CN115135767A - 具有提高的l-谷氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，以及用于使用其生产l-谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有提高的L‑谷氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变体菌株、用于产生所述突变体菌株的方法、以及用于使用所述突变体菌株生产L‑谷氨酸的方法，其中所述谷氨酸棒状杆菌突变体菌株通过引入棒状杆菌属来源的机械敏感性离子通道基因来增强谷氨酸的释放，从而提高L‑谷氨酸的生产产率，并且因此，可以通过使用所述突变体菌株更有效地生产L‑谷氨酸。

Description

具有提高的L-谷氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌 株，以及用于使用其生产L-谷氨酸的方法
技术领域
本发明涉及具有提高的L-谷氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变体菌株，以及使用所述突变体菌株生产L-谷氨酸的方法，并且具体地涉及由于其中引入的来源于棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株的机械敏感性离子通道基因而具有提高的L-谷氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，用于构建所述突变体菌株的方法，以及使用所述突变体菌株生产L-谷氨酸的方法。
背景技术
L-谷氨酸是通过微生物发酵产生的代表性氨基酸。L-谷氨酸单钠(monosodium L-glutamate，MSG)可通过平衡和协调食物的整体味道来提高对食物例如肉、鱼、鸡肉、蔬菜、酱汁、汤和调味品的偏好，可增强盐含量降低多至30％的低盐食物的味道，并且因此被广泛用作家庭调味品和用于生产经加工食物的调味品。
简言之，关于L-谷氨酸发酵的途径，葡萄糖主要发生糖酵解途径(EMP)，但其一部分通过己糖磷酸途径(HMP)代谢成两个丙酮酸分子。在这些分子中，一个分子与CO2结合以形成草酰乙酸，并且另一个分子与来自丙酮酸的乙酰辅酶A结合以形成柠檬酸。然后，草酰乙酸和柠檬酸进入柠檬酸循环(TCA循环)以形成α-酮戊二酸。在此，由于TCA循环缺乏用于将α-酮戊二酸氧化为琥珀酸的代谢途径并且异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶密切参与其中，因此高效地进行通过氧化α-酮戊二酸进行的还原性氨基酸合成，从而产生L-谷氨酸。
L-谷氨酸通常通过主要使用短杆菌属(Brevibacterium sp.)或棒状杆菌属菌株及其突变体菌株进行的发酵来生产。为了提高通过微生物培养的L-谷氨酸生产，已经使用了调节参与L-谷氨酸生物合成的基因之表达的方法。例如，可主要使用通过修饰基因的启动子来提高该基因的拷贝数或调节生物合成途径中酶的活性的方法。特别地，公开了通过扩增特定基因例如pyc基因或fasR(美国专利No.6,852,516)或操纵gdh、gltA、icd、pdh和argG基因中的每一个的启动子区域(美国专利No.6,962,805)来提高L-谷氨酸的产生。因此，参与谷氨酸生物合成途径的大部分基因是已知的，并且因此需要鉴定能够提高谷氨酸生产的新基因，并通过应用该基因来开发新的谷氨酸生产菌株。
因此，本发明人鉴定了有助于L-谷氨酸释放的新基因，并通过将该基因引入L-谷氨酸生产菌株中而构建了突变体菌株。另外，本发明人发现突变体菌株具有提高的L-谷氨酸生产力，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，其包含来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因，并且具有提高的L-谷氨酸生产力。
本发明的另一个目的是提供用于构建谷氨酸棒状杆菌突变体菌株的方法，所述方法包括引入来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因的步骤。
本发明的又一个目的是提供用于生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在L-谷氨酸生产培养基中培养谷氨酸棒状杆菌突变体菌株；以及(ii)从所培养的突变体菌株中或从培养所述突变体菌株的培养基中回收L-谷氨酸。
技术方案
本发明的一个方面提供了谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，其包含来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因，并且具有提高的L-谷氨酸生产力。
本发明人已致力于开发具有提高的L-谷氨酸生产力的新的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，并且作为结果，已发现当将来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因引入到产生L-谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株中时，这有助于L-谷氨酸的释放，从而显著提高突变体菌株的L-谷氨酸生产力。
在本发明中，“棒状杆菌属菌株”是待引入到谷氨酸棒状杆菌菌株中的机械敏感性离子通道基因所来源的菌株，并且可包括任何棒状杆菌属微生物。特别地，棒状杆菌属菌株可以是谷氨酸棒状杆菌、Corynebacterium crudilactis、沙漠棒状杆菌(Corynebacteriumdeserti)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、Corynebacteriumsuranareeae、Corynebacterium lubricantis、Corynebacterium doosanense、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、Corynebacterium uterequi、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、Corynebacterium pacaense、单一棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、Corynebacterium humireducens、海洋棒状杆菌(Corynebacterium marinum)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、企鹅棒状杆菌(Corynebacterium spheniscorum)、Corynebacterium freiburgense、纹状棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、犬棒状杆菌(Corynebacterium canis)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、牛肾盂炎棒状杆菌(Corynebacterium renale)、Corynebacterium pollutisoli、汉氏棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、黑海棒状杆菌(Corynebacterium caspium)、龟口腔棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)、Corynebacaterium pseudopelargi或微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)。
在本发明中，“机械敏感性离子通道”是存在于细菌以及真核生物的细胞膜中的通道，并且参与渗透稳态。编码这种机械敏感性离子通道的基因可来源于棒状杆菌属菌株。优选地，所述基因可以是具有来源于沙漠棒状杆菌的SEQ ID NO:1的核苷酸序列、来源于Corynebacterium crudilactis的SEQ ID NO:2的核苷酸序列或来源于帚石南棒状杆菌的SEQ ID NO:3的核苷酸序列的基因。另外，所述基因还可包含与SEQ ID NO:1至3中的每一个的核苷酸序列具有60％或更多、优选70％或更多、更优选80％或更多、甚至更优选90％或更多、最优选95％或更多同源性的核苷酸序列。“……％或更多同源性”通过在比较区域上比较两个最佳对齐的序列来确定，其中比较区域中的多核苷酸序列的一部分与用于两个序列的最佳对齐的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)。另外，编码机械敏感性离子通道的基因可具有天然存在或非天然存在(例如，遗传操作、辐射、化学处理等)的突变，并且该基因的功能可通过这种突变被减弱或增强。
根据本发明的一个实施方案，机械敏感性离子通道基因可由SEQ ID NO:1至5的核苷酸序列中的任一个编码。
SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以是来源于沙漠棒状杆菌的机械敏感性离子通道基因的核苷酸序列，SEQ ID NO:2的核苷酸序列可以是来源于Corynebacterium crudilactis的机械敏感性离子通道基因的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:3至5的核苷酸序列可以是来源于帚石南棒状杆菌的机械敏感性离子通道基因的核苷酸序列。在此，SEQ ID NO:4和5中的每一个的核苷酸序列可编码这样的氨基酸序列：所述氨基酸序列在来源于帚石南棒状杆菌的机械敏感性离子通道基因的氨基酸序列中的第107位具有丙氨酸(ALA)或缬氨酸(VAL)替换亮氨酸(LEU)。
本发明人认为，与来自谷氨酸棒状杆菌的参与谷氨酸释放的机械敏感性离子通道基因具有70％或更多同源性(针对沙漠棒状杆菌的同源性为74％，针对Corynebacteriumcrudilactis的同源性为72％，并且针对帚石南棒状杆菌的同源性为70％)的核苷酸序列在谷氨酸释放中发挥相同作用，并且本发明人发现包含根据本发明的机械敏感性离子通道基因的突变体菌株与其他谷氨酸生产菌株相比具有显著提高的谷氨酸生产力。
在本发明中，具有“提高的生产力”的菌株意指这样的菌株：该菌株的L-谷氨酸生产力高于其亲本菌株的L-谷氨酸生产力。术语“亲本菌株”是指野生型菌株或待突变的突变体菌株，并且包括待直接突变或待用重组载体等转化的菌株。在本发明中，亲本菌株可以是野生型谷氨酸棒状杆菌菌株或从野生型菌株突变而来的菌株。优选地，亲本菌株可以是谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株。
由根据本发明一个实施方案的具有提高的L-谷氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株产生的L-谷氨酸的量可以比由亲本菌株产生的L-谷氨酸的量高至少5％，具体地5至20％。即，谷氨酸棒状杆菌突变体菌株可产生36至50g L-谷氨酸/升菌株培养物，优选38至45g L-谷氨酸/升菌株培养物。
本发明的另一个方面提供了用于构建谷氨酸棒状杆菌突变体菌株的方法，所述方法包括引入来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因的步骤。
上述步骤是用包含编码机械敏感性离子通道基因的多核苷酸的载体转化亲本菌株的步骤。
在本发明中，术语“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞中的任何载剂。载体可以是可连接另一DNA片段以引起所连接片段复制的复制子。术语“复制子”是指作为体内DNA复制的自主单元发挥作用，即能够在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、黏粒、染色体、病毒)。在本公开内容中，载体没有特别限制，只要其可在宿主中复制即可，并且可使用本领域已知的任何载体。用于构建重组载体的载体可以是天然状态或重组状态的质粒、黏粒、病毒或噬菌体。可使用的噬菌体载体或黏粒载体的一些实例包括pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A和Charon21A，并且可使用的质粒载体的一些实例包括pDZ载体，以及基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的载体。可使用的载体没有特别限制，并且可使用已知的表达载体，但不限于此。
在本公开内容中，术语“转化”意指将基因引入到宿主细胞中，使得该基因可在宿主细胞中表达。对于经转化的基因，该基因是插入在宿主细胞的染色体中还是位于染色体之外并不重要，只要该基因可在宿主细胞中表达即可。在本发明中，转化方法的一个实例可以是电穿孔法(van der Rest et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,52,541-545,1999)等。
本发明的又一个目的是提供用于生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在L-谷氨酸生产培养基中培养谷氨酸棒状杆菌突变体菌株；以及(ii)从所培养的突变体菌株中或从培养所述突变体菌株的培养基中回收L-谷氨酸。
可使用本领域已知的合适培养基和培养条件进行培养，并且本领域任何技术人员可容易地调整和使用培养基和培养条件。特别地，培养基可以是液体培养基，但不限于此。培养方法的一些实例包括但不限于分批培养、连续培养、补料分批培养、或其组合。
根据本发明的一个实施方案，培养基应当以适当的方式满足特定菌株的要求，并且可由本领域技术人员进行适当的修改。针对用于棒状杆菌属菌株的培养基，可参考已知文件(但不限于此)(Manual of Methods for General Bacteriology,American Societyfor Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。
根据本发明的一个实施方案，培养基可包含多种碳源、氮源和微量元素组分。可使用的碳源的一些实例包括：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可使用的氮源的一些实例包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可使用的磷源的一些实例包括但不限于磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或者相应的含钠盐。另外，培养基可包含但不限于生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。另外，培养基可包含必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。此外，可在培养基中使用合适的前体。可在培养期间将培养基或单独的组分通过合适的方法分批或以连续方式添加至培养基中，但不限于此。
根据本发明的一个实施方案，培养基的pH可通过在培养期间以适当方式向微生物培养基中添加化合物例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节。另外，在培养期间，可使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制发泡。另外，为了将培养基保持在有氧条件下，可将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养基中。培养基的温度通常可以是20℃至45℃，例如25℃至40℃。可继续培养直至产生所期望量的可用物质。例如，培养时间可以是10小时至160小时。
根据本发明的一个实施方案，在从所培养的突变体菌株中和从培养基中回收L-谷氨酸的步骤中，所产生的L-谷氨酸可使用本领域中已知的合适方法根据培养方法从培养基中收集或回收。用于收集或回收L-谷氨酸的方法的一些实例包括但不限于离心、过滤、萃取、喷洒、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱(例如，离子交换、亲和力、疏水性和尺寸排阻)。
根据本发明的一个实施方案，回收L-谷氨酸的步骤可通过将培养物在低速下离心以去除生物质并通过离子交换色谱分离所获得的上清液来进行。
根据本公开内容的一个实施方案，回收L-谷氨酸的步骤可包括纯化L-谷氨酸的过程。
有益效果
由于根据本发明的一个实施方案的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株是已将来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因引入其中的菌株，因此其可以以提高的产率生产L-谷氨酸，因为谷氨酸的释放得以增强。因此，当使用该突变体菌株时，可以更有效地生产L-谷氨酸。
附图说明
图1示出了pKmscS1载体的结构，其包含来源于沙漠棒状杆菌菌株的机械敏感性离子通道基因。
图2示出了pKmscS3-L107A载体的结构，其包含编码以下氨基酸序列的机械敏感性离子通道基因：所述氨基酸序列在来源于帚石南棒状杆菌菌株的机械敏感性离子通道基因的氨基酸序列中的第107位具有丙氨酸(ALA)替换氨基酸残基亮氨酸(LEU)。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明。然而，提供这些描述仅用于举例说明目的以帮助理解本发明，并且本发明的范围不受这些举例说明性描述的限制。
实施例1.谷氨酸棒状杆菌突变体菌株的构建
1-1.其中引入来源于沙漠棒状杆菌(C.deserti)的机械敏感性离子通道基因的载体的构建
为了引入机械敏感性离子通道基因mscS1，从沙漠棒状杆菌GIMN1.010中分离染色体DNA并纯化。然后，使用经纯化DNA作为模板，使用下表1中的引物3和4的组进行PCR扩增，持续30个循环，每个循环均由以下组成：95℃持续30秒、58℃持续30秒和72℃持续2分钟。
扩增的基因使用下表1中所示的引物1和2的组以及引物5和6的组通过PCR进行扩增，持续30个循环，每个循环均由以下组成：95℃持续30秒、58℃持续30秒和72℃持续2分钟，所述引物识别待插入基因在载体中的位置。通过对PCR产物进行电泳分别确认约1,500bp、1,600bp和1,500bp的带。
然后将每种经纯化PCR产物(mscS1基因和载体)用作模板用于交叉聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，并使用下表1中所示的引物1和6的组通过交叉PCR技术(Bacteriol.,179:6228-6237,1997)再次扩增。接下来，对4.6kb PCR产物进行纯化，用BamHI限制性酶(Takara,Japan)消化，并随后将其克隆到用相同限制性酶消化的pK19mobSacB载体(Gene,145:69-73,1994)中，从而构建用于引入mscS1基因的pKmscS1载体(图1)。
[表1]
Figure BDA0003794674070000081
1-2.其中引入来源于Corynebacterium crudilactis的机械敏感性离子通道基因的载体的构建
以与实施例1-1中相同的方式构建用于引入mscS2基因的pKmscS2载体，不同之处在于使用C.crudilactis菌株JZ16代替沙漠棒状杆菌并且使用下表2中所示的引物。
[表2]
Figure BDA0003794674070000091
1-3.其中引入来源于帚石南棒状杆菌(C.callunae)的机械敏感性离子通道基因的载体的构建
以与实施例1-1中相同的方式构建用于引入mscS3基因的pKmscS3载体，不同之处在于使用帚石南棒状杆菌DSM 20147代替沙漠棒状杆菌并且使用下表3中所示的引物。
[表3]
Figure BDA0003794674070000101
1-4.其中引入来源于帚石南棒状杆菌的机械敏感性离子通道基因之氨基酸残基突变的载体的构建
为了替换机械敏感性离子通道基因mscS3氨基酸序列中第107位的氨基酸残基并引入所述基因，从帚石南棒状杆菌DSM 20147中分离染色体DNA并纯化。然后，使用经纯化DNA作为模板，使用下表4中所示的引物1和2的组以及引物3和4的组进行PCR扩增，持续30个循环，每个循环均由以下组成：95℃持续30秒、58℃持续30秒和72℃持续2分钟。
然后将每种经纯化PCR产物(mscS3基因和载体)用作模板用于交叉聚合酶链式反应(PCR)，并使用下表4中所示的引物1和4的组通过交叉PCR技术(Bacteriol.,179:6228-6237,1997)再次扩增。接下来，对718bp PCR产物进行纯化，用BamHI限制性酶(Takara,Japan)消化，并随后将其克隆到用相同限制性酶消化的pK19mobSacB载体(Gene,145:69-73,1994)中，从而构建pKmscS3-L107A载体，用于引入在mscS3基因的氨基酸序列中第107位的亮氨酸残基的丙氨酸替换突变(图2)。
[表4]
Figure BDA0003794674070000111
1-5.其中引入来源于帚石南棒状杆菌的机械敏感性离子通道基因之氨基酸残基突变的载体的构建
以与实施例1-4中相同的方式构建用于引入mscS3基因的氨基酸序列中的第107位处亮氨酸残基的缬氨酸替换突变的pKmscS3-L107V载体，不同之处在于使用下表5中所示的引物代替实施例1-4中的引物。
[表5]
Figure BDA0003794674070000112
1-6.谷氨酸棒状杆菌KCTC11558BP菌株的转化和突变体菌株的构建
作为用于转化谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株的方法，使用电感受态细胞制备方法，其是van der Rest方法的经修改形式。
首先，将谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株在补充有2％葡萄糖的100ml 2YT培养基(16g/l胰胨、10g/l酵母提取物、5g/l氯化钠)中培养，并将1mg/ml异烟酸肼(isonicotinic acid hydrazine)和2.5％甘氨酸添加至相同的不含葡萄糖的培养基中。然后，接种种子培养基至OD610值达到0.3，并随后在18℃和180rpm下培养12至16小时，直至OD610值达到1.2至1.4。在冰上保持30分钟之后，在4℃下以4,000rpm进行离心15分钟。在此之后，弃去上清液，并将沉淀的谷氨酸棒状杆菌KCTC11558BP菌株用10％甘油溶液洗涤4次，并最终重悬于0.5ml 10％甘油溶液中，从而制备感受态细胞。使用Bio-Rad电穿孔仪进行电穿孔。将制备的感受态细胞和每个所构建的pKmscS1、pKmscS2、pKmscS3、pKmscS3-L107A和pKmscS3-L107V载体置于电穿孔吸收池(0.2mm)中，然后在2.5kV、200Ω和12.5μF的条件下进行电穿孔。电穿孔完成之后立即向细胞添加1ml再生培养基(含有18.5g/l脑心浸粉(brain heart infusion powder)和0.5M山梨糖醇)，然后将细胞在46℃下热处理6分钟。接下来，使细胞在室温下冷却，转移至15ml盖管中，在30℃下孵育2小时，并接种到选择培养基(含有5g/l胰胨、5g/l NaCl、2.5g/l酵母提取物、18.5g/l脑心浸粉、15g/l琼脂、91g/l山梨糖醇和20μg/l卡那霉素)上。将细胞在30℃下培养72小时，并将产生的菌落在BHI培养基中培养直至稳定期以诱导二次重组。然后将细胞稀释至10-5至10-7个细胞，并接种到不含抗生素的板(含有10％蔗糖)上，并选择不具有卡那霉素抗性且能够在含有10％蔗糖的培养基中生长的菌株。使用上表1至表3中的每一个中所示的引物7和8的组，确定所选择的菌落是其中分别引入了mscS1、mscS2和mscS3基因的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株(IS1、IS2和IS3)。另外，使用上表4和表5的每一个中所示的引物5和6的组，确定所选择的菌落是其中分别引入了mscS3-L107A和mscS3-L107V基因的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株(IS3-A和IS3-V)。
实验例1.突变体菌株之间L-谷氨酸生产力的比较
比较在以上实施例1中构建并且其中分别引入了mscS1、mscS2和mscS3基因的突变体菌株(IS1、IS2和IS3)与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株之间的L-谷氨酸生产力。
将每种突变体菌株和亲本菌株接种到具有下表6中所示组合物的活性板培养基(pH 7.5)上，并在30℃下培养24小时。在此之后，将具有下表7中所示组合物的10mL烧瓶培养基(pH 7.6)置于100mL烧瓶中并用具有在板培养基中培养的各菌株的环(loop)接种，随后在30℃和200rpm下培养48小时。在完成培养之后，测量各培养物中的L-谷氨酸的量，并且结果在下表8中示出。
[表6]
组分 含量
葡萄糖 5g/L
酵母提取物 10g/L
尿素 3g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1g/L
生物素 2μg/L
大豆水解产物 0.1％v/v
亮氨酸 50mg/L
琼脂 20g/L
[表7]
组分 含量
葡萄糖 70g/L
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.4g/L
尿素 2g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1g/L
大豆水解产物 1.5％v/v
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 5g/L
FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 10mg/L
MnSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O 10mg/L
硫胺素-HCl 200μg/L
生物素 2μg/L
碳酸钙 50g/L
[表8]
谷氨酸产生(g/L)
亲本菌株(KCTC 11558BP) 35.3
突变体菌株(IS1) 38.2
突变体菌株(IS2) 37.9
突变体菌株(IS3) 38.4
如上表8中所示，证实了与其中未引入任一种基因的亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株的L-谷氨酸生产力相比，谷氨酸棒状杆菌突变体菌株IS1、IS2和IS3(其中分别引入了沙漠棒状杆菌来源的mscS1基因，C.crudilactis来源的mscS2基因和帚石南棒状杆菌来源的mscS3基因)的L-谷氨酸生产力分别提高了约8％、7％和9％。
实验例2.与具有氨基酸残基替换的突变体菌株的L-谷氨酸生产力的比较
比较在以上实施例1中构建并且其中分别引入了mscS3、mscS3-L107A和mscS3-L107V基因的突变体菌株IS3、IS3-A和IS3-V与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株之间的L-谷氨酸生产力。
以与实施例1中相同的方式培养菌株，测量每种培养物中L-谷氨酸的量，并且结果在下表9中示出。
[表9]
谷氨酸产生(g/L)
亲本菌株(KCTC 11558BP) 35.3
突变体菌株(IS3) 38.4
突变体菌株(IS3-A) 39.7
突变体菌株(IS3-V) 36.8
如上表9中所示，证实了与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCTC 11558BP菌株的L-谷氨酸生产力相比，谷氨酸棒状杆菌突变体菌株IS3、IS3-A和IS3-V的L-谷氨酸生产力分别提高了约9％、12％和4％。
特别地，可以看出，与在其中氨基酸残基亮氨酸未被替换的情况(IS3)下或在其中氨基酸残基亮氨酸被缬氨酸替换的情况(IS3-V)下相比，在其中第107位的氨基酸残基亮氨酸被丙氨酸替换的情况(IS3-A)下，L-谷氨酸生产力提高，这表明来源于帚石南棒状杆菌的mscS3基因的氨基酸序列中的第107位的氨基酸残基是参与谷氨酸生产力的重要位置。
迄今为止，已参照一些实施方案描述了本发明。本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明的实质特征的情况下，本发明可以以经修改形式实施。因此，应从解释说明的角度而不是从限制性的角度考虑所公开的实施方案。本发明的范围由权利要求书而不是以上描述来限定，并且与之等同的范围内的所有差异均应被解释为包括在本发明中。
<110> DAESANG CORPORATION
<120> 具有增强的L-谷氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌突变体，以及用于使用其制备L-谷氨酸的方法
<130> PN190487-P1
<150> KR 10-2020-0017264
<151> 2020-02-12
<150> KR 10-2020-0105435
<151> 2020-08-21
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 沙漠棒状杆菌（Corynebacterium deserti） GIMN1.010
<400> 1
tgggatggac gttggcgcag ttgtctgcac attcgctgtt ggtgctgctg aggtcgttgt 60
ggcctgtgag gttgtagccg gcgtcgtctg aggtgtttga ggcgtctgct cggttggctc 120
ggaggtggca ccggcagtcg gcggggtgcc ggtttcctgg ttccaggttt caggctgcgt 180
atcgacgctt gactccgtcg gaatcacttc cggtgtgaaa ggttcaggcg tgggagtaaa 240
cgtctctaac ggggtggttg ttggtggaat ggtttccccg gttgtttgcg acgtcggcgc 300
aagccatccg ctggagccct gccagttgtc cccggtttcc actgtcatgc ctttaagtaa 360
cagcaagcta ccgaggacca ccaatagaag tgaggtgctc atgcgtacgc gaccgcccaa 420
agataaaatc ttttgccaac gcttggggta gtaatcagta cggaagaatg aacgcagaga 480
atgatctttg tcggattctt ccttcgctgg gtcatcctcg tcccgtactt cttgttccaa 540
aacctcggaa tcaagggctg tttctggatt tccaggactt agcttggtgg atacaggatc 600
aggatcatcg attgaggagg cggcaagcga tgccacagtg gcggccgcgt ccggcttggg 660
ttcagtgaga gcctttggag aattgtcggc caagggatgg gggtgggcgt cgaaaagcgg 720
tttttctttc ggtacctcgt ggctgacgtt gagggtgtcg atgagcgcac ccgtcgttgt 780
ggttgcgctg ccgtattcct cccagaattc gctgatgatt tcggtgcgga ttgcgcgttc 840
gacgagccac tggttgccgg cggtaacttg cacaagaaaa cgcatggaga ctgtccacgg 900
cataccgacg acggttgggg gagtgacatc gacggccggg tgaacatcga gttcgccgag 960
gatttccggt gcgatcttct cctgctctaa cgcgcggcga gtggcagctt ctgaacgcgt 1020
gatgacatcg ctgatgtttt ccgagccaag caggggaatc ggcatgatga ccacggcacg 1080
cgaccagttg ttggaattgt tgatgcacac cttcgccgtg gaatttggga tgatgactgt 1140
ctcttgcgag atggtgcgga tttttgttgc gcgcatggtt atttcaatga cggtaccttc 1200
aaccaccacg ccatttcctt caaagcgcac ccagtcaccc acaccgaatt gcttttccgt 1260
gaggatgaaa aagccagcca agaagtccgc gactatggat tgtgcaccaa gaccaatggc 1320
agctgatgcg atcgtggcag gaattgctgc acctgccaac gacaagccga cagtctgcag 1380
agcggcgaca actagcagga agaacgcaac aatctgcacg atatagacac ccacgccagc 1440
aaaagccagc tggtttttcg acgtgtcagc atctgcgttt tcttccacgc gacgcttgat 1500
cactcgcatg gcgagcctgc cgattcgtgg gattaaaaag gctaaaacca ggataattgc 1560
gaggtcaagg ccagtctcga cgatccaatt ccacaatgaa tagagaatgt acctaaccgg 1620
cagtcctaaa atcat 1635
<210> 2
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Corynebacterium crudilactis菌株JZ16
<400> 2
atgattttag gtgaacgcat ctctttcctt ctttattcat tgtggaattg gattacaaat 60
acaggcattg accttgcaat catcctggtt cttggctttt taatccctcg tttcggccgg 120
attggcatgc ggattatcaa acgccgagtg gaatccaccg ccgatactga cacgaccaaa 180
aaccaactcg cctttgcggg cgtaggcctt tatatcgcac aaatcgtggc atttttcatg 240
cttgcaattg cagcgatgca gctctttggt ttctctctgg caggtgccgc catccccgcc 300
accattgctt ctgctgccat tggtctaggc gcgcaatcca tcgttgcgga tttcttggct 360
ggatttttca tcctgacgga aaaacaattt ggtgtaggtg actgggtgcg cttcgaaggc 420
aacggcatca tcgttgaagg cactgtcatt gaaatcacca tgcgtgccac aaaaatccgc 480
acgattgctc aacaaacggt gatcatccct aactccacgg ccaaggtgtg cattaataac 540
tccaacagct ggtcgcgtgc cgttgtgctc atgccgattc cgatgcttgg ttcagacaac 600
atcactgatg ttattgcacg ttctgaagct gcgactcgtc gtgcacttac gcaggaaata 660
atcgcacctg agatcttggg cgagcttgat gtgcaccccg ccatcgatgt cacgccgcct 720
tctgtcgttg gcatgccctg gatggtgacc atgcgtttcc tcgtccaggt caccgcaggt 780
aatcaatggc ttgtcgaacg cgctatccgc accgaaatca tcagcgaatt ttgggaagaa 840
tatggcagcg ccaccaccac atccggtacg ctgatcgatt ccctcagcgt ggttcaggaa 900
aagaatccgc ttatcgacgc ctctcccaac gctttgcagg aaccgaagcc ggaagctgcc 960
gcgacggtcg catcgctagc agcatcatct aacgatgacg ctgctaatac agtgatcagt 1020
ccaggaaatc cagaaaaggg tcttgattcc gaggtgatgg aacaggagct ttccgttgaa 1080
gaagatacgc ccgaggaaca cgcttctctg caaaagtttt tccgtaccga tttctacccc 1140
aagcgttggc aaaagatctt gtccctggga ggccgcgtcc gcatgagtac gtccctactg 1200
cttgctgcat taatggtgtt gtcgctgacc aaggtgttga tgattgaacc taatgaaaat 1260
tggcaaaatt ccactggccg cttcgctccg caatcaacca caaccacttc tgaaactcct 1320
acgcagctac cgtcaagctc gatagtttcc cccagcgtgc cggtgtcccc aacggtggag 1380
tcaagcgtcg aaacgcagcc tgaaaccgca acctcccagc cccgtagcac cgctgagcaa 1440
accgaggagc ctacggagga gcagccatca accacaccat caacgacggt tccagaaacc 1500
acgccgcaga cacccgaaac ctcctctcca gcccaagaaa cagcaacacc aatgtccacc 1560
ccataa 1566
<210> 3
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帚石南棒状杆菌（Corynebacterium callunae）DSM 20147
<400> 3
atgcccattc ccgtgcttta tttactttca cagttttggt cctgggttgt tgaaaccgga 60
ctagatcttg cgctgatttt ggtattggca tttcttattc cccgcattgg tcgtttttct 120
atgcgggtta ttaagcaccg tattgaaaac aatgcagatg ccgataccac caaaaaccaa 180
ctagcctttg ccggcgttgg agtttatatc gcgcaaataa tcgccttttt tattcttatt 240
gtttcggccc tgcaacagct cgggttttca ctagccggcg cggcgattcc cgcgacagtt 300
gcctctgcgg ccattggtct tggcgcgcaa tccatcatcg ccgatttcct cgccggattt 360
tttatcctca cggaaaaaca attcggcgtg ggtgactggg tgcgctttga aggcaatggc 420
atcgtggtgg aaggcaccgt tattgaaatc acgatgcgtg ccacgcgcat tcgaaccatt 480
agccaagaga cggtaataat cccgaattcc acggccaagg tctgcattaa caactccaat 540
aactggtcgc gcgcggtggt tgtcatcccg atcccaatgc tgggttccga gaatatttct 600
gaggttatta cccgctcgga gcaggcaact cgccgcgcat tggcccaaga agatatcgct 660
gcggaggtac ttggtgagct tgatgtacac ccggcaattg atgtcactcc ccccaccgtt 720
gttggtatgc catggatggt aaccatgcgt ttcttggtgc aggtcaccgc tggtaatcag 780
tggttggttg aacgcgccat ccgcacccaa attattgacg agttctgggc tgagtacggc 840
tctgccacca ccacgtcagg caccctgatt gattcactta acctcgagca tgaggacccc 900
tattataggg gtgtaaaaac cccgcttgtc gacgaaaaac tggagcgaac tggcacccaa 960
ccaaaagctg cagaagacgc cagcatcgta tcgatggcag caagttccaa agatgatcca 1020
gatcccgcca ctgaggtact aagtccaggg aatccagaga aatcccttga cttggaggtg 1080
ccacatgctg aactagaatc cgagaaaccg gcggaagaaa gagccgataa ggatcatttt 1140
atcggtggct ttttccgcac cgattattat ccaaagcgct ggcaaaaagt gttgtccatt 1200
ggtggtcgag tccgtatgac cacctccatc ctgttgctta tcctgggctt tttactgtta 1260
ctcaaaggtt taacggtaca aactagcccg gaatggcagg gctcaaatgg ttggttagct 1320
ccagatactg aaaccacaac tactcaaagc tccatggttg ctcccaccac atcagagtcc 1380
actacaacta ctccaccgca gcgttccagc gtcgaaacgc gctcttctac ctctattcct 1440
gagaccagca cttttagcac cttcgacgag gaaccggcgc ccgcggagca aagctctgca 1500
gcttccacaa ccagccagca gcaacagcaa cagaccacat ctgcgccgac tacacaggag 1560
agcacgccga cctcaacggc acagccacag gcaacagtta cgtccaccca gtag 1614
<210> 4
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帚石南棒状杆菌DSM 20147 - L107A
<400> 4
atgcccattc ccgtgcttta tttactttca cagttttggt cctgggttgt tgaaaccgga 60
ctagatcttg cgctgatttt ggtattggca tttcttattc cccgcattgg tcgtttttct 120
atgcgggtta ttaagcaccg tattgaaaac aatgcagatg ccgataccac caaaaaccaa 180
ctagcctttg ccggcgttgg agtttatatc gcgcaaataa tcgccttttt tattcttatt 240
gtttcggccc tgcaacagct cgggttttca ctagccggcg cggcgattcc cgcgacagtt 300
gcctctgcgg ccattggtgc aggcgcgcaa tccatcatcg ccgatttcct cgccggattt 360
tttatcctca cggaaaaaca attcggcgtg ggtgactggg tgcgctttga aggcaatggc 420
atcgtggtgg aaggcaccgt tattgaaatc acgatgcgtg ccacgcgcat tcgaaccatt 480
agccaagaga cggtaataat cccgaattcc acggccaagg tctgcattaa caactccaat 540
aactggtcgc gcgcggtggt tgtcatcccg atcccaatgc tgggttccga gaatatttct 600
gaggttatta cccgctcgga gcaggcaact cgccgcgcat tggcccaaga agatatcgct 660
gcggaggtac ttggtgagct tgatgtacac ccggcaattg atgtcactcc ccccaccgtt 720
gttggtatgc catggatggt aaccatgcgt ttcttggtgc aggtcaccgc tggtaatcag 780
tggttggttg aacgcgccat ccgcacccaa attattgacg agttctgggc tgagtacggc 840
tctgccacca ccacgtcagg caccctgatt gattcactta acctcgagca tgaggacccc 900
tattataggg gtgtaaaaac cccgcttgtc gacgaaaaac tggagcgaac tggcacccaa 960
ccaaaagctg cagaagacgc cagcatcgta tcgatggcag caagttccaa agatgatcca 1020
gatcccgcca ctgaggtact aagtccaggg aatccagaga aatcccttga cttggaggtg 1080
ccacatgctg aactagaatc cgagaaaccg gcggaagaaa gagccgataa ggatcatttt 1140
atcggtggct ttttccgcac cgattattat ccaaagcgct ggcaaaaagt gttgtccatt 1200
ggtggtcgag tccgtatgac cacctccatc ctgttgctta tcctgggctt tttactgtta 1260
ctcaaaggtt taacggtaca aactagcccg gaatggcagg gctcaaatgg ttggttagct 1320
ccagatactg aaaccacaac tactcaaagc tccatggttg ctcccaccac atcagagtcc 1380
actacaacta ctccaccgca gcgttccagc gtcgaaacgc gctcttctac ctctattcct 1440
gagaccagca cttttagcac cttcgacgag gaaccggcgc ccgcggagca aagctctgca 1500
gcttccacaa ccagccagca gcaacagcaa cagaccacat ctgcgccgac tacacaggag 1560
agcacgccga cctcaacggc acagccacag gcaacagtta cgtccaccca gtag 1614
<210> 5
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帚石南棒状杆菌DSM 20147 - L107V
<400> 5
atgcccattc ccgtgcttta tttactttca cagttttggt cctgggttgt tgaaaccgga 60
ctagatcttg cgctgatttt ggtattggca tttcttattc cccgcattgg tcgtttttct 120
atgcgggtta ttaagcaccg tattgaaaac aatgcagatg ccgataccac caaaaaccaa 180
ctagcctttg ccggcgttgg agtttatatc gcgcaaataa tcgccttttt tattcttatt 240
gtttcggccc tgcaacagct cgggttttca ctagccggcg cggcgattcc cgcgacagtt 300
gcctctgcgg ccattggtgt tggcgcgcaa tccatcatcg ccgatttcct cgccggattt 360
tttatcctca cggaaaaaca attcggcgtg ggtgactggg tgcgctttga aggcaatggc 420
atcgtggtgg aaggcaccgt tattgaaatc acgatgcgtg ccacgcgcat tcgaaccatt 480
agccaagaga cggtaataat cccgaattcc acggccaagg tctgcattaa caactccaat 540
aactggtcgc gcgcggtggt tgtcatcccg atcccaatgc tgggttccga gaatatttct 600
gaggttatta cccgctcgga gcaggcaact cgccgcgcat tggcccaaga agatatcgct 660
gcggaggtac ttggtgagct tgatgtacac ccggcaattg atgtcactcc ccccaccgtt 720
gttggtatgc catggatggt aaccatgcgt ttcttggtgc aggtcaccgc tggtaatcag 780
tggttggttg aacgcgccat ccgcacccaa attattgacg agttctgggc tgagtacggc 840
tctgccacca ccacgtcagg caccctgatt gattcactta acctcgagca tgaggacccc 900
tattataggg gtgtaaaaac cccgcttgtc gacgaaaaac tggagcgaac tggcacccaa 960
ccaaaagctg cagaagacgc cagcatcgta tcgatggcag caagttccaa agatgatcca 1020
gatcccgcca ctgaggtact aagtccaggg aatccagaga aatcccttga cttggaggtg 1080
ccacatgctg aactagaatc cgagaaaccg gcggaagaaa gagccgataa ggatcatttt 1140
atcggtggct ttttccgcac cgattattat ccaaagcgct ggcaaaaagt gttgtccatt 1200
ggtggtcgag tccgtatgac cacctccatc ctgttgctta tcctgggctt tttactgtta 1260
ctcaaaggtt taacggtaca aactagcccg gaatggcagg gctcaaatgg ttggttagct 1320
ccagatactg aaaccacaac tactcaaagc tccatggttg ctcccaccac atcagagtcc 1380
actacaacta ctccaccgca gcgttccagc gtcgaaacgc gctcttctac ctctattcct 1440
gagaccagca cttttagcac cttcgacgag gaaccggcgc ccgcggagca aagctctgca 1500
gcttccacaa ccagccagca gcaacagcaa cagaccacat ctgcgccgac tacacaggag 1560
agcacgccga cctcaacggc acagccacag gcaacagtta cgtccaccca gtag 1614
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1 (表 1)
<400> 6
cgcggatcct ctgccttgct tgccttggt 29
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2 (表1)
<400> 7
cggcagtcct aaaatcatga gccaagatta gcgctg 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3 (表1)
<400> 8
cagcgctaat cttggctcat gattttagga ctgccg 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4 (表1)
<400> 9
acgtctgtaa tcagcgtctt atgggatgga cgttgg 36
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5 (表1)
<400> 10
ccaacgtcca tcccataaga cgctgattac agacgt 36
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物6 (表1)
<400> 11
cgcggatccc cgttgcctgg gagagaaag 29
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物7 (表1)
<400> 12
ggtggtgagt tcctggtt 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物8 (表1)
<400> 13
gtcaacttcg ccttcctg 18
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2 (表2)
<400> 14
gcgttcacct aaaatcatga gccaagatta gcgctg 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3 (表2)
<400> 15
cagcgctaat cttggctcat gattttaggt gaacgc 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4 (表2)
<400> 16
acgtctgtaa tcagcgtctt atggggtgga cattgg 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5 (表2)
<400> 17
ccaatgtcca ccccataaga cgctgattac agacgt 36
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2 (表3)
<400> 18
acctctctat gacctctaga gagccaagat tagcgctgaa 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3 (表3)
<400> 19
ttcagcgcta atcttggctc tctagaggtc atagagaggt 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4 (表3)
<400> 20
acacgtctgt aatcagcgtc atccctactg ggtggacgta 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5 (表3)
<400> 21
tacgtccacc cagtagggat gacgctgatt acagacgtgt 40
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1 (表4)
<400> 22
cgcggatccg gcagctctca aagt 24
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2 (表4)
<400> 23
gcgatgatgg attgcgcgcc tgcaccaatg gccgcagagg caa 43
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3 (表4)
<400> 24
ttgcctctgc ggccattggt gcaggcgcgc aatccatcat cgc 43
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4 (表4)
<400> 25
cgcggatccc agcgatatct tcttgggc 28
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2 (表5)
<400> 26
ttgcctctgc ggccattggt gttggcgcgc aatccatcat cgc 43
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3 (表5)
<400> 27
gcgatgatgg attgcgcgcc aacaccaatg gccgcagagg caa 43

Claims (5)

1.谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变体菌株，其包含来源于棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株的机械敏感性离子通道基因，并且具有提高的L-谷氨酸生产力。
2.权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，其中所述棒状杆菌属菌株是选自沙漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、Corynebacteriumcrudilactis和帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)中的至少一种。
3.权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，其中所述机械敏感性离子通道基因由SEQ ID NO:1至5的核苷酸序列中的任一个编码。
4.用于构建权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株的方法，所述方法包括引入来源于棒状杆菌属菌株的机械敏感性离子通道基因的步骤。
5.用于生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在L-谷氨酸生产培养基中培养权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株；以及
(ii)从所培养的突变体菌株中或从培养所述突变体菌株的培养基中回收L-谷氨酸。
CN202080096445.8A 2020-02-12 2020-08-26 具有提高的l-谷氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌突变体菌株，以及用于使用其生产l-谷氨酸的方法 Active CN115135767B (zh)

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