:NITE P-106(寄託日:2005年6月24日)
エシェリヒア・コリ NCR-1008:NITE P-213(寄託日:2006年2月28日)
(組換えエシェリヒア・コリ(NRC-1003, NRC-1005、NRC-1008)の培養菌体の作成)
アンピシリン100μg/mlを含有するLB斜面培地(バクトトリプトン 1.0%、酵母エキス 0.5%、NaCl 1.0%;pH7.0 (NaOH添加による))で37℃、一晩培養したものを種菌とする。これを、同LB培地(アンピシリン含有)3mLに一白金耳接種し、37℃にて24時間振とうしながら一次培養を行う。一次培養液2mLを200mLの同LB培地(アンピシリン含有、500mL容坂口フラスコを使用)に接種し、37℃で振とう培養(回転数130rpm)する。培養2時間後にIPTGを終濃度0.5mMとなるように添加後、20時間培養し、dCTP生成菌体とする。
dUMPへの変換反応:
(コリネ菌株による脱アミノ反応へのdCTPの影響)
前述の「コリネ菌の培養菌体を含む培養液」から遠心分離で得られる菌体14g/l、グルコース 5%、KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/L、dCMP(5.0mM)、dCTP(0.1mM)及び水(残部)からなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3(KOH溶液により調整)でスターラー攪拌しながら反応させながら、24時間反応させる。反応液の生成物組成は表1に示す。対照区として、dCTP無添加の区を示す。
(コリネ菌株+NRC-1003+NRC-1005共存反応)
前述の「コリネ菌の培養菌体を含む培養液」から遠心分離で得られる菌体 17.2g/l、シチジレートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1003) 3g/l、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1005) 1g/lに相当する遠心分離菌体、グルコース 5%、KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/L、dCMP(14.0mM)及び水(残部)からなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3(KOH溶液により調整)でスターラー攪拌しながら反応させながら、24時間反応させる。反応液の生成物組成は表2に示す。
(コリネ菌株+NRC-1008共存反応)
前述の「コリネ菌の培養菌体を含む培養液」から遠心分離で得られる菌体 17.2g/l、シチジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ(NCR-1008) 3g/l に相当する遠心分離菌体、グルコース 5%、KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/L、dCMP(14.0mM)及び水(残部)からなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3(KOH溶液により調整)でスターラー攪拌しながら反応させながら、24時間反応させる。反応液の生成物組成は表3に示す。
(dUMPの精製)
ここで示す実施例は、デオキシリボヌクレオシド一リン酸の公知の方法を利用した精製を示すもので、精製法はこの実施例に限定されるものではない。
Claims (7)
- デオキシシチジン5'-モノリン酸(dCMP)の脱アミノ反応によるデオキシウリジン5'-モノリン酸(dUMP)の製造方法であって、
反応系中で、dCMPデアミナーゼ活性を有する酵素及びATP生産能を持つコリネバクテリウム・アンモニアゲネスと、デオキシシチジン5'-トリリン酸(dCTP)の存在下で、デオキシシチジン5'-モノリン酸(dCMP)の脱アミノ反応を行い、デオキシウリジン5'-モノリン酸(dUMP)を生成させる工程を有し、
前記反応系中に、dCTP生成反応酵素を持った微生物を共存させて、デオキシシチジン5'-モノリン酸(dCMP)と前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネスにより生産されるATPとから前記脱アミノ反応に用いるデオキシシチジン5'-トリリン酸(dCTP)を生産させる
ことを特徴とするデオキシウリジン5'-モノリン酸(dUMP)の製造方法。 - 前記dCTP生成反応酵素を持った微生物が大腸菌である請求項1に記載の製造方法。
- 前記反応系に、シチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)を有する微生物とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(ndk)を有する微生物の組み合わせを共存させて前記dCTP生成反応酵素によるdCTPの供給を行う請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記シチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)を有する微生物とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ(ndk)を有する微生物の組み合わせが、エシェリヒア・コリ NCR-1003(NITE P-104)及びエシェリヒア・コリ NCR-1005(NITE P-106)の組合せである請求項3に記載の製造方法。
- 前記シチジレートキナーゼとヌクレオシドジホスフェートキナーゼの組み合わせからなるdCTP生成反応酵素を、cmk遺伝子とndk遺伝子を共存させ組み換えた微生物を前記反応系に共存させることで前記反応系に供給する請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記cmk遺伝子とndk遺伝子を共存させ組み換えた微生物がエシェリヒア・コリ NCR-1008(NITE P-213)である請求項5に記載の製造方法。
- 前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネスと前記dCTP生成反応酵素を持った微生物の組合せを、静止菌体の状態で、共存させて行う請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
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