JP2000300272A

JP2000300272A - Ｇｍｐ合成酵素及びその遺伝子

Info

Publication number: JP2000300272A
Application number: JP11114787A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Kawasaki; 寿川崎; Yoshihiro Usuda; 佳弘臼田; Yasuhiro Mihara; 康博三原; Osamu Kurahashi; 修倉橋
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2000-10-31
Also published as: US6593117B2; US6210951B1; US20020151023A1; ID25683A

Abstract

(57)【要約】【課題】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（コリネバクテリウム・グルタミカム）のＧＭＰ合成酵
素をコードする遺伝子（ｇｕａＡ）を提供する。【解決手段】既知のｇｕａＡ遺伝子から推定されるア
ミノ酸配列間において保存されている領域を検索し、こ
れらの領域のアミノ酸配列をもとに、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グル
タミカム）のｇｕａＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅するの
に適した領域及び配列を選定し、選定された配列を用い
てｇｕａＡ遺伝子の一部を単離し、さらにｇｕａＡ遺伝
子全長を含む配列表の配列番号１に示す塩基配列を有す
るＤＮＡを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＧＭＰ合成
酵素及びそれをコードするＤＮＡに関する。ＧＭＰ合成
酵素及び同酵素活性を有する微生物は、調味料等の原料
として有用なグアノシン５’−リン酸等の核酸系物質の
製造に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるグアノシン５’−リ
ン酸（５’−グアニル酸ともいう。以下、「ＧＭＰ」と
略す。）やグアノシン等の等の核酸系物質の製造におい
ては、培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、
アデニン要求性及び核酸アナログ耐性を付与した変異株
（特公昭５５−２９５６号公報、特公昭５５−４５１９
９号公報）等が用いられている。

【０００３】通常の変異処理により得られる変異株は、
目的の遺伝子以外にも変異が導入されることが多く、ま
た、核酸系物質の生合成経路には複雑な制御機構が存在
するために、核酸系物質を著量生産する微生物を得るこ
とは困難である。したがって、従来の菌株育種法によっ
て得られた変異株は、必ずしも満足できるものではなか
った。

【０００４】ＧＭＰは、５’−イノシン酸（ＩＭＰ）か
らキサンチル酸（ＸＭＰ）を経て、ＧＭＰ合成酵素によ
るＬ−グルタミンをアミノ基供与体とするアミノ化反応
によって合成される。そこで、エシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli）由来のＧＭＰ合成酵素遺伝子（ｇｕａ
Ａ）で形質転換したエシェリヒア・コリを用いてＧＭＰ
を製造する方法が提案されている（特公平7-16431
号）。ｇｕａＡ遺伝子は、バチルス・サブチリス（Baci
llus subtilis）（J. Bacteriol., 174, 1883-1890(199
2), EMBL/GenBank/DDBJ accession M83691）、コリネバ
クテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammo
niagenes）（韓国公告特許96-7743号、EMBL/GenBank/DD
BJ accession Y10499）、ボレリア・ブルグドルフェリ
（Borrelia burgdorferi）（J. Bacteriol., 176, 6427
-6432 (1994), EMBL/GenBank/DDBJ Accession L2588
3）、ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Dicty
ostelium discoideum）（J. Biol. Chem., 266, 16448-
16452 (1991), EMBL/GenBank/DDBJaccession M64282）
等で単離されている。

【０００５】しかし、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）のｇ
ｕａＡ遺伝子は知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム
・グルタミカム）のｇｕａＡ遺伝子及び同遺伝子が導入
された形質転換体を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行い、既知のｇｕａＡ遺伝
子から推定されるアミノ酸配列間において保存されてい
る領域を複数見い出し、これらの領域のアミノ酸配列を
もとに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（コリネバクテリウム・グルタミカム）のｇｕａＡ遺伝
子をＰＣＲにより増幅するのに適した領域及び配列を選
定した。そして、選定された配列を用いてｇｕａＡ遺伝
子の一部を単離し、さらにｇｕａＡ遺伝子全長を取得す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明は、以下のとおりである。（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｇ
ＭＰ合成酵素活性を有するタンパク質。（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ。（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＭ
Ｐ合成酵素活性を有するタンパク質。（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）
のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号８８７〜２４５５からなる塩基配列を
含むＤＮＡ。（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号８８７〜２４５５からなる塩基配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
ＧＭＰ合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。（４）前記（２）又は（３）のＤＮＡが、該ＤＮＡがコ
ードするタンパク質が発現可能な形態で導入された形質
転換体。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）由来の
ＧＭＰ合成酵素をコードするＤＮＡである。ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムは、現在コリネバクテ
リウム・グルタミカムに統合されているが、本明細書で
は便宜上、単にブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムと記載することがある。

【００１０】本発明のＤＮＡは、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡから、ＰＣＲによ
ってその一部を取得することができる。ＰＣＲに用いる
プライマーは、これまでにエシェリヒア・コリ、バチル
ス・サブチリス、コリネバクテリウム・アンモニアゲネ
ス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ディクチオステリウ
ム・ディスコイデウム等、数種の生物よりクローニング
されているguaA遺伝子の塩基配列から推定されるＧＭＰ
合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントから、各酵素
間に於いて保存されている領域を検索し、その領域のア
ミノ酸配列をもとに設計することができる。その際、Ｐ
ＣＲプライマーの設計は、対応するコドン数が少なくな
るような領域を選定し、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムのコドン使用頻度を参考にして行う。

【００１１】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムの染色体ＤＮＡは、例えばSaitoらの方法（Biochem.B
iophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（B
iochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により調製するこ
とができる。

【００１２】guaA遺伝子を増幅するための好適なプライ
マー及びＰＣＲ反応条件としては、表１に示す反応２、
３及び４に用いたプライマーの組み合わせ及び反応条件
が挙げられる。この反応条件によれば、約0.5kbp、約1.
2kbp、約0.7kbpの大きさを持つ反応産物が取得され得
る。これらの反応産物のうち、約1.2kbpの断片は約0.5k
bpの断片と重複している。

【００１３】guaA遺伝子全長を取得するには、上記のよ
うにして得られるguaA遺伝子の部分配列を基に、Casset
te-ligation mediated PCR法（Molecular and Cellular
Probes, 6, 467-475）等によって、上流及び下流の隣
接領域を取得すればよい。すなわち、染色体ＤＮＡ上の
既知の領域に隣接する領域は、適当な制限酵素で切断し
た染色体ＤＮＡフラグメントにカセットを連結し、既知
の領域に対応するプライマーと、カセットに対応するプ
ライマーを用いたＰＣＲによって増幅することができ
る。その際、カセットの５’末端を脱リン酸化しておく
と、染色体ＤＮＡフラグメントとカセットの５’末端と
の接続部位にはニックが生じる。そのため、カセットプ
ライマーから始まるＤＮＡ合成はこの接続部位で停止
し、合成プライマーから合成されたＤＮＡのみがカセッ
トプライマーからの合成の鋳型となり、相補鎖が形成さ
れる。得られた増幅産物の塩基配列を決定し、新たに判
明した塩基配列に特異的なプライマーを合成し、上記と
同様にカセットを連結した染色体ＤＮＡフラグメントを
鋳型とするＰＣＲを行う。この操作を繰り返すことによ
り、上流及び下流の隣接領域を取得することができる。
この方法を利用したキットが市販されており（宝酒造
(株)製TAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit）、本発明
のＤＮＡの取得に利用することができる。

【００１４】本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡ及びそ
の隣接領域の塩基配列が明らかとなったので、同塩基配
列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマー
に用いて、コリネ型細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣ
Ｒによって、直接増幅することができる。そのようなプ
ライマーとしては、配列番号１２及び配列番号１３に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
これらのプライマーを用いて得られるＤＮＡは、ＧＭＰ
合成酵素をコードする領域の上流にSD（Shine-Dalgarn
o）配列が、及び両端に制限酵素認識部位がそれぞれ付
加されている。また、本発明のＤＮＡは、その塩基配列
に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用
いるハイブリダイゼーションにより、染色体ＤＮＡライ
ブラリーから単離することもできる。

【００１５】上記のようにして取得される本発明のＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列表の配列
番号１に示す。同塩基配列中、塩基番号８８７〜２４５
５からなる領域が、本発明のタンパク質であるＧＭＰ合
成酵素をコードしている。

【００１６】本発明のＤＮＡは、コードされるタンパク
質のＧＭＰ合成酵素活性が損なわれない限り、１若しく
は複数の位置での１若しくは複数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＧＭＰ合成酵素をコ
ードするものであってもよい。ここで、「複数」とは、
アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種
類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンの
ように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が
存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構
造に大きな影響を与えないことに由来する。従って、Ｇ
ＭＰ合成酵素を構成するアミノ酸配列全体に対し、８０
％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有し、ＧＭＰ
酵素活性を有するものであってもよい。具体的には、前
記「複数」は、２〜１０４個、好ましくは、２〜５０
個、より好ましくは２〜１０個である。

【００１７】上記のようなＧＭＰ合成酵素と実質的に同
一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異
的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改
変することによって得られる。また、上記のような改変
されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても
取得され得る。変異処理としては、ＧＭＰ合成酵素をコ
ードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処
理する方法、及びＧＭＰ合成酵素をコードするＤＮＡを
保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線
照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いら
れている変異剤によって処理する方法が挙げられる。

【００１８】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、ＧＭＰ合成酵素を保持する
微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然
に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。

【００１９】変異を有するＧＭＰ合成酵素をコードする
ＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の
配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８８７〜
２４５５からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＭＰ酵素
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離する
ことによって、ＧＭＰ合成酵素と実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「スト
リンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリ
ッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されな
い条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難
であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例
えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。

【００２０】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎ発現産物のＧＭＰ酵素活性を測定することによって、
容易に取り除くことができる。

【００２１】本発明のタンパク質は、上記本発明のＤＮ
Ａによってコードされるタンパク質であり、配列番号２
に示すアミノ酸配列を有する。本発明のタンパク質は、
ＧＭＰ酵素活性を有する限り、配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ
酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸
配列を有するものであってよい。

【００２２】本発明のＧＭＰ合成酵素は、ＸＭＰからＧ
ＭＰを生成する反応を触媒する活性を有する。その際、
Ｌ−グルタミン及び(NH₄)₂SO₄をアミノ基供与体として
利用し得る。本発明のＧＭＰ合成酵素のＬ−グルタミン
とアンモニアに対するＫｍ値の測定値は、それぞれ、約
9.6 mM、8.2 mMであった。また、本発明のＧＭＰ合成
酵素は、アミノ基供与体をＬ−グルタミンとした場合に
は、pH約6.5付近にて最大活性を示し、アミノ基供与体
をアンモニアとし、アミノ基供与体として添加した(N
H₄)₂SO₄量を一定とした場合には、約8.0〜9.0のpHにて
最大活性を示した。また、本発明のＧＭＰ合成酵素は、
約２３℃までで少なくとも１５分は安定であった。

【００２３】本発明のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードする
ＧＭＰ合成酵素を発現可能な形態で導入された形質転換
体は、形質転換されていない細胞に比べてＧＭＰ合成酵
素活性が増強される。本発明のＤＮＡを導入する宿主微
生物としては、コリネ型細菌が挙げられる。コリネ型細
菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現
在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int.
J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネ
バクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細
菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のも
のが挙げられる。

【００２４】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ムコリネバクテリウム・アセトグルタミカムコリネバクテリウム・アルカノリティカムコリネバクテリウム・カルナエコリネバクテリウム・グルタミカムコリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）コリネバクテリウム・メラセコーラコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスコリネバクテリウム・ハーキュリスブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）ブレビバクテリウム・インマリオフィラムブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム）ブレビバクテリウム・ロゼウムブレビバクテリウム・サッカロリティカムブレビバクテリウム・チオゲニタリスブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス）ブレビバクテリウム・アルバムブレビバクテリウム・セリヌムミクロバクテリウム・アンモニアフィラム具体的には、下記のような菌株を例示することができ
る。

【００２５】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ムＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１
５８０６コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２
１５１１コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６
５コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭＢＰ−１５３９）コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ブレビバクテリウム・インマリオフィラムＡＴＣＣ１
４０６８ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・サッカロリティカムＡＴＣＣ１
４０６６ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２
４０ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス）ＡＴＣＣ６８７１ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１
５３５４

【００２６】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録
番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を
受けることができる。各微生物に対応する登録番号はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタロ
グに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約に
基づいて寄託されている。

【００２７】本発明のＤＮＡは、エシェリヒア・コリ及
び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能な
ベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これ
をエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作
がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自
律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが
好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好まし
く、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG39
9、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。

【００２８】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。

【００２９】

【００３０】ＧＭＰ合成酵素をコードする遺伝子とコリ
ネ型細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡ
を調製するには、ＧＭＰ合成酵素をコードする遺伝子の
末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結
は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが
普通である。

【００３１】上記のように調製した組み換えＤＮＡをコ
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリＫ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）、または電気パルス法（特開平
２−２０７７９１号公報参照）も応用できる。

【００３２】本発明のＤＮＡで形質転換された微生物
は、ＧＭＰ合成酵素の製造に利用することができる。ま
た、本発明のＤＮＡで形質転換され、ＧＭＰ合成酵素活
性が増強された微生物、例えばブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムは、ＸＭＰからＧＭＰを生成する能
力に優れているので、発酵法又は微生物菌体を用いた酵
素法によるＧＭＰの製造に利用することができる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３４】

【実施例１】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムのＧＭＰ合成酵素遺伝子（guaA）の取得 guaAは、これまでにエシェリヒア・コリ、バチルス・サ
ブチリス、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ボ
レリア・ブルグドルフェリ、ディクチオステリウム・デ
ィスコイデウム等、数種の生物よりクローニングされて
いる。これらの遺伝子の塩基配列から推定されるＧＭＰ
合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントから、各酵素
間に於いて保存されている領域が複数見いだされた。そ
こで、これらの保存領域のアミノ酸配列をもとに、PCR
によってブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
guaA遺伝子の一部分を取得した。

【００３５】ＰＣＲプライマーのデザインは、対応する
コドン数が少なくなるような領域を選定し、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムのコドン使用頻度を参
考にして行った。作製したプライマーの配列は、以下の
とおりである。尚、以下の配列中、YはT及びC、RはG及
びA、WはA及びTの混合物を表す。

【００３６】（１）プライマー１ 5’-WTCCCAWTCGATRGT-3’（配列番号３）（２）プライマー２ 5’-CACCACAACGTYGGY-3’（配列番号４）（３）プライマー３ 5’-RCCRACGTTGGGTG-3’（配列番号５）（４）プライマー４ 5’-TGGATGTCYCACGGY-3’（配列番号６）（５）プライマー５ 5’-TGGATGAGCCACGGY-3’（配列番号７）

【００３７】上記のプライマーを用い、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体DNAを
鋳型としてPCRを行った。反応条件を表１に示す。

【００３８】

【表１】表１ PCR反応条件 ──────────────────────────────── 反応プライマー反応条件サイクル ──────────────────────────────── １１、２ 94℃ 30秒,45℃ 30秒,72℃ 2分 30 ２１、２ 94℃ 30秒,40℃ 30秒,72℃ 2分 40 ３４,５,１ 94℃ 30秒,40℃ 30秒,72℃ 2分 40 ４４,５,３ 94℃ 30秒,40℃ 30秒,72℃ 2分 40 ────────────────────────────────

【００３９】上記のPCR反応を行った結果、反応１では
目的の大きさを持つ反応産物は得られなかった。反応
２、３及び４では、それぞれ目的の約0.5kbp、約1.2kb
p、約0.7kbpの大きさを持つ反応産物が得られた。しか
し、反応２、３及び４のいずれにおいても、目的の大き
さを持つ反応産物以外にも、複数の反応産物の生成が認
められた。そこで、アガロースゲル電気泳動によって各
反応産物を分離し、目的の大きさを持つ反応産物のみを
回収した。

【００４０】回収した反応産物を、TAクローニングベク
ター（Invitrogen社）に連結した。得られた組換えプラ
スミドを鋳型として、取得したPCR産物の塩基配列を決
定した。ここでの塩基配列決定の鋳型としては、上記PC
R産物のうち、約0.5kbpの大きさのものと約1.2kbpの大
きさのものを用いた。塩基配列の決定は、Perkin Elmer
社、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kitを用い、
同社製Genetic Analyzer 310にて行った。

【００４１】その結果、約1.2kbpの断片は約0.5kbpの断
片と重複しており、得られた領域の塩基配列より推定さ
れるアミノ酸配列は、他の生物種由来の既知のGMP合成
酵素のアミノ酸配列と高い相同性を示した。従って、上
記で得られたPCR産物は、目的遺伝子の一部である可能
性が高いと判断された。

【００４２】そこで次に、得られた領域の上流域および
下流域の取得を行った。取得は、Cassette-ligation me
diated PCR（Molecular and Cellular Probes, 6, 467-
475）により行った。実際の操作は、宝酒造社製、TaKaR
a LA PCR in vitro Cloningkitを用い、その説明書に従
って行った。

【００４３】上流域取得に用いた既知領域特異的なPCR
プライマーは、１回目反応時、5’-TGCTCTAGACCTGCGATC
TCAGTGAGGAAG-3’（配列番号８）、２回目反応時、5’-
CAGGGTGGTACTGCACGCCAGCCATTTTGC-3’（配列番号９）、
であり下流域取得に用いた既知領域特異的なPCRプライ
マーは、１回目反応時、5’-CTCTGTTGGAGTCCAAGGTGACGG
CCGCAG-3’（配列番号１０）、２回目反応時、5’-GTAT
CTTCCGAAGACGCAATGACCGCCGAC-3’（配列番号１１）、で
ある。

【００４４】使用したカセットは、EcoRI, HindIII, Ps
tI, SalI, XbaIの各カセットである。これらのカセット
に対応する制限酵素で切断したブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869株の染色体DNAに各カセッ
トを連結し、上記プライマー及び前記キットに付属のカ
セットプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、
上流域取得を目的とした反応では、 EcoRI, HindIII, P
stI, SalIの各カセットを用いた場合に、それぞれ約1.5
kbp, 約0.5kbp, 約1.5kbp, 約1.0kbpの反応産物が得ら
れた。これらの塩基配列を決定したところ、全ての産物
が同一配列を含んでいることが判明した。

【００４５】また、下流域取得を目的とした反応では、
EcoRI, HindIII, XbaIの各カセットを用いた場合に、そ
れぞれ約1.2kbp,約0.5kbp,約1.2kbpの反応産物が得られ
た。これらの塩基配列を決定したところ、全ての産物が
同一配列を含んでいることが判明した。

【００４６】上記のようにして得られた配列を、重複部
分を考慮して連結したところ、523アミノ酸残基よりな
るタンパク質をコードし得る領域を含む3390塩基からな
る配列が得られた。また、この523アミノ酸残基よりな
るタンパク質は、全長にわたって、他の生物種由来の既
知のGMP合成酵素のアミノ酸配列と高い相同性を示し
た。従って、目的のguaA遺伝子が取得できたものと考え
られた。

【００４７】

【実施例２】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムguaAのエシェリヒア・コリでの発現実施例１にて取得した遺伝子が目的のguaA遺伝子である
ことを確認するために、同遺伝子をエシェリヒア・コリ
に導入しして発現させ、その形質転換体より無細胞抽出
液を調製し、ＧＭＰ合成酵素活性の確認を行った。エシ
ェリヒア・コリでのguaA遺伝子は、以下のようにして行
った。

【００４８】実施例１にて得られた塩基配列を基に、SD
（Shine-Dalgarno）配列と制限酵素認識部位を付加した
PCRプライマーをデザインし、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869の染色体DNAを鋳型として
PCRを行った。ここで用いたプライマーの配列を以下に
示す。 5'-CTCGTCGACAAGGAAAAAGACGTATGAGCCTTCAGACAAATCATCGC
CC-3’(配列番号12) 5'-CTCGCATGCTTAATCCCATTCGATGGTTCCTGGTGGCTTGGAGGTTA
CGTCC-3’(配列番号13)

【００４９】得られたPCR産物を、プライマーに付加し
た制限酵素認識部位を切断する制限酵素にて消化した
後、同一の制限酵素にて消化したベクター、pUC18（宝
酒造（株））に連結した。この際、目的遺伝子を、ベク
ターに存在するlacプロモーターの転写方向に対して順
方向に連結した。この様に作製したプラスミドでエシェ
リヒア・コリJM109を形質転換した。

【００５０】得られた形質転換体を、50μg/mlアンピシ
リン及び1 mM IPTGを含有するLB培地にて１晩振とう培
養し、遠心による集菌の後、緩衝液Ａ（20 mMリン酸カ
リウム緩衝液(pH7.5)、1 mMジチオスライトール(DTT)）
にて洗浄を行った。洗浄菌体を同緩衝液に懸濁し、超音
波による菌体破砕を行った。破砕後、未破砕菌体等を遠
心によって除去し、これを無細胞抽出液とした。

【００５１】上記無細胞抽出液のGMP合成酵素活性の測
定は、次の組成の反応液にて実施した。反応液Ａ: 100
mM Tris-HCl, pH 8.3, 1 mM DTT, 25 mM XMP, 25mM AT
P, 50mM MgCl₂, 50 mM Ｌ−グルタミン。反応は、30℃
にて10分間行い、50倍容の100mM EDTAの添加によって反
応を停止した。反応産物の分析、定量はHPLCにて行っ
た。分析条件は以下の通りである。

【００５２】カラム：Asahipak GS-220(直径7.6mm，50
cm) 溶離液：0.2 M NaH₂PO₄(pH 3.98 ) 温度：50℃ 流速：1.5 ml/分、検出：紫外線(254nm)吸収

【００５３】また、タンパク質の定量には、Bio-Rad La
boratories社のProtein Assay Kitを用いた。これらの
条件にて、調製した無細胞抽出液のGMP合成酵素活性の
測定を行ったところ、取得した遺伝子を導入した菌株よ
り調製した無細胞抽出液を用いた場合にXMPからGMPの変
換が認められ、目的の活性が確認された。

【００５４】

【実施例３】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムguaA遺伝子産物の性質実施例２に示したguaA遺伝子を発現させたエシェリヒア
・コリJM109より調製した無細胞抽出液をGMP合成酵素源
として、実施例２に示した反応液組成中、Ｌ−グルタミ
ンを(NH₄)₂SO₄に変更し、アミノ基供与体をアンモニア
とした場合にも、XMPからのGMPの生成が認められた。そ
こで、本酵素のアミノ基供与体であるＬ−グルタミンと
アンモニアに対するＫｍ値を求めた。その結果、Ｌ−グ
ルタミン、アンモニアに対するＫｍ値は、それぞれ、9.
6 mM、8.2 mMであり、両基質に対してほぼ同一の値を示
した。

【００５５】アンモニア濃度の算出は、アンモニアのpK
aを9.3、反応液のpHを8.0として、Henderson-Hasselbac
hの式より算出した。本酵素の反応pH特性を求めるたと
ころ、アミノ基供与体をＬ−グルタミンとした場合に
は、pH 6.5付近にて最大活性を示した。アミノ基供与体
をアンモニアとし、アミノ基供与体として添加した(N
H₄)₂SO₄量を一定とした場合には、pH 8.0〜9.0にて最大
活性を示した。

【００５６】本酵素の温度安定性について検討を行った
ところ、図１に示す結果が得られた。温度安定性は、図
１に示した各温度にて無細胞抽出液を15分間保持した
後、30℃にて残存活性を測定し、4℃にて保持した無細
胞抽出液を用いて得られた活性に対する相対活性を求め
ることによって行った。図１に示すように、本酵素は２
３℃までで安定であった。

【００５７】

【発明の効果】本発明により、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム由来のＧＭＰ合成酵素、及びそれを
コードする遺伝子が提供される。ＧＭＰ合成酵素は、Ｇ
ＭＰの製造に利用することができる。また、前記遺伝子
を保持する形質転換体は、ＧＭＰ合成酵素又はＧＭＰの
製造に利用することができる。

【００５８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> ＧＭＰ合成酵素及びその遺伝子 <130> P-6426 <141> 1999-04-22 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3390 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) <220> <221> CDS <222> (887)..(2455) <400> 1 gaattccacc gcctgggaac gattacagca gtggcggaat ctatgaacta cagtcgttct 60 gcgatctccc aacaaatggc gctgctggaa aaagaaattg gtgtgaaact ctttgaaaaa 120 agcggccgaa acctctactt cacagaacaa ggcgaagtgt tggcctcaga aacacatgcg 180 atcatggcag cagtcgatca cgcccgcgca gccgtcctag attcgatgtc tgaagtatcc 240 ggaacgctga aagtcacctc cttccaatcc ctgctgttca cccttgcccc gaaagccatc 300 gcgcgcctga ccgagaaata cccacacctg caagtagaaa tctcccaact agaagtcacc 360 gcagcgctcg aagaactccg cgcccgccgc gtcgacgtcg cactcggtga ggaatacccc 420 gtggaagttc ccctcgttga tgccagcatt caccgcgaag tcctcttcga agaccccatg 480 ctgctggtca ccccagaaag cggtccatac tccggcctca ccctgccaga actccgcgac 540 atccccatcg ccatcgaccc gcccgacctc cccgcaggcg aatgggtcca taggctctgc 600 cggcgcgccg ggtttgagcc ccgcgtgacc tttgaaacca gcgatcccat gctccaggca 660 cacctcgtgc gcagcggttt ggccgtgaca ttttccccca cactgctcac cccgatgctg 720 gaaggcgtgc acatccagcc gctgcccggc aaccccacgc gcacgctcta caccgcggtc 780 agggaagggc gccagaggca tccagccatt aaagcttttc gacgaaccct ccgcccatgt 840 ggccaaagaa tcttatttgg aggctcgtct agtagagtga gttctt gtg agc ctt 895 Val Ser Leu 1 cag aca aat cat cgc cca gta ctc gtc gtt gac ttc ggc gca cag tac 943 Gln Thr Asn His Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe Gly Ala Gln Tyr 5 10 15 gcg cag ctg atc gca cgt cgt gtg cgt gag gcc ggc atc tac tcc gaa 991 Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Gly Ile Tyr Ser Glu 20 25 30 35 gtc atc ccg cac acc gcc acc gca gac gat gtg cgc gct aaa aat gca 1039 Val Ile Pro His Thr Ala Thr Ala Asp Asp Val Arg Ala Lys Asn Ala 40 45 50 gca gcc ctc gtc ctt tcc ggt ggt cca tcc tcc gtg tat gcc gag gga 1087 Ala Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val Tyr Ala Glu Gly 55 60 65 gca cca tcc ctt gac gct gag atc cta gat ctc gga ttg cca gta ttt 1135 Ala Pro Ser Leu Asp Ala Glu Ile Leu Asp Leu Gly Leu Pro Val Phe 70 75 80 ggc att tgc tac ggc ttc caa gcc atg acc cac gcg ctt ggt ggc acc 1183 Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Thr His Ala Leu Gly Gly Thr 85 90 95 gtt gcc aac acc ggt aag cgc gaa tac gga cgc acc gac atc aac gtt 1231 Val Ala Asn Thr Gly Lys Arg Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Ile Asn Val 100 105 110 115 gcc ggt ggc gtc ctc cac gaa ggc ctc gag gcc tgc cac aag gtg tgg 1279 Ala Gly Gly Val Leu His Glu Gly Leu Glu Ala Cys His Lys Val Trp 120 125 130 atg agc cac ggc gac gcc gtc tct gaa gcc cca gaa ggt ttc gta gtc 1327 Met Ser His Gly Asp Ala Val Ser Glu Ala Pro Glu Gly Phe Val Val 135 140 145 acc gct tcc tcc gaa ggt gcg cct gtc gca gct ttc gaa aac aag gaa 1375 Thr Ala Ser Ser Glu Gly Ala Pro Val Ala Ala Phe Glu Asn Lys Glu 150 155 160 cgc aaa atg gct ggc gtg cag tac cac cct gag gtg ctg cac tca cca 1423 Arg Lys Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val Leu His Ser Pro 165 170 175 cac ggc cag gca gtt ctg acc cgc ttc ctc act gag atc gca ggt cta 1471 His Gly Gln Ala Val Leu Thr Arg Phe Leu Thr Glu Ile Ala Gly Leu 180 185 190 195 gag cag aac tgg acc gca gca aac atc gct gaa gaa ctc atc gaa aag 1519 Glu Gln Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ile Ala Glu Glu Leu Ile Glu Lys 200 205 210 gtc cgc gag cag atc ggc gaa gat ggc cgc gct att tgt ggc cta tcc 1567 Val Arg Glu Gln Ile Gly Glu Asp Gly Arg Ala Ile Cys Gly Leu Ser 215 220 225 ggt ggt gtg gac tcc gct gtt gcc ggt gct ttg gtg cag cgt gca att 1615 Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Val Gln Arg Ala Ile 230 235 240 ggt gac cgt ttg acc tgt gtc ttt gtt gac cac ggt ctg ctg cgt gcc 1663 Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly Leu Leu Arg Ala 245 250 255 ggt gag cgc gag cag gtg gaa aaa gac ttc gtc gca gca acc ggc gcc 1711 Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala Ala Thr Gly Ala 260 265 270 275 aag ctg gtt acc gtt gat gag cgt caa gca ttc ctg tcc aag ctg gcc 1759 Lys Leu Val Thr Val Asp Glu Arg Gln Ala Phe Leu Ser Lys Leu Ala 280 285 290 gga gtt acc gaa cca gaa gca aag cgc aag gct atc ggc gct gag ttc 1807 Gly Val Thr Glu Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile Gly Ala Glu Phe 295 300 305 atc cgc tcc ttc gag cgc gca gtt gcc ggt gtg ctg gaa gat gca cca 1855 Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gly Val Leu Glu Asp Ala Pro 310 315 320 gaa ggt tcc acc gtg gac ttc cta gtt cag ggc acc ctg tac cca gac 1903 Glu Gly Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr Leu Tyr Pro Asp 325 330 335 gtc gtg gaa tcc ggt ggt gga tct ggt acc gca aac atc aag agc cac 1951 Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ala Asn Ile Lys Ser His 340 345 350 355 tac aac gtc ggt gga ctg cca gac gat gtg gaa ttc aag ctt gtt gag 1999 Tyr Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Leu Val Glu 360 365 370 cca ctg cgt gac ctc ttc aaa gac gaa gtc cgt gcc gtt ggc cgt gaa 2047 Pro Leu Arg Asp Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala Val Gly Arg Glu 375 380 385 ctt ggc ctg cct gag gaa atc gtt ggc cgc cag cca ttc cca gga cca 2095 Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Gly Arg Gln Pro Phe Pro Gly Pro 390 395 400 gga ctt ggt atc cgc atc atc ggt gaa gtc acc gaa gag cgc ctg gaa 2143 Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu Glu Arg Leu Glu 405 410 415 acc ctc cgc cac gct gac ctg atc gcc cgc acc gag ctc acc gaa gcc 2191 Thr Leu Arg His Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu Leu Thr Glu Ala 420 425 430 435 gga ctc gac ggc gtg atc tgg cag tgc cca gtc gtc ctc ttg gca gat 2239 Gly Leu Asp Gly Val Ile Trp Gln Cys Pro Val Val Leu Leu Ala Asp 440 445 450 gtc cgc tct gtt gga gtc caa ggt gac ggc cgc acc tac gga cac cca 2287 Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr Tyr Gly His Pro 455 460 465 atc gtg ctg cgc cca gta tct tcc gaa gac gca atg acc gcc gac tgg 2335 Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met Thr Ala Asp Trp 470 475 480 acc cgc ttg cca tac gaa gtc ctg gag aag atc tcc acc cgc atc acc 2383 Thr Arg Leu Pro Tyr Glu Val Leu Glu Lys Ile Ser Thr Arg Ile Thr 485 490 495 aac gaa gtt cca gac gta aac cgc gtg gtt ttg gac gta acc tcc aag 2431 Asn Glu Val Pro Asp Val Asn Arg Val Val Leu Asp Val Thr Ser Lys 500 505 510 515 cca cca gga acc atc gaa tgg gag taggccttaa atgagccttc gttaagcggc 2485 Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu 520 aatcacctta tcggtgattg ccgctttccc atttctccgg gttttctgga actttttggg 2545 cgtatgctgg gaatgatctt attattttga tttcagaaag caggagagac cagatgagcg 2605 aaatccttga aacctactgg gcaccccact tcggaaacac cgatgaagcc gcagcactcg 2665 tttcatactt ggcacaagct tccggtgatc ctattgaggt tcacaccctg ttcggggatt 2725 taggtttaga cggactctct ggaaactaca ccgacactga gatcgacggc tacggcgacg 2785 cattcctgct ggttgcagca ctagcagtgt tgatggctga aaacaaagca tccggcggcg 2845 tgaatctggg tgaagttggg ggagctgata aatcgatccg gctgcatgtt gaatccaagg 2905 aaaacaccca gatcaacacc gcattgaagt actttgcgct ttccccagaa gaccacgcag 2965 cggcagatcg cttcgatgag gatgacctgt ctgagcttgc caacttgagt gaagagctgc 3025 gcggacagct ggactaattg ctgcccgttt aaggagtccg attcttcaga tgagtagatg 3085 cctccaagtg aggctgggag gctcttagaa tcgattctga gagggcactt tttattggcc 3145 ttggggtgga atctgcaacg gaccaaacca cactgcccac ggatcctaaa aaggggatcc 3205 gtgggcagtc tggtttggtt attcgacctt caaaccggtc acacatgccc acgaacccca 3265 ataatcggat tcgtgggcac tctggtttgg ttaccaggat gggttagtca ttctgatcag 3325 cgaattccac gttcacatcg ccaattccag agttcacaac cagattcagc attggacctt 3385 ctaga 3390

【００５９】 <210> 2 <211> 523 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Val Ser Leu Gln Thr Asn His Arg Pro Val Leu Val Val Asp Phe Gly 1 5 10 15 Ala Gln Tyr Ala Gln Leu Ile Ala Arg Arg Val Arg Glu Ala Gly Ile 20 25 30 Tyr Ser Glu Val Ile Pro His Thr Ala Thr Ala Asp Asp Val Arg Ala 35 40 45 Lys Asn Ala Ala Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser Val Tyr 50 55 60 Ala Glu Gly Ala Pro Ser Leu Asp Ala Glu Ile Leu Asp Leu Gly Leu 65 70 75 80 Pro Val Phe Gly Ile Cys Tyr Gly Phe Gln Ala Met Thr His Ala Leu 85 90 95 Gly Gly Thr Val Ala Asn Thr Gly Lys Arg Glu Tyr Gly Arg Thr Asp 100 105 110 Ile Asn Val Ala Gly Gly Val Leu His Glu Gly Leu Glu Ala Cys His 115 120 125 Lys Val Trp Met Ser His Gly Asp Ala Val Ser Glu Ala Pro Glu Gly 130 135 140 Phe Val Val Thr Ala Ser Ser Glu Gly Ala Pro Val Ala Ala Phe Glu 145 150 155 160 Asn Lys Glu Arg Lys Met Ala Gly Val Gln Tyr His Pro Glu Val Leu 165 170 175 His Ser Pro His Gly Gln Ala Val Leu Thr Arg Phe Leu Thr Glu Ile 180 185 190 Ala Gly Leu Glu Gln Asn Trp Thr Ala Ala Asn Ile Ala Glu Glu Leu 195 200 205 Ile Glu Lys Val Arg Glu Gln Ile Gly Glu Asp Gly Arg Ala Ile Cys 210 215 220 Gly Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Val Gln 225 230 235 240 Arg Ala Ile Gly Asp Arg Leu Thr Cys Val Phe Val Asp His Gly Leu 245 250 255 Leu Arg Ala Gly Glu Arg Glu Gln Val Glu Lys Asp Phe Val Ala Ala 260 265 270 Thr Gly Ala Lys Leu Val Thr Val Asp Glu Arg Gln Ala Phe Leu Ser 275 280 285 Lys Leu Ala Gly Val Thr Glu Pro Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ile Gly 290 295 300 Ala Glu Phe Ile Arg Ser Phe Glu Arg Ala Val Ala Gly Val Leu Glu 305 310 315 320 Asp Ala Pro Glu Gly Ser Thr Val Asp Phe Leu Val Gln Gly Thr Leu 325 330 335 Tyr Pro Asp Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ala Asn Ile 340 345 350 Lys Ser His Tyr Asn Val Gly Gly Leu Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys 355 360 365 Leu Val Glu Pro Leu Arg Asp Leu Phe Lys Asp Glu Val Arg Ala Val 370 375 380 Gly Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Val Gly Arg Gln Pro Phe 385 390 395 400 Pro Gly Pro Gly Leu Gly Ile Arg Ile Ile Gly Glu Val Thr Glu Glu 405 410 415 Arg Leu Glu Thr Leu Arg His Ala Asp Leu Ile Ala Arg Thr Glu Leu 420 425 430 Thr Glu Ala Gly Leu Asp Gly Val Ile Trp Gln Cys Pro Val Val Leu 435 440 445 Leu Ala Asp Val Arg Ser Val Gly Val Gln Gly Asp Gly Arg Thr Tyr 450 455 460 Gly His Pro Ile Val Leu Arg Pro Val Ser Ser Glu Asp Ala Met Thr 465 470 475 480 Ala Asp Trp Thr Arg Leu Pro Tyr Glu Val Leu Glu Lys Ile Ser Thr 485 490 495 Arg Ile Thr Asn Glu Val Pro Asp Val Asn Arg Val Val Leu Asp Val 500 505 510 Thr Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ile Glu Trp Glu 515 520

【００６０】 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (1,7) <223> w=a or t <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> r=g or a <400> 3 wtcccawtcg atrgt 15

【００６１】 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (12,15) <223> y=t or c <400> 4 caccacaacg tyggy 15

【００６２】 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (1,4) <223> r=g or a <400> 5 rccracgttg ggtg 14

【００６３】 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (9,15) <223> y=t or c <400> 6 tggatgtcyc acggy 15

【００６４】 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> y=t or c <400> 7 ttggatgagc cacggy 16

【００６５】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 8 tgctctagac ctgcgatctc agtgaggaag 30

【００６６】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 9 cagggtggta ctgcacgcca gccattttgc 30

【００６７】 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 10 ctctgttgga gtccaaggtg acggccgcag 30

【００６８】 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 11 gtatcttccg aagacgcaat gaccgccgac 30

【００６９】 <210> 12 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 12 ctcgtcgaca aggaaaaaga cgtatgagcc ttcagacaaa tcatcgccc 49

【００７０】 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 13 ctcgcatgct taatcccatt cgatggttcc tggtggcttg gaggttacgt cc 52

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＧＭＰ合成酵素の温度安定性を示す
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者三原康博神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者倉橋修神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社発酵技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA07 CA03 CA06 DA06 GA11 HA01 4B050 CC03 CC04 LL02 LL05 4B065 AA22Y AA24Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA27 CA41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
質。（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、Ｇ
ＭＰ合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＭ
Ｐ合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項２記載のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号８８７〜２４５５からなる塩基配列を
含むＤＮＡ。（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号８８７〜２４５５からなる塩基配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、
ＧＭＰ合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。
【請求項４】請求項２又は３記載のＤＮＡが、該ＤＮ
Ａがコードするタンパク質が発現可能な形態で導入され
た形質転換体。