ES2311289T3 - Procedimiento para producir acidos nucleicos. - Google Patents

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Yoshihiro Usuda
Hisashi Kawasaki
Megumi Shimaoka
Takashi Utagawa
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Abstract

UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE ACIDO 5'' CO O ACIDO 5'' RTIR DE INOSINA O GUANOSINA O PRECURSORES DE LOS MISMOS, UTILIZANDO UN MICROORGANISMO EL CUAL LLEVA UN ADN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA QUE TIENE LA ACTIVIDAD DE FORMACION DE ACIDO 5'' INOSINICO O ACIDO 5'' Y ES CAPAZ DE REPRODUCIR EL ADENOSIN TRIFOSFATO (ATP); UNA NUEVA PROTEINA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE INOSIN-GUANOSINA QUINASA; UN GEN QUE CODIFICA PARA ESTA PROTEINA; UN ADN RECOMBINANTE QUE CONTIENE ESTE GEN Y UN MICROORGANISMO TRANSFORMADO MEDIANTE EL MISMO.

Description

Procedimiento para producir ácidos nucleicos.
Campo técnico
El presente invento se refiere a un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico para el uso en los aliños o similares de inosina o guanosina o un precursor de los mismos usando microorganismos que producen adenosina trifosfato (ATP) que contienen un ADN que codifica una proteína que tiene la actividad de formar un ácido 5'-inosínico o un ácido 5'-guanílico a partir de inosina o guanosina.
Además, el presente invento se refiere a una proteína nueva que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa, un gen que codifica dicha proteína, un ADN recombinante que contiene dicho gen, y un microorganismo que es transformado con dicho ADN recombinante.
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Antecedentes de la técnica
Para producir ácido 5'-inosínico mediante la fosforilación de inosina usando microorganismos, se ha desarrollado hasta el momento un método usando p-nitrofenilfosfato (Publicación de Patente Japonesa Nº 29.858/1964), un método usando ácidos fosfóricos inorgánicos (Publicación de Patente Japonesa N^{os} 1.186/1967 y 44.350/1974), un método usando fosfato de acetilo (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 82.098/1981), y un método usando ATP (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 230.094/1988). Sin embargo, la acumulación de ácido 5'-inosínico que es producida por éstos métodos no ha sido necesariamente satisfactoria. Como un método mejorado de fosforilación de inosina con ATP, un método que comprende obtener un gen que codifica guanosina-inosina de Escherichia coli, preparando una cepa de E. coli que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa aumentada por la técnica de ADN recombinante, y fosforilando guanosina o inosina usando esta cepa para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico, ha sido también desarrollado (documento WO 91/08286, también publicado como documento EP 0458971). Sin embargo, éste método requiere que un microorganismo para regenerar el ATP a ser consumido en la reacción sea cultivado por separado y que sus células sean añadidas a la disolución de la reacción. Consecuentemente, hay una demanda de un método para obtener ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico más eficientemente.
Asimismo, sólo se conoce que el gen guanosina-inosina quinasa está presente en algunos micoorganismos tales como E. coli [J. Gen. Microbiol., 135, 1263 - 1273 (1989)].
Los presentes inventores han desarrollado un proceso para producir ácido 5'-inosínico y/o ácido 5'-guanílico más eficazmente. Por consiguiente, los autores han encontrado que el ácido 5'-inosínico y/o el ácido 5'-guanílico pueden ser producidos fácilmente con un alto rendimiento al introducir un gen que codifica una guanosina-inosina quinasa en un microorganismo que tiene capacidad suficiente para regenerar el ATP a ser consumido en la reacción. También han encontrado una guanosina-inosina quinasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente de la de una guanosina-inosina quinasa derivada de E. coli.
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Descripción del invento
El presente invento se refiere a un proceso para producir fácilmente ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico para el uso en los aliños o similares de inosina o guanosina o un precursor de las mismas en un alto rendimiento. Más específicamente, el presente invento es para proporcionar un proceso en el que un gen que codifica una proteína que tiene la actividad de convertir inosina y/o guanosina en ácido 5'-inosínico y/o ácido 5'-guanílico es introducido en un microorganismo que tiene capacidad suficiente para regenerar el ATP a ser consumido en la reacción, a través del cual el ácido 5'-inosínico y/o el ácido 5'-guanílico son obtenidos fácilmente de forma eficaz con un alto rendimiento en presencia de sólo el microorganismo que tiene el gen introducido sin cultivar por separado otro microorganismo para la regeneración del ATP a ser consumido en la reacción y añadirlo a la disolución de la reacción.
Además, el presente invento es para proporcionar una proteína nueva que puede ser obtenida de microorganismos que pertenecen al Exiguobacterium acetylicum y que tienen la actividad de convertir inosina y guanosina en ácido 5'-inosínico y ácido 5'-guanílico, respectivamente, un gen que codifica dicha proteína, un ADN recombinante que contiene dicho gen, un microorganismo que es transformado con dicho ADN recombinante, y un proceso para producir ácido 5'-inosínico y/o ácido 5'-guanílico usando este microorganismo.
La proteína del presente invento es nueva en tanto que la secuencia de aminoácidos de la proteína del presente invento es enormemente diferente de la de una proteína conocida que tiene actividad guanosina-inosina quinasa. Una guanosina-inosina quinasa derivada de E. coli ha sido ya conocida. Los presentes inventores han encontrado que una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa es también producida en los microorganismos que pertenecen al género Exiguobacterium que no se conocía antes que tuvieran la actividad guanosina-inosina quinasa, y han aislado con éxito esta proteína y clonar el gen que codifica la proteína. Esta proteína es muy diferente de la proteína conocida con respecto a la secuencia aminoácido.
Se ha descubierto por primera vez por los presentes inventores que la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos bastante diferente de la de la proteína conocida que tiene la actividad guanosina-inosina, tiene la misma actividad que la proteína conocida.
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Es decir, el presente invento se refiere a lo siguiente:
(1) un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico, que comprende poner en contacto un transformante obtenido mediante la introducción de un gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina inosina quinasa en un microorganismo capaz de reproducir ATP, con inosina o guanosina o un precursor de las mismas, una fuente de energía y un donante de fosfato, que acumula ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico en la disolución de la reacción, y que recoge la misma a partir del mismo,
(2) un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según (1), en el que el microorganismo capaz de reproducir ATP pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en Corynebacterium, Escherichia, Sacchromyces, Staphylococcus y Candida,
(3) un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según (1), en el que el microorganismo capaz de reproducir ATP pertenece a Corynebacterium ammoniagenes,
(4) un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según cualquiera de (1) a (3), en el que el gen que codifica la proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa es un gen derivado del Exiguobacterium acetylicum o un gen capaz de hibridar dicho gen,
(5) un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según cualquiera de (1) a (3), en el que el gen que codifica la proteína que tiene actividad quinasa es un gen derivado del Escherichia coli o un gen capaz de hibridar dicho gen,
(6) un transformante obtenido mediante la introducción de un gen que codifica una proteína que tiene actividad quinasa guanosine-inosina en un microorganismo capaz de producir ATP,
(7) un transformante según (6), en el que el microorganismo capaz de reproducir ATP pertenece a un género seleccionado del grupo que consiste en Corynebacterium, Escherichia, Saccharomyces, Staphylococcus y Candida,
(8) un transformante según (6), en el que el microorganismo capaz de reproducir ATP pertenece a Corynebacterium ammoniagenes,
(9) un transformante según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa es un gen derivado del Exiguobacterium acetylicum o un gen capaz de hibridar dicho gen,
(10) un transformante según cualquiera de (6) a (8), en el que el gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa es un gen derivado del Escherichia coli o un gen capaz de hibridar dicho gen,
(11) un ADN recombinante que es capaz de replicar en Corynebacterium ammoniagenes y que contiene un gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa,
(12) un ADN recombinante según (11), en el que el gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa es un gen derivado del Exiguobacterium acetylicum o un gen capaz de hibridar dicho gen,
(13) un ADN recombinante según (11), en el que el gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa es un gen derivado del Escherichia coli o un gen capaz de hibridar dicho gen,
(14) una proteína obtenible de un microorganismo que pertenece a Exiguobacterium acetylicum que tiene actividad guanosina-inosina quinasa las características siguientes:
1. Acción
La enzima transfiere un grupo fosfato a una nucleosida en presencia de un donante de fosfato y forma un nucleósido 5'-monofosfato.
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2. Especificidad de sustrato
Un grupo fosfato en la posición \gamma de un nucleósido trifosfato es transferido al otro nucleósido.
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3. pH óptimo
pH 7,7 - 9,9
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4. Estabilidad de pH
pH 6,7 - 12,1
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5. Temperatura óptima
30 - 50ºC.
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6. Requerimiento de metal
Ión magnesio, ion manganeso, ion cobalto o ion de hierro
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7. Influencia de los iones metálicos
La actividad de la enzima es inhibida fuertemente por el ion cobre y el ion mercurio, y es también inhibida por el ion zinc y el ion cadmio.
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8. Valores de Km
El valor Km es 0,03 mM para guanosina, 1 mM para inosina, y 1,6 mM para ATP cuando la guanosina es usada como un sustrato.
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9. Peso molecular
La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 36 kilodaltones como se ha medido por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
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(15) una proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa y que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 o en la que una parte de los aminoácidos son suprimidos, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 2,
(16) un gen que codifica una proteína según (14) o (15), y
(17) un gen que codifica una proteína que tiene actividad guanosina-inosina, y que tiene una secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 1 o que es capaz de hibridar un gen que tiene dicha secuencia nucleotídica.
En la presente memoria descriptiva, la actividad de inosina fosforilada y guanosina con ATP y que forma el ácido 5'-inosínico y el ácido 5'-guanílico, respectivamente, se refiere a "actividad guanosina-inosina quinasa". La proteína que tiene esta actividad es referida como una "guanosina-inosina quinasa". El microorganismo que tiene capacidad suficiente para regenerar el ATP a ser consumido en la reacción se refiere a "una cepa que produce ATP".
El presente invento será descrito con más detalle más adelante.
La guanosina-inosina quinasa referida en el presente invento es una enzima que cataliza la reacción de fosforilar inosina y guanosina con ATP o similar para formar el ácido 5'-inosínico y el ácido 5'-guanílico, respectivamente. El origen de esta enzima no está particularmente limitado pero se prefiere la guanosina-inosina quinasa derivada de un microorganismo. Incluye no solamente una enzima nueva obtenida de un microorganismo que pertenece a Exiguobacterium acetylicum o similar pero también a una guanosina-inosina quinasa conocida obtenida del E. coli.
La proteína nueva que puede ser obtenida de un microorganismo que pertenece al Exiguobacterium acetylicum o similar y que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa puede ser obtenida por el cultivo de los microorganismos, rompiendo las células obtenidas para preparar un extracto de enzima en bruto, y purificando la enzima del extracto de enzima en bruto. Como un ejemplo de dichos microorganismos, puede ser mencionado el Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.
Taxonómicamente, el Exiguobacterium acetylicum ha sido llamado Brevibacterium acetylicum [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, pp. 1301 - 1313 (1986)]. Sin embargo, como resultado de los análisis genéticos, se propone que el Brevibacterium acetylicum debería ser transferido al género Exiguobacterium como Exiguobacterium acetylicum [Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 74 - 82 (1994)].
La guanosina-inosina quinasa puede ser purificada mediante cualquier método que no afecte la actividad guanosina-inosina quinasa. La purificación es realizada generalmente a través de cromatografía en columna instantánea. Específicamente, la cromatografía en columna de intercambio iónico usando un gradiente de concentración de cloruro de potasio, la cromatografía en columna hidrofóbica usando un gradiente de concentración de sulfato amónico, y la cromatografía en columna de adsorción usando un gradiente de concentración de tampón de fosfato pueden ser usadas en combinación.
En el presente invento, la enzima que puede ser obtenida del microorganismo que pertenece al Exiguobacterium acetylicum y que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa tiene las propiedades siguientes.
1. Acción
La enzima transfiere un grupo fosfato a un nucleósido en presencia de un donante de fosfato y forma un nucleósido 5'-monofosfato.
El donante de fosfato es un nucleósido trifosfato. Ejemplos del nucleósido trifosfato incluyen ATP, 2'-desoxiadenosina trifosfato, guanosina trifosfato, 2'-desoxiguanosina trifosfato y trifosfato de timidina.
Ejemplos del nucleósidos a los que el grupo fosfato es transferido incluyen inosina, guanosina y 2'-desoxiguanosina.
El nucleósido 5'-monofosfato incluye ésteres de 5' monofosfato de los nucleósidos mencionados anteriormente, e 5'-inosinato, 5'-guanilato, 2'-desoxi 5'-guanilato, etc. son dados como ejemplos.
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2. Especificidad de sustrato
Un grupo fosfato en la posición \gamma del nucleósido trifosfato es transferido al otro nucleósido.
Ejemplos del nucleósido trifosfato incluyen ATP, 2'-desoxiadenosina trifosfato, trifosfato de guanosina, trifosfato de 2'-desoxiguanosina y timidina trifosfato.
Ejemplos del otro nucleósido en el que el grupo fosfato es transferido incluyen inosina, guanosina y 2'-desoxiguanosina.
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3. pH óptimo
El pH óptimo está entre 7,7 - 9,9
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4. Estabilidad de pH
La actividad es estable en el intervalo de pH entre 6,7 - 12,1.
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5. Temperatura óptima
La temperatura óptima está entre 30 y 50ºC.
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6. Estabilidad frente a la temperatura.
La enzima es desactivada a 40ºC o mayor.
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7. Requerimiento de metal
Los iones metálicos son requeridos para proceder con la reacción. La reacción procede en presencia de ión magnesio, ión manganeso, ión cobalto o ión hierro.
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8. Influencia de los iones metálicos
La actividad de la enzima es inhibida fuertemente por ión cobre y ión mercurio, y es también inhibida por ión zinc y ión cadmio.
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9. Valores de Km
El valor de Km es 0,03 mM para guanosina, 1 mM para inosina, y 1,6 mM para ATP cuando la guanosina es usada como un sustrato.
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10. Peso molecular
La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 36 kilodaltones como se ha medido por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
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Un fragmento de ADN que contiene el gen estructural que codifica la proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa puede ser obtenido por un método conocido usando una proteína purificada. Ejemplos del método conocido incluyen un método en el que un anticuerpo frente a la proteína anteriormente mencionada es preparado y una librería de expresión de un gen cromosómico es cribada, y un método en el que la secuencia aminoacídica de la proteína purificada es analizada y la librería del gen es cribada usando una sonda que es sintetizada basada en esta secuencia aminoacídica. Como la secuencia aminoacídica, una secuencia aminoacídica interna de la proteína determinada a partir de un polipéptido generado por una digestión de proteína apropiada de la proteína, en adición a la secuencia aminoacídica del extremo N terminal de la proteína. Ejemplos de la sonda incluyen oligonucleótidos sintentizados basados en la secuencia aminoacídica del extremo N terminal o en la secuencia aminoacídica interna, aquellos obtenidos mediante amplificación de una región que corresponde a la secuencia aminoacídica del extremo N terminal o a la secuencia aminoacídica interna a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando un oligonucleótido sintetizado basado en la secuencia, y los obtenidos mediante amplificación de la región correspondiente a una porción del extremo N terminal al aminoácido interno usando oligonucleótidos sintetizados basados en la secuencia aminoacídica del extremo N terminal y la secuencia de aminoácidos interna como cebadores. Además, hay un método en el que un cromosoma está ligado con un oligonucleótido de doble hebra que es llamado casete, y el fragmento deseado es obtenido por PCR usando un cebador de un oligonucleótido formado según la secuencia aminoacídica del extremo N terminal y un cebador formado según la secuencia del casete [Molecular y Cellular Probes, 6, 467 (1992)].
Específicamente, un gen que codifica una proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa de Exiguobacterium acetylicum puede ser obtenido por amplificación de un fragmento de ADN correspondiente a la región del extremo N terminal usando PCR, sintetizando un cebador basado en el fragmento de ADN, y amplificando el fragmento usando PCR con el casete.
La secuencia determinada de 28 aminoácidos en el extremo N terminal de la proteína obtenida a partir del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 es presentada por SEQ ID NO:3 en la lista de secuencias. El aminoácido 18 no fue identificado.
Juzgando por la secuencia de aminoácidos del extremo N terminal, la proteína de Exiguobacterium acetylicum es bastante diferente de la guanosina-inosina quinasa conocida derivada del E. coli, como se describe en el documento WO 91/08286.
Para obtener el gen deseado, el ADN que codifica la porción del extremo N terminal de la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa es amplificada específicamente por PCR usando el cebador sintetizado basado en la secuencia aminoacídica del extremo N terminal mencionada anteriormente y usando el cromosoma del microorganismo que pertenece al Exiguobacterium acetylicum como plantilla, y es clonada. Es comúnmente usado un cebador en el que la composición de bases es aleatoria, el contenido G+C es del 50% aproximadamente, no se forma una estructura secundaria específica, las cadenas no son complementarias unas con otras y la longitud es de 16 a 30 bases. Las secuencias de los cebadores están localizadas en ambos terminales de la secuencia nucleotídica correspondiente a la región del extremo N terminal de la proteína y son mostradas en SEQ ID No: 4 y 5 en el listado de
secuencias.
En la SEQ ID No: 4, el nucleótido 6 es una mezcla de T y C, el nucleótido 9 es una mezcla de A y G, el nucleótido 12 es una mezcla de T, C y A, el nucleótido 15 es una mezcla de T, C, A y G. Y en la SEQ ID No: 5, los nucleótidos 3 y 12 son una mezcla de T y C, el nucleótido 6 es una mezcla de T, C, A y G, los nucleótidos 9 y 15 son una mezcla de A y G.
Después, el cromosoma del microorganismo que pertenece a Exiguobacterium acetylicum es cortado con una endonucleasa de restricción apropiada. Esta sustancia cortada está ligada con el casete para formar una plantilla. Un fragmento de ADN que contiene una porción de gen estructural o la región aguas arriba de la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa es amplificado específicamente por PCR usando la plantilla mencionada anteriormente y el cebador sintetizado según la secuencia nucleotídica correspondiente a la secuencia aminoacídica del extremo N terminal y al cebador sintetizado según el casete, y es clonado. El cebador que satisface las condiciones mencionadas anteriormente, como se muestra en SEQ ID No: 6 y 7 en el listado de secuencias, puede ser usado.
Un vector que es replicable autónomamente en E. coli, usado como un hospedante, puede ser empleado como un vector para clonar el gen. Ejemplos del vector incluyen pUC19, pHSG298, pHSG398 y pBR322. Cualquier cepa que sea adecuada para la replicación del vector puede ser usada como una cepa receptora del ADN recombinante resultante. Ejemplos de la cepa receptora incluyen cepas E. coli tales como HB101, JM109 y DH5.
La secuencia nucleotídica del gen guanosina-inosina quinasa presente en el fragmento de ADN insertado en el vector y la secuencia aminoacídica de la proteína codificada por este gen puede ser determinada por análisis de la secuencia nucleotídica de este fragmento de ADN. La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica de la guanosina-inosina quinasa del ATCC 953 Exiguobacterium acetylicum están representadas por la SEQ ID No: 1 y 2 en el listado de secuencias, respectivamente.
La proteína del presente invento comprende 303 aminoácidos, y el peso molecular es de 32,5 kilodaltones aproximadamente.
La proteína del presente invento incluye no sólo la proteína representada por SEQ ID No: 2 en el listado de secuencias sino también las proteínas obtenidas a partir de las otras cepas que pertenecen a Exiguobacterium acetylicum y otros mutantes naturales que tienen la actividad guanosina-inosina quinasa.
Además, está claro para las personas especializadas en la técnica que las proteínas en las que una parte de la secuencia aminoacídica es sustituida o delecionada, las proteínas en las que los aminoácidos son añadidos a la misma y las proteínas parcialmente modificadas pueden ser usadas siempre y cuando estas proteínas tengan la actividad guanosina-inosina quinasa.
En lugar del gen derivado de Exiguobacterium acetylicum, un gen que es capaz de hibridar el gen puede ser usando mientras codifique la guanosina-inosina quinasa.
El gen que es capaz de hibridar el gen derivado de Exiguobacterium acetylicum puede ser obtenido a partir de las cepas siguientes.
Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652
Kurthia gibsonii ATCC 43195
Kurthia zopfii JCM 6101.
El gen como se menciona anteriormente puede ser obtenido por un método conocido usando la homología. Específicamente, el siguiente método puede ser empleado.
Primero, el ADN cromosómico de cualquiera de los microorganismos mencionados anteriormente es cortado con una endonucleasa de restricción apropiada, y los fragmentos cortados están sometidos a electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos cortados son transferidos a un filtro de transferencia apropiado. Los fragmentos homólogos son detectados por hibridación Southern usando el gen guanosina-inosina quinasa derivado de Exiguobacterium acetylicum como la sonda para determinar la longitud.
Entre los fragmentos cortados con la endonucleasa de restricción, los fragmentos que tienen la longitud deseada son purificados. La purificación es conducida generalmente a través de la centrifugación del gradiente de densidad de sacarosa o recuperada a partir de un gel de agarosa con un polvo de vidrio. Los fragmentos así purificados son ligados con un vector apropiado, y una cepa E. coli es transformada con el vector recombinante así obtenido. El clon que contiene el fragmento deseado que tiene el gen guanosina-inosina quinasa puede ser seleccionado de entre los transformantes resultantes usando el método de hibridación de colonias.
En el presente invento, un gen que codifica una guanosina-inosina quinasa conocida puede ser usado en lugar del gen mencionado anteriormente que codifica la guanosina-inosina quinasa nueva.
Como el gen guanosina-inosina quinasa conocido, el gen derivado de E. coli puede ser usado [J. Gen. Microbiol., 135, 1263 - 1273 (1989); J. Bacteriol. 177, 2236-2240 (1995)], y puede ser obtenido a partir de, por ejemplo, E. coli ATCC 27325.
El gen conocido que codifica la guanosina-inosina quinasa puede ser obtenido usando un método conocido. El gen que codifica la guanosina-inosina quinasa, la cual puede ser usada en el presente invento puede ser también obtenido a partir de un ADN cromosómico de E. coli ATCC 27325 usando el método siguiente.
Primero, los cebadores son sintetizados según la secuencia del gen guanosina-inosina quinasa derivado de E. coli como se representa por la SEQ ID No: 10 en el listado de secuencias (documento WO 91/08286). Son usados comúnmente los cebadores en los que la composición de bases es aleatoria, el contenido en G+C es del 50% aproximadamente, no se forma una estructura secundaria específica, las cadenas no son complementarias unas con otras y la longitud es de 15 a 30 bases. Las secuencias de los cebadores están localizadas en ambos terminales del gen estructural de guanosina-inosina quinasa como se muestra en las SEQ ID Nos. 11 y 12.
Después, el gen estructural guanosina-inosina quinasa puede ser amplificado a partir del ADN cromosómico de E. coli por PCR usando estos cebadores y clonado. Un vector derivado del E. coli, tal como pUC19 y pBR322 es usado. Cualquier cepa receptora que es adecuada para la replicación del vector puede ser usada para el ADN recombinante resultante. Ejemplos de esta cepa receptora incluyen cepas E. coli tales como HB101, JM109 y DH5. De esta manera, es obtenido el vector recombinante que tiene la inserción del fragmento de ADN que contiene el gen guanosina-inosina quinasa de E. coli.
Un gen que es homologo con el gen mencionado anteriormente a partir de E. coli y es capaz de hibridar el gen puede ser usado, como en Exiguobacterium acetylicum, mientras codifica la guanosina-inosina quinasa.
El fragmento de ADN así obtenido que contiene el gen que codifica la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa es introducido en una célula hospedante que puede regenerar el ATP después de recombinarlo de nuevo con el otro vector adecuado o insertar el origen de duplicación.
Un microorganismo que tiene la capacidad suficiente para regenerar el ATP a ser consumido en la reacción a partir de un precursor de ATP (capacidad de producción de ATP) es usado como la célula hospedante.
En el presente invento, el microorganismo que tiene la capacidad de producir ATP puede ser cualquier microorganismo que tiene la capacidad de regenerar el ATP a ser consumido en la reacción de convertir inosina y/o guanosina en ácido 5'-inosínico y/o ácido 5'-guanílico a partir del precursor de ATP en el sistema de reacción a través del cual la reacción puede continuar. Ejemplos de este microorganismo incluyen microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium, Escherichia, Staphylococcus, Saccharomyces o Candida. Los microorganismos pertenecientes al Corynebacterium ammoniagenes que tienen una gran capacidad de producir ATP son preferibles especial-
mente.
A propósito, el Corynebacterium ammoniagenes fue clasificado antes como Brevibacterium ammoniagenes.
Ejemplos específicos de los microorganismos que tienen la capacidad de producir ATP, que son usados en el presente invento, son cepas mostradas a continuación y mutantes derivados del mismo.
Corynebacterium ammoniagenes (nombre anterior: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 6872
Corynebacterium ammoniagenes (nombre anterior: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 21295
Corynebacterium ammoniagenes (nombre anterior: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 21477
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020
Corynebacterium glutamicum (nombre anterior: Brevibacterium flavum) ATCC 14067
Corynebacterium glutamicum (nombre anterior: Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869
Escherichia coli B (ATCC 11303)
Saccharomyces cerevisiae ATCC 20018
Staphylococcus aureus ATCC 4012
Candida zeylanoides ATCC 20356
Candida psychrophila (nombre anterior: Torulopsis psychrophila) ATCC 22163
Además, son preferibles los microorganismos que tienen la actividad de producir ATP en la que la actividad de degradación de la inosina y/o guanosina es débil o deficiente. Los microorganismos siguientes son cogidos de entre los microorganismos mencionados anteriormente.
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21295
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477
Como los microorganismos que producen ATP en el presente invento, las cepas que tienen la capacidad de producir inosina o guanosina a partir del precursor de inosina o guanosina en adición con la capacidad de producir ATP, pueden ser usadas. En este caso, el ácido 5'-inosínico o el ácido 5'-guanílico pueden ser producidos a partir del precursor de inosina o guanosina en lugar de inosina o guanosina. Ejemplos de este precursor incluyen sacáridos tales como la glucosa, sacarosa, molaza y almidón hidrolizado, ácidos orgánicos tales como el ácido acético, y alcoholes tales como glicerol y etanol.
Las cepas que producen ATP que tienen la capacidad de producir inosina o guanosina incluyen:
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21478
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21480
El vector en el que el gen que codifica la guanosina-inosina quinasa es integrado no está limitado particularmente siempre y cuando pueda ser duplicado en el ATP que produce cepas que son las cepas receptoras. Por ejemplo, cuando las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium son usadas como el ATP que produce cepas, son mencionados los plásmidos que pueden ser duplicados autónomamente en estas bacterias. Ejemplos específicos del mismo incluyen pAM330 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 67.699/1983), pHM1519 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 77.895/1983), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 192.900/1983), pCG1 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 134.500/1982), pCG2 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 35.197/1983), pCG4, pCG11 (Solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública Nº 183.799/1982), pGA1 [Gene, 107, 69 (1991)], pHK4 y pHC4 (Solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública Nº 7.491/1993). Cuando la Escherichia coli es usada como el ATP que produce cepa, por ejemplo, plásmido Co1E1, plásmido P15A, plásmido factor R, plásmido factor F y un plásmido fago pueden ser usados. Ejemplos específicos del mismo incluyen pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pACYC184 [J. Bacteriol, 134, 1141 (1978)], y pSC101 [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 70, 3240 (1973)]. Cuando el Saccharomyces cerevisiae es usado como la cepa que produce ATP, pueden ser usados el plásmido YEp, el plásmido YCp, el plásmido YRp y el plásmido YLp. Ejemplos específicos del mismo incluyen YEp24, YRp7 y YCp50. Cuando el Staphylococcus aureus es usado como el ATP que produce cepa, puede ser usado el pRIT5 [EMBO J., 4, 1075 (1985)].
Para expresar el gen que codifica la guanosina-inosina quinasa con una frecuencia alta, es aconsejable que la secuencia promotora y la secuencia SD estén localizadas aguas arriba del gen que codifica la guanosina-inosina quinasa. Un método para introducir estas secuencias no está particularmente limitado. La secuencia promotora y la secuencia SD pueden ser introducidas por un método en el que el gen mencionado anteriormente es insertado aguas abajo de estas secuencias usando el vector que tiene estas secuencias, o un método en el que éstas secuencias son sintetizadas e insertadas aguas arriba del gen mencionado anteriormente. La secuencia promotora y la secuencia SD no están limitadas particularmente. Cuando las bacterias del género Corynebacterium son usadas como el ATP que produce cepas, promotores tac, lac y trp derivados de E. coli, el promotor trp derivado de las bacterias del género Corynebacterium [Gene, 53, 191 (1987)], promotor fda [Mol. Microbiol., 3, 1625 (1989)]. El promotor ppc [Gene, 77, 237 (1989)], promotor lysC (Mol. Microbiol., 5, 1197 (1991)], el promotor gdh [Mol. Microbiol., 6, 317 (1992)], y los promotores csp1 y csp2 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 502.548/1994) pueden ser mencionados. Cuando la Escherichia coli es usada como la cepa que produce ATP, los promotores tac, lac y trp derivados de E. coli y el promotor P_{L} del fago \lambda pueden ser mencionados. Cuando la Saccharomyces cerevisiae es usada como la cepa que produce ATP, los promotores ADH1, ENO1, PGK1, GAP-DH, GAL1, GAL10, GAL7, PH05 y MF\alpha1 pueden ser mencionados. Cuando el Staphylococcus aureus es usado como la cepa que produce ATP, el promotor spa [J. Bacteriol., 159, 713 (1984)] puede ser mencionado.
Un método para introducir el ADN recombinante, que contiene el gen que codifica la proteína que tiene la actividad de convertir inosina y/o guanosina en ácido 5'-inosínico y/o ácido 5'-guanílico, en el microorganismo que produce ATP no está particularmente limitado. Esta introducción puede ser realizada por un método normal. Por ejemplo, cuando las bacterias del género Corynebacterium son usadas como la cepa que produce ATP, el método del protoplasto (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 183.799/1982) y la eletroporación (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 207.791/1990) son especialmente eficaces. Cuando la Escherichia coli es usada como la cepa que produce ATP, el método de cloruro de calcio [J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], el método de Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)], el método SEM (Gene, 96, 23 (1990)), el método de Chung y otros [Pro. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2172 (1989)], electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] pueden ser usados. Hay un método en el que un ADN es introducido preparando células competentes a partir de las células en el estado de proliferación como se indica con respecto al Bacillus subtilis [Gene, 1, 153 (1977)]. Alternativamente, un método en el que las células de una cepa receptora de ADN son formadas en protoplastos o esferoplastos que incorporan fácilmente un ADN recombinante y el ADN recombinante es introducido en esta cepa receptora de ADN, como se indica con respecto al Bacillus subtilis, actinomicetos, y levaduras [Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979), Nature, 274, 398 (1978), y Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] puede ser también usado. Cuando la Saccharomyces cerevisiae es usada como la cepa que produce ATP, el ADN recombinante puede ser introducido por el método de esferoplastos [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], el método de acetato de litio [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], o electroporación ["Methods in Enzymology", 194, 182 (1991)]. Cuando el Staphylococcus aureus es usado como la cepa que produce ATP, la introducción del ADN recombinante puede ser conducida por el método del protoplasto [Plasmid, 5, 292 (1981)].
En el método del protoplasto, la frecuencia alta puede ser obtenida por el método mencionado anteriormente que es usado en el Bacillus subtilis. Sin embargo, como se describe en la Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 183.799/1982, puede ser también utilizado un método en el que un ADN es incorporado en un estado en el que las células de protoplastos de las bacterias que pertenecen al género Corynebacterium son puestas en contacto con o bien el polietilénglicol o el polivinilalcohol y los iones metálicos divalentes. La ingesta del ADN puede ser potenciada por la adición de celulosa de carboximetilo, dextrano, Ficol o plurónico (hecho por Serva Co.) o similar en lugar del polietilén glicol o polivinilalcohol.
El ADN recombinante puede ser introducido en la cepa receptora por el método de electroporacion (referencia a la Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 207.791/1990). El método de transformación usado en los Ejemplos del presente invento es el de electroporación.
Además, el gen guanosina-inosina quinasa puede ser integrado en el ADN cromosómico del microorganismo que produce ATP. El método de integración de este gen en el ADN cromosómico no está particularmente limitado. Por ejemplo, un origen de replicación sensible de temperatura derivado de las bacterias del género Corynebacterium, un gen guanosina-inosina quinasa y un marcador que da resistencia a los antibióticos tales como el cloranfenicol son insertados en un vector plasmídico para formar un ADN recombinante. La bacteria del género Corynebacterium es transformada con este ADN recombinante. El transformante es cultivado en un medio que contiene antibióticos a una temperatura en la que el origen de la replicación sensible a la temperatura no funciona, para formar una cepa transformante en la que el ADN recombinante ha sido integrado en el ADN cromosómico [J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)], y Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 7.491/1993]. O un método usando un elemento genético móvil derivado de las bacterias del género puede ser también usado ["Mobile Genetic Elements", Academic Press, New York (1983), y el documento WO 93/18151].
La actividad guanosina-inosina quinasa puede ser expresada a un nivel alto cultivando el transformante así obtenido del presente invento en el que el ADN recombinante que contiene el gen que codifica la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa ha sido introducido, en un medio de cultivo común que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y opcionalmente nutrientes orgánicos de traza.
Ejemplos de la fuente de carbono incluyen sacáridos tales como glucosa, sacarosa, molaza y almidones hidrolizados; ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido cítrico; y alcoholes tales como etanol. Ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen urea, sales amónicas, amonio acuoso y gas amonio. Ejemplos de las sales inorgánicas incluyen fosfatos, y potasio, magnesio, hierro y sales de manganeso. Ejemplos de los nutrientes orgánicos traza incluyen aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos y ácidos nucleicos así como peptona, extracto de levadura y proteína de soja hidrolizada que contiene cualquiera de éstos.
El cultivo es llevado a cabo aeróbicamente a una temperatura que va desde 25 a 37ºC entre 10 y 40 horas mientras se ajusta el pH entre 5 y 9.
Después de completar el cultivo, la actividad de la guanosina-inosina quinasa acumulada en el cultivo es medida para confirmar la concentración. La actividad puede ser medida por el método descrito en Molec. Gen. Genet. 143, 85 -91 (1975) usando una sustancia obtenida mediante la ruptura de las células recuperadas del cultivo a través de la centrifugación o de similares usando la sonicación o el tratamiento de en prensa francesa, centrifugando las células rotas para eliminar los residuos de células, y eliminar las sustancias moleculares bajas a través de la filtración de gel.
El cultivo de los microorganismos que contienen el gen que codifica la guanosina-inosina quinasa y que tiene la capacidad de sintetizar biológicamente el ATP a partir del precursor ATP, las células separadas de este cultivo, o el producto tratado de las células es contactado con inosina o guanosina o el precursor de las mismas en presencia del donante de energía y el donante de grupo de fosfato, formando de este modo ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico en la disolución de la reacción. Las células pueden ser separadas del cultivo a través de la centrifugación o similar. El producto tratado de las células incluye células tratadas con acetona, células inmovilizadas, células rotas, etc.
Los materiales que son usados preferiblemente en el presente invento son mencionados a continuación.
Los ejemplos del precursor de la inosina o la guanosina incluyen sacáridos tales como glucosa, sacarosa, molaza, almidón hidrolizado, etc.; ácidos orgánicos tales como ácido acético etc.; y alcoholes tales como glicerol, etanol, etc.
Ejemplos del donante de energía incluyen sacáridos tales como glucosa, sacarosa, almidón hidrolizado, molazas, etc.; ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido cítrico, etc.; y alcoholes tales como etanol, etc.
Ejemplos del donante de grupo fosfato incluyen ácidos fosfóricos inorgánicos tales como ácido ortofosfórico, ácido pirofosfórico, ácido polifosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido polimetafosfórico, ácido hexametafosfórico, etc.; sales de estos ácidos inorgánicos; y ácidos fosfóricos orgánicos tales como fosfato de fenilo, fosfato de acetilo, fosfato de carbamilo, etc.
La eficacia de la reacción puede ser mejorada por adición de un precursor de ATP, un tensioactivo, un ion metálico, etc., a la disolución de la reacción.
Ejemplos del precursor de ATP incluyen difosfato de adenosina, ácido adenílico, adenosina, adenina, sal de ácido mineral de adenina, un ácido ribonucleico hidrolizado, etc.
El tensioactivo puede ser un tensioactivo catiónico, aniónico o amfotérico tanto como potencie la fosforilación de la inosina o guanosina. Ejemplos de iones metálicos incluyen ión magnesio, ión manganeso, etc.
En la reacción de fosforilación común usando una combinación de guanosina-inosina quinasa y una cepa que produce ATP, un disolvente orgánico es añadido generalmente al sistema de reacción (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 230.094/1988 y el documento WO 91/08286). Mientras tanto, en el presente invento, la reacción continúa eficazmente incluso cuando el disolvente orgánico es omitido en el sistema de la reacción.
La reacción es realizada aeróbicamente a una temperatura de 25 a 37ºC durante 10 a 30 horas mientras se ajusta el pH entre 6 y 8. Después de completar la reacción, el ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico acumulado en la disolución de la reacción puede ser recogido por tratamiento de resina de intercambio iónico, cristalización o similares.
El mejor modo de llevar a cabo el invento
El presente invento será descrito más específicamente mediante referencia a los Ejemplos siguientes. Sin embargo, el presente invento no está limitado a estos Ejemplos.
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Ejemplo 1
Construcción de un plásmido para expresar un gen guanosina-inosina quinasa derivado de E. coli y la introducción del mismo en Corynebacterium ammoniagenes (1) Amplificación de un gen guanosina-inosina quinasa por PCR y la clonacion del mismo
Los oligonucleótidos que tienen las secuencias que flanquean los extremos 5'- y 3'- del gen guanosina-inosina quinasa derivado de E. coli y los sitios de corte PstI e HindIII de la endonucleasa de restricción, respectivamente, como se muestra en la SEQ ID No: 11 y 12, fueron sintetizados por el método de fosforamidita usando un sintetizador de ADN (Modelo 394, fabricado por Applied Biosystem Co.).
0,25 \mug de estos oligonucleótidos como cebadores, 0,1 \mug del ADN cromosómico de E. coli W3110 (ATCC 27325) preparado por el método de Saito y Miura [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)] como plantilla y 2,5 unidades de la polimerasa de ADN taq (hecha por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos a 0,1 ml de 10 mM de tampón de N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetano (de aquí en adelante referido como "Tris")-hidrocloruro de (pH 8,3) que contiene 200 \muM de dATP, 200 \muM de dCTP, 200 \muM de dGTP, 200 \muM de dTTP, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM y gelatina 0,0001%. La PCR fue llevada a cabo de modo que los tres ciclos de temperatura, a saber, a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 30 segundos, fueron repetidos 25 veces. La disolución de la reacción fue sometida a electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento de ADN deseado fue recuperado usando un polvo de vidrio (hecho por Takara Shuzo Co.).
Aproximadamente 2 \mug de este fragmento de ADN, 20 unidades de endonucleasa PstI y 20 unidades de HindIII fueron mezclados con un tampón de Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, y la mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas. Este producto digerido fue extraído con fenol y precipitado con etanol en una manera normal.
Un microgramo de plásmido ADN pHSG298 (hecho por Takara Shuzo Co.), 20 unidades de endonucleasa de restricción PstI y 20 unidades de endonucleasa de restricción HindIII fueron mezclados con un tampón de Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, y la mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas. Después de completar la incubación, la mezcla de la reacción fue extraída con fenol y precipitada con etanol en una manera normal para obtener el plásmido pHSG298 digerido con PstI e HindIII. 0,1 \mug de este pHSG298 digerido con PstI e HindIII, 0,5 g del fragmento de PCR amplificado digerido con PstI e HindIII y 1 unidad de ADN ligasa T4 fueron añadidos al tampón Tris -hidrocloruro 66 mM (pH 7,5) que contienen cloruro de magnesio 6,6 mM, ditiotreitol 10 mM y ATP 10 mM, y la mezcla fue incubada a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Posteriormente, la E. coli JM109 (hecha por Takara Shuzo Co.) fue transformada con la mezcla de ADN en una manera normal, y fue inoculada en una placa con medio de L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para dar transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos por el método de lisis alcalina descrito en Molecular Cloning 2nd edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 1,25 (1989), y fueron sometidos a la electroforesis del gel de agarosa en una manera normal. El plásmido recombinante en el que el gen guanosina-inosina quinasa fue insertado en el plásmido pHSG298 fue seleccionado. Este plásmido fue designado "pIGK-1".
(2) Inserción del promotor trp del E. coli
Un oligonucleotido que tiene sitios de corte BamHI y PstI de endonucleasa de restricción en los extremos 5' y 3', respectivamente, como se muestra en la SEQ ID NO:13, y un oligonucleótido que tiene la secuencia complementaria, fueron sintetizados. Estos oligonucleótidos en cantidades de 1 \mug cada uno fueron mezclados, tratados a 100ºC durante 5 minutos, y luego enfriados gradualmente para ser hibridados. Esta disolución oligonucleotídica y 20 unidades de BamHI fueron mezclados con un tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y ditiotreitol 1 mM, y la mezcla fue incubada a 30ºC durante 2 horas. El producto digerido resultante fue extraído con fenol y precipitado con etanol. Después, el precipitado así obtenido fue digerido con PstI de la misma manera como en (1), el producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol para obtener el fragmento de ADN que contiene el promotor trp de E. coli y cortado con BamHI y
PstI.
Un microgramo del plásmido recombinante pIGK-1 que contiene el gen guanosina-inosina quinasa obtenido en (1) fue digerido asimismo con BamHI y PstI. La disolución de la reacción fue extraída con fenol y precipitada con etanol en una manera normal para obtener el plásmido digerido con BamHI y PstI. 0,1 \mug de este pIGK-1 digerido con BamHI y PstI, 0,5 g del fragmento obtenido anteriormente digerido con BamHI y PstI y 1 unidad de ADN ligasa T4 (hecha por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos al tampón Tris-hidrocloruro 66 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 6,6 mM, ditiotreitol 10 mM y ATP 10 mM, y la mezcla fue incubada a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Posteriormente, la E. coli JM109 (hecha por Takara Shuzo Co.) fue transformada con la mezcla de ADN, y fue inoculada en una placa con medio L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para obtener transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos por el método de lisis alcalina y fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa en una manera normal para seleccionar un plásmido recombinante en el que el promotor de E. coli trp fue insertado en el plásmido pIGK-1. Este plásmido fue designado "pIGK-2".
(3) Inserción de un origen de replicación derivado del Corynebacterium
Un microgramo del plásmido recombinante pIGK-2 que contiene el gen guanosina-inosina quinasa y el promotor trp obtenido en (2) fue digerido con BamHI en la misma manera como en (2), y el producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. Para impedir la reunión, el plásmido pIGK-2 digerido con BamHI fue sometido a la defosforilacion del fragmento de ADN por el tratamiento usando la fosfatasa alcalina bacteriana según el método descrito en Molecular Cloning 2nd Edition, por J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 1.60 (1989).
Mientras tanto, 1 \mug del plásmido pHC4 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública 7.491/1993) obtenido mediante la inserción de una región de un origen de replicación derivado del Corynebacterium glutamicum en el pHSG399 (hecho por Takara Shuzo Co.) y 10 unidades de endonucleasa de restricción KpnI fueron añadidos a un tampón Tris-hidrocloruro 10 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM y ditiotreitol 1 mM, y la mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas. La disolución de la reacción fue extraída con fenol y el extracto fue precipitado con etanol. Los extremos del pHC4 cortado con KpnI fueron hechos romos por un método prescrito usando un kit para generar extremos romos de ADN (hecho por Takara Shuzo Co.). Una secuencia de unión BamHI fosforilada (hecha por Takara Shuzo Co.) fue unida con este plásmido usando la polinucleotídica ligasa T4 para obtener un fragmento de ADN que tiene el sitio de corte BamHI en ambos lados de una región que contiene el origen de replicación del plásmido derivado del Corynebacterium glutamicum. Este fragmento de ADN y 20 unidades de BamHI fueron mezclados en el mismo tampón como el usado en (2), y la mezcla fue incubada a 30ºC durante 2 horas. La disolución de la reacción fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. 0,1 \mug del plásmido obtenido anteriormente pIGK-2 digerido con BamHI, 0,2 \mug del fragmento de ADN derivado del plásmido pHC4 digerido con BamHI y 1 unidad de ADN ligasa T4 (hecha por Takara Shuzo Co.) fueron mezclados en el mismo tampón como el usado en (1). La mezcla fue incubada a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Posteriormente, la E. coli JM109 (hecha por Takara Shuzo Co.) fue transformada con la mezcla de ADN, y fue inoculada en una placa con medio de L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para obtener transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos por lisis alcalina y fueron sometidos a la electroforesis del gel de agarosa en una manera normal para seleccionar un plásmido recombinante en el que el fragmento de ADN que es duplicable autónomamente dentro del Corynebacterium fue insertado en el plásmido pIGK-2. Este plásmido fue designado "pIGK-3".
La E. coli AJ 12617 que contiene el plásmido pHC4 fue depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japón, el 24 de Abril de 1991 bajo el depósito Nº FERM P-122215. Fue transferido al depósito bajo el Tratado de Budapest el 26 de Agosto de 1991, y fue asignado al depósito Nº FERM BP-3532.
(4) Introducción del pIGK-3 en el Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477
0,1 \mug del pIGK-3 obtenido en (3) fue introducido en el Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477 por un método de transformación normal usando la electroporación (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 207.791/1990). Las células fueron inoculadas en una placa con medio agar que contiene 1% de peptona, 1% de extracto de levadura, 0,5% de cloruro sódico, 0,5% de glucosa y 50 \mug/ml de kanamicina para obtener el transformante ATCC 21477/pIGK-3.
(5) Medida de la actividad guanosina-inosina quinasa del transformante
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 obtenido en (4) fue inoculado en 50 ml de un medio (pH 7,2) que contiene 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura, 5% de glucosa, 0,4% de dihidrógenofosfato potásico, 0,1% de sulfato de magnesio, 0,5% de sulfato amónico, 0,5% de urea, 0,001% de sulfato de hierro, 0,001% de sulfato de manganeso, 0,005 g/litro de hidrocloruro de tiamina, 0,01 g/litro de pantotenato de calcio, 30 \mug de biotina, 0,05% de adenina y 50 mg/litro de kanamicina, y fue cultivado a 32ºC durante 24 horas. El cultivo fue centrifugado en una manera normal para recoger las células.
Una etapa de resuspensión de las células en una disolución de cloruro sódico 0,9% y de centrifugación de la suspensión fue repetida dos veces para lavar las células. Las células resultantes fueron suspendidas en un tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,9) que contiene 20% de glicerol, cloruro de potasio 100 mM y 2-mercaptoetanol 5 mM, y la suspensión fue sonicada a 150 W durante 20 minutos usando un dispositivo fabricado por Kubota K.K. La suspensión así tratada fue centrifugada a 15.000 rpm durante 30 minutos para obtener un sobrenadante. Este sobrenadante fue aplicado a la cromatografía de columna instantánea usando una columna Sephadex G-15 (fabricado por Pharmacia Co.) para eliminar las sustancias de peso molecular bajo y la disolución resultante fue usada como una disolución de enzima en bruto.
La actividad guanosina-inosina quinasa de la disolución de la enzima en bruto resultante fue medida en una mezcla de reacción que contiene Tris 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, ATP 1 mM, cloruro de potasio 250 mM de [8-^{14}C] inosina 0,2 mM. La disolución de la enzima en bruto fue añadida a la mezcla de la reacción, e incubada a 30ºC durante 30 minutos. Una parte de la mezcla de la reacción fue colocada sobre una bandeja de gel de sílice (fabricado por Merck Co.) para terminar la reacción y fue desarrollada con un eluyente que contiene n-butanol, etanol y agua en una relación de volumen de 2:1:1. La mancha de ácido 5'-inosínico fue detectada y determinada usando un analizador Bio-Image (fabricado por Fuji Photo Film Co.). La concentración de proteína de la disolución de la enzima en bruto fue determinada por medio de un kit de ensayo de proteína (fabricado por Bio-Rad Co.) usando albúmina de suero bovina como un estándar, y la actividad específica de la enzima fue calculada. Como un testigo, la actividad específica del ATCC 21477/pHK4, el transformante con el plásmido pHK4, fue medida. Los resultados se muestran en la Tabla 1. El Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 exhibió un alto nivel de la actividad, en la que la actividad de ATCC 21477/pHK4 no fue detectada. De estos resultados, se demostró que el gen introducido derivado de E. coli expresó la actividad guanosina-inosina quinasa en el Corynebacterium ammoniagenes.
El plásmido pHK4 tiene la estructura en la que el promotor trp y el gen guanosina-inosina quinasa son eliminados del pIGK-3, y fue usado como un testigo.
La cepa que alberga el pHK4 en E. coli HB101 fue designada como AJ 13136 y depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japón, el 1 de Agosto de 1995 bajo el Tratado de Budapest con el Nº de acceso FERM BP-5186.
TABLA 1
1
Ejemplo 2
Producción del ácido 5'-inosínico de la inosina usando la cepa que contiene el gen guanosina-inosina quinasa derivada de E. coli
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 fue inoculado en 450 ml de un medio (pH 7,2) que contiene 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura, 5% de glucosa, 0,4% de dihidrógeno fosfato potásico, 0,1% de sulfato de magnesio, 0,5% de sulfato amónico, 0,5% de urea, 0,001% de sulfato de hierro, 0,001% de sulfato de manganeso, 0,005 g/litro de hidrocloruro de tiamina, 0,01 g/litro de pantotenato de calcio, 30 \mug/litro de biotina, 0,05% de adenina y 50 mg/litro de kanamicina, y fue cultivado a 32ºC durante 24 horas. Este cultivo fue centrifugado a 7.000 rpm durante 10 minutos para obtener 20 g de células como un precipitado.
Las células así obtenidas fueron suspendidas en cantidades de 200 g/litro en 20 ml de una disolución de la reacción (pH 7,2) que contiene 50 g/litro de inosina, 20 g/litro de dihidrógeno fosfato potásico, 30 g/litro de glucosa, 5 g/litro de sulfato de magnesio, 10 g/litro de ácido fítico (relación de peso 50%), 4 g/litro de Nymeen S-215 y 1 g/litro de adenina. La mezcla fue incubada a 32ºC con agitación. El pH fue ajustado a 7,2 usando hidróxido de sodio 4 N en tiempos, y una cantidad disminuida de dihidrógeno fosfato potásico fue añadida a la mezcla de la reacción. La reacción fue conducida usando el ATCC 21477/pIGK-4 como un testigo. Después de 30 horas de la reacción, la cantidad de ácido 5'-inosínico en la disolución de la reacción fue determinada por cromatografía líquida de rendimiento alto. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La cantidad de ácido 5'-inosínico acumulado fue indicado en términos de la cantidad de 5'-inosinato disódico 7,5 hidrato. A partir de los resultados, se encontró que la inosina fue convertida en ácido 5'-inosínico por ATCC 21477/pIGK-3 que contiene el gen guanosina-inosina quinasa derivado de E. coli.
TABLA 2
2
Ejemplo 3
Producción de ácido 5'-inosínico a partir de inosina usando la cepa que contiene el gen guanosina-inosina quinasa derivado de E. coli
Las células obtenidas en el Ejemplo 2 fueron suspendidas en una cantidad de 200 g/litro en 50 ml de una disolución de la reacción (pH 7,2) que contiene 60 g/litro de inosina, 20 g/litro de f dihidrógeno fosfato potásico, 30 g/litro de glucosa, 5 g/litro de sulfato de magnesio, 10 g/litro de ácido fítico (relación de peso 50%), 4 g/litro de Nymeen S-215 y 1 g/litro de adenina. La mezcla fue incubada a 32ºC por agitación aeróbica. El pH fue ajustado a 7,2 usando hidróxido sódico 4 N a través de la reacción por monitorización usando un pHmetro y una cantidad disminuida de dihidrógeno fosfato potásico fue añadida a la mezcla de la reacción. Después de 22 horas de la reacción, la cantidad de acumulación de ácido 5'-inosínico fue de 113,8 g/litro, y el rendimiento molar del mismo basado en la inosina añadida fue de aproximadamente 100%.
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Ejemplo 4
Producción del ácido 5'-guanílico a partir de la guanosina usando la cepa que contiene el gen guanosina-inosina quinasa derivada de E. coli
La reacción fue conducida de la misma manera que en el Ejemplo 2 excepto que se usó 1 g/litro de guanosina en lugar de inosina en la disolución de la reacción. Después de 30 horas de la reacción, la cantidad de ácido 5'-guanílico en la mezcla de la reacción fue determinada por cromatografía líquida de alto rendimiento. Como resultado, 0,05 g/litro de ácido 5'-guanílico fueron acumulados como se calculó en términos de 5'-guanilato disódico 6,5 hidrato en la mezcla de la reacción usando ATCC 21477/pIGK-3.
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Ejemplo 5
Purificación de la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa a partir del Exiguobacterium acetylicum y las propiedades del mismo (1) Preparación de las células y un extracto de enzima en bruto
El Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 fue inoculado en 100 ml de un medio (pH 7,2) que contiene 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura bacto, 0,5% de glucosa y 0,5% de cloruro sódico y fue cultivado a 30ºC durante 24 horas. Este cultivo fue inoculado en 2 litros del medio mencionado anteriormente, y fue incubado a 30ºC durante 8 horas. El cultivo así obtenido fue centrifugado a 7000 rpm durante 10 minutos y el precipitado fue lavado dos veces con 0,9% de cloruro sódico para obtener 10 g de células húmedas. Las células fueron suspendidas en 10 ml de un tampón Tris-hidrocloruro 100 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de calcio 100 mM y ditiotreitol 1 mM (tampón A), y fueron molidas por medio de una batidora de bolas (fabricada por Biospeck Co.) usando bolas de vidrio que tienen un diámetro de 0,1 mm. La suspensión fue centrifugada a 15.000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante fue dializado contra el tampón mencionado anteriormente para obtener aproximadamente 20 ml de un extracto de enzima en bruto. La actividad guanosina-inosina quinasa del extracto de la enzima en bruto fue medida por el método siguiente. Cinco microlitros del extracto de la enzima en bruto fueron añadidos a 50 \mul del tampón Tris-hidrocloruro 100 mM (pH 7,5) que contienen cloruro de magnesio 5 mM, ATP 5 mM, cloruro de potasio 100 mM e inosina [8-^{14}C] 0,2 mM. La mezcla de la reacción fue incubada a 30ºC durante 30 minutos. Dos microlitros de la mezcla de la reacción fueron colocados en una placa de gel de sílice (fabricado por Merck Co.) para terminar la reacción y fue desarrollada con un eluyente que contiene n-butanol, etanol y agua en una relación de volumen de 2:1:1. La mancha de ácido 5'-inosínico fue detectada y la cantidad de ácido 5'-inosínico fue determinada usando un analizador de Bio-Imagen (fabricado por Fuji Photo Film Co.). La concentración de la proteína de la disolución de la enzima en bruto fue determinada por medio de un ensayo de proteína (fabricado por Bio-Rad Co.) usando albúmina de suero bovina como un estándar, y la actividad específica de la enzima fue calculada. La actividad guanosina-inosina quinasa del extracto de la enzima en bruto fue de 0,45 nmol/min/mg proteína.
(2) Purificación de la proteína que tiene actividad guanosina-inosina quinasa
El extracto en bruto obtenido en (1) fue aplicado a la columna Toyopearl DEAE (hecha por Tosoh Co.) que ha sido equilibrada con el tampón A. Después de haber sido lavado con el tampón A, la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa fue eluida con el tampón A que contiene cloruro de potasio 200 mM. A 25 ml de la fracción activa así obtenida se añadió sulfato amónico a una saturación del 30%. Después, la mezcla fue agitada a 4ºC durante 30 minutos, el precipitado fue eliminado por centrifugacion. El sobrenadante resultante fue aplicado a la columna Toyopearl Butilo (hecha por Tosoh Co.) que ha sido equilibrada con el tampón A que contiene 30% de sulfato amónico. Después de haber sido lavada con el tampón mencionado anteriormente, la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa fue eluida usando un gradiente de concentración lineal de 200 ml del tampón A que contiene desde 30% a 15% de sulfato amónico. Aproximadamente 15 ml de la fracción activa resultante fueron dializados contra 2 litros de tampón Tris-hidrocloruro 25 mM (pH 7,5) que contienen cloruro potásico 50 mM, ditriotreitol 1 mM y 20% de glicerol (tampón B).
Esta disolución fue centrifugada a 15.000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante resultante fue aplicado a una columna MonoQ FPLC HR5/5 (hecho por Pharmacia Co.) que ha sido equilibrada con el tampón B que contiene cloruro potásico 100 mM. Después de haber sido lavada con el tampón B, la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa fue eluida usando un gradiente de concentración lineal de sulfato amónico desde 100 mM a 500 mM. La fracción activa así obtenida fue dializada frente a 2 litros de tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,4) que contiene ditriotreitol 1 mM y 20% de glicerol (tampón C), y fue aplicado a una columna de hidroxilapatito TSK-GEL HA-1000 (hecha por Tosoh Co.) que ha sido equilibrada con el tampón mencionado anteriormente. Después de haber sido lavado con el tampón mencionado anteriormente, la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa fue eluida usando un gradiente de concentración lineal de 30 ml del tampón C que contiene fosfato potásico desde 10 mM a 500 mM.
Aproximadamente, 6 ml de la fracción activa así obtenida fue aplicada repetidamente a la columna de hidroxilapatito, y la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa fue eluida usando un gradiente de concentración lineal de 30 ml del tampón C que contiene fosfato potásico desde 10 mM a 200 mM. Dos mililitros de la fracción con actividad alta entre las fracciones activas así obtenidas fueron aplicados a una columna Hiload Superdex 200 pg 16/60 de filtración de gel (hecha por Pharmacia Co.) que ha sido equilibrada con tampón Tris-hidrocloruro 25 mM (pH 7,5) que contienen ditriotreitol 1 mM, 20% de glicerol y cloruro de potasio 100 mM, y fueron eluidos con el tampón anteriormente mencionado. Cinco mililitros de 2 ml de la fracción con actividad alta fueron sometidos a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Como resultado, una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 36 kilodaltones fue detectada por la tinción de plata (Nacalai Tesque Co.). Así pues, la proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa derivada del Exiguobacterium acetylicum fue purificada, y el peso molecular del mismo se encontró que era 36 kilodaltones como se midió por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
(3) Propiedades de la guanosina-inosina quinasa derivada de Exiguobacterium acetylicum
La guanosina-inosina quinasa purificada fue añadida al tampón Tris-hidrocloruro 100 mM (pH 7,5) que contienen cloruro de magnesio 5 mM, ATP 5 mM, cloruro de potasio 100 mM y guanosina [8-^{14}C] 0,04 mM. Cincuenta microlitros de esta mezcla de reacción fueron usados como una composición de bases y la reacción fue llevada a cabo a 30ºC durante 10 minutos. La enzima tenía las propiedades siguientes.
1. Acción
La enzima transfiere un grupo fosfato a un nucleósido seleccionado del grupo que consiste en guanosina, inosina y 2'-desoxiguanosina usando como donante fosfato un nucleósido trifosfato seleccionado del grupo que consiste en ATP, 2'-deoxiadenosina trifosfato, guanosina trifosfato, 2'-desoxiguanosina trifosfato y timidina trifosfato, y forma un 5'-monofosfato del nucleósido seleccionado del grupo que consiste en 5'-guanilato, 5'-inosinato y 2-desoxi-5'-guanilato, respectivamente.
2. Especificidad de sustrato
La reacción fue realizada usando 0,5 mM de cada uno de los diversos nucleósidos en lugar de guanosina y ATP [\gamma-^{32}P] en lugar de ATP. El nucleósido 5'fosfato así formado fue medido. Los resultados se muestran en la Tabla 3. La guanosina, inosina y 2'-desoxiguanosina fueron usados como un receptor fosfato.
TABLA 3
3
La reacción fue realizada usando 5 mM de cada uno de los diversos nucleósidos trifosfatos en lugar de ATP, y los posibles donantes de fosfato fueron examinados. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Además del ATP, 2'-desoxiadenosina trifosfato, guanosina trifosfato, 2'-desoxiguanosina trifosfato y trifosfato de timidina fueron usados como el donante de fosfato.
TABLA 4
4
3. pH óptimo
La reacción fue realizada cambiando el tampón de 100 mM a un tampón de acetato sódico-ácido acético (pH 4,2 - 5,6), ácido morforinoetanosulfónico-2 (referido de aquí en adelante como "MES")-tampón de hidróxido sódico (pH 5,4 - 6,3), ácido morforinopropanesulfónico (MOPS)-3-tampón de hidróxido sódico (pH 6,3 - 7,2), tampón Tris-hidrocloruro (pH 7,2 - 8,8), ácido ciclohexilaminopropanosulfónico (referido de aquí en adelante como "CAPS")-tampón de hidróxido sódico (pH 8,8 - 10,4) o tampón de hidróxido sódico -glicina (pH 10,3 - 11,0). El pH óptimo estaba entre 7,7 y 9,9.
4. Estabilidad del pH
La enzima fue tratada a temperatura ambiente durante 30 minutos con tampón de acetato sódico -acetato (pH 1,5 - 5,6), tampón de hidróxido sódico-MES (pH 5,4 - 6,4), tampón de hidróxido sódico-MOPS (pH 6,3 - 7,3), tampón Tris-hidrocloruro (pH 7,2 - 8,8), tampón de hidróxido sódico CAPS (pH 8,9 - 10,4) o tampón de hidróxido sódico-glicina (pH 10,5 - 13,3), cada uno contiene 2,5 mg/ml de albúmina de suero bovina, cloruro de potasio 25 mM, ditiotreitol 0,25 mM y 5% de glicerol. Después, la actividad de la enzima fue medida. Como resultado, la actividad de la enzima fue estable dentro del intervalo de pH entre 6,7 y 12,1.
5. Temperatura óptima
La reacción fue realizada dentro del intervalo de temperaturas entre 16ºC y 60ºC. Como resultado, la temperatura óptima fue entre 30ºC y 50ºC.
6. Estabilidad frente a la temperatura
La enzima fue tratada con tampón Tris-hidrocloruro 12,5 mM (pH 7,5) que contiene 5 mg/ml de albumina de suero bovina, cloruro de potasio 50 mM, ditiotreitol 0,5 mM y 10% de glicerol de 4 a 60ºC durante 30 minutos, y la actividad residual de la enzima fue medida. La actividad de 50% o más fue mantenida tras el tratamiento a 25ºC o menos, y la enzima fue inactivada a 40ºC o más.
7. Requerimiento de metal
La reacción fue realizada cambiando cloruro de magnesio por diversos iones metálicos en la disolución de la reacción. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Se encontró que los iones metálicos fueron requeridos para la actividad, y que la reacción procedió con iones manganeso, iones cobalto e iones hierro distintos de los iones magnesio.
TABLA 5
5
8. Efecto de los iones metálicos
La actividad relativa de la enzima en presencia de 1 mM de diversos iones metálicos en la mezcla de la reacción se muestra en la Tabla 6. La enzima fue inhibida fuertemente por iones cobre e iones mercurio, y fue también inhibida por iones zinc e iones cadmio.
TABLA 6
6
9. Valores de Km
Los valores Km de la enzima que fueron medidos cambiando la concentración del sustrato de la composición de la reacción fueron de 0,03 mM para la guanosina, 1 mM para inosina, y 1,6 mM para el ATP cuando la guanosina fue usada como un sustrato.
10. Peso molecular
La enzima tenía un peso molecular de aproximadamente 36 kilodaltones como se midió por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.
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Ejemplo 6
Aislamiento del gen a partir del cromosoma de Exiguobacterium acetylicum (1) Determinación de una secuencia aminoacídica del extremo N terminal
Aproximadamente 2 ml de la fracción activa obtenida en el Ejemplo 5 (2) fueron concentrados hasta aproximadamente 0,2 ml a través de centrifugación a 6.000 rpm durante 3 horas usando Centricon-10 (fabricado por Amicon Co.). La proteína fue transferida a un filtro a través de la centrifugación usando Prospin (fabricado por Applied Biosystem Co.). Este filtro fue lavado tres veces con 20% de metanol y luego secado. La secuencia aminoacídica de extremo N terminal de la proteína fue determinada usando un secuenciador de proteína 476A (fabricado por Applied Biosystem Co.). La secuencia aminoacídica determinada es representada por la SEQ ID NO:3 en el listado de secuencias. En este listado de secuencias, Xaa representa un aminoácido no identificado. Veintiocho aminoácidos incluyendo un aminoácido no identificado en el extremo N terminal fueron determinados.
(2) Preparación del ADN cromosómico del Exiguobacterium acetylicum y amplificación de la región del extremo N terminal
Tres gramos de células húmedas de Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 fueron obtenidos de 500 ml del cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 5 (1). El ADN cromosómico fue extraído de las células por el método de Saito y Miura [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)].
Según la secuencia aminoacídica del extremo N terminal obtenida en (1), los oligonucleótidos fueron sintetizados. Con respecto a las secuencias nucleotídicas, las mezclas de oligonucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 4 y 5 fueron usadas en consideración de la degeneración de los codones.
0,25 \mumoles de los oligonucleótidos como cebadores, 0,1 \mug de ADN cromosómico de Exiguobacterium acetylicum cómo una plantilla y 2,5 unidades de polimerasa de ADN taq (hecha por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos a 0,1 ml de tampón Tris-hidrocloruro 10 mM (ph 8,3) que contenía dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM y 0,0001% de gelatina. La PCR fue realizada en la que un ciclo de tres temperatura, a saber a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 1 minuto, fue repetido 30 veces. La disolución de la reacción fue sometida a la electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento de ADN amplificado que tiene una longitud de aproximadamente 80 bases fue recuperado usando un polvo de vidrio (hecho por Takara Shuzo Co.). Aproximadamente, 0,2 \mug de este fragmento de ADN fueron añadidos a 50 \mul del tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene 2 unidades del fragmento Klenow, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, mercaptoetanol-2 1mM y cloruro de magnesio 7 mM. La mezcla fue sometida a una reacción de reducción a 37ºC durante 30 minutos. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. El fragmento de ADN así precipitado que tiene los extremos romos fue disuelto en un tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,6) que contiene 10 unidades de polinucleotido quinasa T4, cloruro de magnesio 10 mM, ditiotreitol 5 mM, espermidina 0,1 mM y EDTA 0,1 mM, y fue sometido a una reacción de extremos de fosforilación a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol y el extracto fue precipitado con etanol. El producto de PCR que tiene los extremos romos fosforilados fue recuperado como un
precipitado.
Un microgramo del vector plasmídico pUC18 (hecho por Takara Shuzo Co.) y 20 unidades de endonucleasa de restricción SmaI fueron mezclados con un tampón Tris acetato 33 mM (pH 7,9) que contiene acetato de magnesio 10 mM, acetato potásico 66 mM, ditiotreitol 0,5 mM y 0,01% de albúmina de suero bovina, y la mezcla fue incubada a 30ºC durante 2 horas para obtener un producto digerido. Este producto digerido fue extraído con fenol y precipitado con etanol en una manera normal. Después, para evitar la reunión del fragmento de ADN derivado del vector plasmídico, el fragmento de ADN fue desfosforilado. El fragmento resultante fue extraído con fenol y precipitado con etanol en la manera normal.
0,1 \mug de este pUC18 digerido con SmaI, 0,1 \mug del producto de PCR que tiene los extremos romos fosforilados y una unidad de ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos a 20 \mul del tampón Tris-hidrocloruro 66 mM (pH 7,5) que contienen cloruro de magnesio 6,6 mM, ditiotreitol 10 mM y ATP 10 mM. La mezcla fue incubada a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Posteriormente, la E. coli JM109 (hecho por Takara Shuzo Co.) fue transformada con la mezcla de ADN en una manera normal, y fue inoculado en una placa con medio L que contiene 100 \mug/ml de ampicilina para obtener los transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos a partir de los transformantes por el método de lisis alcalina.
Los plásmidos contenían un fragmento de ADN de aproximadamente 80 bases derivadas del ADN cromosómico del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953. La secuencia nucleotídica del fragmento de ADN fue determinada usando este ADN plasmídico. La determinación de la secuencia nucleotídica fue conducida según el método de Sanger [J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)] usando el kit de secuenciación de Taq DyeDeoxy Terminator cicle (hecho por Perkin Elmer Co.). Así, la secuencia nucleotídica de 83 bases del ADN que corresponde a la región del extremo N terminal de la proteína guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 fue determinada.
(3) Aislamiento del fragmento de ADN que contiene el gen que codifica la guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum
Diez microgramos del ADN cromosómico de Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 preparado en (2) fueron añadidos al tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene 40 unidades de EcoRI, cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, y la mezcla fue incubada a 37ºC durante 32 horas. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol y precipitada con etanol en una manera normal para obtener el ADN cromosómico del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 digerido con EcoRI. Un microgramo de este ADN digerido con EcoRI, 0,05 \mug de casete EcoRI (hecho por Takara Shuzo Co.) y 10 unidades de ADN ligasa T4 fueron añadidos al tampón Tris-hidrocloruro 66 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 6,6 mM, ditiotreitol 10 mM y ATP 10 mM. La mezcla fue incubada a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol y el extracto fue precipitado con etanol para obtener el ADN cromosómico del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligado con el casete EcoRI.
Los oligonucleótidos S1 y S2 que tienen secuencias nucleotídicas mostradas en las SEQ ID NO: 6 y 7 fueron sintetizados según la secuencia determinada en (2).
0,2 \mumoles del oligonucleotido S1 y 0,2 \mumoles del cebador casete C1 (hecho por Takara Shuzo Co.) como cebadores, 0,2 \mug del ADN cromosómico digerido del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligado con casete EcoRI como plantilla y 2,5 unidas de polimerasa de ADN (hecho por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos a 0,1 ml del tampón Tris-hidrocloruro 10 mM (pH 8,3) que contiene dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM y gelatina 0,0001%. La PCR fue realizada en la que un ciclo de tres temperaturas, a saber, a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 3 minutos, fue repetido 25 veces. La PCR fue realizada en las condiciones anteriormente mencionadas usando 1 \mul de la mezcla de reacción como plantilla, y 0,2 \mumoles del oligonucleotido S2 y 0,2 \mumoles del cebador casete C2 (hecho por Takara Shuzo Co.) como cebadores. Una parte de la mezcla de la reacción fue sometida a electroforesis en gel de agarosa. Como resultado, un fragmento de aproximadamente 1.000 pares de bases fueron amplificadas específicamente. Se obtuvo el fragmento de ADN que se extiende desde la región del extremo N terminal de la proteína hasta el sitio de corte del EcoRI aguas abajo del gen.
El fragmento de ADN fue recuperado usando un polvo de vidrio (hecho por Takara Shuzo Co.). Aproximadamente 0,2 \mug de este fragmento de ADN fueron sometidos a una reacción de reducción a 37ºC durante 30 minutos usando el fragmento Klenow. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. El fragmento de ADN recuperado como un precipitado fue sometido a una reacción de fosforilación de extremos a 37ºC durante 1 hora usando polinucleótido quinasa T4. La mezcla de reacción fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. El producto de PCR que tiene los extremos romos fosforilados fue recuperado como un precipitado.
Un microgramo del vector plasmídico pUC18 (hecho por Takara Shuzo Co.) fue tratado con endonucleasa de restricción SmaI a 30ºC durante 2 horas para obtener un producto digerido. Este producto digerido fue extraído con fenol y precipitado con etanol en una manera normal. Posteriormente, el fragmento de ADN fue desfosforilado por tratamiento con fosfatasa alcalina bacteriana, extraído con fenol y precipitado con etanol.
0,1 \mug de este pUC18 digerido con SmaI, 0,1 \mug del producto de PCR que tiene los extremos romos fosforilados y 1 unidad de la ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.) fueron hechos reaccionar a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Después, la E. coli JM109 (hecho por Takara Shuzo Co.) fue transformada con esta mezcla de ADN, e inoculada en una placa con medio de L-agar que contiene 100 \mug/ml de ampicilina para obtener los transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos por el método de lisis alcalina y el plásmido que contiene el fragmento amplificado por PCR fue seleccionado. Este plásmido fue designado como "pCS2".
Los oligonucleótidos complementarios a los oligo-nucleótidos S1 y S2 fueron sintetizados y designados S4 y S3 respectivamente. La amplificación fue realizada por la PCR en las mismas condiciones como se mencionó anteriormente usando el oligonucleotido S3 y el cebador casete C1 (hecho por Takara Shuzo Co.) como cebadores y el producto digerido de ADN cromosómico de Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligado con un casete EcoRI como plantilla. La PCR fue realizada usando la mezcla de la reacción así obtenida como plantilla y el oligonucleotido S4 y el cebador casete C2 (hecho por Takara Shuzo Co.) como cebadores. El fragmento de ADN de aproximadamente 2.300 pares de bases, que se extiende desde la región del extremo N terminal de la proteína hasta el sitio de corte del EcoRI aguas arriba del gen, fue amplificado.
Aproximadamente, 0,2 \mug de este fragmento de ADN fueron sometidos a una reacción de formación de extremos romos a 37ºC durante 30 minutos usando el fragmento Klenow. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. El fragmento de ADN recuperado como un precipitado fue mezclado con 50 \mul del tampón Tris-hidrocloruro 10 mM (pH 7,5) que contiene 10 unidades de endonucleasa de restricción KpnI, cloruro de magnesio 10 mM y ditiotreitol 1 mM. La mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas para obtener el producto digerido. El producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol.
Un microgramo del vector plasmídico pUC18 (hecho por Takara Shuzo Co.), 5 unidades de endonucleasa de restricción KpnI y 5 unidades de endonucleasa de restricción HincII fueron mezclados con 50 \mul de tampón Tris acetato 33 mM (pH 7,9) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 50 mM y ditiotreitol 1 mM. La mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas para obtener un producto digerido. El producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol.
0,1 \mug de este pUC18 digerido con KpnI e HincII, aproximadamente 0,1 \mug del producto de PCR sometido a la reacción de formación de extremos romos y digerida con KpnI fueron hechos reaccionar usando ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.) a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Después, la E. coli JM109 (hecho por Takara Shuzo Co.) fue transformado con esta mezcla de ADN, e inoculada en una placa con medio L-agar que contiene 100 \mug/ml de ampicilina para obtener los transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos a través del método de lisis alcalina. Un plásmido que contiene un fragmento de ADN de aproximadamente 600 pares de bases que se extienden desde la región del extremo N terminal de la proteína hasta el sitio de corte del KpnI aguas arriba del gen seleccionado. Este plásmido fue designado como "pKS4".
(4) Determinación de la secuencia nucleotídica del gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum
Las secuencias nucleotídicas de los plásmidos pCS2 y pKS4 obtenidos en (3) fueron determinadas. La secuencia nucleotídica del que se considera marco de lectura abierto del mismo es representada por la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias. La secuencia aminoacídica del producto por ser considerado de la secuencia nucleotídica es representada por la SEQ ID NO:2 en el listado de secuencias. Esto es, el gen que codifica la proteína que tiene la secuencia aminoacídica representada por la SEQ ID NO:2 en el listado de secuencias es el gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.
La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica fueron comparadas con las secuencias conocidas con respecto a la homología. El EMBL y SWISS-PROT fueron usados como base de datos. Como resultado, se encontró que el ADN representado por la SEQ ID NO:1 en el listado de secuencias y la proteína codificada por este ADN son nuevos, y que la secuencia nucleotídica es menos homóloga que la secuencia que codifica la guanosina-inosina quinasa de E. coli que es el único gen conocido que codifica la guanosina-inosina quinasa, y es bastante diferente del mismo.
La proteína codificada por este gen estaba compuesta de 303 aminoácidos, y el peso molecular de la proteína esperada de la secuencia aminoacídica fue de 32,5 kilodaltones.
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Ejemplo 7
Construcción de un plásmido para expresar la guanosina-inosina quinasa derivada del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 e introducción del mismo en el Corynebacterium ammoniagenes (1) Amplificación del gen guanosina-inosina quinasa por PCR y clonación del mismo
Los oligonucleótidos que tienen la secuencia de flanqueante 5' y 3' del gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum y la endonucleasa de restricción PstI y los sitios de corte SphI, respectivamente, como se muestra en la SEQ ID NO: 8 y 9 fueron sintetizados.
0,25 \mumoles de estos oligonucleótidos como cebadores, 0,1 \mug del ADN cromosómico del Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 preparado en el Ejemplo 6 (2) como plantilla y 2,5 unidades de la ADN polimerasa taq (hecho por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos a 0,1 ml del tampón Tris-hidrocloruro 10 mM (pH 8,3) que contienen dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM y gelatina 0,0001%. La PCR fue realizada en la que un ciclo de tres temperaturas, a saber, a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 30 segundos, fue repetido 25 veces. La mezcla de la reacción fue sometida a electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento de ADN deseado fue recuperado usando polvo de vidrio (hecho por Takara Shuzo Co.). Aproximadamente, 2 \mug de este fragmento de ADN, 10 unidades de endonucleasa de restricción PstI y 10 unidades de endonucleasa de restricción SphI fueron mezclados con 50 \mul del tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y ditiotreitol 1 mM. La mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas para obtener un producto digerido. El producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol.
Un microgramo de plásmido pHSG298 (hecho por Takara Shuzo Co.), 20 unidades de endonucleasa de restricción PstI y 20 unidades de endonucleasa de restricción SphI fueron mezclados con tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y ditiotreitol 1 mM. La mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol y precipitada con etanol en una manera normal para obtener el plásmido pHSG298 digerido con PstI y SphI. 0,1 \mug de este plásmido pHSG298 digerido con PstI y SphI, 0,5 \mug del fragmento amplificado PCR digerido con PstI y SphI y 1 unidad del ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.) fueron añadidos al tampón Tris-hidrocloruro 66 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 6,6 mM, ditiotreitol 10 mM y ATP 10 mM. La mezcla fue incubada a 16ºC durante 8 horas para ligar el ADN. Posteriormente, el E. coli JM109 (hecho por Takara Shuzo Co.) fue transformado con esta mezcla de ADN en una manera normal, y fue inoculado en una placa con medio L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para obtener los transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos por el método lisis alcalina y fueron sometidos a la electroforesis en gel de agarosa. Fue seleccionado un plásmido recombinante en el que el gen guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium acetylicum fue insertado en el plásmido del vector pHSG298. Este plásmido fue designado "pBA-1".
(2) Inserción del promotor trp de E. coli
Un fragmento de ADN que contiene el promotor trp de E. coli cortado con BamHI y PstI fue preparado de la misma manera como en el Ejemplo 1 (2).
Un microgramo del plásmido recombinante pBA-1 que tiene insertado allí el fragmento de ADN que contiene el gen guanosina-inosina quinasa como se obtiene en (1) fue digerido con BamHI y PstI. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol y precipitada con etanol de una manera normal para obtener un plásmido digerido con BamHI y PstI. 0,1 \mug de este plásmido digerido con BamHI y PstI fueron ligados con el fragmento de ADN que contiene el promotor trp de E. coli digerido con BamHI y PstI usando 1 unidad de la ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.). Posteriormente, la E. coli JM109 (hecha por Takara Shuzo Co.) fue transformada con esta mezcla de ADN, y fue inoculada en una placa con medio L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para obtener los transfor-
mantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos, y fueron sometidos a la electroforesis en gel de agarosa. Fue seleccionado un plásmido recombinante en el que el promotor trp de E. coli fue insertado en el plásmido pBA-1. Este plásmido fue designado "pBA-2".
La E. coli AJ 13094 que contiene el plásmido pBA-2 fue depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken 305, Japón, el 27 de Abril de 1995 bajo el Tratado de Budapest con el Nº de acceso FERM BP-5089.
(3) Inserción de un origen de replicación derivado de una bacteria del género Corynebacterium
De la misma manera que en (2), 1 \mug del plásmido recombinante pBA-2 que contiene el gen guanosina-inosina quinasa y el promotor trp obtenido en (2) fue digerido con BamHI. El producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. El precipitado fue digerido con KpnI en la misma manera que en el Ejemplo 6 (2), y el producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. El plásmido así obtenido pBA-2 digerido con BamHI y KpnI fue sometido a la desfosforilacion del fragmento de ADN a través del tratamiento con fosfatasa bacteriana. La sustancia resultante fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol.
Mientras tanto, 1 \mug del plásmido pHC4 (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 7.491/1993) fue digerido asimismo con BamHI y KpnI. El producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. 0,1 \mug del plásmido obtenido anteriormente pBA-2 digerido con BamHI y KpnI fue ligado con 0,2 \mug del fragmento de ADN derivado del plásmido pHC4 digerido con BamHI y KpnI usando el ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.). Posteriormente, la E. coli JM109 (hecha por Takara Shuzo Co.) fue transformada con esta mezcla de ADN, y fue inoculada en una placa con medio L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para obtener los transformantes.
Los plásmidos fueron extraídos de los transformantes así obtenidos por el método de lisis alcalina, y fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa. Fue seleccionado un plásmido recombinante en el que el origen de replicación de una bacteria del género Corynebacterium fue insertado en el plásmido pBA-2. Este plásmido fue designado "pBA-3".
(4) Introducción del pBA-3 en el Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477
0,1 \mug del pBA-3 obtenido en (3) fue introducido en el Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477 por el método de electroporación normal (Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 207.791/1990). Las células transformadas fueron inoculadas en un medio agar que contiene 1% de peptona, 1% de extracto de levadura, 0,5% de cloruro sódico, 0,5% de glucosa y 50 g/ml de kanamicina para obtener el transformante ATCC 21477/pBA-3.
(5) Medida de la actividad guanosina-inosina quinasa de la cepa recombinante
El Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pBA-3 obtenido en (4) fue inoculado en 50 ml de un medio (pH 7,2) que contiene 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura, 5% de glucosa, 0,4% de dihidrógeno fosfato potásico, 0,1% de sulfato de magnesio, 0,5% de sulfato amónico, 0,5% de urea, 0,001% de sulfato ferroso, 0,001% de sulfato de manganeso, 0,005 g/litro de hidrocloruro de tiamina, 0,01 g/litro de pantotenato de calcio, 30 \mug/litro de biotina, 0,05% de adenina y 50 mg/litro de kanamicina, y fue cultivado a 32ºC durante 24 horas. El cultivo fue centrifugado en una manera normal para recoger las células.
La etapa de suspender las células en 0,9% de disolución acuosa de cloruro sódico y de centrifugar la suspensión, fue repetida dos veces para lavar las células. Las células resultantes fueron suspendidas en un tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,9) que contiene 20% de glicerol y cloruro de potasio 100 mM, y la suspensión fue sonicada a 150 W durante 20 minutos y luego centrifugada a 15.000 rpm durante 30 minutos para obtener un sobrenadante. Este sobrenadante fue aplicado a una columna Sephadex G-15 (hecha por Pharmacia Co.) para eliminar las sustancias de peso molecular bajo y la disolución resultante fue usada como una disolución de la enzima en bruto.
La actividad guanosina-inosina quinasa de la disolución de la enzima en bruto fue medida por el método descrito en el Ejemplo 5 (1). En este momento, el ATCC 21477/pHK4, que fue obtenido por la transformación con el plásmido pHK4, fue usado como un testigo. Los resultados se muestran en la Tabla 7. El ATCC 21477/pBA-3 exhibió un alto nivel de la actividad, mientras que ninguna actividad fue observada en el ATCC 21477/pHK4. A partir de estos resultados, se demostró que el gen introducido se derivó del Exiguobacterium acetylicum expresado en la actividad guanosina-inosina quinasa en Corynebacterium ammoniagenes.
El plásmido pHK4 fue usado como un testigo porque tiene una estructura en la que el promotor trp y las regiones del gen guanosina-inosina quinasa son eliminados del pBA-3.
La cepa que alberga el pHK4 en la E. coli HB101 fue designada como AJ 13136 y depositada en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japón, el 1 de Agosto de 1995 bajo el Tratado de Budapest con el Nº de acceso FERM BP-5186.
TABLA 7
7
Ejemplo 8
Producción del ácido 5'-inosínico a partir de la inosina usando las células que contienen el gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum
El Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pBA-3 fue inoculado en 450 ml de un medio (pH 7,2) que contiene 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura, 5% de glucosa, 0,4% de dihidrógeno fosfato potásico, 0,1% de sulfato de magnesio, 0,5% de sulfato amónico, 0,5% de urea, 0,001% de sulfato ferroso, 0,001% de sulfato de manganeso, 0,005 g/litro de hidrocloruro de tiamina, 0,01 g/litro de pantotenato de calcio, 30 \mug/litro de biotina, 0,05% de adenina y 50 mg/litro de kanamicina, y fue cultivado a 32ºC durante 24 horas. El cultivo resultante fue centrifugado a 7.000 rpm durante 10 minutos, para recoger 20 g de las células húmedas como un precipitado.
Las células así obtenidas fueron suspendidas en cantidades de 200 g/litro en 20 ml de una disolución de la reacción (pH 7,2) que contiene 50 g/litro de inosina, 20 g/litro de dihidrógeno fosfato potásico, 30 g/litro de glucosa, 5 g/litro de sulfato de magnesio, 10 g/litro de ácido fítico (relación de peso del 50%), 4 g/litro de Nymeen S-215 y 1 g/litro de adenina. La suspensión fue incubada a 32ºC con agitación. El pH fue ajustado a 7,2 con hidróxido de sodio 4 N a veces, y una cantidad reducida de dihidrógeno fosfato potásico fue añadida a la mezcla de la reacción. La reacción usando el ATCC 21477/pHK4 fue llevada a cabo como un testigo. Después de 30 horas de la reacción, la cantidad de ácido 5'-inosínico en la disolución de la reacción fue determinada a través de cromatografía líquida de alto
rendimiento.
Los resultados se muestran en la Tabla 8. La cantidad de ácido 5'-inosínico acumulada fue indicada en términos de la cantidad de 5'-inosinato disódico 7,5 hidrato. A partir de los resultados, la conversión de la inosina en ácido 5'-inosínico fue observada en ATCC 21477/pBA-3 que expresa la actividad guanosina-inosina quinasa.
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TABLA 8
8 
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Ejemplo 9
Producción del ácido 5'-inosínico a partir de la inosina usando las células que contienen el gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum
Las células obtenidas en el Ejemplo 8 fueron resuspendidas en cantidades de 200 g/litro en 50 ml de una disolución de la reacción (pH 7,2) que contiene 60 g/litro de inosina, 20 g/litro de dihidrógeno fosfato potásico, 30 g/litro de glucosa, 5 g/litro de sulfato de magnesio, 10 g/litro de ácido fítico (relación de peso del 50%), 1 g/litro de Nymeen S-215 y 1 g/litro de adenina. La suspensión fue incubada a 32ºC con agitación aeróbicamente. El pH fue ajustado a 7,2 con hidróxido de sodio 4 N monitorizándolo usando un pH metro, y una cantidad reducida de dihidrógeno fosfato potásico fue añadida a la mezcla de reacción. Después de 30 horas de la reacción, la cantidad de ácido 5'-inosínico acumulada fue de 111,3 g/litro, y el rendimiento molar del mismo basado en la inosina añadida fue aproximadamente del 100%.
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Ejemplo 10
Conversión de la guanosina en ácido 5'-guanílico usando las células que contienen el gen guanosina-inosina quinasa
Las células obtenidas en el Ejemplo 8 fueron resuspendidas en cantidades de 200 g/litro en 50 ml de una disolución de la reacción (pH 7,2) que contiene 25 g/litro de guanosina, 20 g/litro de dihidrógeno fosfato potásico, 30 g/litro de glucosa, 5 g/litro de sulfato de magnesio, 10 g/litro de ácido fítico (relación de peso del 50%), 4 g/litro de Nymeen S-215 y 1 g/litro de adenina. La suspensión fue incubada a 32ºC con agitación aeróbicamente. El pH fue ajustado a 7,2 con hidróxido de sodio 4N por monitoreo usando un medidor de pH. Después de 8 horas de la reacción, la cantidad de ácido 5'-guanílico acumulada fue de 7,3 g/litro, y el rendimiento molar del mismo basado en la guanosina añadida fue aproximadamente del 14%.
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Ejemplo 11
Detección de la actividad guanosina-inosina quinasa en el Exiguobacterium aurantiacum, Kurthia gibsonii y Kurthia zopfii)
El Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652 fue inoculado en 50 ml de un medio (pH 9,7) que contiene, 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura bacto, 0,5% de glucosa, 0,5% de cloruro sódico y 1% de carbonato sódico. Cada uno de los Kurthia gibsonii ATCC 43195 y Kurthia zopfii ATCC 33403 fueron inoculado en 50 ml de un medio (pH 7,2) que contiene 1% de polipeptona, 1% de extracto de levadura bacto, 0,5% de glucosa, 0,5% de cloruro sódico. El cultivo fue llevado a cabo a 30ºC durante 4 horas. Cada uno de los cultivos obtenidos fue centrifugado a 7.000 rpm durante 10 minutos, y el precipitado fue lavado dos veces con 0,9% de cloruro sódico para obtener células húmedas. Las células fueron suspendidas en 3 ml del tampón A y rotas mediante sonicación. La suspensión fue centrifugada a 15.000 rpm durante 30 minutos, y el sobrenadante fue desalado usando una columna Sephadex G-25 (fabricada por Pharmacia Co.), para obtener aproximadamente 3,5 ml de un extracto de enzima en bruto. Cinco microlitros del extracto de enzima en bruto fueron añadidos a 50 \mul de un tampón Tris-hidrocloruro 100 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 5 mM, ATP 5 mM, cloruro de potasio 100 mM, guanosina 0,06 mM y guanosina 0,04 mM [8-^{14}C]. La mezcla fue incubada a 30ºC durante 10 minutos. La cantidad de ácido 5'-guanílico formada fue determinada, y la actividad específica de la guanosina-inosina quinasa fue medida. Los resultados se muestran en la Tabla 9. La actividad guanosina-inosina quinasa fue observada en todas las cepas.
TABLA 9
9 
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Ejemplo 12
Detección de los fragmentos que tienen homología con el gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium acetylicum en cromosomas del Exiguobacterium aurantiacum, Kurthia gibsonii y Kurthia zopfii
El Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652, Kurthia gibsonii ATCC 3195 y Kurthia zopfii ATCC 33403 fueron cultivados a 30ºC durante 16 horas de la misma manera que en el Ejemplo 11. Los ADNs cromosomales fueron preparados a partir de los cultivos respectivos de la misma manera que en el Ejemplo 5 (2). Diez microgramos de cada uno de los ADNs cromosomales y 100 unidades de endonucleasa de restricción EcoRI fueron mezclados con un tampón Tris-hidrocloruro 50 mM (pH 7,5) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y ditiotreitol 1 mM y fueron incubados a 37ºC durante 14 horas. Posteriormente, la mezcla de la reacción fue extraída con fenol y el extracto fue precipitado con etanol en la manera normal. El ADN cromosómico así obtenido digerido por EcoRI fue sometido a electroforesis en gel de agarosa 0,8% y fue transferido a una membrana de nylon (hecha por DuPont Co.) a partir del gel de agarosa por el método de transferencia alcalina descrito en Molecular Cloning 2nd Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 9.31 (1989). La membrana fue sometida a la hibridación a 42ºC durante 14 horas en presencia de 20% de formamida usando como sonda el fragmento que contiene el gen guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium acetylicum. Cuando esta membrana fue lavada con 0,2 x SSC (cloruro sódico 0,03 M y citrato de sodio 3 mM) y 0,1% SDS, los fragmentos homólogos fueron detectados en todas las cepas. Especialmente, el fragmento de aproximadamente 4,6 kb que exhibió la homología más fuerte fue detectado en el cromosoma del Exiguobacterium aurantiacum.
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Ejemplo 13
Aislamiento del fragmento homólogo al gen guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium acetylicum a partir del cromosoma de Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652)
Dieciocho microgramos del ADN cromosómico del Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652 y 200 unidades de endonucleasa de restricción EcoRI fueron reactivados a 37ºC durante 3 horas. La mezcla de la reacción fue extraída con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. Los fragmentos digeridos resultantes fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de aproximadamente 4,6 kb fueron recuperados usando un polvo de vidrio (hecho por Takara Shuzo Co.) para obtener los fragmentos cromosomales del tamaño seleccionado del Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652.
Un microgramo del vector plasmídico pMW218 (hecho por Nippon Gene Co.) fue incubado con 20 unidades de endonucleasa de restricción EcoRI a 37ºC durante 3 horas. El producto digerido fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol. Posteriormente, el fragmento de ADN fue desfosforilado por el tratamiento de fosfatasa alcalina. El fragmento así tratado fue extraído con fenol, y el extracto fue precipitado con etanol.
0,2 \mug de este pMW218 digerido con EcoRI fue ligado con 5 \mug de los fragmentos cromosomales del Exiguobacterium aurantiacum digerido con EcoRI usando el ADN ligasa T4 (hecho por Takara Shuzo Co.). Después, el E. coli JM109 (hecho por Takara Shuzo Co.) fue transformado con la mezcla de ADN, y fue inoculado en una placa con medio L-agar que contiene 100 \mug/ml de kanamicina para obtener aproximadamente 1.000 transformantes.
De entre los transformantes obtenidos, el transformante para ser hibridado con la sonda de ADN fue seleccionado por el método de hibridación de colonias. Un ADN plasmídico fue extraído de este transformante por el método de lisis alcalina. Este plásmido de ADN contenía un fragmento de ADN de aproximadamente 4,6 kb derivado del cromosoma del Exiguobacterium aurantiacum.
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Ejemplo 14
Determinacion de la secuencia nucleotídica del gen guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium aurantiacum
El plásmido obtenido en el Ejemplo 13 fue cortado con endonucleasas de restricción, y fue luego sometido a la hibridación Southern, por lo que identificó el fragmento para ser hibridado con la sonda de ADN. Como resultado, se encontró que un fragmento de aproximadamente 2,7 kb que fue cortado con EcoRI y PstI fue hibridado. Este fragmento de ADN fue ligado con el vector plasmídico pSTV28 (hecho por Takara Shuzo Co.) cortado con EcoRI y PstI e introducido en el E. coli JM109. De entre los transformantes obtenidos, el fragmento para ser hibridado con la sonda de ADN fue clonado por el método de hibridación de colonias descrito en Molecular Cloning 2nd Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 1.90 (1989). La actividad guanosina-inosina quinasa del extracto libre de célula de una cepa E. coli que alberga un plásmido que contiene el fragmento anterior fue medido según el método descrito en el Ejemplo 7 (5), y se encontró que era aproximadamente 300 veces tan alto como la cepa que alberga el vector que fue usado como referencia. Asi pues se confirmó que el fragmento clonado contiene el gen guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium aurantiacum.
La secuencia nucleotídica del fragmento cortado con EcoRI y PstI fue determinada usando el ADN plasmídico así obtenido. La secuencia nucleotídica del marco de lectura abierto que se espera de la secuencia nucleotídica determinada es representada por la SEQ ID NO: 14 en el listado de secuencias. La secuencia aminoacídica del producto por se espera de esta secuencia nucleotídica es representada por la SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias. Ambas secuencias nucleotídicas y la secuencia aminoacídica mostraron una fuerte homología al guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium acetylicum. Sin embargo, el gen fue sin duda un gen nuevo. Es decir, el gen que codifica la proteina que tiene la secuencia aminoacídica representada por la SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias es la del gen guanosina-inosina quinasa del Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652.
Como se menciona anteriormente, un gen capaz de hibridar el gen guanosina-inosina quinasa derivado del Exiguobacterium acetylicum fue obtenido, y se confirmó que este gen codifica una proteína que tiene la actividad guanosina-inosina quinasa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Ajinomoto Co., Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: MÉTODO PARA PRODUCIR ÁCIDOS NUCLEICOS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS:
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Organismo: Exiguobacterium acetylicum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 953
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..909
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1302 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Organismo: Escherichia coli 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA: HM70
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..1302
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: otro ácido nucleico..ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 924 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Organismo: Exiguobacterium aurantiacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 35652
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..654
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 308 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
25
26

Claims (9)

1. Un proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico, que comprende poner en contacto un transformante obtenido mediante la introducción de un gen que codifica una proteína que tiene actividad inosinoa-guanosina quinasa en un microorganismo capaz de regernera ATP a ser consumido en el proceso, que pertenece a un género seleccionado a partir de un grupo que consiste en Corynebacterium y Escherichia, con inosina o guanosina o un precursor del mismo, una fuente de energia seleccionada a partir de un grupo que consiste en sacáridos, ácidos orgánicos y alcoholes, y un donante de fosfato, acumular ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico en la disolución de reacción, y recoger los mismos a partir de este proceso.
2. El proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según la reivindicación 1, en el que el miscroorganismo capaz de regenerar ATP a ser consumido en el proceso pertenece a Corynebacterium ammoniagenes.
3. El proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el gen que codifica una proteína que tiene actividad inosina-guanosina quinasa es un gen derivado de Exiguobacterium acetilicum.
4. El proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según la reivindicación 3, en el que la proteína que tienen actividad inosina-guanosina quinasa es una proteína que consiste en la secueancia aminoacídica ques es mostrada en la SEQ ID No. 2 o SEQ ID NO: 15
5. El proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el gen que codifica para la proteína que tiene actividad inosina-guanosina quinasa es un gen derivado de Eschericha coli.
6. El proceso para producir ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico según la reivindicación 5, en el que el gen que codifica la proteína que tiene la actividad inosina-guanosina quinasa es un gen que consiste en la secuencia nucleotícia, que es mostrada en la SEQ ID No. 10.
7. Una proteína obtenible a partir de un microorganismo que pertenece al Exiguobacterium acetilicum que tiene actividad inosina-guanosina quinasa y las siguientes características:
(1) Acción
La enzima tranfiere un grupo fosfato en un nucleósico en presencia de un donante de fosfato y forma un nucleósico 5'-monofosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Especificidad de sustrato
Un grupo fosfato en la posición gamma de un nucleósico trifosfato es tranferido al otro nucleósido
\vskip1.000000\baselineskip
(3) pH óptimo
pH 7,7-9,9
\vskip1.000000\baselineskip
(4) Estabilidad al pH
pH 6,7-12,1
\vskip1.000000\baselineskip
(5) Temperatura óptima
30-50ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
(6) Requerimientos metálicos
ión magnesio, ión manganeso, ión cobalto o ión hierro
\vskip1.000000\baselineskip
(7) Influencia de los iones metálicos
La actividad de la enzima es fuertemente inhibida por ión cobre e ión mercurio, y es también inhibida por ión zinc e ión cadmio.
\vskip1.000000\baselineskip
(8) valor de Km
valor de Km es 0,03 mM para guanosina, 1 mM para inosina, y 1,6 mM para ATP cuando la guanosina es usada como un sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
(9) Peso molecular
La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 36 kilodaltones como se mide mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
8. Una proteína que tiene actividad inosina-guanosina quinasa y que tiene la secuencia aminoacídica, que es mostrada en la SEQ ID NO: 2.
9. Un gen que codifica una proteína según la reivindicación 7 u 8.
ES96906930T 1995-03-24 1996-03-22 Procedimiento para producir acidos nucleicos. Expired - Lifetime ES2311289T3 (es)

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JP7-102888 1995-03-24
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