KR100400338B1 - 푸린 뉴클레오티드의 제조법 - Google Patents

푸린 뉴클레오티드의 제조법 Download PDF

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Abstract

동일 발효조내에서 효율적으로 뉴클레오티드를 제조하기 위한 프로세스의 개발을 과제로 한다.
그 해결수단으로서, 본 발명에 의하면, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가지고, 또한 유도시에 이 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현시킬 수 있는 DNA 를 도입한 미생물을 배지에 배양하고, 이 배양물 중에 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생성 축적시킨 후, 이 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 발현을 유도하고, 이 배양물 중에 이 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 생성시키고 상기 효소를 발현시켜 축적시키고, 이 배양물 중에서 이 푸린 뉴클레오티드를 채취하는 것을 특징으로 하는, 푸린 뉴클레오티드의 제조법 및 이 제조법에서 사용할 수 있는 미생물을 제공할 수 있다.

Description

푸린 뉴클레오티드의 제조법{PROCESS FOR PRODUCING PURINE NUCLEOTIDES}
본 발명은 조미료로서 큰 수요가 있는 푸린 뉴클레오티드의 제조법 및 이 제조법에 유용한 미생물에 관한 것이다.
5'-구아닐산 (이하, GMP 로 약기함) 과 5'-이노신산 (이하, IMP 로 약기함) 은 강한 정미성 (呈味性) 을 나타내는 푸린 뉴클레오티드로서, 화학조미료 성분으로 널리 사용되고 있다.
이들 정미성 뉴클레오티드류의 제법으로서, 효모균체에서 추출한 RNA 를 리보 누클레아제 P1 에 의하여 가수분해한 후에 필요한 5'-뉴클레오티드를 분리 정제하는 방법 [Food Technol.,18, 287 (1964)]; IMP 를 생산하는 능력을 가지는 미생물을 사용하여 IMP 를 직접 발효생산하는 방법 [Agricultural and Biological Chemistry,46, 2257 (1982)]; 이노신이나 구아노신 등의 뉴클레오티드류를 화학적 인산화에 의하여 뉴클레오티드로 변환시키는 방법 [Bulletin of the Chemical Society of Japan,42, 3505 (1969)], 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium) 의 변이주를 사용하여 5-아미노-4-이미다졸카르복사미드 리보시드 (이하, AICAR 로 약기함) 를 발효법으로 생산하고, 이어서 AICAR 에서 화학적 합성법에 의하여 뉴클레오티드를 제조하는 방법 [Biotechnol. Bioeng.,9, 329, (1967), J. Org. Chem.,32, 1825 (1967)]; 5'-크산틸산 (이하, XMP 로 약기함) 생산성의 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)의 변이주를 배지에 배양하여 XMP 를 생성 축적시키고, 이어서 셀프 클로닝에 의하여 XMP 아미나아제 (별명 GMP 합성효소) 활성을 강화시킨 대장균을 배양하여 효소원으로 하여, XMP 에서 효소반응에 의하여 GMP 를 제조하는 방법 [Biosci. Biotech. Biochem.,61, 840 (1997), 일본 공개특허공보 233798/88 ] 등이 알려져 있다.
이상의 것을 정리하면, 지금까지 개발된 정미성 뉴클레오티드의 생산법은 원리적으로 다음의 3 가지 방법으로 대별할 수 있다 [타카오 쇼오이치 외편, 응용미생물학, 붕에이도 출판 (1996)] :
(1) 효모 RNA 를 미생물효소 또는 화학적으로 분해하는 방법 (RNA 분해법),
(2) 당과 질소원ㆍ인산원을 함유하는 배지에서 미생물의 변이주를 배양하여, 뉴클레오티드를 직접 생산시키는 방법 (직접 발효법),
(3) 발효법으로 뉴클레오티드합성의 중간체를 생산한 후, 화학적 또는 효소적으로 뉴클레오티드로 변환하는 방법 (발효와 화학합성 또는 효소전환의 복합프로세스).
상기 (1) 의 RNA 분해법은, 정미성이 있는 푸린 뉴클레오티드와 거의 등량의 피리미딘 뉴클레오티드가 부생되는 점에서 정제공정이 번잡해지지 않을 수 없다. 상기 (2) 의 직접 발효법은, 일반적으로 뉴클레오티드의 막 투과성이 장해가 되므로 세포 외에 상당량의 뉴클레오티드를 생성 축적할 수 있는 고생산균의 육종이 용이하지 않아, 경제적으로 만족할 수 있는 생산성을 얻기 어렵다. 특히 GMP 에 대해서는, 지금까지 직접생산에 대해서는 알려져 있지 않다. 단 XMP 는 예외적으로 상당량 생성 축적되는 것이 알려져 있다 [타카오 쇼오이치 외편, 응용미생물학, 붕에이도 출판 (1996)]. 그 때문에 현재 경제적으로 유리한 정미성 뉴클레오티드의 제조법으로서 (3) 의 발효와 화학합성 또는 효소전환의 복합 프로세스가 공업적으로 널리 사용되고 있다.
이 복합 프로세스에서는 전체의 생산성 향상의 한 가지 포인트는 제 1 공정의 발효공정에 있어서의 뉴클레오티드 합성중간체의 생산수율을 높이는데 있다 (프로세스의 제 1 공정). 따라서, XMP, 구아노신 또는 이노신의 고생산 미생물이 많이 육종되고 있다 [Agricultural and Biological Chemistry,42, 399 (1978), Agricultural and Biological Chemistry,43, 1739 (1979), Agricultural and Biological Chemistry,46, 2347 (1982)].
제 2 공정의 공정, 즉 화학적 또는 효소적으로 중간체를 뉴클레오티드로 변환하는 공정도 여러 가지 방법이 개발되고 있다 (프로세스의 제 2 공정). 화학적 방법으로는 부위 특이적인 인산화 반응 (뉴클레오시드 →5'-뉴클레오티드) [Bulletin of the Chemical Society of Japan,42, 3505 (1969) 이 공업적으로 사용되고 있다. 그러나, 화학적 인산화 반응을 위해서는 인산기 수용체인 뉴클레오시드를 필요한 순도까지 정제하는 중간 공정이 필요하고, 또한 발효에 사용되는 발효기외에 화학반응 용기의 사용이 필요하다. 따라서 아미나아제 또는 포스포릴라아제를 이용한 효소방법이 주목받고 있어, 여러 가지로 검토되고 있다. 지금까지 아미노화에 관해서는 XMP 아미나아제에 의한 방법이 알려져 있다 [타카오 쇼오이치 외편, 응용미생물학, 붕에이도 출판 (1996)].
또한, 인산화에 대해서는, 포스포트랜스퍼라아제, 키나아제 혹은 포스파타아제를 이용한 인산화법이 알려져 있고, 특히 키나아제 혹은 포스파타아제를 이용한 반응이 보다 효율이 좋은 방법으로 검토되고 있다. 예를 들어, 대장균의 이노신-구아노신 키나아제를 코드하는 유전자를 갖는 대장균주를 이용한 5'-뉴클레오티드의 제조법 (WO91/08286 호), 엑시구오박테리움 아세틸리캄(Exiguobacterium acetylicum) 의 이노신-구아노신 키나아제를 코드하는 유전자를 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 균주를 이용한 5'-뉴클레오티드의 제조법 (WO96/30501 호), 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii)의 포스파타아제 유전자에 랜덤변이를 부여한 유전자를 갖는 대장균 주를 이용한 5'-뉴클레오티드의 제조법 (일본 공개특허공보 37785/97, 일본 공개특허공보 201481/98) 이 개발되었다.
포스페이트 공여체로는, 여러 가지의 화합물이 검토되고 있는데, 예를 들어 P-니트로페닐포스페이트를 사용하는 방법 (일본 특허공보 2985/64), 무기인산을 사용한 방법 (일본 특허공보 1186/67, 일본 특허공보 44350/74), 폴리인산을 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 56390/78), 아세틸포스페이트를 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 82098/81), ATP 를 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 230094/88), 폴리인산, 페닐포스페이트, 카르바밀포스페이트를 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 37785/97), 피로인산을 사용하는 방법 (일본 공개특허공보 37785/97, 일본 공개특허공보 201481/98) 등이 알려져 있다.
그러나, 이 방법들에서 사용하는 기질이 고가 또는 불안정하거나, 반응부생물이 발생하므로 정제공정이 번잡해지는 등의 이유에서 공업적으로 유리한 방법이라고는 할 수 없다. 그래서, 경제성을 충족시키는 실용적인 방법으로서, 미생물이 탄수화물 대사의 과정에서 무기인산을 이용하여 AMP 또는 ADP 에서 ATP 를 재생시키는 ATP 재생계를 이용한 뉴클레오티드 생산 시스템이 개발되고 있다. 예를 들어, XMP 생산균이 가지고 있는 글루코오스를 대사하여 ATP 를 생합성하는 활성을 ATP 재생계로서 사용하는 방법이 제안되었다. 이 ATP 재생계와, XMP 및 ATP 에서 GMP 를 생성하는 능력을 가지는 미생물의 XMP 아미나아제 활성을 커플링시킴으로써 ATP 대신에 저렴한 글루코오스와 무기인산을 ATP 재생기질로 사용하는 GMP 의 제법을 교시하는 간행물이 있다 [Biosci. Biotech. Biochem.,61, 840, (1997)]. 또한, 이와 유사하게, 효소로서 이노신 키나아제를 이용하는 IMP 의 제조법도 있다 (일본 공개특허공보 230094/88).
직접 발효에 의하여 XMP, 구아노신 또는 이노신을 생산하게 하는 발효공정과, 그 발효산물들을 효소적으로 GMP 또는 IMP 로 전환하는 반응공정으로 이루어지는 GMP 또는 IMP 의 제조 프로세스에서는 2 종의 미생물이 사용되고 있다.
즉, 프로세스의 제 1 공정인 발효공정에서는, XMP, 구아노신 또는 이노신의 생산균 (생산균) 으로서 육종된 변이주가 사용된다. 프로세스의 제 2 공정인 아미노화 또는 인산화를 행하는 반응공정에서는 XMP 아미나아제활성 또는 이노신-구아노신 키나아제 활성을 가지는 단백질을 코드하는 고발현되는 유전자를 포함하는 미생물(전환 미생물)이 사용된다.
제 2 공정의 반응에 있어서 필요해지는 ATP 는 제 2 공정의 전환균뿐만 아니라, 제 1 공정의 생산균이 가지고 있는 ATP 재생활성이 이용된다.
따라서, 제 2 공정의 반응공정은 XMP 아미나아제활성 또는 이노신-구아노신 키나아제활성과 ATP 재생활성을 2 균체간에 커플링시킨 시스템으로 되어 있다.
전체의 프로세스 개요는 아래와 같다.
먼저, 대형 발효조에서 생산균을 당과 질소원을 주원료로 하는 배지에 배양하여 XMP, 구아노신 또는 이노신을 생성 축적시킨다. 한편으로, 별도의 소형 발효조에서 전환균을 배양한다. 제 1 공정의 발효가 종료된 시점에서 이 대형 발효조에 별도로 배양한 전환균을 첨가하여 저렴한 에너지 공여체 및 인산기 공여체의 존재 하에서 인산화 또는 아미노화 반응을 행한다.
이상에서와 같은 효소반응에 의한 제조 프로세스는 화학적으로 인산화를 행하는 방법에 비하여 전술한 이유에 의하여 유리한 것이나, 전환균을 배양하기 위한 소형 발효조가 필요하여, 전환균을 첨가하는 만큼, 제 1 공정의 발효공정에서의 배지의 양을 줄일 필요가 있고, 따라서 목적하는 뉴클레오티드의 배치당 수득량이 저하되는 등의 관점에서 충분히 효율적인 프로세스라고는 할 수 없다.
본 발명은 동일 발효조내에서 효율적으로 푸린 뉴클레오티드를 제조하기 위한 프로세스의 개발을 과제로 한다.
본 발명자들은 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 유전자를, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가진 발효균에 도입시키고, 그 발현을 발효공정 및 반응공정의 양 공정간에서 제어하여, 하나의 미생물만으로 푸린 뉴클레오티드의 전구물질의 발효에 이어서, 상기 전구물질에서의 푸린 뉴클레오티드로의 전환반응을 하나의 발효조내에서 행할 수 있는, 보다 우수한 푸린 뉴클레오티드의 제조 프로세스를 개발할 가능성에 대하여 예의검토를 거듭하였다. 그 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
도 1 은, 플라스미드 pLAC857 의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2 는, 플라스미드 pGUA2 의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3 은, 플라스미드 pIGK2 의 구조를 나타낸 도면이다.
*도면의 주요부분에 대한 부호의 설명*
PL: PL프로모터
guaA: 대장균에서 유래하는 XMP 아미나아제 유전자
Cㆍglt ORI: 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 복제 기점
Spcr: 스펙티노마이신 내성 유전자
cI857: 온도 감수성 리프레서 (repressor) 유전자
PICL: 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래하는 이소시트레이트 리아제 유전자 발현 제어 영역
TICL: 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래하는 이소시트레이트 리아제 유전자 터미네이터
igk: 대장균에서 유래하는 이노신-구아노신 키나아제 유전자
Kmr: 카나마이신 내성 유전자
APr: 암피실린 내성 유전자
Eㆍcoli ORI: 대장균 복제 기점
즉, 본 발명은 아래의 (1)∼(19) 에 관한 것이다.
(1) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가지고, 또한 유도시에 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는 DNA 를 도입한 미생물을 배지에서 배양하고; 배양물 중에 상기 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생성 축적시킨 후; 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 발현을 유도하여 상기 효소를 발현시키고; 상기 배양물 중에 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 생성 축적시키고; 상기 배양물 중에서 상기 푸린 뉴클레오티드를 회수하는 것을 특징으로 하는, 푸린 뉴클레오티드의 제조법.
(2) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 5'-크산틸산, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 5'-크산틸산아미나아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인, 상기 (1) 에 기재된 제조법.
(3) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 구아노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인, 상기 (1) 에 기재된 제조법.
(4) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 이노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-이노신산인, 상기 (1) 에 기재된 제조법.
(5) 미생물이 코리네박테리움속, 에스케리키아속, 바실러스속으로 이루어지는 군에서 선택되는 미생물인, 상기 (1) 에 기재된 제조법.
(6) 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스인, 상기 (1) 에 기재된 제조법.
(7) 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 발현이, 온도상승, pH 상승및 삼투압 상승에서 선택되는 조건의 변화에 의해, 또는 당질계의 탄소원에서 비당질계의 탄소원으로 전환함으로써 유도되는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 에 기재된 제조법.
(8) 비당질계의 탄소원이 아세트산 또는 아세트산염인, 상기 (7) 에 기재된 제조법.
(9) 푸린 뉴클레오티드 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는 DNA.
(10) 온도 상승, pH 상승 및 삼투압 상승에서 선택되는 조건의 변화에 의해, 또는 당질계의 탄소원에서 비당질계의 탄소원으로 전환함으로써, 유도시에 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는, 상기 (9) 에 기재된 DNA.
(11) 비당질계의 탄소원이, 아세트산 또는 아세트산염인, 상기 (10) 에 기재된 DNA.
(12) DNA 가, pLAC857 또는 pIGK2 인, 상기 (9) 또는 (10) 에 기재된 DNA.
(13) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가지고, 또한 유도시에 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는 DNA 가 도입된 미생물.
(14) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 5'-크산틸산, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 5'-크산틸산아미나아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인, 상기 (13) 에 기재된 미생물.
(15) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 구아노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인, 상기 (13) 에 기재된 미생물.
(16) 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 이노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-이노신산인, 상기 (13) 에 기재된 미생물.
(17) 미생물이, 코리네박테리움속, 에스케리키아속, 바실러스속으로 이루어지는 군에서 선택되는 미생물인, 상기 (13) 에 기재된 미생물.
(18) 미생물이, 코리네박테리움 암모니아게네스인, 상기 (13) 에 기재된 미생물.
(19) 미생물이, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pLAC857 (FERM BP-6639) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pIGK2 (FERM BP-6638) 인, 상기 (18) 에 기재된 미생물.
본 발명은 직접 발효에 의하여 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하게 하는 발효공정과, 상기 발효공정에서 생산된 전구물질을 효소적으로 푸린 뉴클레오티드로 전환하는 반응공정을 단일 미생물을 사용하여 하나의 발효조내에서 연속적으로 행하는 프로세스를 제공한다.
상기 프로세스를 성립시키기 위하여, 본 발명자들이 알아낸 중요한 요건은 다음의 3 가지이다.
즉, 첫째로 직접 발효에 의하여 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하게 하는 발효공정에서는 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자의 발현이 발효에 실질적으로 영향을 미치지 않는 수준으로 억제될 필요가 있다는 점.
상기 효소의 발현이 억제되지 않는 경우에는, 상기 효소의 활성에 의하여 발효 중에 세포내에 푸린 뉴클레오티드가 생성 축적되고, 하기 이유에 의하여 발효수율이 저하된다.
푸린 뉴클레오티드로서, GMP 가 축적된 경우에는 푸린 생합성 경로상의 키(key)효소의 피드백 억제가 유발되어, XMP 의 생산이 멈추어 버린다. IMP 가 축적된 경우에는 이노신 생성과의 사이에서 무익한 사이클 (Futile cycle) 이 형성되어 ATP 가 낭비되기 시작한다. 이렇게 세포내에서의 푸린 뉴클레오티드의 생성 축적은 발효수율의 저하를 초래하게 되어 경제적으로 불리하다.
둘째로, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성하는 반응공정에서는, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소활성이 충분히 유도되어야 한다는 점,
셋째로, 발효를 끝내고 또한 유도처리를 행한 생산균에 충분한 ATP 재생활성과 전환반응을 위한 인산화 또는 아미노화 활성이 유지되게 하고, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성하는 반응공정에서 그것이 충분하게 기능해야 한다는 점.
이상의 3 가지이다.
본 발명에 사용되는 미생물은 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가지고, 또한 ATP 재생활성을 가지는 미생물이면 야생주, 변이주, 세포융합주, 형질도입주 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 조성한 재조합주일 수 있다. 이 미생물로서 바람직한 것으로는 핵산발효나 아미노산발효에 유용한 코리네박테리움속, 에스케리키아속, 바실러스속 에 속하는 미생물을 들 수 있다. 강력한 ATP 재생활성을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스는 더욱 바람직한 미생물로 들 수 있다.
푸린 뉴클레오티드의 전구물질로는 XMP, 구아노신, 이노신, 아데노신 등을 들 수 있다.
ATP 재생활성이란 미생물이 당질을 에너지 공여 기질로서 대사하는 과정에서 무기인산을 이용하여 AMP 혹은 ADP 에서 ATP 를 재생시키는 활성을 말한다. 이 ATP 재생계는 해당계, TCA 사이클, 전자전달계 등의 탄수화물대사계 및 에너지대사계의 일부로서, 거의 모든 미생물이 그 활성을 가지고 있다.
본 발명에 사용되는 미생물의 구체예로는, 예를 들어 아래의 균주 및 이것들에서 유도되는 변이주를 들 수 있다.
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14067
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869
대장균 ATCC 14948
대장균 ATCC 11303
대장균 ATCC 9637
바실러스 서브틸리스 ATCC 14618
본 발명에 사용되는 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소로는 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소라면 어느 것이라도 사용할 수 있고, XMP 아미나아제, 이노신-구아노신 키나아제, 포스파타아제, 아데닐레이트 키나아제 등을 들 수 있다.
이들 효소를 코드하는 DNA 로서, 예를 들어 아래의 것을 들 수 있다.
XMP 아미나아제를 코드하는 유전자로서, 대장균에서 유래하는 것 [Nucleic Acids Res.,13, 1303 (1985)], 바실러스 서브틸리스에서 유래하는 것 [Nucleic Acids Res.,18, 6710 (1990)], 코리네박테리움 암모니아게네스 (Genbank 접근 번호 g2765074)에서 유래하는 것 등을 들 수 있다.
이노신-구아노신 키나아제를 코드하는 유전자로서, 대장균에서 유래하는 것 (WO91/08286 호), 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 (Exiguobacterium acetylicum) 에서 유래하는 것 (WO96/30501 호) 등을 들 수 있다.
포스파타아제를 코드하는 유전자로서 모르가넬라 모르가니에서 유래하는 것 (일본 공개특허공보 37785/97, 일본 공개특허공보 201481/98) 등을 들 수 있다.
아데닐레이트 키나아제를 코드하는 유전자로서 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)에서 유래하는 것 [J. Biol. Chem.,263, 19468 (1988)] 을 들 수 있다.
푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자는 공지 방법에 의하여 수득할 수 있다.
예를 들어, XMP 의 아미나아제를 코드하는 유전자의 경우에는, XMP 아미나아제 구조유전자 서열의 양 말단에 위치하는 서열을 기초로 하여 프라이머를 합성한다. 계속하여, 제조된 프라이머와 대장균 염색체 DNA, 바실러스 서브틸리스 염색체 DNA 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 염색체 DNA를 사용하여 폴리머라아제 연속 반응법 (PCR 법) 에 의하여 XMP 아미나아제 구조유전자를 취득할 수 있다.
이노신-구아노신 키나아제를 코드하는 유전자의 경우에는, 이노신-구아노신 키나아제의 구조유전자 서열의 양 말단에 위치하는 서열을 기초로 하여 합성한 프라이머와 대장균 염색체 DNA 또는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 염색체 DNA 를 사용하여 PCR 법에 의하여 이노신-구아노신 키나아제 구조유전자를 수득할 수 있다. 동시에, PCR 법을 사용함으로써 모르가넬라 모르가니 염색체 DNA 에서 포스파타아제 구조유전자를, 또한 사카로미세스 세레비시에 염색체 DNA 에서 아데닐레이트 키나아제 구조유전자를 수득할 수 있다.
이렇게 수득된 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자는 적당한 유도성 발현 벡터의 발현 제어가 가능한 전사ㆍ번역 신호의 지배 하에 배치함으로써, 이 유전자의 발현을 제어할 수 있는 재조합 플라스미드를 얻을 수 있다.
유도성발현 벡터로서는, 사용하는 미생물체에서 복제 가능함과 동시에 아래의 3 조건을 충족시키면 특별히 한정되지 않는다.
첫째, 직접 발효에 의하여 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산시키는 발효공정에서 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자의 발현을 발효에 실질적으로 영향을 미치지 않는 수준에서 억제할 수 있을 것.
둘째, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성하는 반응공정으로 이행하기 전에 행하는 유도처리에 의하여, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 활성을 충분히 유도할 수 있을 것.
셋째, 이 유도방법이 유도처리 후에도 생산균이 충분한 ATP 재생활성과 전환활성을 유지할 수 있게 하는 방법일 것.
상기 3 조건을 충족시키는 벡터로서, 예를 들어 PL프로모터/cI857 리프레서 유전자를 보유하고, 고온에서 유도되는 pPAC31 (WO98/12343 호), lac 프로모터/lacIts 리프레서 유전자를 보유하고, 고온에서 유도되는 pBB 1 [Gene,70, 415 (1988), PL프로모터/cI857 리프레서 유전자를 보유하고, 고pH 에서 유도되는 pRK248cIts [Gene,97,125 (1991)], proU 발현제어영역을 보유하고, 고삼투압 하에서 유도되는 pOSEX 2 [Gene,151, 137 (1994)], trc 프로모터/lacIq리프레서 유전자를 보유하고, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 로 유도되는 pTrc99A [Gene,69, 301 (1988)], araBAD 프로모터/araC 리프레서 유전자를 보유하고, L-아라비노스로 유도되는 pAL9181 [Appl. Microbiol. Biotechnol.,37, 205 (1992)], 당질계의 탄소원에서 비당질계의 탄소원으로 전환함으로써 유도되는 벡터 등의 대장균 용으로 구축되어 있는 유도성발현 벡터를 들 수 있다.
그리고, 이들 유도성발현 벡터상의, 발현 조절에 관계되는 전사ㆍ번역 신호 영역을 돌연변이 기술 또는 재조합 DNA 기술로 변경시킨 벡터도 또한 사용할 수 있다.
이들 공지의 유도성발현 벡터 또는 그것들로부터 더욱 개량된 벡터를 대장균 이외의 숙주에 이용하는 경우에는 이 숙주에서 기능하는 복제 기점을 삽입하면 된다. 예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스를 숙주로 사용하는 경우에는 이 벡터에 코리네박테리움 암모니아게네스에서 기능하는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래하는 플라스미드의 복제 기점 등을 삽입할 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래하는 플라스미드로는, 예를 들어 pCG1 (일본 공개특허공보 134500/82), pCG2 (일본 공개특허공보 35197/83), pCG4 (일본 공개특허공보 183799/82), PAM330 (일본 공개특허공보 67699/83), pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 (일본 공개특허공보 166890/87) 를 들 수 있다
코리네박테리움에 있어서, 온도를 상승시킴으로써 유도할 수 있는 벡터로는, 예를 들어 대장균에 있어서 고온에서 유도되는 벡터인 pPAC31 에 함유된 PL프로모터/cI857 유전자와, 코리네박테리움 내에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터를 라이게이션하여 작제되는 플라스미드 벡터 등을 들 수 있고, 아세트산 등의 비당질 탄소원으로 유도 할 수 있는 벡터로는 pCEX2 (일본 공개특허공보 224259/91) 등을 들 수 있다.
한편, 이들 유도성발현 벡터상의 유전자 발현제어에 관계되는 전사-번역 신호가, 사용되는 미생물내에서 기능하지 않거나, 기능해도 상기 3 요건을 충분히 충족시키지 못하는 경우에는 이 전사-번역 신호 영역을 돌연변이 기술 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 상기 3 요건이 충족되도록 충분히 개량하거나, 이 미생물에 적용할 수 있는 유도성 발현 시스템을 새로이 개발할 필요가 있다. 전자의 경우에는, 사용되는 미생물에서 이미 알려진 전사-번역 신호 서열을 참고하여, 예를 들어 부위돌연변이 (Site-derected-mutagenesis) 등의 방법에 의하여 실시할 수 있다. 후자의 경우에는, 대장균 등으로 구축된 전술한 바와 같은 일반적인 유도성 발현 시스템의 개발방법에 준하여 개발구축 할 수 있다
유도성 발현계를 구비한 미생물으로서, 바람직하게는 대장균에 있어서 고온에서 유도되는 벡터인 pPAC31 에 함유된 PL프로모터/cI857 유전자와, 코리네박테리움 내에서 자립 복제할 수 있는 벡터를 라이게이션하여 작제되는 온도유도형 플라스미드 벡터, 또는 저렴한 아세트산의 첨가로 발현을 제어할 수 있는 pCEX2 를 유도성 유전자 발현 시스템으로 사용하여 각각 개발한 코리네박테리움 암모니아게네스 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 상기 3 조건을 충족시키면 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자가 벡터 플라스미드상에 존재하거나, 숙주 미생물의 염색체에 통합되어 있어도 문제는 없다. 즉, 이 유전자의 발현을 소망하는 바와 같이 제어할 수 있다면, 플라스미드의 보유주, 유전자의 염색체 통합주의 어느 것이어도 특별히 한정되지 않는다.
푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자를 함유하는 유도성 발현 플라스미드를 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 미생물에 도입하는 방법으로서, 원형질체법, 전기천공법, 염화칼슘법, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (이하, 머레큐러ㆍ클로닝 제 2 판으로 약기함) 등에 기재된, 통상 사용되는 방법을 들 수 있다.
예를 들어, 숙주균으로서 코리네박테리움속 세균을 사용하는 경우에는, 원형질체법 (일본 공개특허공보 183799/82), 전기천공법 (일본 공개특허공보 207791/90) 이 특히 유효하다. 숙주균으로서 대장균을 사용하는 경우에는 염화칼슘법 [J. Mol. Biol.,53, 159 (1970)] 등도 사용할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자를 도입한 본 발명의 형질전환체를, 탄소원, 질소원, 무기물류, 다시 필요에 따라서 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 배지에서 배양하고, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생성 축적 후, 열처리 또는 아세트산 첨가 등의 유도처리를 실시함으로써 푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 발현을 유도할 수 있다.
상기 발효공정에서 사용하는 배지내의 탄소원으로서, 상기 미생물에 의해 동화될 수 있는 임의의 탄소원을 사용할 수 있다.
상기 발효공정에서 사용되는 배지의 탄소원으로는, 글루코오스, 프럭토스, 슈크로스, 당밀, 폐당밀, 전분가수분해물 등의 탄수화물, 에탄올, 글리세린, 소르비톨 등의 알코올류, 피루브산, 젖산 등의 유기산, 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아스파르트산 등의 아미노산 등, 이 미생물이 자화 (資化) 가능한 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 이들 사용농도는 5∼30 % 가 바람직하다.
질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 탄산암모늄, 아세트산 암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄염, 우레아, 각종 아미노산, 펩톤, NZ 아민, 육 추출물 (meat extract), 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 피시 밀 (fish meal) 또는 그 소화물 등 여러 가지를 들 수 있다.
무기물로는, 칼륨 디히드로겐포스페이트, 디칼륨 히드로겐포스페이트, 황산마그네슘, 인산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산아연, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
사용하는 미생물이 아미노산, 핵산, 비타민 등 특정한 영양물질을 생육 (生育) 에 있어서 요구하는 경우에는 배지에 이들 물질을 적당량 첨가한다.
배양은 진탕배양 또는 통기 교반배양 등의 호기(好氣)의 조건하에서 행한다. 배양온도는 일반적으로 26℃∼37℃ 가 최적이다. 배양기간은 통상 1 일∼5 일 동안이다.
푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 코드하는 유전자를 발현시키기 위한 유도처리조건으로는, 예를 들어
pPAC31 또는 pBB1 : 통기 교반 조건하에서 37℃∼42℃ 에서 1∼24 시간, pRK248cIts : pH 9 에서 1∼24 시간,
pOSEX2 : 50 ∼300 mmol/l NaCl 존재 하에서 1∼24 시간,
pTrc99A : 0.1 ∼0.5mmol/l IPTG 존재 하에서 1∼24 시간,
pAL9181 : 0.2% L-아라비노스 첨가조건 하에서 1∼24 시간,
pCEX2 : 0.1%∼2% 아세트산 암모늄 또는 아세트산나트륨 첨가조건 하에서 1∼24 시간, 처리하는 것이 바람직하다
푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성하는 반응공정에 있어서, 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다.
계면활성제로서는 세포막을 통한 푸린-뉴클레오티드의 투과를 촉진하는 계면활성제가 바람직하다.
적합한 예는, 폴리옥시에틸렌 스테아릴아민 (예를 들어, 나이민 (Nymeen) S-215 일본 유시사 제조), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Cation FB, Cation F2-40 E 등의 양이온성 계면활성제, 나트륨 올레일아미드설페이트, 뉴렉스 (Newrex) TAB 및 라피졸 (Rapizole) 80 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노스테아레이트 (예를 들어 Nonion ST 221) 등의 양쪽성 계면활성제로서, 통상 0.1∼50 ㎎/㎖, 바람직하게는 1∼20 ㎎/㎖ 의 농도로 사용된다.
푸린 뉴클레오티드의 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성하는 공정의 반응은 pH 6∼8 로 조정하고, 온도 20∼40℃ 로 유지하여 1∼48 시간 동안 행한다.
반응종료 후, 반응 혼합물중에 생성 축적된 푸린 뉴클레오티드를 회수하는 방법은, 균체를 제거하여 농축 정석 (晶析) 하는 방법, 활성탄처리법, 혹은 이온교환수지법 등의 공지 방법에 의하여 실시할 수 있다 [엔토오 이사오 등, 가가꾸 공학회 (편)[바이오세퍼레이션 프로세스 편람], 쿄오리츠 출판 (1996)].
이하에서 본 발명의 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 유전공학적 수법은 미리 적시하지 않는 한, 문헌 [Molecular Cloning 제 2 판]에 기재된 방법에 준하여 행하였다.
[실시예]
실시예 1
PL프로모터 지배하의 대장균의 XMP 아미나아제 유전자를 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스의 XMP 생산균의 조성 및 이 미생물에 의한 GMP 의 생산
(1) XMP 아미나아제 유전자의 발현을 온도의 변화에 의하여 제어할 수 있는 유도성발현 플라스미드 pLAC857 의 조성
열 유도성발현 플라스미드 pLAC857 은 공지의 플라스미드 pPLA66 에서 이하의 2 가지 공정을 거쳐 구축하였다. pPLA66 은 PL프로모터 및 trpL 의 SD 서열의 하향에 XMP 아미나아제 유전자를 라이게이션함으로써 조성된 XMP 아미나아제의 고발현 플라스미드이다 [Biosci. Biotech. Biochem.,61, 840 (1997)].
온도 감수성 리프레서 유전자 cI857 을 플라스미드 pPLA66 에, 이하의 방법으로 삽입하였다.
플라스미드 pPLA66 (1 ㎍)를EcoR Ⅰ (5 단위) 및 BglⅡ (5 단위) 로 절단하였다. 이 절단물을 아가로스겔 전기영동법으로 분리하고, PL프로모터 및 대장균에서 유래하는 XMP 아미나아제 유전자 (guaA 유전자) 부분을 포함하는 DNA 단편을 QIAGEN 사 제조 QIAEX Ⅱ 를 사용하여 겔에서 회수하였다.
cI857 유전자를 함유하는 플라스미드 pPAC31 (WO98/12343 호) (1㎍)를EcoR Ⅰ (5 단위) 및BamH 1 (5 단위) 로 절단하였다. 이 절단물을 아가로스겔 전기영동으로 분리하고, cI857 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 대장균에서 유래하는 복제 기점을 함유하는 DNA 단편을 겔에서 회수하였다.
상기 유전자를 함유하는 DNA 단편과 앞서 조제한 guaA 유전자를 함유하는 DNA 단편을 타카라 주조사에서 제조한 라이게이션 키트를 사용하여 라이게이션하였다.
상기 라이게이션 혼합물을 사용하여 대장균 JM109 (타카라 주조사 제조) 를 형질전환한 후, 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 L 한천배지상에 도포하고, 암피실린 내성 형질전환체를 얻었다.
얻어진 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하였다.
이 플라스미드를 각종 제한효소로 절단해석한 결과, PL프로모터 지배하의 XMP 아미나아제 유전자, cI857 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 대장균에서 자발적으로 복제가능한 플라스미드의 복제 기점으로 이루어지는 구조를 가지는 플라스미드 pLA857 이 수득되었음을 확인하였다.
이 플라스미드 pLA857 에, 코리네박테리움에서 자발적으로 복제가능한 플라스미드의 복제 기점을 아래의 방법으로 삽입하였다.
플라스미드 pLA857 (1 ㎍)을 본 플라스미드상에 유일하게 존재하는 Pst I 절단 부위에서PstⅠ (5 단위) 로 절단하고, 이 절단물을 아가로스겔 전기영동법으로 분리하여 겔에서 회수하여, pLA 857 의PstⅠ 절단물을 취득하였다.
코리네박테리움 암모니아게네스에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터 pCG 116 (일본 공개특허공보 265892/89) (1 ㎍) 를PstⅠ (5 단위) 로 절단하고, 재결합을 방지하기 위하여 알칼리포스파타제로 처리하여 DNA 를 탈인산화시킨 후, 페놀로 추출하고 에탄올 침전을 행하여, pCG116 의PstⅠ 절단물을 취득하였다.
상기에서 수득한, pLA 857 의 Pst1 절단물과 pCG 116 의 Pst1 절단물을 상기 라이게이션 키트를 사용하여 라이게이션시켰다.
이 라이게이션 처리에 의하여 수득한 DNA 1 ㎍ 을 사용하여, 전기천공법 [Appl. Microbiol. Biotechnol.,30, 283 (1989)] 에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 주를 형질전환하고, 스펙티노마이신 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 A 한천배지 [글루코오스 0.5 %, 펩톤 1 %, 육 추출물 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화나트륨 0.25 %, 한천 1.5%, 아데닌 10 ㎎/1, 구아닌 10 ㎎/ℓ (pH 7.2)] 에 도포하였다.
스펙티노마이신 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하였다.
이 플라스미드를 각종 제한효소로 절단해석하여, 얻어진 형질전환주가 도 1 에 나타낸 원하는 구조를 가지는 플라스미드 pLAC857 을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
pLAC857 을 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pLAC857 은 부다페스트조약에 근거하여 1999 년 2 월 5 일부로 고오교기쥬츠인 세이메이코오가꾸기쥬츠 켄큐쇼, 니혼코쿠 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1 초오메 1 방 3 고 (우편번호 305-0048) 에 FERM BP-6639 로서 기탁되어 있다.
(2) FERM BP-1261 주에 pLAC857 을 도입한 주가 가지는 XMP 아미나아제활성의 측정
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pLAC857 (FERM BP-6639) 에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 pLAC857 을 추출하였다.
이 플라스미드를 사용하여 상기 전기천공법으로 코리네박테리움 암모니아게네스의 XMP 생산균 FERM BP-1261 (특허번호 제 2618383 호 : 아데닌 리키(leaky) 요구성 및 구아닌 요구성) 을 형질전환하였다.
스펙티노마이신 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하였다.
이 플라스미드를 각종 제한효소로 절단해석하여, 얻어진 형질전환체가 pLAC857 을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
pLAC857 을 가지는 XMP 생산균 FERM BP-1261 주를, 스펙티노마이신 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 배지 (A 한천배지로부터 한천을 제거하여 제조한 배지)에서, 30 ℃ 및 37 ℃ 조건하에서 24 시간 동안 진탕 배양하였다.
배양 후, 원심분리에 의하여 균체를 수득하였다.
이 균체를 100 mmol/l Tris-HCl (pH 7.0) 으로 2 회 세정한 후, 동일 완충액 10 ㎖ 에 현탁하였다.
이 균체 현탁액에 유리조각 (신마루엔타프라이제스사 제조 0.1∼0.2 φ) 10 g 을 첨가하고, 빙냉하면서 호모게나이저 (니혼세이기사 제조) 로 10 분 동안 파쇄처리하였다.
얻어진 처리액을 4 ℃ 에서 10 분 동안 원심 (14000 ×g) 하고, 상청을 세포추출액으로서 회수하였다.
사전에 42 ℃ 로 보온한 세포추출액을 첨가한 반응 혼합물 [160 mmol/l Tris-HCl (pH8.6), 12 mmol/l ATP Na2·3H2O, 16 mmol/l MgSO4·7H2O, 40 mmol/l (NH4)2SO4] 1.15 ㎖ 에 0.1 ㎖ 의 0.3 mol/l XMP 를 첨가하여 42 ℃ 에서 반응을 개시하였다. 15 분 후에 반응액에 3.9 ㎖ 의 3.5 % 의 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
이 반응 정지액을 3000 rpm 으로 10 동안 원심분리 한 후, 상청의 290 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 1 분 동안 1 μ㏖ 의 GMP 를 생성시키는 활성을 1 단위 (U) 로 하고, 단백질 1 ㎎ 당의 비활성을 산출하였다. 단백질은 단백질 분석 키트 (바이오라드사 제조) 를 사용하여 정량하였다.
결과를 제 1 표에 나타낸다. 30 ℃ 에서 배양한 균체에서는 활성이 검출되지 않는 반면, 37 ℃ 에서 배양한 균체는 활성이 검출되었다. 본 결과는 pLAC857 을 가지는 FERM BP-1261 주에 있어서, XMP 아미나아제 유전자의 발현이 PL프로모터의 지배하에 있고, 이 효소활성을 온도에 의하여 제어할 수 있는 것을 나타내고 있다.
배양온도 비활성 (μ㏖/min/㎎ 단백질)
30 ℃ 검출되지 않음
37 ℃ 0.25
(3) pLAC857 을 가지는 XMP 생산균 FERM BP-1261 주에 의한 GMP 의 생산
pLAC857 을 가지는 FERM BP-1261 주를 스트렙토마이신 20 ㎍/㎖ 을 함유하는 A 한천배지상에서 30 ℃, 2 일 동안 배양한 후, 얻어진 균체를 스트렙토마이신 20 ㎍/㎖ 을 함유하는 60 ㎖ 의 C 시드 (seed) 배지 [글루코오스 5 %, 효모 추출물 1 %, 펩톤 1 %, NaCl 0.25 %, 우레아 0.3 %, 아데닌 150 ㎎/ℓ, 구아닌 150 ㎎/ℓ (pH 7.2)] 를 첨가한 250 ㎖ 용량의 3각 플라스크에 균을 접종하고, 30 ℃, 24 시간 동안 진탕배양하였다.
얻어진 배양액 전량을 0.94 ℓ의 D 시드 배지 [글루코오스 8.8 %, 육 추출물 1.7 %, 펩톤 1.7 %, KH2PO40.167 %, K2HPO40.167 %, MgSO4ㆍ7H2O 0.167 %, 아데닌 333 mg/l, 구아닌 350mg/l, FeSO4ㆍ7H2O 33 ㎎/ℓ, ZnSO4ㆍ7H2O 17 ㎎/ℓ, MnSO4ㆍ4∼6 H2O 6.7 ㎎/ℓ, β-알라닌 25 ㎎/ℓ, L-시스테인 33 ㎎/ℓ, 비오틴 167 ㎍/ℓ, CuSO4ㆍ5H2O 1.3 ㎎/ℓ, 티아민 8.3 ㎎/ℓ (pH 7.2)] 를 첨가한 2 ℓ용량의 발효조에 균을 접종하고, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.2 로 유지하면서, 30 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 24 시간 동안 배양하였다.
얻어진 배양액 (120 ㎖) 를, 0.88 ℓ 의 F 발효배지 [글루코오스 8 %, 오르토인산 1.67 %, KOH 1.29 %, MgSO4ㆍ7H2O 1.2 %, CaCl2ㆍ2H2O 123 ㎎/ℓ, FeSO4ㆍ7H2O 24.6 ㎎/ℓ, MnSO4ㆍ4∼6H2O 12.3 ㎎/ℓ, ZnSO4ㆍ7H2O 12.3 ㎎/ℓ, β-알라닌 18.5 ㎎/ℓ, L-시스테인 24.6 ㎎/ℓ, 니코틴아미드 6.2 ㎎/ℓ, 히스티딘 24.6 ㎎/ℓ, 비오틴 185 ㎍/ℓ, CuSO4ㆍ5H2O 2.5 ㎎/ℓ, 아데닌 203 ㎎/ℓ, 구아닌 10 ㎎/ℓ (pH 7.2)] 를 첨가한 2 ℓ용량의 발효조에 균을 접종하고, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.2 로 유지하면서, 28 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 44 시간 동안 배양하였다.
배양 종료 후, 배지 상청 중의 XMP 및 GMP 의 축적량을 HPLC 를 사용하여 다음과 같이 하여 정량하였다.
HPLC 분석
칼럼: Asahipak GS-320H (아사히카세이사 제조)
용출액: 0.2 mol/l NaH2PO4(PH 3.0)
유속: 1 ㎖/min
검출: UV 254 ㎚
XMP 및 GMP 의 축적량은 UV 254 ㎚ 의 흡광도에 의하여 측정하고, 흡광강도를 표준과 비교하여 정량하였다.
HPLC 분석의 결과, XMP 는 27.2 g/ℓ생성 축적되어 있으나, GMP 는 검출되지 않았다.
XMP 아미나아제 유전자의 발현을 유도하기 위하여 배양 브로스를 40 ℃ 로 승온시키고 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 7.2 로 유지하면서, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 조건에서 6 시간 동안 열처리하였다.
이 열유도처리한 XMP 의 발효액에 글루코오스 2.5 %, 피트산 10 g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 4.4 g/ℓ, Na2HPO49.36 g/ℓ, 아데닌 96.9 ㎎/ℓ, 나이민 S-215 10 g/ℓ를 첨가한 후, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.4 로 유지하면서, 40 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 24 시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 배지 상청 중의 GMP 의 축적량을 상기 HPLC 분석 조건에서 정량하였다.
HPLC 분석 결과, 20.8 g/ℓ 의 생성 축적이 확인되었다.
실시예 2
이소시트레이트 리아제 유전자의 프로모터 지배 하의 코리네박테리움 암모니아게네스의 XMP 아미나아제 유전자를 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스의 XMP 생산균의 조성 및 이 균주에 의한 GMP 의 생산
(1) PCR 법에 의한 XMP 아미나아제 유전자의 증폭 및 클로닝
코리네박테리움 암모니아게네스의 XMP 아미나아제 유전자의 단리는 염기서열에 기초하여 PCR 법으로 다음과 같이 행하였다.
먼저, XMP 아미나아제 유전자의 양 말단에 위치하고, 각각 제한효소AflⅡ,BamHⅠ 절단부위를 가지는 서열번호 1 및 2 에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 또한 주형으로 하는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 의 염색체 DNA 의 조제는 글리신 존재 하에서 배양한 균체를 라이소자임과 아크로모펩티다아제로 처리하여, 원형질체를 조제하는 방법 (일본 공개특허공보 225776/94) 에 따라서 행하였다.
염색체 DNA (0.1 ㎍) 과 프라이머로서, 상기 올리고뉴클레오티드 (각각 0.25 μM) 및 Taq DNA 폴리머라아제 (타카라 주조사 제조) 2.5 단위를 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 200 μM, 50 mmol/l 염화칼륨, 1.5 mmol/l 염화마그네슘 및 0.0001 % 의 젤라틴을 함유하는 10 mmol/l 트리스-염산완충액 (pH 8.3) 0.1 ㎖ 에 첨가하고, PCR 을 행하였다.
PCR 은 94 ℃ 에서 90 초 동안, 50 ℃ 에서 120 초 동안, 72 ℃ 에서 120 초 동안의 반응을 1 사이클로 하여 10 사이클 반복하고, 94 ℃ 에서 90 초 동안, 40 ℃ 에서 120 초 동안, 72 ℃ 에서 120 초 동안의 반응을 1 사이클로 하여 10 사이클 반복하고, 다시 94 ℃ 에서 90 초 동안, 40 ℃ 에서 120 초 동안, 72 ℃ 에서 180 초 동안의 반응을 1 사이클로 하여 20 사이클 반복한 후, 72 ℃ 에서 360 초 동안 반응시키는 조건으로 행하였다.
얻어진 반응액을 사용하여 아가로스겔 전기영동을 행하고, 목적하는 약 1.6 kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
이 DNA 단편을 제한효소AflⅡ (5 단위) 및BamHⅠ (5 단위) 로 절단하고, DNA 단편의 양 말단이AflⅡ 또는BamHⅠ 로 처리된 약 1.6 kb 의 절단물을 아가로스겔 전기영동법으로 분리, 회수하였다.
(2) XMP 아미나아제 유전자의 발현을 탄소원에 의하여 제어할 수 있는 유도성발현 플라스미드 pGUA2 의 조성
유도성발현 벡터 pCEX2 (일본 공개특허공보 224259/91) 를 사용하여 XMP 아미나아제 유전자의 발현을 탄소원에 의하여 제어할 수 있는 플라스미드를 아래와 같이 구축하였다.
pCEX2 는 코리네박테리움 글루타미쿰의 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현 조절영역 및 전사종결 신호 서열을 포함하는 벡터로서, 멀티클로닝 부위에 삽입된 외래 유전자의 발현은 당질 존재 하에서는 억제되고, 아세트산 등의 비당질 존재 하에서는 유도된다.
pCEX2 벡터 DNA (1 ㎍) 을AflⅡ (0.5 단위) 로 부분 절단한 후,BamHⅠ (5 단위) 로 절단하고, 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현 조절 영역, 전사종료 신호영역, 스펙티노마이신 내성 유전자 및 코리네박테리움 암모니아게네스에서 자발적으로 복제가능한 플라스미드의 복제 기점을 포함하는 7.6 kb 의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동법에 의하여 분리, 회수하였다.
상기 DNA 단편과 상기 실시예 2 (1) 에서 수득한 XMP 아미나아제 유전자의 PCR 증폭단편을 라이게이션하여 라이게이션된 DNA 를 수득하였다.
이 라이게이션 DNA (1 ㎍)를 사용하고, 전기천공법을 사용하여 코리네박테리움ㆍ암모니아게네스 ATCC 6872 주를 형질전환하고, 스펙티노마이신 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 A 한천배지에 도포하였다.
스펙티노마이신 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하였다.
이 플라스미드 DNA 를 각종 제한효소로 절단해석하여, 얻어진 형질전환주가 도 2 에 나타낸, 원하는 구조를 가지는 플라스미드 pGUA2 를 가지는 것을 확인하였다.
(3) FERM BP-1261 주에 pGUA2 를 도입한 주가 가지는 XMP 아미나아제 활성의 측정
pGUA2 를 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 주에서 알칼리 용균법으로 플라스미드 pGUA2 를 추출하였다.
이 플라스미드를 사용하고, 전기천공법에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스의 XMP 생산균 FERM BP-1261 (아데닌-리키 요구성 및 구아닌 요구성) 을 형질전환하였다.
스펙티노마이신 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하였다.
이 플라스미드를 각종 제한효소로 절단해석한 결과, 형질전환주가 pGUA2 를 보유하고 있다는 것을 확인하였다.
pGUA2 를 가지는 XMP 생산균 FERM BP-1261 주를, 스펙티노마이신 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 A 배지 및 이 배지의 글루코오스를 아세트산 암모늄으로 대체한 배지의 2 종류의 배지에서 30 ℃ 에서 24 시간 동안 별도로 진탕 배양하였다.
얻어진 배양액에서 각각 균체를 취득하고, 실시예 1 (2) 와 동일하게 실시하여 세균추출액을 조제하였다.
이들 추출액을 사용하고, 이들 추출액 중의 XMP 아미나아제 활성을 실시예 1 (2) 에 기재된 방법에 준하여 측정하였다.
결과를 표 2 에 나타낸다.
글루코오스를 탄소원으로 하여 배양한 균체에서는 매우 낮은 수준의 활성밖에 검출되지 않은 반면, 2 % 아세트산 암모늄을 탄소원으로 하여 배양한 균체에서는 고수준의 활성이 검출되었다.
이 결과는, pGUA2 를 가지는 FERM BP-1261 주에 있어서, XMP 아미나아제 유전자의 발현이 이소시트레이트 리아제 유전자의 프로모터 지배 하에 있고, 이 효소활성을 탄소원에 의하여 조절할 수 있는 것을 나타내고 있다.
탄소원 비활성 (μ㏖/min/㎎ 단백질)
글루코오스 0.05
아세트산 암모늄 0.38
(4) XMP 생산균 FERM BP-1261 주에 pGUA2 를 도입한 주에 의한 GMP 의 생산
pGUA2 를 가지는 FERM BP-1261 주를 사용하여, 실시예 1 (3) 과 동일한 배양조건에서 XMP 발효를 행하였다. 배양 종료 후의 배지 상청 중의 XMP 및 GMP 의 생성 축적량을 실시예 1 (3) 과 동일한 방법으로 정량하였다.
그 결과, XMP 의 축적량은 18.4 g/ℓ 이었다. GMP 는 검출되지 않았다.
발효 종료 후, XMP 아미나아제 유전자의 발현을 유도하기 위하여 아세트산 암모늄을 최종 농도가 2 % 가 되도록 발효 브로스에 첨가하고, 5.5 mol/l 의 암모늄수로 pH 7.2 로 유지하면서 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 10 시간 동안 계속 배양하였다.
아세트산 암모늄 존재 하에서 유도처리를 실시한 이 배양액에 글루코오스 2.5 %, 피트산 10 g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 4.4 g/ℓ, Na2HPO49.36 g/ℓ, 아데닌 96.9 ㎎/ℓ, 나이민 S-215 10 g/ℓ를 첨가한 후, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.4 로 유지하면서, 40 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 24 시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 이 반응 혼합물의 배지 상청 중의 GMP 의 축적량을 실시예 1 (3) 에 기재된 방법에 준하여 정량하였다.
이 반응 혼합물에 GMP 는 14.4 g/ℓ으로 생성 축적되어 있었다.
실시예 3
이소시트레이트 리아제 유전자의 프로모터 지배 하의 대장균의 이노신-구아노신 키나아제 유전자를 가지는 코리네박테리움 암모니아게네스의 이노신 생산균의 조성 및 이 균주에 의한 IMP 의 생산
(1) PCR 법에 의한 이노신-구아노신 키나아제 유전자의 증폭 및 클로닝
대장균의 이노신-구아노신 키나아제 유전자의 단리는, 공지의 염기서열(WO91/08286 호) 에 기초하여 PCR 법에 의하여 다음과 같이 실시하였다.
이노신-구아노신 키나아제 유전자의 양 말단에 위치하고, 각각 제한효소AflⅡ,BamHⅠ 절단부위를 가지는 서열번호 3 및 4 에 나타낸 올리고 뉴클레오티드를 합성하였다.
이노신-구아노신 키나아제 유전자의 주형으로서, 대장균 HM70/pBM2 주 (WO91/08286 호) 가 보유하는 플라스미드 pBM 2 를 사용하였다.
이 플라스미드 DNA (0.1 ㎍) 와 프라이머로서 상기 올리고 뉴클레오티드 (0.25 μM 각각) 및 Taq DNA 폴리머라아제 (타카라 주조사 제조, 2.5 단위)를 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 200 μM, 50 mmol/l 염화칼륨, 1.5 mmol/l 염화마그네슘 및 0.0001 % 의 젤라틴을 함유하는 10 mmol/l 트리스-염산완충액 (pH 8.3) 0.1 ㎖ 에 첨가하고, PCR 을 행하였다.
PCR 은 94 ℃ 에서 90 초 동안, 50 ℃ 에서 120 초 동안, 72 ℃ 에서 120 초 동안의 반응을 1 사이클로 하여 10 사이클 반복한 후, 94 ℃ 에서 90 초 동안, 40 ℃ 에서 120 초 동안, 72 ℃ 에서 120 초 동안의 반응을 1 사이클로 하여 10 사이클 반복하고, 다시 94 ℃ 에서 90 초 동안, 40 ℃ 에서 120 초 동안, 72 ℃ 에서 180 초 동안의 반응을 1 사이클로 하여 20 사이클 반복한 후, 72 ℃ 에서 360 초 동안 반응시키는 조건으로 행하였다.
얻어진 PCR 반응산물과 PCR 산물 클로닝용 벡터 pT-Adv 벡터 (클론테크사 제조) 를 라이게이션시켰다.
이 라이게이션 처리에 의하여 수득된 DNA 1 ㎍ 를 사용하여 대장균 DH 5 α를 형질전환하고 암피실린 100 ㎍/㎖ 을 함유하는 L 한천배지에 도포하였다.
암피실린 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 pT-AI 을 추출하였다.
이 플라스미드 pT-AI 의 구조를 각종 제한효소를 사용하여 해석함으로써, 이 플라스미드가 이노신-구아노신 키나아제 유전자 (1.3 kb), 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 및 대장균 주에서 자발적으로 복제가능한 플라스미드의 복제 기점을 가지는 것을 확인하였다.
(2) 이노신-구아노신 키나아제 유전자의 발현을 탄소원에 의하여 조절할 수 있는 유도성 발현 플라스미드 pIGK2 의 조성
유도성 발현 벡터 pCEX2 (일본 공개특허공보 224259/91) 를 사용하여 이노신-구아노신 키나아제 유전자의 발현을 탄소원에 의하여 조절할 수 있는 플라스미드를 아래와 같이 구축하였다.
pCEX2 벡터 DNA 1 ㎍ 를KpnⅠ (5 단위) 로 절단하고, 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현 조절 영역, 전사종료 신호 영역, 스펙티노마이신 내성 유전자 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 자발적으로 복제가능한 플라스미드의 복제 기점을 포함하는 7.6 kb 의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동법에 의하여 분리, 회수하였다.
상기 실시예 3 (1) 에서 얻은 이노신-구아노신 키나아제 유전자를 함유하는 플라스미드 pT-AI (1 ㎍) 를KpnⅠ (5 단위) 로 절단한 후, 탈인산처리하였다.
이KpnⅠ 절단 DNA 단편과 상기 pCEX2 의KpnⅠ 절단단편을 라이게이션시켰다.
얻어진 라이게이션 혼합액을 사용하여, 대장균 DH 5α 를 형질전환시킨 후, 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 L 한천배지상에 도포하고, 암피실린 내성 형질전환주를 얻었다.
얻어진 형질전환체에서, 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드를 추출하였다.
이 플라스미드를 각종 제한효소로 절단해석한 결과, 도 3 에 나타낸 원하는 구조를 가지는 플라스미드 pIGK2 가 얻어졌음을 확인하였다.
상기 플라스미드 (1 ㎍) 를 사용하고, 전기천공법에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 주를 형질전환시키고, 스펙티노마이신 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 A 한천배지에 도포하였다.
스펙티노마이신 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하여, 형질전환체가 pIGK2 를 가지는 것을 확인하였다.
pIGK2 를 가지는 코리네박테리움ㆍ암모니아게네스 ATCC 6872/pIGK2 는 부다페스트조약에 기초하여 1999 년 2 월 5 일부로 공업기술원 생명공학 기술연구소, 니혼코쿠 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1 초오메 1 방 3 고 (우편번호 305-0046) 에 FERM BP-6638 로서 기탁되었다.
(3) FERM BP-2217 주에 pIGK2 를 도입하여 제조한 균주의 이노신-구아노신 키나아제 활성의 측정
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pIGK2 (FERM BP-6638 호) 에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 pIGK2 를 추출하였다.
이 플라스미드를 사용하고, 전기천공법에 의하여 코리네박테리움 암모니아게네스의 이노신 생산균 FERM BP-2217 (일본특허번호 제2578496 호: 아데닌-리키 요구성 및 구아닌 요구성) 을 형질전환시켰다.
스펙티노마이신 내성 형질전환체에서 알칼리 용균법에 의하여 플라스미드 DNA 를 추출하였다.
이 플라스미드를 각종 제한효소로 절단해석함으로써, 얻어진 형질전환주가 pIGK2 를 보유하고 있는 것을 확인하였다.
pIGK2 를 가지는 이노신 생산균 FERM BP-2217 주를, 스펙티노마이신 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 A 배지 및 이 배지의 글루코오스를 아세트산 암모늄으로 대체한 배지의 2 종류의 배지에서 30 ℃ 에서 24 시간 동안 각각 배양하였다.
얻어진 배양액에서 균체를 취득하고, 이들 균체로부터 실시예 1 (2) 에 기재된 방법에 준하여 세포추출액을 조제하였다.
이들 추출액 중의 이노신-구아노신 키나아제의 활성을 이하의 방법으로 측정하였다.
미리 30 ℃ 로 보온한 반응액 [100 mmol/l HEPES 완충액 (pH 7.2), 10 mmol/l MgSO4, 50 mmol/l KCl, 1 mmol/l ATP, 1 mmol/l 이노신] 0.1 ㎖ 에 세포추출액 0.01 ㎖ 를 첨가하고, 30 ℃에서, 30 분 정도 반응시켰다.
반응 중에, 시간 경과에 따라서 반응액의 일부를 샘플링하고, 0.2 mol/l NaH2PO4(H3PO4로 pH 2.6 으로 조정) 을 사용하여 샘플링액을 1/20 으로 희석시켜반응을 정지시켰다.
이 반응정지액 중의 이노신 및 IMP 의 생성량을, 아래의 HPLC 분석조건으로 정량하였다.
HPLC 분석조건
칼럼: Asahipak GS-320H (아사히카세이사 제조)
용출액: 0.2 mol/l NaH2PO4(PH 2.6)
유속: 1 ㎖/min
검출: UV 254 ㎚
이노신 및 IMP 의 축적량은 UV 254 ㎚ 의 흡광도에 의하여 측정하고, 흡광강도를 표준과 비교함으로써 정량하였다. 1 분 동안에 1 μ㏖ 의 IMP 를 생성시키는 활성을 1 단위 (U) 로 하고, 단백질 1 ㎎ 당의 비활성을 산출하였다.
단백질은, 단백질 분석 키트 (바이오라드사 제조) 를 사용하여 정량하였다.
결과를 제 3 표에 나타내었다. 글루코오스를 탄소원으로 하여 배양한 균체에서는 매우 낮은 수준의 활성밖에 검출되지 않은 것에 비하여, 2 % 아세트산 암모늄을 탄소원으로 하여 배양한 균체에서는 높은 수준의 활성이 검출되었다. 본 결과는, pIGK2 를 가지는 FERM BP-2217 주에 있어서, 이노신-구아노신 키나아제 유전자의 발현이 이소시트레이트 리아제 유전자의 프로모터 지배 하에 있고, 상기 효소의 활성을 탄소원에 의하여 조절할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
탄소원 비활성 (μ㏖/min/㎎ 단백질)
글루코오스 0.02
아세트산 암모늄 0.34
(4) pIGK2 를 가지는 이노신 생산균 FERM BP-2217 주에 의한 IMP 의 생산
pIGK2 를 가지는 FERM BP-2217 주를 스트렙토마이신을 20 ㎍/㎖ 함유하는 A 한천배지상에서 30 ℃, 2 일 동안 배양하였다.
배양 후, 얻어진 균체를 스트렙토마이신을 20 ㎍/㎖ 함유하는 CI 시드 배지 60 ㎖ [글루코오스 5 %, 효모 추출물 1 %, 펩톤 1 %, NaCl 0.25 %, 우레아 0.25 %, 아데닌 300 ㎎/ℓ및 구아닌 100㎎/ℓ(pH 7.2)] 을 함유하는 250ml 의 어렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크에 접종한후, 30℃ 에서 24 시간동안 진탕 배양한다.
수득한 배양물 전체를 0.94 ℓ 의 DI 시드 배지 [글루코오스 7 %, 육 추출물 1 %, 펩톤 1 %, KH2PO40.1 %, K2HPO40.1 %, MgSO4ㆍ7H2O 0.1 %, 아데닌 300 ㎎/ℓ, 구아닌 300㎎/ℓ, FeSO4ㆍ7H2O 10 ㎎/ℓ, ZnSO4ㆍ7H2O 10 ㎎/ℓ, MnSO4ㆍ4∼6H2O 10 ㎎/ℓ, β-알라닌 16 ㎎/ℓ, L-시스테인 20 ㎎/ℓ, 비오틴 30 ㎍/ℓ, CuSO4ㆍ5H2O 2 ㎎/ℓ, 티아민 6 ㎎/ℓ (pH 7.2)] 를 첨가한 2 ℓ용량의 발효조에 균을 접종하고, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.2 로 유지하면서, 30 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 24 시간 동안 배양하였다.
얻어진 배양액 (120 ㎖) 를, 0.88 ℓ의 FⅠ발효배지 [글루코오스 8 %, CSL 2.07 %, KH2PO40.21 %, K2HPO40.21 %, MgSO4ㆍ7H2O 0.43 %, CaCl2ㆍ2H2O 105 ㎎/ℓ, FeSO4ㆍ7H2O 10.4 ㎎/ℓ, MnSO4ㆍ4∼6H2O 20.7 ㎎/ℓ, ZnSO4ㆍ7H2O 5.2 ㎎/ℓ, 판토텐산칼슘 10.4 ㎎/ℓ, L-시스테인 20.7 ㎎/ℓ, 니코틴산 5.2 ㎎/ℓ, 비오틴 93.8 ㎍/ℓ, CuSO4ㆍ5H2O 0.51 ㎎/ℓ, 아데닌 313 ㎎/ℓ (pH 7.2)] 를 첨가한 2 ℓ용량의 발효조에 균을 접종하고, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.2 로 유지하면서, 28 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 44 시간 동안 배양하였다.
배양 종료 후, 이 배양액의 상청 중의 이노신 및 IMP 의 생성 축적량을 실시예 3 (3) 에 기재된 방법에 준하여 정량하였다.
배양 상청 중의 이노신의 생성 축적량은 23.1 g/ℓ이고, IMP 는 검출되지 않았다.
배양 종료 후, 이노신-구아노신 키나아제 유전자의 발현을 유도하기 위하여 아세트산 암모늄을 최종 농도가 2 % 가 되도록 첨가하고, 5.5 mol/l 의 암모늄수로 pH 7.2 로 유지하면서, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 10 시간 동안 계속 배양하였다.
얻어진 배양액에, 글루코오스 2.5 %, 피트산 10 g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 4.4 g/ℓ, Na2HPO49.36 g/ℓ, 아데닌 96.9 ㎎/ℓ, 나이민 S-215 10 g/ℓ를 첨가한 후, 5.5 mol/l 암모늄수로 pH 를 7.4 로 유지하면서, 40 ℃, 교반 (600 rpm), 통기 (1 ℓ/min) 의 조건에서 24 시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응 상청 중의 IMP 의 축적량을 실시예 3 (3) 에 기재된 방법에 준하여 정량하였다.
37.7 g/ℓ의 IMP 가 반응액 중에 생성 축적되어 있었다.
본 발명에 의하여 조미료로서 큰 수요가 있는 푸린 뉴클레오티드를 동일 발효조내에서 효율적으로 제조하기 위한 제조법 및 이 제조법에 사용할 수 있는 미생물을 제공할 수 있다.

Claims (19)

  1. 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가지고, 또한 유도시에 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는 DNA 를 도입한 미생물을 배지에서 배양하고, 상기 배양물 중에 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생성 축적시킨 후, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 발현을 유도하여 상기 효소를 발현시키고, 상기 배양물 중에 상기 전구물질에서 상기 푸린 뉴클레오티드를 생성 축적시키고, 상기 배양물 중에서 상기 푸린 뉴클레오티드를 회수하는 것을 특징으로 하는, 푸린 뉴클레오티드의 제조법.
  2. 제 1 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 5'-크산틸산, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 5'-크산틸산 아미나아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인 제조법.
  3. 제 1 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 구아노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인 제조법.
  4. 제 1 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 이노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-이노신산인 제조법.
  5. 제 1 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 (Corynebacterium)속, 에스케리키아 (Escherichia)속 및 바실러스 (Bacillus)속으로 구성된 군으로부터 선택되는 속에 속하는 제조법.
  6. 제 1 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)인 제조법.
  7. 제 1 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소의 발현이, 온도 상승, pH 상승 및 삼투압 상승으로 구성된 군으로부터 선택되는 조건을 변화시키거나, 또는 당질계의 탄소원에서 비당질계의 탄소원으로 전환함으로써 유도되는 것을 특징으로 하는 제조법.
  8. 제 7 항에 있어서, 비당질계의 탄소원이 아세트산 또는 아세테이트인 제조법.
  9. cI857 유전자 또는 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현 조절 영역, 및 XMP 아미나아제 유전자 또는 이노신-구아노신 키나아제 유전자를 포함하는 DNA.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, DNA 가 pLAC857 또는 pIGK2 인 DNA.
  13. 푸린 뉴클레오티드의 전구물질을 생산하는 능력을 가지며, 또한 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는 도입된 DNA 를 보유한, 코리네박테리윰, 에스케리키아 및 바실러스로 구성된 군으로부터 선택된 속에 속하는 미생물.
  14. 제 13 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 5'-크산틸산, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 5'-크산틸산 아미나아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인 미생물.
  15. 제 13 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 구아노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-구아닐산인 미생물.
  16. 제 13 항에 있어서, 푸린 뉴클레오티드의 전구물질이 이노신, 상기 전구물질에서 푸린 뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소가 이노신-구아노신 키나아제 또는 포스파타아제, 푸린 뉴클레오티드가 5'-이노신산인 미생물.
  17. 제 13 항에 있어서, DNA 는 cI857 유전자 또는 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현 조절 영역, 및 XMP 아미나아제 유전자 또는 이노신-구아노신 키나아제 유전자를 포함하는 미생물.
  18. 삭제
  19. 제 13 항 또는 제 17 항에 있어서, 미생물이, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pLAC857 (FERM BP-6639) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872/pIGK2 (FERM BP-6638) 인 미생물.
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