KR101210704B1 - ５'－크산틸산 및 ５'－구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 5'－크산틸산 또는 ５'－구아닐산의 생산방법 - Google Patents

５'－크산틸산 및 ５'－구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 5'－크산틸산 또는 ５'－구아닐산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5'-크산틸산 생산능 및 5'-구아닐산 생산능이 증가된 미생물에 관한 것으로서, 구체적으로 프롤린 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 미생물 및 상기 형질전환되어 제조된 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

５'－크산틸산 및 ５'－구아닐산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 5'－크산틸산 또는 ５'－구아닐산의 생산방법{Microorganism having enhanced 5'-xanthosine monophosphate and　5'-guanine monophosphate productivity and a method of producing 5'-xanthosine monophosphate or 5'-guanine monophosphate using the same}
본 발명은 프롤린 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 미생물, 및 상기 형질전환되어 제조된 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
5'-구아닐산 (5'-guanine monophosphate: 이하 GMP)는 IMP (inosine monophosphate)와 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. GMP는 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 IMP과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.
지금까지 알려진 GMP의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 GMP를 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate; 이하 XMP라 칭한다)을 코리네형 미생물을 이용하여 GMP로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 대장균 (Escherichia Coli)을 이용하여 GMP로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이 중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.
상기 서술한 방법 중 XMP를 생산하여 GMP로 전환시키는 방법을 이용하여 GMP를 생산할 경우, XMP의 생산성을 강화하는 전략 또는 GMP 전환 반응 중 조효소로 사용되는 ATP의 지속적인 공급이 필요하다. 따라서 XMP 생산을 강화시키기 위하여 종래에는 변이 처리를 통해 구아노신 또는 XMP의 내성을 가지는 미생물을 생산하였는데, 예를 들면, 대한민국 특허출원 제10-1991-018061호는 XMP 수율을 높이기 위하여 아데닌과 구아닌 반영양요구성형의 크산틸산 아미나아제 불활성 균주이며 구아노신 유사체 내성을 가지고 있고 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 감수성이 매우 높은 균주를 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 제10-2001-000513호에는 XMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)를 친주로 자외선을 조사하여, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제를 통상적인 방법에 따라 처리함으로써, 친주의 형질을 변형시켜 XMP의 생합성에 영향을 주는 발린 (valine)에 대한 유사체 (analoge)인 노르발린 (norvaline) 내성주를 선별하여, 그 결과 XMP을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시키는 미생물을 이용한 XMP 생산방법을 개시하고 있다. 아울러 대한민국 특허출원 제10-2008-006537호에서는 XMP의 생합성에 관련하는 생합성 경로의 유전자인 purN, purH 를 강화하여 XMP 수율을 향상시킨 예도 있다.
상기 언급한 바와 같이 XMP를 이용하여 GMP로 전환하기 위하여는 GMP 생산 과정 중에 조효소로 사용되는 ATP의 공급이 중요한데, 상기 ATP 생산의 대부분은 XMP를 생산하는 XMP 생산 균주 내에서 이루어지며, 전환반응은 세포의 ATP와 XMP에 대한 막투과성을 증가시키는 자이렌과 같은 물질을 배지 중에 첨가하여 ATP와 XMP가 GMP 생산균주 내로 잘 유입되도록 한 다음, XMP를 GMP로 전환시킴으로서 수행될 수 있다. 따라서, GMP의 생산수율을 높이기 위해서는 ATP의 생산을 강화하는 전략이 필요하다.
XMP로부터 GMP로 전환하는 화학반응식은 다음과 같다.
XMP + ATP + NH3 ---------------------> GMP + AMP + PPi
XMP 아미나아제
즉, 1차적으로 XMP를 생산하고, XMP 및 미생물을 포함하는 배양액에 XMP 아미나아제(XMP aminase) 활성을 가지는 효소 또는 미생물을 첨가하여 2차적으로 전환반응을 진행하여 GMP를 생산하는 공법의 핵심은 전환반응 과정 중에 지속적으로 조효소인 ATP를 공급하는 것이며, 따라서 XMP 생산균주의 ATP 생성능을 강화시키는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다. 전환반응의 결과로 생성된 AMP는 ATP 생성을 위한 기질로 다시 사용되며, 아데닌 (adenine)계의 핵산 뉴클레오티드는 전환반응계에서 지속적으로 ATP생성을 위해 재생된다.
이와 같이 고수율의 GMP를 생산하기 위하여는 XMP 생산률 향상이 필요하고, XMP의 생산 증가를 위하여는 ATP 생산을 증대시켜야 하는 바, 상기와 같은 배경기술 하에서, 본 발명자들은 ATP 생산의 증대를 위한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 프롤린 디하이드로게나아제 (proline dehydrogenase)의 활성을 강화할 경우, ATP 생산 증대를 통하여 XMP 및 GMP의 수율을 향상시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명자들은 XMP 수율을 향상시킬 수 있는 유전자를 밝히고, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 디자인하는 한편, 상기 벡터로 형질전환된 코리네박테리아 속 미생물을 제조함으로써, 상기 미생물로부터 XMP 또는 GMP를 고수율로 수득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 프롤린 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서 하나의 양태로서 본 발명은 프롤린 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 유래의 미생물에 관한 것이다. 바람직하게 본 발명은 프롤린 디하드로게나아제 활성을 내재적 활성보다 증가시킴으로써 5'-크산틸산(XMP) 생산능 및 5'-구아닐산(GMP) 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 미생물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프롤린 디하이드로게나아제 (proline degydrogenase)"란 프롤린 디하이드로게나제/델타-1-피롤린-5-카르복실레이트 디하이드로게나제 (proline dehydrogenase/delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase)로서, 상기 효소는 알라닌, 아스파테이트 및 글루타메이트 대사 경로, 아르기닌 및 프롤린 대사 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은, 해당 효소의 활성을 증가시킴으로써 XMP 뿐만 아니라 GMP의 생산 수율이 향상된 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성"이란 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하고, "내재적 활성이 증가"되어 있다는 의미는 천연 상태의 효소 활성과 비교할 때 활성이 더 향상된 것을 의미한다. 본 발명의 효소 활성 증가란, 효소 자체의 활성이 증대되어 본래의 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 유전자 카피 수 증가, 또는 외부로부터의 유전자 도입 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함한다. 또한 상기 증가된 효소의 활성은, 예를 들면, 유전자 카피 수의 증가, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등 당업계에 알려진 방법이 제한 없이 사용된 결과에 의해 달성 될 수 있으며, 상기 예들에 의해 효소 활성 증가 방법이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의해 활성이 증가되는 효소인 프롤린 디하이드로게나아제는 코리네박테리아의 putA 유전자에 의해 암호화 될 수 있으며, 상기 유전자와 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체, 유사체 등을 모두 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 putA 유전자는 그와 실질적으로 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 보이며, putA 서열과 70% 이상의 상동성을 지니는 유전자, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 유전자를 포함한다. 바람직하게 본 발명의 putA 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 될 수 있다. 또한 내부 또는 외부적 요인에 의해 유전자 카피 수가 증가되는 경우, 증가시킬 수 있는 카피 수는 공지된 방법에 의하여 당업자의 필요에 따라 목적에 맞게 선택할 수 있다. 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력 하에서 배양하는 방법 등에 의해 용이하게 이루어질 수 있으며, 상기 예에 의해 내재적 유전자 증폭 방법이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 코리네박테리아 속 미생물에 상기 프롤린 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 벡터를 도입함으로써 그 내재적 활성보다 현저히 증가된 형질전환된 미생물을 생산하였다.
본 발명의 "코리네박테리아 속 미생물"은 당업계에서 사용되는 코리네박테리아 속 미생물이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리아 암모니아게네스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 브레비박테리움 플라부므, 브레비박테리움 락토메르멘툼 등이 사용될 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 코리네박테리아 속 미생물의 종류가 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 코리네박테리아 속 미생물에는, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰 R, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) ATCC 13869 및 이들로 부터 제조된 균주를 포함한다. 바람직하게는 코리네박테리아 암모니아게네스 KCCM-10530로부터 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-1346일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 균주는 수탁번호 KCCM-10530인 코리네박테리움 암모니아게네스에 도 1의 개열지도를 갖는 벡터를 도입하는 한편, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 미생물을 배지에 배양하여 2 카피 이상의 putA 유전자를 상동 재조합에 의해 내재적 유전자와 치환한 결과, 2 이상의 카피를 갖는 putA 유전자가 염색체 내에 삽입된 균주를 제조할 수 있었다.
본 발명에서 사용되는 용어 "5'-크산틸산(XMP)"이란 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 용도로 다방면에서 이용되고 있으며, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승 효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중의 하나이다. XMP는 퓨린 뉴클레오타이드(purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5'-구아닐산 (5'-guanylic acid, GMP)의 제조원료로서 중요한 물질이다. 바람직하게 본 발명은 이러한 XMP의 생산능이 향상된 형질전환된 미생물을 제조하였고, 이를 배양하여, 그 배양액으로부터 XMP을 생산한 결과, 종전의 미생물보다 약 4%가 향상된 XMP 생산능을 갖는 형질전환된 미생물 균주를 수득할 수 있었으며, 이를 통하여 XMP 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명에서 사용되는 용어 "5'-구아닐산(GMP)"이란 구아노신과 인산이 결합한 뉴클레오티드의 하나로서 핵산을 구성하며 그 위치에 따라 5'-체, 3'-체 및 2'-체의 3 종류로 나뉜다. 본 발명에서 생산되는 5'-구아닐산은 무색의 침상결정으로, 생체 내에 유리상태로 존재한다. 분자식은 C10H14N5O8P이며, 나트륨염에는 표고의 맛이 있어 화학 조미료로 사용되는 물질이다. GMP는 송이버섯 맛을 내며, 정미성 조미료로 각광을 받고 있는, 핵산계 조미료 중의 하나이다. 바람직하게 본 발명은 형질전환된 미생물을 이용하여 이러한 5'-구아닐산을 고수율로 얻을 수 있는 방법을 밝혀내었으며, 종전의 미생물을 이용한 방법보다 GMP의 농도가 약 7%가 증가됨을 확인하였다.
본 발명은 putA 유전자를 포함하는 벡터를 도입하여 프롤린 디하이드로게나제 활성이 증가된 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 벡터는 putA 유전자와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하며, 형질전환되는 미생물의 종류 및 특성에 따라 putA 유전자와 실질적으로 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 수행하는 유전자의 서열에 차이가 존재할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 바람직하게 본 발명은 서열번호 7의 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 7의 유전자는 코리네박테리아의 putA 유전자의 천연형 서열이다. 상기 "putA 유전자"는 프롤린 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 의미한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 경우, 상기 기능을 수행하는 유전자는 accession number NC_006958로써 서열이 알려져 있으며, mRNA 서열은 YP_224396.1로 공지되어 있다.
바람직한 양태로서 본 발명은, 서열번호 7로 표시되는 putA 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다. 본 발명의 벡터는 putA 유전자를 포함할 수 있는 벡터라면 당업계에서 통상적으로 사용되는 벡터를 제한 없이 사용할 수 있으며, 사용되는 숙주의 특성에 따라 최적의 벡터를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게 상기 벡터는 pDZ-putA이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pDZ에 서열번호 7을 포함하는 putA 유전자를 도입함으로서 pDZ-putA 벡터를 제조하였다(도 1).
본 발명의 형질전환된 미생물은 putA 유전자를 숙주 미생물에 도입함으로써 제조할 수 있다. putA 유전자는 벡터에 클로닝 되어 세포에 형질전환되는 것이 바람직하다.
형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 pDZ-putA를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 전달할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 숙주의 염색체 내로 재조합 가능하게 하도록 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명의 putA 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 포함하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형질전환의 방법으로 상기 벡터를 수탁번호 KCCM-10530인 코리네박테리움 암모니아게네스에 도입한 후, 선택 배지에 배양하여 2 카피의 putA 유전자를 내재적 유전자의 자리에 상동 재조합 방법에 의해 치환시킴으로써, 2 카피를 갖는 putA 유전자가 염색체 내에 삽입되도록 제조하였다. 그 결과 코리네박테리움 암모니아게네스의 형질전환으로 KCJ-1346로 명명된 신규한 형질전환된 미생물을 수득하였으며, 이를 2010년 2월 24일 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (Korean Culture center of Microorganisms; KCCM, 대한민국, 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 수탁번호 KCCM11068P로 기탁하였다.
본 발명은 상기 기술된 형질전환된 미생물을 이용하여 직접 발효법에 의함으로써 배양액 내에 고수율로 XMP 또는 GMP를 수득할 수 있다. 바람직하게 상기 방법에서 사용되는 미생물은 프롤린 디하이드로게나아제의 활성이 증가된 미생물이며, 또한 상기 미생물인 숙주의 염색체 내에 벡터의 putA 유전자가 삽입됨으로써 XMP 및 GMP의 생산량을 증가시킬 수 있다. 이러한 생산방법에 사용되는 미생물은 바람직하게 수탁번호 KCCM11068P 일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 본 발은 putA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 XMP를 수득하는 방법을 포함하는 XMP 생산 방법을 제공하며, 또한 (a) putA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 균주에 XMP 아미나아제를 첨가하는 단계; 및 상기 (b) 단계의 배양액으로부터 GMP를 수득하는 단계를 포함하는 GMP의 생산 방법을 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 기탁된 미생물을 이용하여 직접 발효법에 의해 배양액 내 고수율로 XMP을 직접 축적하여 생산하는 방법을 제공한다. 또한 추가로 상기 XMP 및 상기 형질전환된 미생물을 포함한 배양액에 XMP 아미나아제 활성을 가지는 효소 또는 미생물, 바람직하게는 대장균을 첨가하여 전환반응을 진행시키고, 이어서 상기 배양액 중의 GMP를 분리 정제함으로써 GMP를 수득할 수 있다.
본 발명에서 배양액으로 사용되는 배지는, 당업계에서 통상적으로 사용되는 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게 배지는 포도당을 탄소원으로 사용하고, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 갈락토즈, 사카로즈, 아라비노스, 맥아당, 자일로스, 트레할로스, 리보오스, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 상기 배지에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨(소듐)-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 그 외에, 상기 물질에 더하여 아미노산, 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체 등이 더 포함될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃, 또는 35℃ 내지 37℃이다. 배양은 원하는 목적 물질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간 내에서 달성할 수 있다.
XMP 또는 GMP는 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다. 본 발명의 XMP 또는 GMP를 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 XMP 또는 GMP를 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 XMP 또는 GMP를 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 XMP 또는 GMP 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 이용하면, 프롤린 디하이드로게나아제의 증대된 활성으로 인하여 기존의 XMP 및 GMP 생산 미생물에 비해 현저하게 높은 수득률로 XMP 또는 GMP를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 미생물을 사용하면 고효율로 XMP 또는 GMP을 수득할 수 있다.
도 1은 pDZ 벡터에 putA 유전자를 클로닝한 pDZ-putA 벡터 구조를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KTCC -10530번 유래 putA 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 ( pDZ - putA ) 제작
본 실시예에서는 대한민국 공개특허 제10-2007-94433호에 개시된 벡터 pDZ 를 이용하여 유전자의 염색체 삽입을 진행하였다. pDZ 벡터를 이용하여 코리네박테리움의 염색체 뉴클레오티드를 삽입하기 위하여 염색체상의 삽입되는 부위와 상동성을 갖는 서열이, 삽입되는 pDZ 벡터 내에 포함되어야 하므로, 삽입하려고 하는 서열을 양 옆에 포함하고 있는 pDZ벡터를 제작하였다.
본 실시예에서는 putA 유전자의 증폭을 위하여, NIH GenBank를 근거로 하여 putA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI ID_3344496) 를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머 (서열번호 1 내지 4)를 합성하였다.
코리네박테리움 KCCM-10530를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (stratagene)이고, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 2분을 25회 반복하였다. 그 결과 4.4 kb의 putA 유전자 두쌍 (putA-A, putA-B)을 얻었다. putA-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, putA-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 하여 증폭된 것이다.
서열번호 1: CCCAAGCCTTGAGCGCGTCGGTCACTCAACTA
서열번호 2: CAGCCAATCTTGCAGCCAA
서열번호 3: TGAGCGTCGGTCACTCAACTA
서열번호 4: CGGGATCCCAGCCAATCTTGCAGTCCAA
상기 증폭 산물 putA-A, putA-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (putA-A: HindIII, putA-B: BamHI)를 처리하고, 다음으로 제한효소 HindIII 와 BamHI 이 처리된 pDZ 벡터에 3조각 접합을 통하여, 최종적으로 putA 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-putA 재조합 벡터를 얻었다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 pDZ-putA를 나타내는 도면이다.
실시예 2: putA 삽입 균주 개발
제작된 pDZ-putA벡터를 KCCM-10530 균주에 형질 전환하고, 실시예 1에서 기술한 것과 같이 2차 재조합 과정을 거쳐 염색체 상에서 putA 유전자의 바로 옆에 1 카피의 putA 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-1346를 얻었다. 상기 KCJ-1346로 명명한 신규한 미생물을 2010년 2월 24일 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (Korean Culture center of Microorganisms; KCCM, 대한민국, 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 수탁번호 KCCM11068P로 기탁하였다. 연속적으로 삽입된 putA 유전자는 2 카피의 putA의 업스트림 (upstream)과 다운스트림 (downstream) 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (서열번호 5 및 서열번호 6)을 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
서열번호 5: CGAACTACGTGGCACAGTTTG
서열번호 6: AGCAGGCCATTAAAACGACC
실시예 3: putA 삽입 균주의 XMP 생산
실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1346를 XMP 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 하기 종 배지 3ml을 함유하는 14㎖ 튜브 (tube)에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530와 KCJ-1346를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 32㎖ (본배지 24㎖ + 별살배지 8㎖)을 포함하고 있는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 0.4㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 96 시간 동안 230 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5'- 크산틸산의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530와 KCJ-1346에 대한 배양액 중의 XMP 결과는 하기 표1 과 같다.
균주명 KCCM -10530 KCJ -1346
XMP (g/ℓ) 28.6 29.9
종배지: 포도당 30 g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150mg/ℓ, 구아닌 150mg/ℓ, pH 7.2
생산배지 (본배지): 포도당 80g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 아데닌 30mg/ℓ, 구아닌 30mg/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 황산구리 1mg/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ, 염화칼슘 10mg/l, pH 7.2
생산배지 (별살배지): 인산제1칼륨 10 g/ℓ, 인산제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ, 황산암모늄 5g/ℓ
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1346는 모균주 KCCM-10530에 비하여 XMP 생산이 1.1 g/ℓ 증가되었음을 확인할 수 있었으며, 이는 3.8%의 생산증가를 의미한다.
실시예 4: putA 삽입균주의 프롤린 디하이드로게나아제 활성
실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1346의 프롤린 디하이드로게나이제 활성 확인을 위해 아래와 같은 방법으로 효소활성을 측정하였다. 박토펩톤 10g/ℓ, 박토 비프(beef) 추출물 5g/ℓ, 박토 효모 추출물 5g/ℓ, NaCl 2.5g/ℓ, 아데닌 50mg/ℓ, 구아닌 50 mg/ℓ 배지에 균주를 접종하고, 30℃에서 12시간 배양하여 OD 10까지 키웠다. 배양 후 10㎖의 세포를 배양액에서 회수하여 50mM Hepes, 10mM potassium acetate, 10mM CaCl2, 10mM MgCl2버퍼에 2번 세척하여 100mM Tris-HCl pH 7.5 버퍼 1㎖에 풀어주었다.
세포 분쇄기 (sonicator)를 이용하여 세포를 파괴한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액을 다시 원심분리하여 pellet만을 취하여 100㎕ 버퍼에 녹였다. 이 중 10㎕를 효소액으로 사용하였다. 반응액을 100mM Tris-HCl pH 7.5, 50μM 2,6-디클로로인돌페놀 (2,6-dichloroindolphenol (Cl2Ind))의 혼합물로 만들었다. Cl2Ind는 얼려두었다가 반응 직전에 섞어주었다. 만들어 놓은 반응 혼합물 980㎕에 기질(substrate)인 100mM 프롤린 10㎕, 효소액 10 ㎕를 첨가하여 30℃에서 15분 동안 섞이도록 하면서 반응시켰다. 반응 후 효소의 활성은 환원된 Cl2Ind의 농도로 확인할 수 있다. Cl2Ind의 600nm에서 흡수 계수(absorption coefficient)는 22 cm-1mM-1이다.
균주명 KCCM -10530 KCJ -1346
환원된 Cl 2 Ind (μM) 4.09 5.00
상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1346는 모균주 KCCM-10530에 비하여 프롤린 디하이드로게나아제 효소활성이 22 % 증가 되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: putA 삽입 균주의 ATP 농도측정
실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1346의 세포내 ATP 농도측정을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기 종 배지 3㎖을 함유하는 14㎖ 튜브에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530와 변이주 KCJ-1346를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 종 배지 25㎖을 포함하고 있는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 0.4㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 20 시간 동안 230 rpm으로 진탕 배양하였으며, 배양이 완료된 후에 배양액의 최종 세포 OD와 세포내 ATP 농도를 측정하였다. 상기 실험 수행의 결과, 모균주인 KCCM-10530에 비하여 본 발명의 변이주인 KCJ-1346 가 단위 OD당 생성된 ATP 농도가 높음을 확인할 수 있었으며, 이는 결과적으로 기존 균주 대비 XMP 및 GMP 생성 수율이 높아질 가능성을 시사한다. 결과는 표 3에 나타내었다.
균주명 OD
(A562) 		ATP 농도
(μM) 		단위 OD 당 ATP 생성
( ATP 농도/ OD )
KCCM -10530 17.3 37.54 2.17
KCJ -1346 18.5 64.24 3.48
상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1346는 모균주 KCCM-10530에 비하여 단위 OD당 생성된 ATP 농도가 약 60 % 증가되었음을 확인 할 수 있었다.
실시예 6: putA 삽입 균주의 XMP 발효 및 GMP 생산
실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1346를 GMP 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기 종 배지 3㎖을 함유하는 14㎖ 튜브에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530와 변이주 KCJ-1346를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 32㎖ (본배지 24㎖ + 별살배지 8㎖)을 포함하고 있는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 0.4㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 96 시간 동안 230 rpm으로 진탕 배양하였다. 생성된 XMP를 GMP전환 반응을 수행하기 위하여 삼각플라스크 발효액에 하기의 전환 반응 첨가물과 대장균의 XMP 아미나아제(XMP aminase)를 첨가하여 40℃에서 2.5 시간 동안 전환반응을 수행하였다. 상기 실험 수행의 결과, 모균주인 KCCM-10530에 비하여 본 발명의 변이주인 KCJ-1346가 XMP 소모량 대비 GMP의 생성 량을 의미하는 전환율이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 기존 균주 대비 GMP생성 수율이 높아진 균주를 획득할 수 있었다. 결과는 표 4에 나타내었다.
균주명 농 도 (g/ℓ) 전환율(%)
( GMP 생성량/ XMP 소모량)
XMP GMP
KCCM -10530 24.7 17.78 72.0
KCJ -1346 25.9 19.02 73.4
상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1346는 모균주 KCCM-10530에 비하여 전환율이 1.4 %, GMP 농도가 6.9 % 증가 되었음을 확인할 수 있었다.
종배지: 포도당 30 g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150mg/ℓ, 구아닌 150mg/ℓ, pH 7.2
생산배지 (본배지): 포도당 80g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 아데닌 30mg/ℓ, 구아닌 30mg/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 황산구리 1mg/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ, 염화칼슘 10mg/ℓ, pH 7.2
생산배지 (별살 배지): 인산 제1칼륨 10g/ℓ, 인산 제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ, 황산암모늄 5g/ℓ
전환반응 첨가물: 피틱산(phytic acid) 1.8g/ℓ, MgSO4 4.8g/ℓ, 니민(nymeen) 3㎖/ℓ, 자이렌(xylene) 2%, 아데닌 100mg/ℓ, Na2HPO4 7.7g/ℓ, 글루코스 46g/ℓ
한국미생물보존센터(국외) KCCM11068P 20100224
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 프롤린 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된, 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산 생산 코리네박테리아 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네형 박테리아의 putA 유전자의 발현량 증가에 의해 프롤린 디하이드로게나아제의 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 코리네박테리아 속 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 putA 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것인 코리네박테리아 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터가 도입되어 형질전환된 코리네박테리아 속 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 ATP 생산능이 증가된 코리네박테리아 속 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)인 코리네박테리아 속 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 수탁번호 제KCCM11068P호인 코리네박테리아 속 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하여, 배양액으로부터 5'-구아닐산 또는 5'-크산틸산을 생산하는 방법.
  9. (a) putA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 코리네박테리아 속 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 균주에 5'-크산틸산 아미나아제를 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 배양액으로부터 5'-구아닐산을 수득하는 단계를 포함하는 5'구아닐산(GMP)의 생산 방법.
  10. (a) putA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 코리네박테리아 속 균주를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 5'-크산틸산을 수득하는 단계를 포함하는 5'-크산틸산(XMP)의 생산 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 프롤린 디하이드로게나아제 활성은 프롤린 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자의 카피 수 증가, 프로모터 교체 또는 변형, 및 돌연변이에 의한 효소 활성 증가로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 미생물.
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