BR112020014350A2 - Micro-organismo do gênero corynebacterium que produz nucleotídeo purina e método para produzir nucleotídeo purina usando o mesmo - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a um micro-organismo do gênero corynebacterium que produz um nucleotídeo purina e um método para produzir um nucleotídeo purina usando o mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MICRO-ORGANISMO DO

GÊNERO CORYNEBACTERIUM QUE PRODUZ NUCLEOTÍDEO PURINA E MÉTODO PARA PRODUZIR NUCLEOTÍDEO PURINA USANDO O MESMO” CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente descrição se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium e um método para produzir um nucleotídeo purina usando o mesmo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Nucleotídeos purina, tais como 5'-inosina monofosfato (daqui por diante, IMP), 5'-xantosina monofosfato (daqui por diante, XMP), 5'-guanosina monofosfato (daqui por diante, GMP), ácido 5'-adenílico (daqui por diante, AMP) etc., são intermediários do sistema metabólico de biossíntese de ácido nucleico. Estes intermediários desempenham um papel fisiologicamente importante in vivo e são amplamente usados em alimento, medicamento etc. Entre eles, IMP com um sabor de carne e GMP com um sabor de cogumelo são amplamente usados como aditivos para tempero alimentar. Além disso, sabe-se que quando estes dois materiais são misturados com glutamato monossódico (MSG), seus sabores são adicionalmente melhorados e, assim, um tempero composto complexo no qual estes três materiais são combinados é amplamente usado.

[003] Entretanto, exemplos do método para produzir um nucleotídeo purina podem incluir: (1) um método por degradação enzimática de ácido ribonucleico (RNA) extraído de células de levedura; (2) um método de preparação por fermentação cultivando um micro-organismo que produz um nucleotídeo purina, e recuperando diretamente o nucleotídeo purina no líquido cultivado; (3) um método por fosforilação química do nucleosídeo produzido por fermentação; e (4) um método por fosforilação enzimática do nucleosídeo produzido por fermentação etc. (Patente KR 10-1049023, Publicação de Patente JP 4363042, Patente KR 10-1210704, e Agri. Biol. Chem., 36(9), 1511-1522). Entre estes, enquanto o método (1) apresente problemas em termos de fornecimento/demanda de matéria prima e eficiência econômica, o método (2) é amplamente usado em virtude de suas vantagens econômicas e ambientais.

Entretanto, no caso da produção de GMP (um dos nucleotídeos purina), existe uma desvantagem na qual o rendimento é baixo em virtude do problema de sua permeabilidade da membrana celular e, assim, um método de produção de GMP por conversão enzimática de XMP produzido por meio de fermentação microbiana também é utilizado.

[004] Entretanto, durante a produção do nucleotídeo purina por fermentação usando um micro-organismo, o micro-organismo pode ser submetido ao estresse em virtude da temperatura, pH, pressão osmótica, desnutrição e fatores oxidativos. Entre estes, particularmente no estresse oxidativo, as espécies reativas do oxigênio (ROS), que são um fator inevitável gerado durante a produção fermentativa, se tornam a principal causa, e as ROS podem causar o crescimento anormal do micro-organismo.

PROBLEMA TÉCNICO

[005] Os presentes inventores têm estudado e realizado esforços para melhorar a produtividade de nucleotídeos purina superando o estresse oxidativo, que pode ocorrer durante o processo de fermentação de um micro-organismo. Em função disso, confirmaram que, em um micro-organismo onde uma proteína particular é inativada, a produtividade de nucleotídeos purina é melhorada, bem como o crescimento do micro-organismo é mantido, completando assim a presente descrição.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[006] Um objetivo da presente descrição é prover um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um nucleotídeo purina, em que uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[007] Um outro objetivo da presente descrição é prover um método para produzir um nucleotídeo purina usando o micro-organismo.

[008] Ainda um outro objetivo da presente descrição é prover um método para aumentar a produção de um nucleotídeo purina em um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que inclui inativar uma proteína da presente descrição no micro- organismo do gênero Corynebacterium.

[009] Ainda um outro objetivo da presente descrição é prover um uso do micro-

organismo para produzir um nucleotídeo purina.

EFEITOS VANTAJOSOS

[010] O micro-organismo que produz nucleotídeos purina da presente descrição pode produzir nucleotídeos purina com alta eficiência. Adicionalmente, os nucleotídeos purina preparados podem ser aplicados não apenas em ração animal ou aditivos de ração animal, mas também em vários produtos (por exemplo, alimentos humanos ou aditivos alimentares, temperos, produtos farmacêuticos etc.).

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[011] A presente descrição é descrita em detalhes da maneira a seguir. No entanto, descrições respectivas e modalidades descritas na presente descrição também podem ser aplicadas às outras descrições e modalidades. Isto é, todas as combinações de vários elementos aqui descritos estão no escopo da presente descrição. Adicionalmente, o escopo da presente descrição não é limitado pela descrição específica a seguir.

[012] Para atingir os objetivos anteriores, um aspecto da presente descrição provê um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um nucleotídeo purina, em que uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[013] Em uma modalidade específica, Corynebacterium stationis que produz um nucleotídeo purina, em que uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada, é provido.

[014] Da maneira aqui usada, o termo “nucleotídeo purina” se refere coletivamente a um composto, que apresenta um nucleosídeo purina, e em que um grupo fosfato é ligado a uma fração de açúcar do nucleosídeo por uma ligação éster.

[015] Especificamente, o nucleotídeo purina pode ser pelo menos um nucleotídeo purina selecionado do grupo que consiste em IMP, XMP, GMP e AMP, mas nucleotídeos purina capazes de aumentar a produtividade inativando uma proteína que consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 também podem ser incluídos sem limitação.

[016] Da maneira aqui usada, o termo “proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1” se refere a uma proteína codificada por um gene do grupo da família WhiB e, especificamente, pode ser um regulador transcricional WhiB. A proteína inclui quatro resíduos de cisteína conservados que formam um agrupamento sensível a óxidos de oxigênio e nitrogênio (4Fe-4S), e a proteína é conhecida por desempenhar um papel importante em exibir várias propriedades biológicas de Actinomycetes. Suas funções até o momento são conhecidas por seu envolvimento em funções celulares totais (por exemplo, patogênese, resistência a antibiótico, crescimento celular etc.), mas suas funções e mecanismos detalhados não foram bem estudados.

[017] A proteína com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 da presente descrição pode ser uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, uma proteína que consiste essencialmente em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, mas a proteína não é limitada à mesma.

[018] Adicionalmente, a proteína da presente descrição pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido descrita como SEQ ID NO: 1, mas qualquer sequência com uma atividade idêntica à proteína pode ser incluída sem limitação, e os versados na técnica podem obter informação de sequência a partir de bases de dados conhecidas (por exemplo, GenBank do NCBI etc.). Adicionalmente, a proteína com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 da presente descrição pode ser uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou uma proteína que inclui uma sequência de aminoácido com uma homologia ou identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 %. Adicionalmente, é evidente que qualquer proteína com uma sequência de aminoácido com eliminação, modificação, substituição, ou adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo da presente descrição, contanto que a proteína apresente uma sequência de aminoácido com quaisquer das homologias ou identidades anteriores, e exiba uma atividade biológica correspondente à proteína anterior.

[019] Além disso, qualquer polipeptídeo, que é codificado por um polinucleotídeo hibridizado em condições de severidade com uma sonda que pode ser preparada a partir de sequências conhecidas de gene (por exemplo, sequências complementares a toda ou parte de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo que constitui a proteína anterior), e apresenta uma atividade idêntica à proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, pode ser incluído sem limitação.

[020] Isto é, na presente descrição, embora seja descrita como “uma proteína ou polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácido de uma SEQ ID NO particular”, “uma proteína ou polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácido de uma SEQ ID NO particular”, ou “uma proteína ou polipeptídeo com uma sequência de aminoácido de uma SEQ ID NO particular”, é evidente que qualquer proteína que apresenta uma sequência de aminoácido com eliminação, modificação, substituição, substituição conservativa ou adição em parte da sequência também pode ser incluída no escopo da presente descrição, contanto que a proteína apresente uma atividade idêntica ou correspondente ao polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO.: particular, por exemplo, um caso onde uma sequência que que não altera a função da proteína é adicionada à terminação N e/ou terminação C da sequência de aminoácido, um caso onde a sequência de aminoácido apresenta uma mutação de ocorrência natural, ou um caso onde a sequência de aminoácido apresenta uma mutação silenciosa ou substituição conservativa da mesma.

[021] O termo “substituição conservativa” se refere a uma substituição de um aminoácido por um outro aminoácido com propriedades químicas estruturais e/ou químicas similares. Uma substituição de aminoácido como essa pode ocorrer em geral com base em similaridades em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática de resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos carregados negativamente (acídicos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano.

[022] Da maneira aqui usada, o termo “polinucleotídeo” apresenta um significado que inclui em geral uma molécula de DNA ou RNA, e um nucleotídeo (isto é, a unidade estrutural básica de um polinucleotídeo) pode incluir não apenas nucleotídeos naturais, mas também seus análogos, nos quais a fração de açúcar ou base é modificada (vide Scheit, Nucleotides Analogs, John Wiley, Nova lorque (1980); UhIlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).

[023] A sequência de polinucleotídeo de um gene que codifica a proteína com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 pode ser obtida a partir de uma base de dados conhecida (por exemplo, GenBank do NCBI etc.), mas não é limitada à mesma.

[024] O polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que codifica a proteína com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 da presente descrição, ou um polinucleotídeo que codifica a proteína com uma homologia ou identidade com a proteína da presente descrição de 60 %, 70 %, 80 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 %.

[025] Especificamente, a proteína com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 pode ser um polinucleotídeo com uma homologia ou identidade com a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 %. Entretanto, é evidente que qualquer sequência de polinucleotídeo, que codifica a proteína com uma atividade correspondendo à proteína que consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, pode ser incluída no escopo da presente descrição, sem ficar limitada à mesma.

[026] Adicionalmente, é evidente que, com base na degeneração do código genético, qualquer polinucleotídeo que pode ser traduzido em uma proteína consistindo na mesma sequência de aminoácido, ou uma proteína com uma homologia para a mesma, também pode ser incluída no escopo da presente descrição. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeo pode ser qualquer sequência capaz de hibridizar com uma sonda, a qual pode ser preparada a partir de uma sequência de gene conhecida (por exemplo, uma sequência complementar a toda ou parte das sequências de nucleotídeo anteriores), em condições de severidade para codificar uma proteína com a atividade da proteína que consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[027] O termo “condições de severidade” se refere às condições que possibilitam hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições são especificamente descritas em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et a/., Molecular Cloning, À Laboratory Manual, 2º Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova lorque). As condições podem incluir realizar hibridização entre genes com uma alta homologia ou identidade, por exemplo, uma homologia ou identidade de 40 % ou mais, especificamente 70 % ou mais, 80 % ou mais, 85 % ou mais, e 90 % ou mais, more especificamente 95 % ou mais, ainda mais especificamente 97 % ou mais, e acima de tudo especificamente 99 % ou mais, embora não realizando hibridização entre genes com uma homologia ou identidade menor que as homologias ou identidades anteriores; ou realizando condições de lavagem convencionais para hibridização Southern, isto é, lavagem uma vez, especificamente, duas vezes ou três vezes em uma concentração de sal e temperatura correspondendo a 60 ºC, 1xSSC, e SDS 0,1 %, especificamente 60 ºC, 0,1xSSC, e SDS 0,1 %, e mais especificamente 68 ºC, 0,1xSSC, e SDS 0,1 %. À hibridização exige que dois ácidos nucleicos apresentem uma(s) sequência(s) complementar(s), embora possa existir uma(s) incompatibilidade(es) entre bases dependendo da severidade da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo que podem hibridizar umas com as outras. Por exemplo, com relação ao DNA, adenosina é complementar à timina, enquanto citosina é complementar à guanina. Dessa maneira, a presente descrição também pode incluir fragmentos isolados de ácido nucleico complementares à sequência total, bem como sequências de ácido nucleico substancialmente similares.

[028] Especificamente, polinucleotídeos com uma homologia ou identidade podem ser detectados em um valor de Tm de 55 ºC usando condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização, e usando as condições descritas anteriormente. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 ºC, 63 ºC, ou 65 ºC, mas a temperatura não é limitada à mesma e pode ser ajustada apropriadamente pelos versados na técnica, de acordo com o propósito.

[029] A severidade adequada para a hibridização de polinucleotídeos depende do tamanho e grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (vide Sambrook et a/l., supra, 9,50 a 9,51 e 11,7 a 11,8).

[030] Da maneira aqui usada, o termo “homologia” ou “identidade” se refere a um grau de identidade entre duas sequências de aminoácido ou sequências de nucleotídeo fornecidas, e pode ser expresso como um percentual. Estes termos “homologia” e “identidade” frequentemente podem ser usados indiferentemente. Na presente especificação, uma sequência homóloga com uma atividade idêntica ou similar a uma dada sequência de aminoácido, ou sequência de polinucleotídeo, é representada como “% de homologia”.

[031] A homologia ou identidade da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservados é determinada por algoritmo de alinhamento padrão, e penalidades de intervalo padrão estabelecidas por um programa que é usado podem ser utilizadas juntas. Atualmente, as sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar umas nas outras ao longo da sequência completa ou pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % ou mais do tamanho completo em condições de severidade moderada ou elevada. Em hibridização, polinucleotídeos incluindo um(s) códon(s) degenerado(s) em vez de um(s) códon(s) também são considerados.

[032] Se quaisquer duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo apresentarem uma homologia, similaridade ou identidade, estas podem ser determinadas usando algoritmos de computador conhecidos na técnica (por exemplo, programa “FASTA” usando parâmetros padrões descritos por Pearson et al. (1988)

[Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444]). Alternativamente, algoritmo de Needleman-Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) realizado em um programa Needleman de The European Molecular Biology Open Software Suite do pacote EMBOSS (Rice et a/., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (versão 5.0.0 ou uma versão posterior) pode ser usado para determinar o mesmo (incluindo o pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.] [ET AL., J Molec Biol 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.]J(1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas usando BLAST a partir da base de dados National Center for Biotechnology Information ou ClustalW.

[033] A homologia, similaridade ou identidade entre polinucleotídeos ou polipeptídeos, por exemplo, pode ser determinada comparando a informação de sequência fornecida usando o programa de computador GAP, tal como um programa introduzido por Needleman et al. (J Mol Biol. 48: 443 (1970)), da maneira descrita por Smith e Waterman (Adv. Appl. Math (1981) 2: 482). Em resumo, o programa GAP define homologia, similaridade, ou identidade como o número de símbolos alinhados similares (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) dividido pelo número total dos símbolos em uma das duas sequências mais curtas. Os parâmetros padrões para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (incluindo um valor 1 para identidade e um valor O para ausência de identidade) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov, et al., (Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)), da maneira descrita por Schwartz e Dayhoff, eds. (Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) ou matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUCA4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou um penalidade de abertura de intervalo de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para intervalos finais. Portanto, o termo “homologia” ou “identidade”, da maneira aqui usada, se refere à relevância entre sequências.

[034] Na presente descrição, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um nucleotídeo purina pode ser um no qual uma proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada.

[035] Em particular, a inativação da proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 pode ser usada indiferentemente no mesmo sentido como na inativação da proteína da família WhiB, a inativação do regulador transcricional WhiB, ou a inativação de uma proteína codificada por um gene que inclui a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2.

[036] Da maneira aqui usada, o termo “a proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada” significa que a proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 não é expressa de maneira alguma; ou a proteína pode ser expressa, mas apresenta nenhuma ou atividade reduzida, comparada à sua cepa parental ou uma cepa não modificada. Adicionalmente, o termo anterior significa que a proteína WhcEDBA, que é codificada por um gene do grupo da família WhiB, não apresenta atividade ou sua atividade é reduzida, comparada à sua cepa parental ou uma cepa não modificada. Em particular, a redução descrita anteriormente é um conceito que inclui um caso onde a atividade de uma proteína é reduzida em virtude de uma mutação, eliminação etc. de um gene que codifica a proteína, comparada à atividade da proteína originalmente presente em um micro- organismo; um caso onde o grau da atividade intercelular geral da proteína é menor que aquele de sua cepa tipo selvagem natural, ou a cepa antes da modificação, em virtude da inibição da expressão do gene que codifica a proteína ou inibição da tradução do gene etc.; e uma combinação de ambos os casos.

[037] Na presente descrição, confirmou-se primeiro que a inativação da proteína anterior está relacionada à produtividade de nucleotídeos purina.

[038] Na presente descrição, a inativação pode ser atingida pela aplicação de vários métodos conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos incluem: 1) um método de eliminar todo ou parte do gene que codifica a proteína; 2) um método de modificar a sequência de controle de expressão para reduzir a expressão do gene que codifica a proteína; 3) um método de modificar a sequência do gene que codifica a proteína, de maneira tal que a atividade da proteína seja removida ou enfraquecida; 4) um método de introduzir um oligonucleotídeo antissentido (por exemplo, RNA antissentido), que liga complementaridade a uma transcrição do gene que codifica a proteína; 5) um método de preparar a anexação de um ribossomo impossível formando uma estrutura secundária pela adição de uma sequência, que é complementar à sequência de Shine-Dalgarno (SD), em uma extremidade dianteira da sequência SD do gene que codifica a proteína; 6) um método de engenharia de transcrição reversa (RTE), em que um promotor transcrito reversamente é adicionado na terminação 3' do quadro aberto de leitura (ORF), da sequência de polinucleotídeo do gene que codifica a proteína etc.; e a inativação pode ser atingida por uma combinação destes métodos, mas os métodos não são particularmente limitados aos mesmos.

[039] Especificamente, o método de eliminar todo ou parte do gene que codifica a proteína pode ser realizado substituindo o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena, no cromossomo, por um polinucleotídeo ou gene marcador com uma sequência de nucleotídeo parcialmente eliminada, usando um vetor para inserção cromossomal em um micro-organismo. Como um exemplo do método de eliminar todo ou parte de um polinucleotídeo, um método para eliminar um polinucleotídeo por recombinação homóloga pode ser usado, mas o método não é limitado ao mesmo.

[040] Adicionalmente, o método para eliminar todo ou parte do gene pode ser realizado de maneira tal que uma mutação seja induzida no gene usando luz (por exemplo, raios-ultravioleta) ou produtos químicos, e cepas nas quais um gene alvo é eliminado são selecionadas a partir dos mutantes obtidos. O método para eliminar um gene anterior inclui um método por tecnologia recombinante do DNA. Na tecnologia recombinante do DNA, por exemplo, pode existir um método no qual a recombinação homóloga ocorra introduzindo uma sequência de nucleotídeo ou vetor contendo uma sequência de nucleotídeo homólogo a um gene alvo no micro-organismo.

[041] Adicionalmente, a sequência de nucleotídeo ou vetor a ser introduzida pode incluir um marcador selecionável dominante, mas não é limitada à mesma.

[042] Adicionalmente, o método para modificar uma sequência de controle de expressão pode ser atingido pela aplicação de vários métodos conhecidos na técnica. Como exemplos do método, a modificação da sequência de controle de expressão pode ser realizada induzindo uma mutação na sequência de polinucleotídeo por eliminação, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação das mesmas de modo a enfraquecer ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão; ou substituindo a sequência de polinucleotídeo por uma sequência de polinucleotídeo com uma atividade mais fraca. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência do operador, uma sequência que codifica um sítio de ligação de ribossomo, sequências que controlam a finalização da transcrição e tradução etc., mas a sequência de controle de expressão não é limitada às mesmas.

[043] Adicionalmente, o método para modificar uma sequência de gene pode ser realizado introduzindo uma mutação na sequência de gene por eliminação, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação das mesmas de maneira a enfraquecer adicionalmente a atividade da proteína; ou substituindo a sequência de gene por uma sequência de gene melhorada para apresentar uma atividade mais fraca ou uma sequência de gene melhorada para não apresentar atividade, mas o método para modificar uma sequência de gene não é limitado aos mesmos.

[044] Da maneira aqui usada, o termo “micro-organismo que produz um nucleotídeo purina” ou “micro-organismo com uma capacidade de produzir nucleotídeo purina” se refere a um micro-organismo que apresenta naturalmente uma capacidade de produzir nucleotídeo purina; ou um micro-organismo em que uma capacidade de produzir nucleotídeo purina, que não está presente em sua cepa parental, é provida. Especificamente, o micro-organismo pode ser um no qual a proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, uma proteína da família WhiB, ou um regulador transcricional WhiB é inativado, apresentando assim uma capacidade de produzir nucleotídeo purina.

[045] Na presente descrição, “micro-organismo do gênero Corynebacterium” pode incluir todos os micro-organismos do gênero Corynebacterium. Especificamente, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium stationis, Corynebacterium —glutamicum, Corynebacterium phocae, Corynebacterium flavescens, —Corynebacterium humireducens, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium — pollutisoli Corynebacterium —marinumy Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium durum, Corynebacterium pilosum, ou Corynebacterium testudinoris, e mais especificamente Corynebacterium stationis, mas o micro-organismo não é limitada aos mesmos.

[046] No entanto, embora já seja conhecido que um micro-organismo do gênero Corynebacterium possa produzir nucleotídeos purina, o micro-organismo apresenta uma capacidade significativamente menor de produzir nucleotídeo, e o gene que atua em seu mecanismo de produção ou o princípio do mecanismo não é conhecido. Dessa maneira, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um nucleotídeo purina da presente descrição se refere a um micro-organismo tipo selvagem do próprio gênero Corynebacterium; um micro-organismo do gênero Corynebacterium em que a atividade do gene associado ao mecanismo de produção do nucleotídeo purina é melhorada ou inativada, apresentando assim uma melhor capacidade de produzir nucleotídeo purina; ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium em que a atividade de um gene exógeno é introduzida ou melhorada, apresentando assim uma melhor capacidade de produzir nucleotídeo purina. Especificamente, o micro- organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium stationis, em que a via biossintética de nucleotídeos purina é melhorada, e a melhoria pode significar que a atividade de uma proteína envolvida na via biossintética é melhor. Alternativamente, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium stationis, em que a atividade de uma proteína envolvida na via de degradação de nucleotídeos purina ou seu(s) precursor(s) é inativada.

[047] Em particular, no caso onde o nucleotídeo purina é 5'-inosina monofosfato (IMP), exemplos da proteína envolvida na via biossintética de nucleotídeos purina pode incluir pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste em amidofosforribosiltransferase — (PurF), fosforribosilamina-glicina ligase (PurD), fosforribosilglicinamida — formiltransferase — (PurN), fosforribosilformilglicinamidina sintase (PurL), AIR sintetase (FGAM ciclase), fosforribosilaminoimidazo! carboxilase, fosforribosilaminoimidazolsuccinocarboxamida — sintase, —adenilossuccinato liase (ADSL), fosforribosilaminoimidazolcarboxamida — formiltransferase e inosina monofosfato sintase.

[048] Adicionalmente, no caso onde o nucleotídeo purina é 5'-xantosina monofosfato (XMP), exemplos da proteína em que a atividade é melhorada podem incluir adicionalmente IMP desidrogenase, além do grupo que consiste nas proteínas anteriores.

[049] Adicionalmente, no case onde o nucleotídeo purina é 5'-guanosina monofosfato (GMP), exemplos da proteína em que a atividade é melhorada podem incluir adicionalmente IMP desidrogenase e/ou GMP sintase, além do grupo que consiste nas proteínas anteriores.

[050] Adicionalmente, no caso onde o nucleotídeo purina é ácido 5'-adenílico (AMP), exemplos da proteína em que a atividade é melhorada podem incluir adicionalmente adenilossuccinato sintase (purA), além do grupo que consiste nas proteínas anteriores.

[051] Mais especificamente, a proteína envolvida na via biossintética de nucleotídeos purina pode ser amidofosforribosiltransferase (PurF), mas a proteína não é limitada à mesma.

[052] Um outro aspecto da presente descrição provê um método para produzir nucleotídeos purina, que inclui uma etapa de cultivar o micro-organismo anterior, de acordo com a presente descrição, em um meio.

[053] O método de produção anterior pode incluir adicionalmente uma etapa de recuperar nucleotídeos purina.

[054] O micro-organismo e nucleotídeos purina são da maneira descrita anteriormente.

[055] Da maneira aqui usada, o termo “cultura” significa que um micro-organismo é crescido em condições ambientais apropriadamente e artificialmente controladas. Na presente descrição, o processo de cultura de um micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser realizado usando os métodos amplamente conhecidos na técnica. Especificamente, a cultura pode ser realizada continuamente em um processo em lote, processo em lote alimentado, ou processo em lote alimentado repetido, mas o processo de cultura não é limitado aos mesmos.

[056] A etapa de cultivar o micro-organismo pode ser realizada em cultura em lote, cultura contínua, cultura em lote alimentado etc., conhecidas na técnica, mas a etapa de cultivar o micro-organismo não é particularmente limitada às mesmas. O meio e outras condições de cultura usados para cultivar o micro-organismo da presente descrição não são particularmente limitados, mas qualquer meio usado na cultura convencional para um micro-organismo pode ser usado. Especificamente, o micro-organismo da presente descrição pode ser cultivado em condições aeróbicas em um meio convencional contendo uma fonte de carbono apropriada, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo, composto inorgânico, aminoácido e/ou vitamina etc., ajustando ao mesmo tempo a temperatura, pH etc. O meio para cultivar uma cepa de Corynebacterium é conhecido (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., Estados Unidos, 1981).

[057] As fontes de carbono que podem ser usadas no meio incluem sacarídeos e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim, e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) etc. Estes materiais podem ser usados sozinhos ou como uma mistura, mas não são limitados aos mesmos.

[058] As fontes de nitrogênio que podem ser usadas no meio incluem peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de feijão e ureia, ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio) etc. As fontes de nitrogênio também podem ser usadas sozinhas ou como uma mistura, mas não são limitadas às mesmas.

[059] As fontes de fósforo que podem ser usadas no meio podem incluir di- hidrogênio fosfato de potássio, hidrogênio fosfato de dipotássio e sais contendo sódio correspondentes dos mesmos. Adicionalmente, o meio de cultura pode incluir um sal metálico (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro) exigido para o crescimento. Finalmente, o meio de cultura pode incluir materiais de crescimento essenciais (por exemplo, aminoácidos e vitaminas), além dos materiais anteriores. Adicionalmente, os precursores adequados para um meio de cultura podem ser usados. As matérias primas anteriores podem ser adicionadas em um modo de cultura em lote ou modo de cultura contínua, durante um processo de cultura, por um método adequado para um meio de cultura.

[060] O pH de um meio de cultura pode ser ajustado durante a cultura do micro- organismo usando um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico) de uma maneira apropriada. Adicionalmente, a geração de espuma pode ser prevenida usando um agente antiespuma (por exemplo, éster de poliglico| de ácido graxo). Adicionalmente, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado no meio de cultura, a fim de manter um estado aeróbico do meio de cultura. A temperatura do meio de cultura pode ser normalmente mantida em 20 ºC a 45ºC, e especificamente 25 ºC a 40 ºC. O processo de cultura pode continuar até a quantidade desejada de produção de L-aminoácido ser obtida e, especificamente, por a 160 horas.

[061] Os nucleotídeos purina produzidos pelo processo de cultura anterior podem ser liberados no meio ou permanecerem nas células.

[062] O método para produzir nucleotídeos purina da presente descrição, após a etapa de cultura, pode incluir adicionalmente uma etapa de recuperar nucleotídeos purina a partir do micro-organismo ou do meio.

[063] A recuperação dos nucleotídeos purina pode ser realizada por um método convencional conhecido na técnica. Como o método para recuperação, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização etc., pode ser usada. Por exemplo, o meio de cultura pode ser centrifugado em uma velocidade baixa para remover a biomassa e o sobrenadante obtido pode ser separada por meio de cromatografia de troca iônica, mas o método para recuperação não é limitado ao mesmo, e os nucleotídeos purina desejados podem ser recuperados a partir do micro- organismo cultivado ou do meio, por um método apropriado conhecido na técnica.

[064] A etapa de recuperação pode incluir adicionalmente um processo de separação e/ou um processo de purificação.

[065] Ainda um outro aspecto da presente descrição provê um uso de um micro- organismo do gênero Corynebacterium, em que uma proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é inativada, para o aumento de produção do nucleotídeo purina.

[066] Ainda um outro aspecto da presente descrição provê um método para aumentar a produção de nucleotídeos purina, que inclui uma etapa de inativar a proteína incluindo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 da presente descrição em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[067] Os termos “nucleotídeo purina”, “uma proteína que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1”, “inativação” e “um micro-organismo do gênero Corynebacterium” são da maneira descrita anteriormente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[068] Daqui por diante, a presente descrição será descrita em detalhes por meio de modalidades exemplares. Entretanto, estas modalidades exemplares são apenas para propósitos ilustrativos e não são prendidas para limitar o escopo da presente descrição.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PARA O

PROPÓSITO DE INATIVAÇÃO DE PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB

[069] Uma proteína da família WhiB foi selecionada como uma proteína alvo a ser inativada para o aumento de uma capacidade de produzir nucleotídeo purina.

EXEMPLO 1-1: SELEÇÃO DE PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB DE

CORYNEBACTERIUM STATIONIS

[070] Uma proteína da família WhiB foi triada a partir do genoma de uma cepa Corynebacterium stationis ATCC 6872 tipo selvagem e, entre os genes no genoma, um tipo de gene que é considerado por estar envolvido na produção do nucleotídeo purina foi selecionado. Com base nas sequências de nucleotídeo relatadas no Genbank NIH (Estados Unidos), o gene foi confirmado como um regulador transcricional, WhiB.

EXEMPLO 1-2: PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE GENE QUE

CODIFICA A PROTEÍNA PARA INATIVAÇÃO DE PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB

[071] Os genes cromossomais da cepa ATCC 6872, que é uma cepa tipo selvagem de Corynebacterium stationis, foram extraídos usando o kit de extração de DNA total G-spin (Intron, Cat. No 17045). A seguir, a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada usando os genes cromossomais como um molde.

[072] A seguir, para a inativação de uma proteína da família WhiB, as atividades endógenas destas proteínas foram completamente removidas eliminando os genes que codificam estas proteínas; ou os níveis de expressão destas proteínas foram minimizados enfraquecendo os genes que codificam estas proteínas.

[073] Especificamente, as atividades endógenas dos genes anteriores foram removidas usando o vetor preparado de acordo com o Exemplo 1-2-1, e cada um do códon de iniciação endógeno (isto é, ATG) da cepa anterior foi substituído por GTG ou TTG usando o vetor preparado de acordo com o Exemplo 1-2-2. Sabe-se que o códon GTG ou TTG apresenta uma menor eficiência da expressão de proteína comparado ao códon ATG.

EXEMPLO 1-2-1: PREPARAÇÃO DE VETOR FOR ELIMINAÇÃO DO

GENE QUE CODIFICA PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB

[074] A fim de preparar um vetor para o propósito de eliminação de um gene que codifica uma proteína da família WhiB, cada um dos fragmentos de gene (eliminação- A e eliminação-B) foi obtido realizando PCR que usa o DNA genômico da cepa ATCC 6872 como um molde junto com um par de oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e um par de oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 5e SEQ ID NO: 6, respectivamente. Em particular, PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 ºC por 5 minutos; 25 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 55 ºC por 30 segundos, e polimerização a 72 “ºC por 2 minutos; e polimerização a 72 ºC por 7 minutos.

[075] Em função disso, dois fragmentos de polinucleotídeo (isto é, um fragmento de eliminação A de 1.026 bp e um fragmento de eliminação-B de 1.044 bp) podem ser obtidos. Uma PCR de sobreposição foi realizada usando estes dois fragmentos como moldes junto com oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 3 e SEQIDNO: 6 e, por meio disso, um produto de PCR de 2.050 bp (daqui por diante, denominado como “fragmento de eliminação”) foi obtido.

[076] O fragmento de eliminação obtido foi tratado com uma enzima de restrição Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA, Estados Unidos) e ligado ao vetor pDZ, que foi tratado com a mesma enzima de restrição, usando T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA, Estados Unidos). O gene preparado foi transformado em E. coli DH5a, e os transformantes foram selecionados em um meio LB contendo canamicina, e a seguir o DNA foi obtido usando o kit de DNA total de plasmídeo DNA-spin (iNt(RON).

[077] O vetor preparado pelo método anterior, que objetiva eliminar o gene que codifica uma proteína da família WhiB, foi denominado como “pDZ-eliminação”.

EXEMPLO 1-2-2: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA REDUZIR A

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB

[078] A fim de preparar um vetor que objetiva enfraquecer o gene que codifica uma proteína da família WhiB, o códon de iniciação da cepa ATCC 6872 (isto é, ATG) foi modificado para TTG ou GTG.

[079] Primeiro, a fim de preparar uma cepa em que o códon de iniciação é modificado para TTG, cada um dos fragmentos de gene (alt-A e alt-B, onde o códon de iniciação é modificado para TTG ou GTG) foi obtido realizando PCR que usa o DNA genômico da cepa ATCC 6872 como um molde, junto com um par de oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e um par de oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. Em função disso, dois polinucleotídeos (isto é, um fragmento alt-A de 974 bp e um fragmento alt-B de 982 bp) podem ser obtidos. Uma PCR de sobreposição foi realizada usando estes dois fragmentos como moldes junto com oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 10 e, por meio disso, um produto de PCR de 1.955 bp (daqui por diante, denominado como “fragmento alt”) foi obtido.

[080] Adicionalmente, a fim de preparar uma cepa na qual o códon de iniciação é modificado para GTG, cada um dos fragmentos de gene (alt-A e alt-B) foi obtido realizando PCR que usa o DNA genômico da cepa ATCC 6872 como um molde, junto com um par de oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 11 eum par de oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. Em função disso, dois polinucleotídeos (isto é, um fragmento alt-A de 974 bp e um fragmento alt-B de 982 bp) podem ser obtidos. Uma PCR de sobreposição foi realizada usando estes dois fragmentos como moldes, junto com oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 10 e, por meio disso, um produto de PCR de 1.955 bp (daqui por diante, denominado como “fragmento alg”) foi obtido.

[081] No entanto, as condições para cada PCR são as mesmas da maneira a seguir: desnaturação a 94 ºC por 5 minutos; 25 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 55 ºC por 30 segundos, e polimerização a 72 “ºC por 2 minutos; e polimerização a 72 ºC por 7 minutos.

[082] Os fragmentos de gene obtidos foram cada qual tratados com uma enzima de restrição Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA, Estados Unidos) e ligados ao vetor pDZ, que foi tratado com a mesma enzima de restrição, usando T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA, Estados Unidos) Cada gene preparado foi transformado em E. coli DH5a, e os transformantes foram selecionados em um meio LB contendo canamicina, e a seguir o DNA foi obtido usando o kit de DNA total de plasmídeo DNA-spin (iNtRON).

[083] Os vetores preparados pelo método anterior, que objetivam enfraquecer o gene que codifica uma proteína da família WhiB, foram denominados como “pDZ-alt” e “pDZ-alg”, respectivamente.

[084] No entanto, as sequências de oligonucleotídeos iniciadores usadas para a preparação dos vetores são mostardas na tabela 1 a seguir. Tabela 1

TCACTAACTGGGCTGATTATCTCG TTGAGATTATGTGTGGATAAGCAGAAG

GTGAGATTATGTGTGGATAAGCAGAAG EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA TIPO SELVAGEM QUE PRODUZ NUCLEOTÍDEOS PURINA, E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR

NUCLEOTÍDEO PURINA DA MESMA EXEMPLO 2-1: PREPARAÇÃO DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA TIPO SELVAGEM DERIVADA QUE

PRODUZ XMP ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS PURINA

[085] Os dois tipos de vetores (isto é, pDZ-alt e pDZ-alg), preparados de acordo com o exemplo 1, foram cada qual individualmente transformados na cepa Corynebacterium stationis KCCM-10530 (patente KR 10-0542568) por eletroporação, e as colônias crescidas em um meio de seleção contendo canamicina (25 mg/L) foram primeiro selecionadas.

[086] A seguir, as cepas, nas quais o gene que codifica uma proteína da família WBhiB é eliminado ou o códon de iniciação é modificado para uma forma enfraquecida (isto é, ATG-TTG ou ATG>-GTG), foram obtidas por meio de um processo de cruzamento secundário usando uma homologia entre o gene endógeno das cepas, e os polinucleotídeos incluídos nos vetores anteriores.

[087] No entanto, a cepa na qual o gene que codifica a proteína da família WhiB é eliminado foi selecionada usando os oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 13 e SEQID NO: 6. Quando PCR é realizada usando os oligonucleotídeos iniciadores anteriores, a cepa tipo selvagem produziu um fragmento de 1.680 bp, ao passo que na cepa onde o gene é eliminado, um fragmento de 1.414 bp foi detectado.

[088] Adicionalmente, a cepa na qual o gene que codifica a proteína da família WhiB é enfraquecido foi selecionada com base na PCR por incompatibilidade. À mutação ATG—>TTG' foi selecionada usando os oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 6, ao passo que a mutação ATG>GTG' foi selecionada usando SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 6. Uma vez que SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: incluem cada qual T ou G na terminação 3' em vez de A, que é uma sequência de nucleotídeo da cepa tipo selvagem, os fragmentos de PCR foram detectados naturalmente apenas quando ocorreu uma mutação. As cepas que foram confirmadas primeiro por PCR por incompatibilidade, foram finalmente confirmadas por meio da análise de sequência do gene.

[089] Finalmente, as cepas obtidas pelo método anterior foram denominadas da maneira a seguir: a cepa na qual o gene que codifica a proteína da família WhiB é eliminado foi denominada como “CN02-1545”; a cepa na qual o gene anterior é enfraquecido em virtude da substituição do códon de iniciação em uma forma TTG foi denominada como “CJX-1546”; e a cepa na qual o gene anterior é enfraquecido em virtude da substituição do códon de iniciação em uma forma GTG foi denominada como “CJX-1547”.

[090] No entanto, as sequências de oligonucleotídeos iniciadores usadas para a preparação das cepas são mostradas na tabela 2 a seguir. Tabela 2

[091] No entanto, a cepa CN02-1545 foi depositada internacionalmente no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 7 de novembro de 2017, segundo as disposições do Tratado de Budapest e número de acesso atribuído KCCM12152P.

EXEMPLO 2-2: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR XMP DA

CEPA NA QUAL A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA

[092] A fim de avaliar a capacidade de produzir XMP da cepa Corynebacterium stationis KCCM-10530, que produz XMP entre nucleotídeos purina, e cepas CN02- 1545, CJX-1546 e CJX-1547 preparadas no exemplo 2-1, o método de cultura descrito a seguir foi usado.

[093] O meio para semeadura a seguir (5 mL) foi dispensado em cada tubo de teste (diâmetro: 18 mm), que foi autoclavado de acordo com o método convencional, inoculado com uma cepa a ser usada, e cultivado com agitação a 30 ºC em 180 rom por 18 horas. O resultante foi usado como uma solução de cultura para semeadura. Entre os meios de fermentação, o meio principal e um meio estéril adicional foram cada qual autoclavados de acordo com o método convencional, e dispensados em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL para agitação, que foi autoclavado antecipadamente, em uma quantidade de 29 mL e 10 mL, respectivamente, fagocitados com a solução de cultura para semeadura (1 mL) e cultivados por 72 horas. A taxa de revolução foi ajustada em 200 rpm e a temperatura foi ajustada a 30 ºC.

[094] As composições do meio usadas são da maneira a seguir. A quantidade de produção de XMP foi mensurada por um método usando HPLC após a finalização da cultura, e os resultados são mostrados na tabela 3 a seguir. A concentração do acúmulo de XMP foi indicada como “5'-xantilato de sódio-7H20”.

MEIO PARA SEMEADURA DO FRASCO XMP

[095] Glicose 30 g/L, Peptona 15 g/L, Extrato de levedura 15 g/L, NaCl 2,5 g/L, Ureia 3 g/L, Adenina 150 mg/L, Guanina 150 mg/L, pH 7,2 MEIO DE PRODUÇÃO DO FRASCO XMP (MEIO PRINCIPAL)

[096] Glicose 60 g/L, Sulfato de magnésio 10 g/L, Cloreto de cálcio 10 mg/L, Sulfato de ferro 20 mg/L, Sulfato de manganês 10 mg/L, Sulfato de zinco 10 mg/L, Sulfato de cobre 1 mg/L, Biotina 100 pg/L, Tiamina 5 mg/L, Adenina 30 mg/L, Guanina 30 mg/L, pH 7,2 MEIO DE PRODUÇÃO DO FRASCO XMP (MEIO ESTÉRIL ADICIONAL)

[097] Di-hidrogênio fosfato de potássio 10 g/L, Hidrogênio fosfato de dipotássio g/L, Ureia 7 g/L, Sulfato de amônio 5 g/L Tabela 3 Cepa g/L g/L/hr

[098] Em particular, na tabela 3, a produtividade representa a quantidade de XMP produzido por unidade de hora no ponto de tempo de 48 horas após a finalização da cultura.

[099] Da maneira mostrada na tabela 3, confirmou-se que a cepa parental (isto é, cepa KCCM10530) produziu XMP em uma concentração de 11,8 g/L após finalização da cultura no frasco; a cepa CNO02-1545 mostrou um aumento na quantidade de produção de XMP em 1,3 g/L; a cepa CJX-1546 mostrou um aumento na quantidade de produção de XMP em 0,5 g/L; e a cepa CJX-1547 mostrou um aumento na quantidade de produção de XMP em 0,7 g/L. Estes resultados confirmaram que a quantidade de produção de XMP das cepas anteriores foi melhorada em 11 %, 4 % e 6 %, respectivamente, comparada àquela da cepa parental.

[0100] Adicionalmente, enquanto a cepa parental (isto é, cepa KCCM10530) mostrou uma produtividade de 0,148 g/L/hr, a cepa CN02-1545 mostrou uma produtividade de 0,191 g/L/hr, a cepa CJX-1546 mostrou uma produtividade de 0,188 g/L/hr, e a cepa CJX-1547 mostrou uma produtividade de 0,198 g/L/hr. Estes resultados confirmaram que a produtividade de XMP das cepas anteriores foi melhorada em 29 %, 27 % e 34 %, respectivamente, comparada àquela da cepa parental.

[0101] Os resultados anteriores implicam que, quando a proteína da família WhiB da presente descrição é inativada em uma cepa, sua produção do nucleotídeo purina é aumentada.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA MUTANTE QUE PRODUZ NUCLEOTÍDEO PURINA, EM QUE O GENE DA VIA BIOSSINTÉTICA DE PURINA É MELHORADO, E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR NUCLEOTÍDEO

PURINA DA MESMA EXEMPLO 3-1: PREPARAÇÃO DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA MUTANTE QUE PRODUZ XMP

ENTRE NUCLEOTÍDEOS PURINA

[0102] Uma cepa, na qual um gene que codifica uma proteína da família WhiB é inativada, foi preparada usando uma cepa que produz XMP, em que um gene da via biossintética de purina é melhorado. Especificamente, a cepa produtora de XMP, em que um gene da via biossintética de purina é melhorado, sendo uma cepa modificada de KCCM-10530 onde PurF é melhorado, é uma cepa na qual o códon de iniciação do gene purF (isto é, GTG) é convertido em ATG. A cepa KCCM-10530, na qual o gene da via biossintética de purina, purF, é melhorado, foi denominada como CJX- 1544 [KCCM-10530 purF(gia)]l. A cepa CJX-1544 [KCCM-10530 purF(9g1a)] foi transformada com o vetor pDZ-eliminação, que é um vetor recombinante preparado no exemplo 1, por eletroporação. As colônias crescidas em um meio de seleção contendo canamicina (25 mg/L) foram primeiro selecionadas.

[0103] A seguir, uma cepa na qual um gene que codifica a proteína da família WBhiB é eliminado foi obtida por meio de um processo de cruzamento secundário, usando uma homologia entre o gene endógeno da cepa anterior e o polinucleotídeo incluído no vetor anterior. No entanto, a cepa na qual um gene que codifica a proteína da família WhiB é eliminado foi obtida da mesma maneira que no exemplo 2, usando os oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 6.

[0104] Finalmente, a cepa, em que um gene que codifica a proteína da família WBhiB é eliminado, obtida pelo método anterior, foi denominada como “CJX-1553”. EXEMPLO 3-2: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR XMP

ENTRE NUCLEOTÍDEOS PURINA DE CEPA NA QUAL O GENE QUE CODIFICA PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADO

[0105] A fim de avaliar a capacidade de produzir XMP da cepa CJX-1544, em que o gene da via biossintética de purina (isto é, purF) é melhorado, e a cepa CJX-1553 preparada no exemplo 3-1, o método de cultura como no exemplo 2-2 foi usado. Após a finalização da cultura, a quantidade de produção de XMP em cada cepa foi avaliada por um método usando HPLC, e os resultados são mostrados na tabela 4 a seguir. Tabela 4 Número da Cepa g/L g/L/hr: CX1544

[0106] Em particular, na tabela 4, a produtividade representa a quantidade de XMP produzido por unidade de hora no ponto de tempo de 48 horas, após a finalização da cultura.

[0107] Da maneira mostrada na tabela 4, confirmou-se que a quantidade de produção de XMP foi aumentada na cepa CJX-1553 em 1,5 g/L, comparada à sua cepa parental (isto é, CJX-1544), em que um fator da via biossintética de purina (isto é, purF) é melhorado. O resultado anterior confirmou que a quantidade de produção de XMP na cepa CJX-1553 melhorou em 10,7 %, comparada àquela da sua cepa parental (isto é, CJX-1544).

[0108] Adicionalmente, confirmou-se que a cepa parental (isto é, CJX-1544) mostrou uma produtividade de 0,183 g/L/hr e o CJX-1553 cepa mostrou uma produtividade de 0,212 g/L/hr. O resultado anterior confirmou que a produtividade de XMP da cepa CJX-1553 é melhorada em 16 %, comparada à sua cepa parental (isto é, CJX-1544).

EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA PRODUTORA DE NUCLEOTÍDEO PURINA TIPO SELVAGEM, E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR

NUCLEOTÍDEO PURINA DA MESMA EXEMPLO 4-1: PREPARAÇÃO DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA TIPO SELVAGEM DERIVADA QUE

PRODUZ IMP ENTRE NUCLEOTÍDEOS PURINA

[0109] Os dois tipos de vetores (isto é, pDZ-alt e pDZ-alg), preparados de acordo com o exemplo 1, foram cada qual individualmente transformados na cepa Corynebacterium stationis KCCM-10610 (Patente KR 10-0588577) por eletroporação, e as colônias crescidas em um meio de seleção contendo canamicina (25 mg/L) foram primeiro selecionadas.

[0110] A seguir, cepas, em que o códon de iniciação do gene que codifica uma proteína da família WhiB é modificado para uma forma enfraquecida (isto é, ATG—TTG ou ATG>GTG), foram obtidas por meio de um processo de cruzamento secundário usando uma homologia entre o gene endógeno da cepa e os polinucleotídeos incluídos nos vetores anteriores.

[0111] A cepa na qual o gene que codifica a proteína da família WhiB é enfraquecido foi selecionada com base na PCR por incompatibilidade. A mutação “ATG>TTG' foi selecionada usando os oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 6, ao passo que a mutação ATG>GTG' foi selecionada usando os oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 6. Uma vez que SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 incluem cada qual T ou G na terminação 3' em vez de A, que é uma sequência de nucleotídeo da cepa tipo selvagem, os fragmentos de PCR foram detectados naturalmente apenas quando ocorreu uma mutação. As cepas que foram confirmadas primeiro por PCR por incompatibilidade, foram finalmente confirmadas por meio da análise de sequência do gene.

[0112] Finalmente, as cepas obtidas pelo método anterior foram denominadas da maneira a seguir: isto é, a cepa na qual o gene que codifica a proteína da família WhiB é enfraquecido em virtude da substituição do códon de iniciação em uma forma TTG foi denominada coma “CJ1I-2078”; e a cepa na qual o gene anterior é enfraquecido em virtude da substituição do códon de iniciação em uma forma GTG foi denominada como “CJI-2077”.

EXEMPLO 4-2: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR IMP

ENTRE NUCLEOTÍDEOS PURINA DA CEPA NA QUAL A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA

[0113] A fim de avaliar a capacidade de produzir IMP da cepa Corynebacterium stationis KCCM-10610, que é uma cepa que produz IMP entre nucleotídeos purina, e cepas CJI-2078 e CJI-2077 preparadas no exemplo 4-1, o método de cultura descrito a seguir foi usado.

[0114] O meio para semeadura a seguir (5 mL) foi inoculado em cada tubo de teste autoclavado (diâmetro: 18 mm), cultivado com agitação a 30 ºC por 24 horas, e o resultante foi usado como uma solução de cultura para semeadura. Um meio de produção (29 mL) foi dispensado em um frasco de Erlenmeyer para agitação, o qual foi autoclavado a 121ºC por 15 minutos, e inoculado com a solução de cultura para semeadura (2 mL) e cultivado por 4 a 5 dias. As condições de cultura foram da maneira a seguir: taxa de revolução foi ajustada em 170 rpm, a temperatura foi ajustada a 30

ºC, e o pH foi ajustado em 7,5.

[0115] As composições de meio usadas são da maneira a seguir. A quantidade de produção de IMP foi medida por um método usando HPLC após a finalização da cultura, e os resultados são mostrados na tabela 5.

MEIO PARA SEMEADURA IMP

[0116] Glicose 10 g/L, Peptona 10 g/L, Extrato de carne 10 g/L, Extrato de levedura g/L, NaCl 2,5 g/L, Adenina 100 mg/L, Guanina 100 mg/L, pH 7,2

MEIO DE PRODUÇÃO EM FRASCO IMP

[0117] Glutamato monossódico 1 g/L, Cloreto de amônio 10 g/L, sulfato de magnésio 12 g/L, Cloreto de cálcio 0,1 g/L, Sulfato de ferro 20 mg/L, Sulfato de manganês 20 mg/L, Sulfato de zinco 20 mg/L, Sulfato de cobre 5 mg/L, L-cisteína 23 mg/L, Alanina 24 mg/L, Ácido nicotínico 8 mg/L, Biotina 45 ua/L, Tiamina HCI 5 mg/L, Adenina 30 mg/L, Ácido fosfórico (85 %) 19 g/L, Glicose 26 g/L, Frutose 14 g/L (Adicionada) Tabela 5 Cepa

[0118] Da maneira mostrada na tabela 5 anterior, confirmou-se que a quantidade de produção de IMP foi aumentada em 0,5 g/L na cepa CJI-2078 e em 0,2 g/L na cepa CJI-2077, comparada à sua cepa parental (isto é, KCCM-10610). Estes resultados confirmaram que a quantidade de produção de IMP foi melhorada nestas cepas em 4,5 % e 1,8 %, respectivamente, comparada à sua cepa parental.

EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE CEPA NA QUAL A PROTEÍNA DA

FAMÍLIA WHIB É INATIVADA USANDO CEPA MUTANTE QUE PRODUZ NUCLEOTÍDEO PURINA, EM QUE O GENE DE VIA BIOSSINTÉTICA DE PURINA É MELHORADO, E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR NUCLEOTÍDEO

PURINA DA MESMA EXEMPLO 5-1: PREPARAÇÃO DE CEPA, NA QUAL A PROTEÍNA DA FAMÍLIA WHIB É INATIVADA, USANDO CEPA MUTANTE QUE PRODUZ IMP

ENTRE NUCLEOTÍDEOS PURINA

[0119] Uma cepa, em que uma proteína da família WhiB é inativada, foi preparada usando uma cepa produtora de IMP, em que um gene da via biossintética de purina é melhorado. Especificamente, a cepa que produz IMP, em que um gene da via biossintética de purina é melhorado, que é uma cepa modificada de KCCM-10610 onde PurF (isto é, um gene da via biossintética de purina) é melhorado, é uma cepa na qual o códon de iniciação do gene purF (isto é, GTG) é convertido em ATG. A cepa KCCM-10610, na qual o gene da via biossintética de purina, purF, é melhorado, foi denominada como CJI-1964/[KCCM-10610 purF(gia)]l. A cepa CJI-1964/[KCCM- 10610 purF(g1a)] foi transformada com os dois tipos de vetores (isto é, pDZ-alt e pDZ- alg) preparados no exemplo 1, por eletroporação, e as cepas, em que o códon de iniciação do gene que codifica a proteína da família WhiB foi modificado em uma forma enfraquecida (isto é, ATG>-TTG ou ATG-GTG), foram obtidas da mesma maneira que no exemplo 4-1.

[0120] Finalmente, as cepas obtidas pelo método anterior foram denominadas da maneira a seguir: isto é, a cepa na qual o gene que codifica a proteína da família WhiB é enfraquecido, em virtude da substituição do códon de iniciação em uma forma TTG, foi denominada como “CJI-2081”; e a cepa na qual o gene anterior é enfraquecido, em virtude da substituição do códon de iniciação em uma forma GTG, foi denominada como “CJI-2080”.

EXEMPLO 5-2: AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR IMP ENTRE NUCLEOTÍDEOS PURINA DE CEPA, EM QUE A PROTEÍNA DA FAMÍLIA

WHIB É INATIVADA

[0121] A fim de avaliar a capacidade de produzir IMP da cepa CJI-1964, em que um gene da via biossintética de purina é melhorado, e das cepas CJ1I-2081 e CJI-2080 preparadas no exemplo 5-1, o método de cultura como no Exemplo 4-2 foi usado.

Após a finalização da cultura, a quantidade de produção de IMP em cada cepa foi medida por um método usando HPLC, e os resultados são mostrados na tabela 6 a seguir.

Tabela 6

[0122] Da maneira mostrada na tabela 6 anterior, confirmou-se que a quantidade de produção de IMP foi aumentada em 0,9 g/L na cepa CJI-2081 e em 0,7 g/L na cepa CJI-2080, comparada à sua cepa parental (isto é, CJI-1964). Estes resultados confirmaram que a quantidade de produção de IMP foi melhorada nestas cepas em 7,8 % e 6,1 %, respectivamente, comparada à sua cepa parental.

[0123] Isto é, confirmou-se que quando um regulador transcricional proteico da família WhiB é inativado em uma cepa, a cepa pode produzir nucleotídeos purina em maior rendimento, comparado à sua cepa parental ou outros micro-organismos não modificados. Adicionalmente, estes resultados implicam que, quando a proteína da família WhiB é inativada em uma cepa, a cepa pode produzir nucleotídeos purina em maior rendimento, comparada à sua cepa parental ou outros micro-organismos não modificados. A partir do precedente, os versados na técnica, aos quais a presente descrição pertence, serão capazes de entender que a presente descrição pode ser incorporada em outras formas específicas, sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente descrição. Em relação a isso, as modalidades exemplares aqui descritas são apenas para propósitos ilustrativos, e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente descrição. Ao contrário, a presente descrição é pretendida para incluir não apenas as modalidades exemplares, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem ser incluídas no espírito e escopo da presente descrição, da maneira definida pelas reinvindicações em anexo.

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES

1. Corynebacterium stationis que produz um nucleotídeo purina, caracterizada por uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ser inativada.

2. Corynebacterium stationis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o nucleotídeo purina ser pelo menos um nucleotídeo purina selecionado de 5'-inosina monofosfato (IMP), 5'-xantosina monofosfato (XMP), B'-guanosina monofosfato (GMP), e ácido 5'-adenílico (AMP).

3. Corynebacterium stationis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por, na Corynebacterium stationis, uma via biossintética de um nucleotídeo purina ser adicionalmente melhorada.

4, Corynebacterium stationis, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a melhoria de uma via biossintética de um nucleotídeo purina ser a melhoria de uma atividade da proteína amidofosforribosiltransferase (PurF).

5. Método para produzir um nucleotídeo purina, caracterizado por compreender cultivar a Corynebacterium stationis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em um meio.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o nucleotídeo purina ser pelo menos um nucleotídeo purina selecionado de 5"- inosina monofosfato (IMP), 5'-xantosina monofosfato (XMP), 5'-guanosina monofosfato (GMP), e ácido 5'-adenílico (AMP).

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender — adicionalmente recuperar um nucleotídeo purina da Corynebacterium stationis cultivada ou do meio após a cultura.

8. Método para aumentar a produção de um nucleotídeo purina, caracterizado por compreender inativar uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 em um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

Resumo da Patente de Invenção para “MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO

CORYNEBACTERIUM QUE PRODUZ NUCLEOTÍDEO PURINA E MÉTODO PARA PRODUZIR NUCLEOTÍDEO PURINA USANDO O MESMO” A presente invenção se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um nucleotídeo purina e um método para produzir um nucleotídeo purina usando o mesmo.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.

Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: P5216- Listagem de Sequências.txt - Data de Geração do Código: 14/07/2020 - Hora de Geração do Código: 14:31:28 - Código de Controle: - Campo 1: 2A05876EE564F283 - Campo 2: BOEAA8S988E982BD1