CN113227381A - L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法 - Google Patents

L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及L‑谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的L‑谷氨酸的制造方法，根据本发明的一个具体例的突变株的柠苹酸合酶的活性弱化或者失活，从而作为副产物的柠苹酸的生产量减少，L‑谷氨酸的生产能力优异，而且使YggB蛋白质突变的菌株增强谷氨酸的排出，从而L‑谷氨酸的生产收率提高，因此如果利用上述突变株，则可以更有效地制造L‑谷氨酸。

Description

L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的L-谷氨酸的 制造方法
技术领域
本发明涉及L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的L-谷氨酸的制造方法，更具体而言，涉及柠苹酸合酶(citramalate synthase)的活性弱化或者失活，从而作为副产物的柠苹酸的生产量减少，L-谷氨酸的生产能力增加的棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)突变株及利用其的L-谷氨酸的制造方法。
背景技术
L-谷氨酸是通过微生物发酵进行生产的代表性氨基酸，L-谷氨酸钠(monosodiumL-glutamate，MSG)平衡和协调食物的整体味道，从而提高对肉、鱼、鸡、蔬菜、酱、汤、调料等食品的喜好度，可以增进减盐30％的低盐食品的味道，因此广泛用作家庭用和用于加工食品生产的调味料。
通常，为了生产L-谷氨酸，主要利用短杆菌(Brevibacterium)或棒状杆菌(Corynebacterium)属菌株及其突变株并通过发酵进行生产。为了增加基于微生物培养的L-谷氨酸的生产量，利用了为了增加L-谷氨酸生物合成途径中基因的表达而增加相应基因的复制数，或者转变基因的启动子来调节生物合成途径上的酶活性的方法。具体而言，通过扩增pyc基因或fasR之类的特定基因(美国专利第6852516号)，或者操作gdh、gltA、icd、pdh和argG基因的启动子(promoter)部位(美国专利第6962805号)来增加L-谷氨酸生产量。
已知柠苹酸合酶(citramalate synthase,cimA)是以乙酰CoA和丙酮酸为基质来合成柠苹酸的酶，cimA基因不存在于谷氨酸棒状杆菌，而与cimA基因同源性高的leuA基因在谷氨酸棒状杆菌中起到柠苹酸合酶(citramalate synthase)的作用。
作为L-谷氨酸的发酵途径中的基质，使用乙酰CoA，因此本申请的发明人们使柠苹酸合酶的活性弱化或者失活而节约作为基质的乙酰CoA，从而进一步提高L-谷氨酸生产率。
另一方面，据报道棒状细菌的yggB基因是大肠杆菌(Escherichia coli)的yggB基因的同源物(FEMS Microbiol Lett.2003,218(2),p305-309,Mol Microbiol.2004,54(2),p420-438)，是一种机械敏感通道(mechanosensitive channel)(EMBO J.1999,18(7):1730-7)。作为赋予棒状细菌L-谷氨酸生产能力的方法，具体而言，尚未报道如本发明所述的突变对L-谷氨酸生成产生的影响。
因此，本申请的发明人们制作了使柠苹酸合酶的活性弱化或者失活的突变株以及进一步对参与谷氨酸排出的YggB蛋白质诱导突变而得到的突变株，确认了上述突变株的L-谷氨酸生产能力优异，从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
韩国授权专利第10-1138289号
发明内容
本发明的目的在于提供柠苹酸合酶(citramalate synthase)的活性弱化或者失活且L-谷氨酸的生产能力得到提高的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)突变株。
本发明的另一目的在于提供L-谷氨酸的制造方法，包括以下步骤：
(a)在培养基中培养棒状杆菌属突变株的步骤；以及
(b)从培养的突变株或者培养基中回收L-谷氨酸的步骤。
本发明的一个方式提供柠苹酸合酶(citramalate synthase)的活性弱化或者失活且L-谷氨酸的生产能力得到提高的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)突变株。
在本发明中，“柠苹酸合酶”是指催化将乙酰CoA和丙酮酸转化为柠苹酸和辅酶A(coenzyme A)的过程的酶。
在本发明中，“生产能力得到提高的”菌株是指与亲本菌株相比，L-谷氨酸的生产率增加的菌株。
在本发明中，“亲本菌株”是指成为突变对象的野生型或突变株，包括直接成为突变的对象或通过重组的载体等转化的对象。在本发明中，亲本菌株可以是野生型谷氨酸棒状杆菌菌株或由野生型突变的菌株。优选地，可以是谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株。
根据本发明的一具体例，L-谷氨酸的生产能力得到提高的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)突变株可以是与亲本菌株相比，柠苹酸合酶(citramalatesynthase)的活性弱化或者失活的菌株。
在本发明中，“活性弱化”是指细胞内的柠苹酸合酶的酶活性程度与野生型菌株或转变前的菌株等亲本菌株相比减少的情况。所述弱化是包括以下情况的概念：通过编码酶的基因的突变等，酶本身的活性与原始微生物具有的酶的活性相比减少的情况，以及通过阻碍编码它的基因的转录(transcription)或者阻碍翻译(translation)等，上述酶的表达水平下降，细胞内的整体酶活性程度与野生型菌株或转变前的菌株相比低的情况，也包括它们组合的情况。此外，在本发明中，“失活”是指编码柠苹酸合酶的基因的表达与野生型菌株或者转变前的菌株相比，完全不进行表达或者即使进行表达也不具有其活性的状态。
根据本发明的一具体例，柠苹酸合酶的酶活性的弱化或者失活可以通过适用该领域中众所周知的各种方法来实现。例如，有如下方法：利用以包括上述酶的活性被完全去除的情况在内的使上述酶的活性减少的方式进行突变的基因替换染色体上的编码上述酶的基因的方法；向编码上述酶的染色体上的基因的表达调控序列(例如启动子)引入突变的方法；将编码上述酶的基因的表达调控序列替换为活性弱或者无活性的序列的方法；使编码上述酶的染色体上的基因的整体或者部分缺失的方法；引入与上述染色体上的基因的转录体互补结合而阻碍从上述mRNA到酶的翻译的反义寡核苷酸(例如反义RNA)的方法；在编码上述酶的基因的SD序列前端人为性地添加与SD序列互补的序列而形成二级结构物，从而使核糖体(ribosome)不能附着的方法；以及以逆转录的方式将启动子添加于相应序列的ORF(开放阅读框，open reading frame)的3'末端的RTE(逆转录工程，Reverse transcriptionengineering)方法等，也可以通过它们的组合来实现，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，柠苹酸合酶可以通过leuA(2-异丙基苹果酸合酶，2-isopropylmalate synthase)基因而进行编码。
在本发明中，已知leuA(2-异丙基苹果酸合酶，2-isopropylmalate synthase)基因与cimA(柠苹酸合酶，citramalate synthase)基因同源性高，在棒状杆菌属菌株中起到柠苹酸合酶的作用。根据本发明的一具体例，上述leuA基因由SEQ ID NO:14的核苷酸序列构成。
根据本发明的一具体例，柠苹酸合酶的活性弱化或者失活可以是编码柠苹酸合酶的leuA基因的表达减少而柠苹酸合酶的活性弱化或者失活。
在本发明中，“表达的减少”是指基因的表达量与本来的表达量相比减少，包括表达完全被阻碍而未形成表达的情况。在想要减少微生物中的表达时，可以置换基因翻译的起始密码子来减少其表达，或者以减少现存的基因的表达量的方式通过基因工程进行操作。为了表达调控而转变序列的方法可以通过缺失、插入、非保守或保守置换或者它们的组合，对上述表达调控序列的核酸序列诱导表达调控序列上的突变而实施，或者可以通过将启动子替换为更弱启动子等的方法实施。上述表达调控序列包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的终止的序列，但并不限定于此。使表达减少的基因存在于待突变的微生物内时，例如，可以通过将驱动上述基因的表达的天然启动子(native promoter)置换为弱启动子(weak promoter)，或者引入突变，从而减少上述基因的表达。而且，可以通过使现有基因的全部或者部分缺失，从而减少上述基因的表达。
根据本发明的一具体例，减少leuA基因的表达可以通过缺失、插入、非保守或保守置换或者它们的组合，对核酸序列诱导序列上的突变而实施，或者可以通过替换为更弱的启动子等方法实施。
根据本发明的一个具体例的缺失leuA基因的棒状杆菌属突变株与亲本菌株相比，作为产物，柠苹酸(citramalate)生产量减少，节约乙酰CoA，从而可以增加L-谷氨酸生产量。
根据本发明的一具体例，上述棒状杆菌属突变株可以进一步诱导使选自由SEQ IDNO:15表示的YggB蛋白质的氨基酸序列中的作为93号氨基酸的亮氨酸和作为109号氨基酸的亮氨酸中的一种以上的亮氨酸置换为丙氨酸或缬氨酸的突变。
本发明中的yggB基因是指编码机械敏感通道(mechanosensitive channel)的基因。yggB基因相当于在NCBI数据库中以Genbank Accession No.NC_003450进行登记的基因组序列中的1336092至1337693序列的互补序列，也称为NCgl1221。用yggB基因编码的YggB蛋白质登记为GenBank accession No.NP_600492号。根据本发明的一具体例，编码有yggB基因的YggB蛋白质由SEQ ID NO:15的氨基酸序列构成。
根据一具体例，通过使选自由SEQ ID NO:15表示的YggB蛋白质的氨基酸序列中的作为93号氨基酸的亮氨酸和作为109号氨基酸的亮氨酸中的一种以上的亮氨酸置换为丙氨酸或缬氨酸的突变，通过干预可排出L-谷氨酸的YggB蛋白质的孔内部的甲基被去除、或者增加孔的直径，从而具有上述突变的菌株的L-谷氨酸的生产能力得到提高。
具体而言，上述突变株可以通过突变而包含上述YggB蛋白质的突变体，或者可以通过包含编码上述YggB蛋白质的突变体的聚核苷酸的载体而进行转化。
在本发明中，“载体”是指用于向宿主细胞克隆和/或转移碱基的任意的介质。载体可以是能够与其它DNA片段结合而引起结合片段的复制的复制子(replicon)。“复制子”是指在生物体内能够作为DNA复制的自身单元的，即能够通过自身的调控而进行复制的任意的遗传单元(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，在本发明中，载体只要是能够在宿主中进行复制就没有特别限定，可以利用该领域中已知的任意的载体。上述重组载体的制作中所使用的载体可以为天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A、以及Charon21A等，作为质粒载体，可以使用pDZ载体、pBR系、pUC系、pBluescriptⅡ系、pGEM系、pTZ系、pCL系和pET系等。可以使用的载体不特别限定，可以使用公知的表达载体，但并不限定于此。
在本发明中，“转化”是将基因引入宿主细胞内，使其可以在宿主细胞内进行表达，经转化的基因只要可以在宿主细胞内表达，就可以包括插入宿主细胞的染色体内或者位于染色体外的情形，而不受限制。
根据本发明的一个具体例的leuA基因缺失且引起YggB蛋白质突变的棒状杆菌属突变株与亲本菌株相比，L-谷氨酸生产量增加，用于L-谷氨酸生产的培养时间缩短，从而可以有效地生产L-谷氨酸。
根据本发明的一具体例，上述棒状杆菌属菌株可以为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
根据本发明的一具体例，上述棒状杆菌属菌株可以为产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)、栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacteriummelassecola)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacteriu m efficiens)、或者力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)等，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，上述棒状杆菌属菌株最优选为谷氨酸棒状杆菌KCTC11558BP。
本发明的另一方式提供L-谷氨酸的制造方法，其包括以下步骤：
(a)在培养基中培养棒状杆菌属突变株的步骤；以及
(b)从经培养的突变株或者培养基中回收L-谷氨酸的步骤。
根据本发明的一具体例，上述培养可以根据该领域中已知的合适的培养基和培养条件而进行，只要是本领域技术人员就可以容易地调整培养基和培养条件来使用。具体而言，上述培养基可以是液体培养基，但并不限定于此。培养方法可以包括例如分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)、补料分批式培养(fed-batchculture)或者它们的组合培养，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，上述培养基必须以合适的方式满足特定菌株的要求，可以由本领域技术人员适当地进行变形。关于棒状杆菌属菌株的培养，培养基可以参考公知的文献(Manual of Methods for General Bacteriology.American Society forBacteriology.Washington D.C.,USA,1981)，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，培养基中可以包含各种碳源、氮源和微量元素成分。作为可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素之类的糖及碳水化合物；大豆油、向日葵油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸。这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素或者无机化合物，例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源同样可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的磷的供应源，可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐，但并不限定于此。此外，培养基可以含有生长所需要的硫酸镁或硫酸铁之类的金属盐，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和维生素之类的必要生长物质。此外，可以使用合适培养基的前体。上述培养基或单个成分可以在培养过程中通过适当的方式分批或连续添加到培养液中，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，在培养过程中，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物以适当的方式添加到微生物培养液中来调整培养液的pH。此外，在培养过程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生。进而，为了维持培养液的有氧状态，可以向培养液内注入氧气或者含氧气的气体(例如空气)。培养液的温度通常可以为20℃至45℃，例如，可以为25℃至40℃。培养时间可以持续到有用物质获得期望的生产量为止，例如，可以为10至160小时。
根据本发明的一具体例，在从上述培养的突变株和培养基中回收L-谷氨酸的步骤中，可以根据培养方法并利用该领域中公知的合适的方法而从培养基中收集或回收所生产的L-谷氨酸。例如，可以使用离心分离、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶化、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，在回收谷氨酸的步骤中，可以将培养物低速离心分离而去除生物质，可以将得到的上清液通过离子交换色谱法而分离。
根据本发明的一具体例，在上述回收L-谷氨酸的步骤中，可以包括纯化L-谷氨酸的工序。
根据本发明的一个具体例的突变株是柠苹酸合酶的活性弱化或者失活，从而作为副产物的柠苹酸的生产量减少，L-谷氨酸的生产能力优异，而且使YggB蛋白质突变的菌株增强谷氨酸的排出，从而L-谷氨酸的生产收率提高，因此如果利用上述突变株，则可以更有效地制造L-谷氨酸。
附图说明
图1表示柠苹酸的合成路径。
图2表示为了破碎谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株中的leuA基因而制造的pKLA载体。
图3表示在缺失leuA基因的部分中引物(primer)1、4的位置。
图4a表示YggB蛋白质的结构。
图4b表示YggB蛋白质的氨基酸序列中的第93号亮氨酸被置换为丙氨酸的YggB蛋白质的孔(pore)结构。
图4c表示YggB蛋白质的氨基酸序列中的第109号亮氨酸被置换为丙氨酸的YggB蛋白质的孔(pore)结构。
图5表示为了将I10菌株中YggB蛋白质的氨基酸序列中的第93号氨基酸置换为其它氨基酸而制造的pKY93载体。
具体实施方式
下面，通过实施例来对一个以上的具体例更详细地进行说明。但是，这些实施例用于例示性说明一个以上的具体例，本发明的范围并不限定于这些实施例。
实施例1.菌株发酵终止液的细胞内代谢物分析
谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株是对I6菌株用通过化学方法引起DNA突变的亚硝基胍(nitrosoguanidine，NTG)进行处理而得到的突变株，通过具有糖蜜抗性，使用原料价格低廉的糖蜜作为主要碳源，从而可以以高收率生产L-谷氨酸(韩国公开专利第10-2011-0034718号)。
对具有谷氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌I6(以下称为I6)和谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP(以下称为KCTC 11558BP)的细胞内部的代谢物物质和L-谷氨酸量进行了分析。
将KCTC 11558BP和I6分别接种在25ml的CM液体培养基(1％的葡萄糖(glucose)、1％的蛋白胨(polypeptone)、0.5％的酵母提取物(yeast extract)、0.5％的牛肉提取物(beef extract)、0.25％的NaCl、0.2％的尿素(urea)、50％的NaOH 100l，pH6.8，1L基准)中后，在30℃以200rpm震荡培养。培养过程中细胞生长达到指数增殖期(exponential phase)时，通过快速真空过滤(rapid vacuum filtration，Durapore HV，0.45m；Millipore，Billerica，MA)，将细胞从培养液分离。将吸附有细胞的过滤器用10ml的冷却水洗涤2次后，在含有5M的吗啉乙磺酸(morpholine ethanesulfonic acid)和5M的蛋氨酸砜(methioninesulfone)的甲醇中浸渍10分钟而终止反应。在由此得到的提取液中混合等量的氯仿和0.4倍体积的水后，只将水层(aqueous phase)用于旋转离心柱(spin column)而去除蛋白质污染物。对过滤的提取液使用毛细管电泳质谱(capillary electrophoresis massspectrometry)分析柠苹酸的相对量，将其结果记载在下述表1中。
另外，实施利用了C18柱(Apollo C18，5μm，150mm×4.6mm)的高效液相色谱(HPLC；安捷伦，美国)而分析了L-谷氨酸生产量。其结果记载在下述表1中。将具有8.85g/L的KH2PO4、1.652g/L的四丁基氢氧化铵溶液(Tetrabutyl ammonium hydroxide solution)、10ml/L的乙腈、12.5mg/L的叠氮化钠(sodium azide)的组成且pH3.15(用磷酸调节)的分析缓冲液用0.45μm的膜过滤器(membrane-filter)(HA)过滤而使用。
如表1所示的那样，确认了KCTC 11558BP生产的柠苹酸(citramalate)与作为对照组的I6相比，增加了约3倍。
【表1】
I6(对照组) KCTC 11558BP
L-谷氨酸生产量(g/L) 34 37.5
柠苹酸(相对量) 130.2 330.1
实施例2.缺失leuA基因的谷氨酸棒状杆菌突变株的制造
图1表示柠苹酸的合成路径。柠苹酸通过大肠杆菌中的cimA(柠苹酸合酶(citramalate synthase))基因而生成，但是在谷氨酸棒状杆菌中，不存在cimA基因。但是，已知谷氨酸棒状杆菌中的与cimA基因同源性高的leuA基因起到柠苹酸合酶(citramalatesynthase)的作用，因此想要破碎leuA(2-异丙基苹果酸合酶，2-isopropylmalatesynthase)来减少作为副产物的柠苹酸，节约用于制造L-谷氨酸的作为基质的乙酰CoA，从而进一步提高L-谷氨酸的生产率。SEQ ID NO:14表示leuA基因的核苷酸序列。
实施例2-1.leuA基因破碎载体的制造
为了破碎谷氨酸棒状杆菌中的leuA基因(NCgl0245)，利用了具有L-谷氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP。
分离谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株的染色体DNA，将其用作模板，分别利用下述引物(primer)1、2组合和引物(primer)3、4组合，以95℃30秒、57℃30秒、72℃60秒的条件重复30次循环而实施PCR，将得到的PCR产物(图2中的H1和H2)进行了纯化。
经纯化的PCR产物再次作为用于交叉PCR(crossover polymerase chainreaction)的模板使用，用引物1、4组合再一次进行扩增。
为了使leuA基因缺失，将1600bp的交叉PCR产物纯化后，用XbaI和SalI限制酶(Takara，日本)切割后，利用用同一限制酶切割的pK19mobSacB载体(Gene，145:69-73，1994)进行克隆，从而制造了用于leuA基因破碎的载体，将其命名为pKLA。图2表示为了破碎谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株中的leuA基因而制造的pKLA载体。
【表2】
引物名称 序列(5'-3') 序列号
引物1 5'-TCTAGACCCTTCCCGGAAACCCCCAC-3' SEQ ID NO:1
引物2 5'-GGGGTTTCGATCTTGGCAGG-3' SEQ ID NO:2
引物3 5'-ACCGCGCGCTGGACGTCAAC-3' SEQ ID NO:3
引物4 5'-GTCGACTGGCCGAAACGCTTAGCGCT-3' SEQ ID NO:4
实施例2-2.谷氨酸棒状杆菌菌株的转化及leuA缺失突变株制造
使用范德雷斯特(van der Rest)的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.,52,541-545,1999)，对通过电转感受态细胞制造法而制备成能够转化的谷氨酸棒状杆菌KCTC11558BP菌株(以下称为KCTC 11558BP)，通过电击引入了实施例2-1中制造的载体pKLA。
具体而言，在100ml的添加有2％葡萄糖的2YT培养基(胰蛋白胨16g/l、酵母抽提物10g/l、氯化钠5g/l)中将KCTC 11558BP菌株进行一次培养，在不包括葡萄糖的同一培养基中添加1mg/ml浓度的异烟酸肼(isonicotinic acid hydrazine)和2.5％的甘氨酸(glycine)。然后，接种种子培养液使OD610值成为0.3后，以18℃、180rpm培养12至16小时，使OD610值成为1.2至1.4。在冰块中放置30分钟后，以4℃、4000rpm离心分离15分钟。然后，去除上清液，将经沉淀的KCTC 11558BP菌株用10％甘油溶液洗涤4次，最后，在0.5ml的10％甘油溶液中再悬浮。电穿孔法(Electroporation)使用Bio-Rad电穿孔仪(electroporator)而实施。在电穿孔比色皿(0.2mm)中放入通过上述方法制造的感受态细胞(competent cell)，添加实施例2-1中制造的pKLA载体后，以2.5kV、200Ω和12.5μF的条件施加了电击。电击结束后立即添加1ml的再生(Regeneration)培养基(脑心浸液(Brain Heart infusion)18.5g/l，山梨糖醇0.5M)，在46℃热处理6分钟。然后，在室温下冷却后，移至15ml的离心管中，在30℃培养2小时，涂抹在筛选培养基(胰蛋白胨5g/l、NaCl 5g/l、酵母抽提物2.5g/l、脑心浸粉(Brain Heart infusion powder)18.5g/l、琼脂15g/l、山梨糖醇91g/l、卡那霉素(kanamycine)20μg/l)中。在30℃培养72小时而生成的菌落在BHI培养基中培养至静止期，诱导二次重组，稀释到10-5至10-7，涂抹在无抗生素的平板(含10％蔗糖(sucrose))，筛选在无卡那霉素抗性且包含10％蔗糖的培养基中生长的菌株。对经筛选的菌株使用上述表2中记载的引物1、4组合而确认了缺失leuA基因的谷氨酸棒状杆菌菌株，将缺失leuA基因的缺陷菌株命名为“I10”。图3表示缺失leuA基因的部分中引物1、4的位置。
实施例2-3.leuA缺陷菌株(I10)的营养需求确认
上述实施例2-2中制造的leuA缺陷菌株(以下称为I10)缺失leuA基因，因此成为需求亮氨酸营养的菌株，为了进行确认，涂抹在以下述表3的组成制造的基本培养基和添加亮氨酸的培养基中，在30℃培养24小时，测定生长程度，将其结果记载在表4中。
【表3】
Figure BDA0003112073390000121
如表4所示的那样，与作为未添加亮氨酸的基本培养基中的亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株相比，I10菌株的生长急剧下降，通过添加亮氨酸，从而恢复生长。因此，确认了I10菌株中缺失leuA基因。
【表4】
KCTC 11558BP I10
基本培养基 ++++ +
基本培养基+50ppm亮氨酸 ++++ ++++
实施例3.缺失leuA基因的谷氨酸棒状杆菌菌株(I10)的L-谷氨酸和柠苹酸生产量 确认
利用以下述表5中记载的含量制造的活性平板培养基，将leuA缺陷菌株(以下称为I10)和谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP(以下称为KCTC11558BP)在30℃培养24小时。然后，将以下述表6中记载的含量制造的10ml的L-谷氨酸烧瓶培养基放入100ml的烧瓶中，将上述培养的菌用接种环接种，以30℃、200rpm培养48小时。培养终止液用于实施L-谷氨酸生产量和细胞内代谢物的分析。L-谷氨酸生产量和柠苹酸的相对量通过与实施例1记载的方法相同的方法实施。
表7表示I10和KCTC 11558BP中的L-谷氨酸生产量和柠苹酸的相对量。如表7所示的那样，可以确认I10菌株中的L-谷氨酸的生产量增加，柠苹酸显著减少。
【表5】
Figure BDA0003112073390000131
【表6】
Figure BDA0003112073390000141
【表7】
KCTC 11558BP I10
L-谷氨酸生产量(g/L) 37.5 39.7
柠苹酸(相对量) 320.4 8.5
实施例4.YggB突变株的制造
leuA缺陷菌株(I10)的代谢物分析结果确认了细胞内蓄积了大量的L-谷氨酸，从而增强了L-谷氨酸的排出。
已知YggB作为机械敏感通道的同源物(mechanosensitive channel homolog)，在谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸排出中起到重要的作用。SEQ ID NO:15表示YggB蛋白质的氨基酸序列。图4a表示YggB蛋白质的结构。分析YggB的蛋白质结构，从而探索了可以增强排出的突变。
图4b表示将YggB蛋白质的氨基酸序列中第93号亮氨酸置换为丙氨酸的YggB蛋白质的孔(pore)结构，图4c表示将YggB蛋白质的氨基酸序列中第109号亮氨酸置换为丙氨酸的YggB蛋白质的孔(pore)结构。
实施例4-1.YggB蛋白质的氨基酸序列中第93号氨基酸被置换的菌株的制作
如图4b所示的那样，推测为了扩大L-谷氨酸移动通道，在将YggB蛋白质的氨基酸序列中第93号亮氨酸置换为丙氨酸时，干预孔内部的狭窄部分的甲基被去除，孔的直径增加，从而制作了突变株。
分离实施例2-2中制作的I10菌株的染色体DNA，将其用作模板，分别利用引物(primer)5、6组合和引物(primer)7、8组合，以95℃30秒、57℃30秒、72℃60秒的条件重复30次循环，从而实施PCR，将得到的PCR产物进行纯化。将经纯化的PCR产物用作模板，利用引物5、8，用交叉PCR进行扩增。经扩增的产物通过碱基序列分析而确认突变后，利用XbaI、SalI限制酶(Takara，日本)进行切割。将pK19mobSacB载体用同一限制酶切割，与上述经扩增的交叉PCR产物连接而制作载体，将其命名为pKY93。使用的引物序列记载在表8中。图5表示用于置换I10菌株中的YggB蛋白质的氨基酸序列中第93号氨基酸的pKY93载体。
【表8】
引物 序列(5'-3') SEQ ID NO:
引物5 5'-TCTAGATTGAGAAGCTGCCACATTCAC-3' SEQ ID NO:5
引物6 5'-GCAGCGCCCGCGGCAGAGAAACCAAAAGCC-3' SEQ ID NO:6
引物7 5'-CTCTGCCGCGGGCGCTGCGATTCCGGCAAC-3' SEQ ID NO:7
引物8 5'-GTCGACGATCTGGTTTTGCTGTTTCTTCCGG-3' SEQ ID NO:8
引物9 5'-GACTGCGCACCAGCACCAATGGCAGCTGAC-3' SEQ ID NO:9
引物10 5'-GGTGCTGGTGCGCAGTCGATTGTTGCGGAC-3' SEQ ID NO:10
引物11 5'-TCTAGAGGAATCAGGATTCTCACAAAGTTCAGGC-3' SEQ ID NO:11
引物12 5'-CGGAATCGCAGTGCCCGCGAGAGAGAAACC-3' SEQ ID NO:12
引物13 5'-CGCGGGCACTGCGATTCCGGCAACCATTGC-3' SEQ ID NO:13
通过与上述实施例2-2相同的方法，对I10菌株引入上述pKY93载体，筛选经转化的菌株，将其命名为I10-93。在I10-93突变株中，YggB蛋白质的作为93号氨基酸的亮氨酸被置换为丙氨酸。
实施例4-2.YggB蛋白质的氨基酸序列中第109号氨基酸被置换的菌株的制作
如图4c所示的那样，推测为了扩大L-谷氨酸移动通路，在将YggB蛋白质的氨基酸序列中第109号亮氨酸置换为丙氨酸时，干预孔内部的狭窄部分的甲基被去除，孔的直径增加，从而制作了突变株。
分离实施例2-2中制作的I10菌株的染色体DNA，将其用作模板，分别利用引物(primer)5、9组合和引物(primer)10、8组合，以95℃30秒、57℃30秒、72℃60秒的条件重复30次循环，从而实施PCR，将得到的PCR产物进行纯化。经纯化的PCR产物用作模板，利用引物5、8，用交叉PCR进行扩增。经扩增的产物通过碱基序列分析而确认突变后，利用XbaI、SalI限制酶(Takara，日本)进行切割。将pK19mobSacB载体用同一限制酶切割，与上述经扩增的交叉PCR产物连接而制作载体，将其命名为pKY109。使用的引物序列记载在表8中。
通过与上述实施例2-2相同的方法，对I10菌株引入上述pKY109载体，筛选经转化的菌株，将其命名为I10-109。在I10-109突变株中，YggB蛋白质的作为109号氨基酸的亮氨酸被置换为丙氨酸。
实施例5.突变株的L-谷氨酸生产率确认
通过与实施例1和实施例3相同的方法，测定了烧瓶规模下的I10、I10-93和I10-109菌株生成L-谷氨酸的量以及所需的时间，将其结果记载在表9中。
【表9】
I10 I10-93 I10-109
L-谷氨酸生产量(g/L) 39 42.5 45.2
时间(hr) 48 48 44
如表9所示的那样，诱导了YggB蛋白质的孔(pore)扩大的I10-93和I10-109突变株与I10菌株相比，L-谷氨酸生产量增加。特别是，I10-109菌株的情况与I10相比，L-谷氨酸生产量显著增加，发酵时间也从48小时缩短至44小时，从而可以有效生产L-谷氨酸。
<110> 大象株式会社
<120> L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的L-谷氨酸的制造方法
<130> PX190056PCT
<150> KR 10-2018-0161190
<151> 2018-12-13
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 1
<400> 1
tctagaccct tcccggaaac ccccac 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 2
<400> 2
ggggtttcga tcttggcagg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 3
<400> 3
accgcgcgct ggacgtcaac 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 4
<400> 4
gtcgactggc cgaaacgctt agcgct 26
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5
<400> 5
tctagattga gaagctgcca cattcac 27
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 6
<400> 6
gcagcgcccg cggcagagaa accaaaagcc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 7
<400> 7
ctctgccgcg ggcgctgcga ttccggcaac 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 8
<400> 8
gtcgacgatc tggttttgct gtttcttccg g 31
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 9
<400> 9
gactgcgcac cagcaccaat ggcagctgac 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 10
<400> 10
ggtgctggtg cgcagtcgat tgttgcggac 30
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 11
<400> 11
tctagaggaa tcaggattct cacaaagttc aggc 34
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 12
<400> 12
cggaatcgca gtgcccgcga gagagaaacc 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 13
<400> 13
cgcgggcact gcgattccgg caaccattgc 30
<210> 14
<211> 1851
<212> DNA
<213> 棒状杆菌属
<400> 14
atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60
cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120
tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180
aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240
ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300
ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360
cgtgagatca tcgaaaaggg catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420
gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480
gtgcacttct acaactccac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540
gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccat cgctcaggat 600
tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660
gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720
ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780
tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840
ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900
gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960
accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020
cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080
tacggcggtg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140
ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200
gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260
ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320
tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380
accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440
gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500
gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560
ggcaaggacg tcaccgtcga tggccgcggc aacggcccac tggccgctta cgccaacgcg 1620
ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccgcacctcg 1680
ggcgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740
ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800
aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851
<210> 15
<211> 533
<212> PRT
<213> 棒状杆菌属
<400> 15
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515 520 525
Pro Thr Ser Thr Pro
530

Claims (5)

1.一种棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)突变株，其柠苹酸合酶的活性弱化或者失活且L-谷氨酸的生产能力得到提高。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属突变株，其中，所述柠苹酸合酶通过leuA基因进行编码，所述leuA基因为2-异丙基苹果酸合酶基因。
3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属突变株，其中，所述棒状杆菌属突变株进一步诱导了使选自由SEQ ID NO:15表示的YggB蛋白质的氨基酸序列中的作为93号氨基酸的亮氨酸和作为109号氨基酸的亮氨酸中的一种以上的亮氨酸置换为丙氨酸或缬氨酸的突变。
4.根据权利要求1所述的棒状杆菌属突变株，其中，所述菌株为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
5.一种L-谷氨酸的制造方法，其包括以下步骤：
(a)在培养基中培养权利要求1所述的棒状杆菌属突变株的步骤；以及
(b)从所述培养的突变株或者培养基中回收L-谷氨酸的步骤。
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