TWI836531B - 新穎水解麩醯胺酸ｇｍｐ合成酶變體及使用該變體以製造嘌呤核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本申請係關於一種水解麩醯胺酸GMP合成酶變體以及使用該變體製造嘌呤核苷酸的方法。
Description
本揭露係關於水解麩醯胺酸GMP合成酶變體及使用該變體以製造嘌呤核苷酸的方法。
嘌呤核苷酸係一種核酸系材料，其廣泛用於食品調味添加劑或食品，並作為一種增強風味的核酸系調味料受到關注。
對於嘌呤核苷酸的製造，已經進行了各種研究以開發具有高效生產的微生物和發酵製程技術。例如，主要使用標靶物質特異性方案，如增加編碼參與嘌呤核苷酸生物合成酶的基因的表現或去除生物合成中不必要的基因(EP 3722430 A1和US 2020-0347346 A1)。
隨著對嘌呤核苷酸需求的增加，仍需研究有效的嘌呤核苷酸製造。
本揭露提供一種水解麩醯胺酸GMP合成酶變體。
本揭露的一方面係提供水解麩醯胺酸GMP合成酶變體。
本揭露的另一方面係提供編碼該變體的多核苷酸。
本揭露的又一方面係提供一種微生物，該微生物含有該變體或編碼該變體的多核苷酸。
本揭露的又一方面係提供一種用於製造嘌呤核苷酸的方法，該方法包括培養該微生物。
本揭露的變體可用於高效製造嘌呤核苷酸。
本揭露將具體描述如下。本揭露中所揭露的各個描述和實施態樣亦可應用於其他描述和實施態樣。換言之，本揭露中所揭露的各種要素的所有組合皆落入本揭露的範圍內。此外，本揭露的範圍不受以下具體描述限制。此外，在整個說明書中，參考了許多文獻和專利文件，並提供了它們的引用。引用的文獻和專利文件的揭露內容，以其整體藉由引用併入本說明書中，且本揭露內容所屬之技術領域的等級和本揭露內容的細節得到更清楚的解釋。
本揭露的一方面提供一種水解麩醯胺酸GMP合成酶變體，其中，相應於SEQ ID NO：3中位置29的胺基酸被另一個胺基酸取代。
該水解麩醯胺酸GMP合成酶變體係指在具有水解麩醯胺酸GMP合成酶活性的多肽或水解麩醯胺酸GMP合成酶中，包括從相應於從SEQ ID NO：3的N終端的位置29的胺基酸用另一胺基酸取代的變體。
在本揭露中，「水解麩醯胺酸GMP合成酶」係參予將5’-黃核苷單磷酸(XMP)轉化為5’-鳥苷單磷酸(以下簡稱GMP)的酶。
本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶可為水解麩醯胺酸GMP合成酶或具有水解麩醯胺酸GMP合成酶活性的多肽，對其進行修飾以製備本揭露所提供的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體。
具體地，該多肽可為天然存在的多肽或野生型多肽，或其等的成熟多肽，且可包括其變體或功能片段，包括任何多肽但不限制，只要其可為本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶的親代即可。
在一實施態樣中，本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶可來源於棒狀桿菌屬(genus Corynebacterium)，更具體地，來源於停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)，但不限於此。
在一實施態樣中，本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶可為SEQ ID NO：3的多肽。在一實施態樣中，本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶可為與SEQ ID NO：3的多肽具有至少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且具有與由SEQ ID NO：3的胺基酸序列組成的多肽相同或相應的活性的任何多肽，皆包括但不限制地在水解麩醯胺酸GMP合成酶的範圍內。具體地，水解麩
醯胺酸GMP合成酶可具有、包含或實質上由SEQ ID NO：3中所示的胺基酸序列組成，但不限於此。
本揭露中待突變的水解麩醯胺酸GMP合成酶可為棒狀桿菌屬物種衍生的水解麩醯胺酸GMP合成酶，以及具體地，含有SEQ ID NO：3所示胺基酸序列的多肽/蛋白質或與該合成酶具有相同活性的任意多肽/蛋白質可不受限制地包括在內。例如，多肽/蛋白質可含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與其具有至少80%同源性或一致性的胺基酸序列，但不限於此。具體地，多肽/蛋白質可以包含與SEQ ID NO：3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或一致性的胺基酸序列。在其序列的一部分中具有缺失(deletion)、修飾、取代或加成(addition)的多肽/蛋白質，只要其係具有這種同源性或一致性，並表現出水解麩醯胺酸GMP合成酶活性的多肽/蛋白質，顯然包括在本揭露的待突變多肽/蛋白質的範圍內。
本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶的序列可在已知數據庫NCBI GenBank中獲得。例如，本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶可為由guaA基因編碼的多肽。例如，本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶可來源於停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)、乾酪棒狀桿菌(Corynebacterium casei)或產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)，其實例可為由NCBI參考序列WP_194285183.1、WP_006823296.1或WP_040355890.1表現的酶，但不限於此。
如本文所用，術語「同源性」或「一致性」係指兩個給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的相似程度，且可表示為百分比。術語同源性和一致性經常可以互換使用。
保留(conserved)多核苷酸或多肽的序列的同源性或一致性可由標準比對算法(standard alignment algorithm)所決定，且藉由使用程式所建立的預設空位罰分(default gap penalties)亦可一同使用。實質上，同源或相同的序列通常可在中度或高度嚴格(stringent)條件下以整體或部分彼此雜交。顯然，雜交還包括與多核苷酸的雜交，該多核苷酸含有常用密碼子或考慮到多核苷酸中的密碼子簡併性的密碼子。
在任何兩個多核苷酸或多肽序列之間的同源性、相似性或一致性可使用諸如「FASTA」程式之已知電腦演算法，運用由例如在Pearson等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444所用的預設參數而決定。或係在歐洲分子生物學開放軟體套件(European Molecular Biology Open Software Suite，EMBOSS)組合(Rice等人，2000,Trends Genet.16：276-277)(5.0.0或更新之版本)之Needleman程式中執行的Needleman-Wunsch演算法(1970,J.Mol.Biol.48：443-453)可被用於決定上述同源性、相似性或一致性(包括GCG程式組合(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人，J MOLEC BIOL 215：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994，和CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可使用來自國家生物技術資訊中心
資料庫(National Center for Biotechnology Information database)的BLAST或ClustalW來決定上述同源性、相似性或一致性。
多核苷酸或多肽之間的同源性、相似性或一致性可藉由使用GAP電腦程式比對序列訊息來決定，例如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48：443，如由Smith和Waterman Adv.Appl.Math(1981)2：482所揭露。簡言之，GAP程式將同源性、相似性或一致性界定為藉由將相似的經對齊的符號(即核苷酸或胺基酸)的數量除以兩個序列中較短者的符號總數而獲得的值。GAP程式的預設參數可包括：(1)二進位比較矩陣(包含表示一致性的數值1和表示非一致性的數值0)以及如揭露於Schwartz和Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中的Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14：6745之加權比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣)；(2)對各空位(gap)之3.0的罰分(penalty)以及各空位中的每個符號額外0.10的罰分(或是一個空位開啟10罰分，且一個空位延伸0.5罰分；(3)對終端空位無懲罰。
如本文所用，術語「變體(variant)」係指與在突變前藉由至少一個胺基酸的保留取代和/或修飾的胺基酸序列相比，具有不同的序列但維持功能或性質的多肽。這種變體通常可以藉由修飾多肽的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸並評估修飾多肽的性質來鑑定。換言之，與突變前的多肽相比，變體的能力可增加、不變或降低。一些變體可以包括其中至少一個部分，如N-末端前導序列或跨膜結構域被去除的變體。其他變體可以包括其中成熟蛋白質的N-末端和/或C-末端的一部分經去除的變體。術語「變體」也可與「修飾(modification)」、「經修飾的蛋白質(modified protein)」、
「經修飾的多肽(modified polypeptide)」、「突變體(mutant)」、「突變蛋白(mutein)」、「趨異體(divergent)」等互換使用，且在被突變的意義上使用的任何術語皆可不受限地使用。
此外，變體可以包括對多肽的性質和二級結構具有最小影響的胺基酸的缺失或加成。例如，共轉譯(co-translationally)或翻譯後(post-translationally)蛋白質的N末端的訊號(或前導)序列引導蛋白質的轉化，可與變體的N末端綴合(conjugate)。此外，變體還可以與另一序列或接頭綴合，如此以鑑定、純化或合成變體。
在本揭露提供的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體可為含有胺基酸序列的多肽，其中，相應於SEQ ID NO：3的位置29的胺基酸被另一個胺基酸取代。具體地，其他胺基酸可選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸和組胺酸。
「另一個胺基酸(another amino acid)」不受限制，只要該胺基酸與取代前的胺基酸不同即可。即使沒有具體說明「經另一個胺酸取代」，本揭露中的「經特定胺基酸取代」的表述顯然係用與取代前的胺基酸不同的胺酸取代。
在一實施態樣中，本揭露的變體係其中相應於作為參考蛋白質的SEQ ID NO：3的胺基酸序列的位置29的胺基酸係除精胺酸之外的胺基酸。具體地，該變體的SEQ ID NO：3中位置29相應的胺基酸可選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺
酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸和組胺酸。
在一實施態樣中，本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體可包有胺基酸序列，其中相應於在前述SEQ ID NO：3胺基酸序列位置29的胺基酸係除精胺酸之外的胺基酸，且與前述SEQ ID NO：3胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%或99.8%的同源性或一致性。
例如，本揭露提供的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體可由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成或可含有與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%或99.8%的一致性的胺基酸序列，但不限於此。
顯而易見地，即使具有胺基酸序列的一部分為具有缺失、修飾、置換、保留置換或加成的變體，只要該胺基酸序列具有與本揭露變體相應的同源性或一致性並表現出活性，即包含在本揭露的範圍之內。
例如，在胺基酸序列的N-末端、C-末端和/或內部，可能存在序列加成或缺失、自然發生的突變、沉默突變或保留取代，這些不改變本揭露變體的功能。
「保留取代(conservative substitution)」係指一個胺基酸被另一個具有與其相似的結構和/或化學性質的胺基酸取代。這種胺基酸取代通常可基於殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或雙性特性的相似性而發生。通常，保留取代可對蛋白質或多肽的活性影響很小或沒有影響。
如本文所用，術語「相應於(corresponding to)」係指在多肽中列舉的位置處的胺基酸殘基，或與多肽中列舉的殘基相似、相同或同源的胺基酸殘基。在相應位置鑑定胺基酸可決定指稱特定序列的序列之特定胺基酸。如本文所用，術語「相應區域(corresponding region)」通常係指相關蛋白質或參考蛋白質中的相似或相應位點。
例如，任何胺基酸序列與SEQ ID NO：3比對，基於此，該胺基酸序列的各胺基酸殘基可參照相應於SEQ ID NO：3的胺基酸殘基的胺基酸殘基編號位置進行編號。例如，本揭露中描述的序列比對演算法可與查詢序列(也稱為「參考序列」)相比，鑑定胺基酸的位置或修飾發生的位置，例如取代、插入或缺失。
對於這種比對，Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)或EMBOSS套裝軟體的Needle程式EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16：276-277)可做為實施例使用，但不受限於此，可適當地使用本領域已知的序列比對程式、成對序列比較算法等。
本揭露的另一方面提供編碼本揭露變體的多核苷酸。
如本文所用，術語「多核苷酸(polynucleotide)」係指具有超過一定長度的DNA或RNA股作為核苷酸聚合物，其係藉由共價鍵連接核苷酸單體的長鏈。
例如，編碼本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶的多核苷酸可以具有或含有編碼SEQ ID NO：4的核苷酸序列的序列。例如，編碼水
解麩醯胺酸GMP合成酶的多核苷酸可由或實質上由SEQ ID NO：4的序列組成。
考慮到密碼子簡併性(degeneracy)或生物體理想的密碼子，其中，本揭露的變體將被表現出來，本揭露的多核苷酸可在其編碼區中，在本揭露的變體的胺基酸序列不改變的範圍內，進行各種修飾。
具體地，編碼本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體的多核苷酸可以具有或含有與SEQ ID NO：4的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和小於100%的同源性或一致性的核苷酸序列，或者可由或實質上由與SEQ ID NO：4的序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%和小於100%的同源性或一致性的核苷酸序列組成，但不限於此。在具有這種同源性或一致性的序列中，編碼相應於SEQ ID NO：3中位置29的胺基酸的密碼子可為編碼除精胺酸之外的胺基酸密碼子之一。
此外，本揭露的多核苷酸可包括，但不限於，在嚴格條件下，與能夠從已知基因序列製備的探針氫化的序列，例如，與本揭露的多核苷酸序列的一部分或全部互補的序列。術語「嚴格條件(stringent condition)」係指能夠在多核苷酸之間進行特異性雜交的條件。這些條件在文獻中有詳細描述(參見，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；and F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-
11.8)。例如，這樣的條件可以包括具有高同源性或一致性的多核苷酸，如其之間具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性的多核苷酸彼此雜交，但具有同源性或同一性較低的多核苷酸彼此不雜交的條件；或用於典型南方雜交法(Southern hybridization)的洗滌條件，其中洗滌在鹽濃度和溫度下進行，其相應於60℃、1×SSC、0.1% SDS；特別係60℃，0.1×SSC，0.1% SDS；更具體而言，68℃，0.1×SSC，0.1% SDS，一次，特別係兩次或三次。
雜交需要兩個核酸具有互補序列，儘管鹼基之間的錯配可能取決於雜交嚴格性(stringency)。術語「互補(complementary)」用於描述可以相互雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，對於DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本揭露的多核苷酸還可包括與整個序列以及與實質上相似的核酸序列互補的經單離的核酸片段。
具體地，與本揭露的多核苷酸具有同源性或一致性的多核苷酸，可以使用包括Tm為55℃之雜交步驟的雜交條件和利用上述條件來檢測。此外，Tm值可以為60℃、63℃或65℃，但不限於此，所屬技術領域中具有通常知識者可根據目的適當控制。
用於雜交多核苷酸的適當嚴格性取決於多核苷酸的長度和互補程度，且其變量係所屬技術領域中眾所周知的(例如，Sambrook et al.，同上)。
本揭露的又一方面提供一種包括編碼本揭露變體的多核苷酸的載體。載體可係用於在宿主細胞中表現多核苷酸的表現載體，但不限於此。
本揭露的「載體(vector)」可包括DNA建構體(construct)，該DNA建構體含有編碼標靶多肽之多核苷酸之核苷酸序列，可操作地連接到合適的表現控制區(或表現控制序列)，據此在合適的宿主表現標靶多肽。表現控制區可以包括能夠啟動轉錄的啟動子、用於控制這種轉錄的任何操縱子序列、用於編碼合適的mRNA核醣體結合位點的序列、以及用於控制轉錄和轉譯終止的序列。該載體，在轉形到合適的宿主細胞後，可獨立於宿主的基因組進行複製或發揮作用，或可整合到基因組本身中。
本揭露中使用的載體沒有被特別限制，且可使用所屬技術領域已知的任何載體。通常使用的載體的實例可包括天然或重組質體、黏質體、病毒和噬菌體。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌體載體或黏質體載體，以及基於pBR、基於pUC、基於pBluescriptII、基於pGEM、基於pTZ、基於pCL和基於pET的載體可用作質體載體。具體而言，可使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC載體。
例如，可經由用於在細胞中將染色體插入的載體，把編碼標靶多肽的多核苷酸插入染色體。使用所屬技術領域已知的任何方法可施行該多核苷酸插入染色體，例如同源重組，但不限於此。該載體還可包括用於研究染色體插入或不插入的選擇標記。該選擇標記係用於選擇用載體轉
形的細胞，即識別標靶核酸分子的插入，且可使用賦予可選擇的表現型標記，如耐藥性、營養缺陷型、細胞毒性藥物抗性或表面蛋白質的表現。在利用選擇劑處理的情況下，只有表現選擇標記的細胞可存活或表現其他表現型性狀，因而可選擇轉形的細胞。
如本文所用，術語「轉形(transformation)」係指將含有編碼靶多肽的多核苷酸的載體引入宿主細胞或微生物中，以允許由多核苷酸編碼的多肽在宿主細胞中表現。轉形的多核苷酸的實例可包括任何多肽，只要其可在宿主細胞中表現，不管其係插入並位於宿主細胞的染色體或位於染色體之外。此外，多核苷酸的實例包括編碼標靶蛋白質的DNA和/或RNA。該多核苷酸可以以任何形式引入，只要該多核苷酸可以在宿主細胞中引入和表現即可。例如，可以表現匣(expression cassette)的形式引入多核苷酸，該表現匣含有自我表現所需之所有因子的基因建構體。該表現匣通常可包括可操作地連接至多核苷酸的啟動子、轉錄終止訊號、核醣體結合位點和轉譯末端訊號。表現匣可為能夠自我複製的表現載體。此外，該多核苷酸可以其原始形式引入宿主細胞中，可操作地連接宿主細胞中表現所需的序列，但不限於此。
如上所述，術語「可操作地連接(operatively linked)」係指用於啟動和介導編碼本揭露變體之多核苷酸轉錄的啟動子序列與多核苷酸序列之間的功能性連接。
本揭露的又一方面提供微生物，該微生物包括本揭露的變體或編碼該變體的多核苷酸。
本揭露的微生物可以包括本揭露的變體、編碼該變體的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體。
如本文所用，術語「微生物(microorganism)(或菌株(strain))」涵蓋所有野生型微生物或天然或人工遺傳修飾的微生物，係指由於外源基因的插入或內源基因活性的增強或不活化而使特定機制的減弱或增強的微生物，且可為包括用於製造標靶多肽、蛋白質或產物的遺傳修飾的微生物。
本揭露的微生物可為：包括本揭露的變體、編碼本揭露的變體的多核苷酸和包括編碼本揭露變體之多核苷酸之載體中的至少一種的微生物；經修飾以表現本揭露的變體或編碼本揭露的變體之多核苷酸的微生物；表現本揭露的變體或編碼本揭露的變體之多核苷酸的微生物(例如重組菌株)；或具有本揭露的變體之活性的微生物(例如，重組菌株)，但不限於此。
本揭露的微生物可具有嘌呤核苷酸製造能力。
本揭露的微生物可為天然具有水解麩醯胺酸GMP合成酶或嘌呤核苷酸製造能力的微生物，或藉由將本揭露的變體或編碼本揭露的變體的多核苷酸(或包括該多核苷酸的載體)引入沒有水解麩醯胺酸GMP合成酶或嘌呤核苷酸製造能力親代菌株和/或藉由賦予親代菌株嘌呤核苷酸製造能力所獲得的微生物，但不限於此。例如，本揭露的微生物可為具有藉由引入本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體而賦予嘌呤核苷酸製造能力的微生物。例如，本揭露的微生物可為具有藉由引入本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體而增強嘌呤核苷酸製造能力的微生物。然而，本揭露的微生物不限於此。
例如，本揭露的菌株係由包括本揭露多核苷酸或編碼本揭露變體之多核苷酸的載體轉形的細胞或微生物，且因而表現本揭露的變體，且對於本揭露的目的，本揭露的菌株涵蓋藉由包括本揭露內容的變體，可製造嘌呤核苷酸的所有微生物。例如，本揭露的菌株可為藉由將編碼本揭露的變體的多核苷酸引入至天然野生型微生物或製造嘌呤核苷酸的微生物，經由表現水解麩醯胺酸GMP合成酶而具有增強的嘌呤核苷酸製造能力的重組菌株。與天然野生型微生物或水解麩醯胺酸GMP合成酶未經修飾的微生物(即表現野生型水解麩醯胺酸GMP合成酶(SEQ ID NO：3)的微生物或不表現修飾蛋白質的微生物)相比，該重組菌株具有增強的嘌呤核苷酸製造能力，但不限於此。
如本文所用，術語「未經修飾的微生物(non-modified microorganism)」可指野生型菌株或原樣的天然菌株，或由於天然或人工因素引起基因突變的轉形前的菌株，不排除包括可能在微生物中自然發生的突變的菌株。例如，未經修飾微生物可以指未引入本文所述的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體或在其引入之前的菌株。「未經修飾的微生物(non-modified microorganism)」可以與「修飾前的菌株(strain before modification)」、「修飾前的微生物(microorganism before modification)」、「未變異的菌株(non-varied strain)」、「未經修飾的菌株(non-modified strain)」、「未經變異的微生物(non-varied microorganism)」或「參考微生物(reference microorganism)」互換使用。
在一實施態樣中，本揭露的微生物可為棒狀桿菌屬的微生物。例如，本揭露的微生物可為停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)、生
乳棒狀桿菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒狀桿菌(Corynebacterium deserti)、高效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、癒傷組織棒狀桿菌(Corynebacterium callunae)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、奇異棒狀桿菌(Corynebacterium singular)、耐鹽棒狀桿菌(Corynebacterium halotolerans)、紋狀棒狀桿菌(Corynebacterium striatum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒狀桿菌(Corynebacterium pollutisoli)、模擬棒狀桿菌(Corynebacterium imitans)、龜鱉目棒狀桿菌(Corynebacterium testudinoris)或微黃棒狀桿菌(Corynebacterium flavescens)。具體地，本發明的微生物可為停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)，但不限於此。
本文中的術語「嘌呤核苷酸(purine nucleotide)」係指含有基於嘌呤結構的核苷酸。嘌呤核苷酸可為XMP、IMP、GMP或AMP，特別係IMP、XMP或GMP。更具體地說，嘌呤核苷酸可為XMP或GMP，但不限於此。
本揭露的「肌苷5’-單磷酸酯(inosine 5'-monophosphate)或5’-肌苷酸(5'-inosinic acid)(IMP)」和「鳥苷-5’-單磷酸酯(guanosine-5'-monophosphate)或5’-鳥苷酸(5'-guanylic acid)(GMP)」係核酸生物合成代謝系統的中間產物，在體內具有重要的生理作用且廣泛地用於食品、藥品等。具體而言，已知IMP本身賦予牛肉風味，且已知衍生自XMP的GMP賦予蘑菇風味。眾所周知，這兩種材料都增強麩胺酸單鈉鹽(MSG)的風味，且因此作為一種增強風味的核酸系調味料備受關注。
在一實施態樣中，GMP可藉由從XMP轉化而製造，但不限於此。例如，藉由將增加製造的XMP轉化為GMP，可增加GMP的製造量，且因此GMP也包括在本揭露的範圍內。
本發明的「XMP」也稱為黃苷5’-單磷酸酯(xanthosine-5'-monophosphate)或5’-黃苷酸，且可經由IMP脫氫酶的作用由IMP形成，或者經由GMP合成酶的作用轉化為GMP。
如本文所用，術語「製造嘌呤核苷酸的微生物(microorganism producing a purine nucleotide)」涵蓋所有野生型微生物或天然或人工遺傳修飾的微生物，並且係指由於外源基因的插入或內源基因活性的增強或不活化而使特定機制減弱或增強的微生物，其中，該微生物可具有用於標靶嘌呤核苷酸製造的基因突變或增強的活性。
藉由含有本揭露的水解麩醯胺酸GMP合成酶變體，本發明的製造嘌呤核苷酸的微生物可以保持增強的製造靶嘌呤核苷酸的能力。
在一實施態樣中，在本揭露中製造嘌呤核苷酸的微生物或具有製造嘌呤核苷酸能力的微生物，可為其中參與嘌呤核苷酸生物合成的一些基因被增強或減弱，或參與嘌呤核苷酸降解路徑的一些基因被增強或減弱的微生物。
如本文所用，術語多肽活性的「減弱(diminishment)」具有涵蓋與內在活性相比所有活性降低或活性缺乏的概念。該減弱可以與不活化、不足、向下調節、減少、降低、衰減等互換使用。
該減弱還可以包括：由於編碼多肽的多核苷酸的突變等，與原始微生物所擁有的多肽的活性相比，多肽本身的活性降低或消失的情況；
由於抑制編碼多肽的多核苷酸的基因的表現或抑制編碼多核苷酸之多肽或抑制轉譯成多肽，與天然菌株相比細胞中整體多肽的活性和/或濃度(表現濃度)較低的情況；不表現多核苷酸的情況；和/或儘管表現多核苷酸，但多肽沒有活性的情況。「內在活性(intrinsic activity)」係指當菌株或微生物因自然或人為因素引起的基因突變而轉形時，修飾前親代菌株或野生型或未經修飾微生物原始所擁有的特定多肽的活性。該術語可以與「修飾前的活性(activity before modification)」互換使用。多肽的活性與其內在活性相比之多肽的活性的「不活化(inactivation)、不足(deficiency)、減少(decrease)、向下調節(down-regulation)、降低(reduction)或衰減(attenuation)」意指該多肽的活性與轉形前親代菌株或未經修飾微生物原始所擁有的特定多肽的活性相比為較低。
多肽活性的減弱可藉由所屬技術領域已知的任何方法進行，但不限於此，且可藉由應用所屬技術領域熟知的各種方法來實現(例如，Nakashima N.et al.,Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2)：2773-2793,and Sambrook et al.Molecular Cloning 2012,etc.)。
具體地，本揭露之多肽的減弱可以藉由以下方式實現：
1)編碼多肽的基因的一部分或全部的缺失(deletion)；
2)修飾表現控制區(或表現控制序列)以降低編碼多肽的基因的表現；
3)修飾構成多肽的胺基酸序列以消除或減弱多肽的活性(例如，胺基酸序列中至少一個胺基酸的缺失/取代/加成)；
4)修飾編碼多核苷酸的基因序列以消除或減弱多肽的活性(例如，多肽基因的核苷酸序列中的至少一個核苷酸的缺失/取代/加成，以編碼經修飾多肽以消除或減弱該多肽的活性)；
5)編碼多肽的基因轉錄物的起始密碼子或5’-UTR區的核苷酸序列的修飾；
6)引入與編碼多肽的基因轉錄物互補結合的反義寡核苷酸(例如反義RNA)；
7)在夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列的上游加入與編碼多肽的基因的夏因-達爾加諾序列互補的序列，以形成使核醣體不可能附著的二級結構；
8)在編碼多肽(逆轉錄工程(reverse transcription engineering)，RTE)的基因序列的開放閱讀框(open reading frame，ORF)的3’端加入待逆轉錄的啟動子；或
9)自1)至8)項中選擇兩種或更多種的組合，但不特別限於此。
例如，這些描述如下。
編碼第1)項中多肽之基因的部分或全部的缺失可為染色體中編碼內源性標靶蛋白質之全部多核苷酸的消除、用缺失一些核苷酸的多核苷酸替換，或用標記基因替換。
第2)項中的表現控制區(或表現控制序列)的修飾可為經由缺失、插入、非保留或保留取代或其組合在表現控制區(或表現控制序列)的突變，或替換為活性更減弱的序列。表現控制區包括啟動子、操縱子序列、編碼核醣體結合位點的序列和控制轉錄和轉譯終止的序列，但不限於此。
第3)和4)項中的胺基酸序列或多核苷酸序列的修飾可為在多肽的胺基酸序列或編碼多肽的多核苷酸序列中，經由缺失、插入、非保守或保守取代或其組合對序列的修飾、或用經修飾為具有更為減弱活性的胺基酸序列或多核苷酸序列替換或用經改良為不具活性的胺基酸序列或多核苷酸序列替換，因而減弱多肽的活性。例如，可藉由將突變引入多核苷酸序列，以形成終止密碼子來抑制或消除基因的表現。
第5)項中編碼多肽的基因轉錄物的起始密碼子或5’-UTR區之核苷酸序列的修飾可為，例如，用編碼不是內源起使密碼子的另一個具有較低多肽表現率的起始密碼子的取代，但不限於此。
第6)項中引入與編碼多肽的基因轉錄物互補結合的反義寡核苷酸(例如，反義RNA)可以參考，例如，文獻(Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986)。
第7)項中在夏因-達爾加諾序列的上游加入與編碼多肽的基因的夏因-達爾加諾序列互補的序列，以形成使核醣體不可能附著的二級結構，可能使mRNA不可能轉譯或降低其比率。
在第8)項中的編碼多肽的基因序列的開放閱讀框(ORF)的3’末端加入待逆轉錄的啟動子(逆轉錄工程，RTE)，可能使反義核苷酸與編碼多肽的基因轉錄物互補因而降低多肽的活性。
如本文所用，術語多肽活性的「增強(enhancement)」係指與多肽的內在活性相比，多肽的活性增加。增強可以與活化(activation)、向上調節(up-regulation)、過度表現(overexpression)、增加(increase)等，互
換使用。在此，活化、增強、向上調節、過度表現和增加可以包括所有表現出原始不擁有或不表現的活性與內在活性或修飾前的活性相比為增強的活性。「內在活性(intrinsic activity)」係指當菌株或微生物因自然或人為因素引起的基因突變而轉形時，其轉形前親代菌株或未經修飾微生物原始擁有的特定多肽的活性。該術語可以與「修飾前的活性(activity before modification)」互換使用。與其內在活性相比，多肽的活性的「增強(enhancement)」、「向上調節(up-regulation)」、「過度表現(overexpression)」或「增加(increase)」意指提高轉形前親代菌株或未經修飾微生物原始擁有之特定多肽的活性和/或濃度(表現濃度)。
可經由外源多肽的引入或內源多肽的活性增強和/或濃度(表現濃度)來實現增強。多肽活性的增強可以藉由相應多肽的活性程度或表現濃度的增加或從相應多肽製造之產量的增加來鑑定。
多肽活性的增強可藉由所屬技術領域公知的各種方法來實現，且不限定，只要與轉形前的微生物相比該方法能夠增強目標多肽的活性即可。具體地，可使用所屬技術領域中具有通常知識者熟知的基因工程和/或蛋白質工程，其係分子生物學的常規方法(例如，Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012等)，但不限於此。
具體地，本揭露之多肽的增強可藉由以下方式實現：
1)增加編碼多肽的多核苷酸的細胞內複本數；
2)將編碼多肽的染色體的基因表現控制區替換為具有更高活性的序列；
3)修飾編碼多肽的基因轉錄物的起始密碼子或5’-UTR區的核苷酸序列；
4)修飾多肽的胺基酸序列以增強多肽的活性；
5)修飾編碼多肽的多核苷酸序列以增強多肽的活性(例如，修飾多肽基因的多核苷酸序列以編碼經修飾的多肽以增強該多肽活性)；
6)引入展現該多肽活性的外源多肽或編碼該多肽的外源多肽；
7)編碼多肽的多核苷酸的密碼子優化；
8)藉由分析多肽的三級結構所選擇的暴露位點的修飾或化學修飾；或者
9)選自1)至8)項中的兩種或更多種的組合，但不特別限於此。
更具體地，多肽的增強描述如下。
第1)項中編碼多肽的多核苷酸的細胞內複本數的增加，可藉由將載體引入宿主細胞來實現，在宿主細胞中，編碼相應多肽的多核苷酸為可操作地連接且可獨立於宿主進行複製和發揮作用。或者，第1)項的增加可藉由將編碼相應多肽的多核苷酸的一個或多個複本引入宿主細胞的染色體來實現。藉由將可使多核苷酸插入宿主細胞染色體的載體引入至宿主細胞來進行染色體的引入。該多核苷酸如上所述。
第2)項中將編碼多肽的染色體的基因表現控制區替換為具有強活性的序列可為，例如，經由缺失、插入、非保留或保留取代或組合對序列進行修飾或替換為具有較強活性的序列，以進一步增強表現控制區的活性。表現控制區可包括，但不限於，啟動子、操縱子序列、編碼核醣體結合位點的序列、控制轉錄和轉譯終止的序列等。例如，可以用較強的啟動子替換原始的啟動子，但不限於此。
已知較強的啟動子的實施例可以為CJ1至CJ7啟動子(US 7662943 B2)、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL7啟動子、SPL13(sm3)啟動子(US 10584338 B2)、O2啟動子(US 10273491 B2)、tkt啟動子、yccA啟動子等，但不限於此。
第3)項中編碼基因轉錄物的起始密碼子或5’-UTR區的核苷酸序列的修飾可為，例如，用編碼不是內源起始密碼子的具有較高多肽表現率另一個起始密碼子，而不係內源起始密碼子，的核苷酸序列取代，但不限於此。
第4)和5)項中的胺基酸序列或多核苷酸序列的修飾可為經由在多肽的胺基酸序列或編碼多肽的多核苷酸序列中的缺失、插入、非保守或保守取代或其組合的序列修飾，或用經修飾為具有較強活性的胺基酸序列或多核苷酸序列的替換，或用經修飾為具有增加的活性的胺基酸序列或多核苷酸序列的替換，以增強多肽的活性。具體地，可以藉由同源重組將多核苷酸插入至染色體進行替換，但不限於此。本文使用的載體可以復包括用於檢查染色體插入的選擇標記。選擇標記如上所述。
第6)項中引入表現多肽的活性的外源多肽，可為將編碼展現與多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入至宿主細胞。該外源多核苷酸不限於其來源或序列，只要外源多核苷酸展現與多核苷酸相同/相似的活性即可。可藉由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇的任何已知轉化方法進行引入，且可經由在宿主細胞中表現引入的多核苷酸製造多肽並增強其活性。
第7)項中編碼多肽的多核苷酸的密碼子優化，可為內源多核苷酸的密碼子優化以增加其在宿主細胞的轉錄或轉譯，或外源多核苷酸的密碼子優化以允許其在宿主細胞的優化轉錄或轉譯。
第8)項中藉由分析多肽的三級結構選擇的暴露位點的修飾或化學修飾可為，例如，藉由將待分析多肽的序列訊息與儲存現有蛋白質序列訊息的數據庫進行比較，根據序列的相似性確定模板蛋白質候選物，以及鑑定基於此的結構之待修飾或化學修飾之暴露位點的修飾或化學修飾。
這種多肽活性的增強可意味著相應多肽的活性、濃度或表現量級，相對於修飾前野生型或微生物菌株中表現的多肽的活性或濃度為增加的，或從相應多肽製造的產物的量為增加的，但不限於此。
本揭露的微生物中的部分或全部多核苷酸的修飾可以藉由以下方式誘導：(a)基因組編輯採用同源重組或工程化核酸酶(例如，CRISPR-Cas9)，使用用於在微生物的染色體插入的載體或和/或(b)用光處理，例如紫外線和輻射，和/或化學品，但不限於此。修飾基因的部分或全部的方法可以包括藉由DNA重組技術的方法。例如，可將含有與標靶基因同源的核苷酸序列的核苷酸序列或載體引入至微生物以引起同源重組，從而導致基因的部分或全部缺失。待引入的核苷酸序列或載體可以包括顯性選擇標記，但不限於此。
本揭露的又一方面提供一種製造嘌呤核苷酸的方法，該方法包括培養包括本揭露的變體或編碼該變體之多核苷酸的微生物。
本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可包括在培養基中培養包括本揭露的變體、編碼該變體的多核苷酸或包括多核苷酸的載體的微生物。
如本文所用，術語「培養(culture)」係指在適當調整的環境條件下生長本揭露的微生物。本揭露的培養程序可根據本領域已知的適當培養基或培養條件進行。所屬技術領域中具有通常知識者可以根據所選擇的菌株容易地調整這種培養方法。具體地，培養可為分批式、連續式和/或分批進料式，但不限於此。
如本文所用，「培養基(medium)」係指含有作為主要成分的培養微生物所需的營養物質的混合物，其中培養基供應營養物質、生長因子等，包括生存和生長所必需的水。具體地，對於用於培養本發明的微生物的培養基和其他培養條件，可使用任何用於微生物通常培養的培養基而沒有特別限制。然而，本揭露的微生物可在有氧條件下在含有適當碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸和/或維生素的常規培養基中培養，同時可調整溫度及pH等。
具體而言，可在文獻中找到用於棒狀桿菌屬菌株的培養基(“Manual of Methods for General Bacteriology”by the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981))。
在本發明中，碳源可包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖和麥芽糖；糖醇，如甘露醇和山梨糖醇；有機酸，如丙酮酸、乳酸和檸檬酸；和胺基酸，如麩胺酸、甲硫胺酸酸和離胺酸。此外，可使用天然有機營養源，如澱粉水解物、糖蜜、黑帶糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米漿，特別地，可使用碳水化合物，如葡萄糖和無菌預處理糖蜜(即轉化為還原糖類的糖蜜)，且可使用適量的其他碳源而沒有限制。這些碳源可單獨使用或兩種或更多種組合使用，但不限於此。
對於氮源，可使用無機氮源，如氨、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨；胺基酸，如麩胺酸、甲硫胺酸和麩醯胺酸；和有機氮源，如蛋白腖、NZ-胺、肉萃取物、酵母萃取物、麥芽萃取物、玉米漿、酪蛋白水解物、魚類或其分解產物、脫脂豆餅或其降解產物等。這些氮源可單獨使用或以其兩種或更多種組合使用，但不限於此。
磷酸鹽源的實例可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和與其相應的含鈉鹽。對於無機化合物，可使用氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣等，且此外，可包括胺基酸類、維生素類和/或合適的前驅物。這些組成成分或前驅物可以分批或連續方式添加到培養基中。然而，本揭露不限於此。
在本揭露的微生物的培養過程中，培養基的pH可藉由向培養基以適當方式添加化合物如氫氧化銨、氫氧化鉀、胺、磷酸和硫酸，予以調節。此外，可添加消泡劑，如脂肪酸聚二醇酯，以壓制培養過程中的泡沫形成。此外，可向培養基注入氧氣或含氧氣體以維持培養基的好氧(aerobic)狀態，或可注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體，也可不注入氣體，以維持培養基的厭氧(anaerobic)或非好氧(non-aerobic)狀態，但不限於此。
在本揭露的培養中，培養溫度可保持在20℃至45℃，具體為25℃至40℃，並且可進行約10小時至160小時的培養，但不限於此。
藉由本揭露的培養製造的嘌呤核苷酸可釋放到培養基中者可保留在細胞中而不被釋放。
本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可復包括製備本發明的微生物、製備培養微生物的培養基或這些步驟的組合(不分先後，以任意順序)，例如，在培養步驟之前或之後。
本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可復包括從由培養物的培養基(經進行培養的培養基)或微生物回收嘌呤核苷酸。在培養步驟之後可以復包括回收步驟。
回收可為根據用於本揭露的微生物的培養方法，使用所屬技術領域已知的適當方法收集所需的嘌呤核苷酸，培養方法例如分批、連續或進料分批型培養。例如，可使用離心、過濾、用結晶蛋白質沉澱劑處理(鹽析)、萃取、超音波破碎、超濾、透析、各種類型的層析法如分子篩層析法(凝膠過濾)、吸附層析法、離子交換層析法和親和層析法、HPLC，以及這些方法的組合，且可藉由使用所屬技術領域已知的適當方法，從培養基或微生物中回收所需的嘌呤核苷酸。
本揭露的嘌呤核苷酸製造方法可復包括純化步驟。可以藉由使用所屬技術領域已知的適當方法進行純化。在一個示例性實施態樣中，當本揭露的嘌呤核苷酸製造方法包括回收步驟和純化步驟兩者時，回收步驟和純化步驟可以不分先後順序連續或不連續進行，或者可以同時進行或整合為一步驟進行，但不限於此。
在示例性實施例中，本揭露的GMP製造方法可復包括將XMP轉化為GMP。在本揭露的GMP製造方法中，可在培養步驟或覆蓋步驟之後進一步包括轉化步驟。可藉由使用所屬技術領域已知的適當方法來
執行轉化步驟。例如，可使用棒狀桿菌、大腸桿菌或5’-黃苷酸胺基酶(KR 10-0655902 B1、US 2013-0095529 A1等)進行轉化，但不限於此。
在本揭露的方法中，變體、多核苷酸、載體、菌株、嘌呤核苷酸等如上文其他方面所述。
本揭露的又一方面係提供一種用於製造嘌呤核苷酸的組成物，該組成物含有本發明的變體、編碼該變體的多核苷酸、包括載體或本發明的多核苷酸的微生物，該載體包括多核苷酸；藉由培養該微生物獲得的培養基；或其組成物。
本揭露的組成物還可含有通常用於製造嘌呤核苷酸的組成物的任何合適的賦形劑，且該賦形劑的實例可以包括防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等滲劑，但不限於此。
在本揭露的組成物中，變體、多核苷酸、載體、微生物、培養基、嘌呤核苷酸等如上文其他方面所述。
在本揭露的又一方面提供用於增加微生物嘌呤核苷酸製造能力的方法，該方法包括修飾微生物以表現本揭露的變體。
在本申請的方法中，變體、多核苷酸、載體、微生物、培養基、嘌呤核苷酸等如上文其他方面所述。
本揭露的又一方面提供本揭露的變體用於製造嘌呤核苷酸的用途。
本揭露的又一方面提供本揭露的變體、編碼該變體的多核苷酸或包括包含該變體之載體的微生物的用途。
該變體、多核苷酸、載體及微生物等如上文其他方面所述。
[本發明的實施模式]
下面將結合實施例和試驗例對本揭露進行詳細說明。然而，這些實施例和試驗例的出現係為了具體說明本揭露，本揭露的範圍不限於此。
實施例1：guaA合成酶減弱變體的製備
為了探索用於XMP生產的guaA變體，建構guaA突變體庫，編碼該變體的基因。
實施例1-1：含有guaA的載體的製備
為了製備guaA突變體庫，首先建構含有guaA的重組載體。使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的染色體為模板，以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引子進行PCR，及利用TOPO選殖套組(TOPO Cloning Kit(Invitrogen)將擴增產物選殖到pCR2.1載體，得到的載體命名為pCR-guaA。
表1
實施例1-2：guaA突變體庫的建構
以實施例1-1中建構的pCR-guaA載體為模板建構guaA突變體庫。採用易誤PCR(error-prone PCR)套組(Clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)製備，且按照製造商的說明書使用SEQ ID NOS：
7和8的引子隨機突變得到具不同序列的guaA突變體PCR產物。使用TOPO選殖套組(Invitrogen)選殖擴增產物，然後轉形至大腸桿菌DH5α，並在含有康絲菌素(kanamycin)(25mg/L)的LB固體培養基塗菌。收集經轉形的大腸桿菌菌落以萃取質體，命名為pCR-guaA-library。
表2
實施例1-3：庫建構評估與菌株選擇
將實施例1-2中製備的pCR-guaA-library藉由電穿孔轉形到停滯棒狀桿菌ATCC6872野生型菌株中，然後將該菌株塗抹在含有25mg/L康絲菌素的營養培養基，以得到5,000個菌株菌落，其中插入突變基因。各自的菌落被命名為C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)1到C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)5000。
- 營養培養基：1%蛋白腖、1%牛肉萃取物、0.25%氯化鈉、1%酵母萃取物、150mg/L腺嘌呤、150mg/L鳥嘌呤、2%瓊脂、pH 7.2(基於1L蒸餾水)。
將所獲得的5,000個菌落中的每一菌落在壓力下進行高壓滅菌，接種在含有康絲菌素(25mg/L)的100μL種子培養基，在96孔板中在微孔板振盪器(TAITEC)以30℃、1200rpm振盪培養24小時，然後用作種子培養物。將320μL高壓滅菌醱酵培養基(240μL主培養基+80μL分別
滅菌培養基)分配到96深孔板，向其中每一孔接種15μL種子培養物，隨後在與上述相同的條件振盪培養72小時。
為了分析培養物中製造的XMP的量，培養完成後將640μL無菌水分配到培養物中，然後以4000rpm離心15分鐘，然後將3μL上清液轉移到96-孔UV板，向其中分配297μL蒸餾水。接著，用微孔盤讀取器振盪30秒，用分光光度計測定在25℃及260nm波長的吸光度。然後，選擇與野生型菌株相比吸光度增加的10個突變菌株菌落。相比於對照，其他菌落顯示出相似或降低的吸光度。
藉由上述方法重複測定10株選擇之菌株的吸光度，並研究XMP的製造量，且選擇其中一種菌株(C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726)，其與野生菌株相比具有顯著增強的XMP製造能力。
為了驗證最終選擇的菌株的有效性，進行醱酵效價測試(fermentation titer test)。
將停滯棒狀桿菌ATCC6872野生型菌株和所選的C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株接種在含有2.5mL的下述種子培養基的14mL管中，並在30℃以170rpm振盪培養24小時。在含有32mL的下述製造培養基(24mL主培養基+8mL分別的無菌培養基)的250mL角擋燒瓶(corner-baffle flask)中，接種0.7mL種子培養物(seed culture)，並在30℃以170rpm振盪培養75小時。
種子培養基、主培養基和分別的無菌培養基的組成如下。
<XMP Flask種子培養基>
30g/L葡萄糖、15g/L蛋白腖、15g/L酵母萃取物、2.5g/L氯化鈉、3g/L尿素、150mg/L腺嘌呤、150mg/L鳥嘌呤，pH 7.0(基於1L蒸餾水)。
<XMP燒瓶生產培養基(主培養基)>
50g/L葡萄糖、10g/L硫酸鎂、3g/L酵母萃取物、100mg/L氯化鈣、20mg/L硫酸鐵、10mg/L硫酸錳、10mg/L硫酸鋅、0.8mg/L硫酸銅、20mg/L組胺酸、15mg/L胱胺酸、15mg/L β-丙胺酸、100μg/L生物素、5mg/L硫胺素、50mg/L腺嘌呤、25mg/L鳥嘌呤、15mg/L菸鹼酸，pH 7.0(基於1L蒸餾水)。
<XMP燒瓶生產培養基(分別的無菌培養基)>
18g/L磷酸二氫鉀、42g/L磷酸氫二鉀、7g/L尿素、5g/L硫酸銨(基於1L蒸餾水)。
培養結束後，藉由使用HPLC的方法測定XMP產生量的結果如表3所示。
表3
如表3所示，與野生型菌株相比，C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726中製造的XMP濃度為4.83g/L。
實施例1-4：藉由基因定序鑑定突變
為了鑑定C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株的guaA變體的序列，使用SEQ ID NO：8和9的引子將C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株進行PCR和定序。作為與野生型菌株的guaA基因序列比較的結果，C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726菌株被鑑定為包括突變，其中guaA基因中位置29的胺基酸從精胺酸被取代為半胱胺酸(位置85的核苷酸從c取代為t：SEQ ID NO：2)。
鑑定出的變體序列見表4。
表4
在以下實施例中，研究guaA突變是否對XMP產生有影響。
實施例2：guaA變體效果的鑑定
實施例2-1：建構guaA變體表現的載體
為了研究將guaA酶胺基酸序列中的位置29的精胺酸替換為半胱胺酸的變體(R29C；SEQ ID NO：1)對XMP生產的影響，建構用於製備其表現菌株的載體，該載體如下藉由使用質體pDCM2(韓國公開號10-2020-0136813)，在棒狀桿菌(Corynebacterium)染色體中進行基因插入和替換。
藉由使用停滯棒狀桿菌ATCC6872的染色體為模板，連同SEQ ID NOS：10和11以及SEQ ID NOS：12和13的引子對進行PCR。SolgTM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，且PCR擴增條件為：95℃變性5分鐘；30個循環其中95℃變性30秒、58℃退火30秒和72℃聚合60秒；然後72℃聚合反應5分鐘，得到各PCR產物。將擴增產物與先前藉由SmaI限制酶消化製備的pDCM2載體混合，並藉由吉布森組裝(Gibson Assembly)(DG Gibson等人，NATURE METHODS,Vol.6 No.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)進行複製獲得重組質體，其命名為pDCM2-guaA(R29C)。藉由將吉布森組裝試劑和每個基因片段以計算的莫耳數混合來進行複製，然後在50℃下保存1小時。
實施例2-2：guaA變體表現菌株的製備
將上述實施例中建構的pDCM2-guaA(R29C)載體藉由電穿孔轉形到停滯棒狀桿菌ATCC6872菌株中，在含有25mg/L康絲菌素的培養基，選擇藉由同源序列重組將載體插入染色體的菌株。將所選擇的初代菌株進行二次交換(cross-over)，以選擇具有引入標靶基因的突變菌株。藉由使用SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15之引子對的PCR和定序，研
究最終轉形菌株中基因突變的引入，確認的菌株命名為C.st ATCC6872：：guaA(R29C)。
實施例2-3：guaA變體表現菌株的XMP製造能力比較
藉由實施例1-3中的醱酵效價評估方法，研究實施例2-2中所製備之C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株和野生型菌株的XMP製造能力。培養完成後，用HPLC測定XMP的製造量，培養結果見表5。
試驗重複3次，分析結果的平均值見表5。
表5
如表5所示，在C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株中製造的XMP濃度為5.21g/L。
C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株被命名為CN02-2299，於2021年8月9日寄存在布達佩斯條約下的寄存機構韓國微生物保存中心(Korea Microorganism Conservation Center)，寄存號為KCCM13029P。
實施例3：在guaA突變中用其他胺基酸取代胺基酸
實施例3-1：對於guaA突變之胺基酸取代和插入之載體的建構
藉由上述實施例所鑑定的XMP可藉由guaA(R29C)突變產生。為了研究guaA突變的位置重要性，建構用其他胺基酸取代位置29胺基酸的載體，並研究對XMP製造能力的影響。以實施例2-1中建構的pDCM2-guaA(R29C)載體為模板進行定點突變誘發。
具體地，PCR的進行藉由使用以下引子對：SEQ ID NO：10和16以及SEQ ID NO：17和13的引子對、SEQ ID NO：10和18以及SEQ ID NO：19和13的引子對、NOS：10和20以及SEQ ID NOS：21和13的引子對、SEQ ID NOS：10和22以及SEQ ID NOS：23和13的引子對、SEQ ID NOS：10和24以及SEQ ID NOS：25和13的引子對、SEQ ID NOS：10和26以及SEQ ID NOS：27和13的引子對、SEQ ID NOS：10和28以及SEQ ID NOS：29和13的引子對、SEQ ID NOS：10和30和SEQ ID NO：31和13的引子對、SEQ ID NO：10和32以及SEQ ID NO：33和13的引子對、SEQ ID NO：10和34以及SEQ ID NO：35和13的引子對、SEQ ID NO：10和36以及SEQ ID NO：37和13的引子對、SEQ ID NO：10和38以及SEQ ID NO：39和13的引子對、SEQ ID NO：10和40以及SEQ ID NO：41和13的引子對、SEQ ID NO：10和42以及SEQ ID NO：43和13的引子對、SEQ ID NO：10和44以及SEQ ID NOS：45和13的引子對、SEQ ID NOS：10和46以及SEQ ID NOS：47和13的引子對、SEQ ID NOS：10和48以及SEQ ID NOS：49和13的引子對、SEQ ID NOS：10和50以及SEQ ID NOS：51和13的引子對。聚合酶係採用SolgTM Pfu-X DNA聚合酶，PCR擴增條件為：在95℃變性5分鐘；在95℃變性30秒進行30個循環、在58℃退火30秒和在72℃聚合60秒；然後在72℃聚合反應5分鐘，得到各PCR產物。將各擴增產物與預先用SmaI限制酶消化製備的pDCM2載體混合，藉由吉布森組裝法複製得到重組質體，得到的質體訊息見表6。計算莫耳數的吉布森組裝試劑和各自的片段，然後在50℃保存1小時。
表6
實施例3-2：具有以其他胺基酸在guaA變體突變取代之菌株的製備及XMP製造能力的比較
將實施例3-1中得到之用於突變導入的18個載體轉形到停滯棒狀桿菌ATCC6872野生型菌株中，在含有25mg/L康絲菌素的培養基，選擇藉由同源序列重組將載體插入染色體的菌株。對選擇的初代菌株進行二次交換(cross-over)以選擇具有引入標靶基因的突變菌株。藉由使用SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15之引子對的PCR和定序，研究最終轉形菌株中基因突變的引入，菌株名稱根據所插入突變如下表7所示。
表7
對製備的菌株C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株和野生型菌株進行培養，藉由實施例1-3中的醱酵效價評估方法分析XMP濃度。試驗重複3次，分析結果的平均值見表8。
表8
參照表8，與野生型菌株相比，在包括guaA的菌株其中，藉由guaA基因編碼的胺基酸序列中的位置29的胺基酸被除精胺酸以外的其他胺基酸取代，相較於野生型菌株，其被鑑定為製造XMP。即，guaA基因編碼的胺基酸序列中位置29的胺基酸相應於XMP製造中的主要突變位置，更具體地說，當guaA基因編碼的胺基酸序列中的位置29的胺基酸被除精胺酸以外的其他胺基酸取代時(半胱胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、酪胺酸、色胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、天門冬胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸、離胺酸和麩胺酸)取代，含有這種突變的微生物可以大大增加XMP的製造量。
因此可以看出，具有用其他胺基酸取代guaA中位置29胺基酸的變體可有利地用於製造嘌呤核苷酸。
實施例4：guaA變體表現菌株之GMP製造能力的鑑定
藉由以下方法(參見韓國專利號KR 10-0655902 B1和美國專利公開號US 201-0095529 A1)，使用C.st ATCC6872：：guaA(R29C)的XMP培養物作為XMP製造菌株，研究GMP的生產。
C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株藉由實施例1-3中的醱酵效價評價方法進行培養。培養結束後，藉由使用HPLC的方法測定XMP製
造量。對於所製造的XMP成為GMP的轉化反應，以下轉化反應添加劑和大腸桿菌XMP胺基酶被添加到角擋燒瓶內的醱酵液中，在40℃，進行2.5小時的轉化反應。
<轉化反應添加劑>
1.8g/L植酸、4.8g/L硫酸鎂、3mL/L nymeen、2%二甲苯、100mg/L腺嘌呤、7.7g/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、2g/L麩醯胺酸、46g/L葡萄糖。
作為試驗的結果，表示GMP製造量與XMP消耗量的轉化率如表9所示。
表9
如表9所示，由C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株製造的XMP經由轉化反應製造3.54g/L GMP。
因此確定了用另一個胺基酸取代guaA中的位置29胺基酸的變體增加了GMP生產，因此可以看出本揭露提供的變體可有利地用於生產一種嘌呤核苷酸。
如上所述，本揭露所屬技術領域中具有通常知識者將能夠理解，在不悖離其技術精神或基本特徵的情況下，本揭露可以其他特定形式實施。因此，以上描述的實施態樣應被解釋為示例性的而不限制本公開。
本揭露的範圍應理解為，凡因專利申請範圍及其同等物的定義和範圍而產生的變化或修改均落入本揭露的範圍內。
【生物材料寄存】
C.st ATCC6872：：guaA(R29C)菌株被命名為CN02-2299，於2021年8月9日寄存在布達佩斯條約下的寄存機構韓國微生物保存中心(Korea Microorganism Conservation Center)，寄存號為KCCM13029P。
Claims (11)
- 一種水解麩醯胺酸GMP合成酶變體，其中，相應於SEQ ID NO：3中的位置29的胺基酸被另一個胺基酸取代，且該另一種胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸和組胺酸。
- 一種編碼如請求項1所述之水解麩醯胺酸GMP合成酶變體的多核苷酸。
- 一種微生物，其包含水解麩醯胺酸GMP合成酶變體或編碼該變體的多核苷酸，其中，相應於SEQ ID NO：3中位置29的胺基酸被另一個胺基酸取代，且該另一種胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸和組胺酸。
- 如請求項3所述之微生物，其中，該微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
- 一種用於製造XMP或GMP的方法，該方法包含培養棒狀桿菌屬(Corynebacterium)之微生物，其含有如請求項1所述之變體或編碼該變體的多核苷酸。
- 如請求項5所述之方法，其中，該微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
- 如請求項5或6所述之方法，復包括從培養基或微生物中回收該XMP或GMP。
- 一種用於製造XMP或GMP的組成物，該組成物包含以下至少一種：水解麩醯胺酸GMP合成酶變體，其中，相應於SEQ ID NO：3中位置29的胺基酸被另一個胺基酸取代，且該另一種胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸和組胺酸；包含該變體的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)之微生物；以及其中經培養該微生物的培養基。
- 如請求項8所述之組成物，其中，該微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
- 一種用於增加棒狀桿菌屬(Corynebacterium)之微生物的XMP或GMP製造能力的方法，該方法包括修飾該微生物以表現如請求項1所述之水解麩醯胺酸GMP合成酶變體。
- 如請求項10所述之方法，其中，該微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
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