JP2023514216A - Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－グルタミン酸の生産方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびその製造方法、これを用いたＬ－グルタミン酸の生産方法に関し、前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されることにより、グルタミン酸の排出を強化させてＬ－グルタミン酸の生産収率が向上するので、前記変異菌株を用いると、より効果的にＬ－グルタミン酸を製造することができる。
Description
本発明は、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－グルタミン酸の生産方法に関し、具体的には、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株に由来する機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されてＬ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびその製造方法、これを用いたＬ－グルタミン酸の生産方法に関する。
Ｌ－グルタミン酸は、微生物の発酵によって生産される代表的なアミノ酸であり、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、ＭＳＧ）は、食べ物の全体的な味に均衡とバランスをとるようにして、肉、魚、ニワトリ、野菜、ソース、スープ、味付けなど食品の選好度を高め、塩を３０％まで低減した低塩食品の味を増進させることが可能で、家庭用および加工食品生産のための調味料として幅広く用いられている。
Ｌ－グルタミン酸の発酵経路を簡単にみると、ブドウ糖は主に当該経路（ＥＭＰ）を経るが、一部は六炭糖リン酸経路（ＨＭＰ）を経て２分子のピルビン酸（ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ）に代謝される。そのうち１分子はＣＯ２を固定してオキサロ酢酸（ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）になり、他の１分子はピルビン酸からアセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）と結合してクエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）になる。さらに、オキサロ酢酸とクエン酸はクエン酸回路（ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ）に入ってアルファ－ケトグルタル酸（α－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）になる。ここで、アルファ－ケトグルタル酸からコハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）に酸化される酸化代謝経路が欠如しており、また、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とグルタメートデヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）が密接に関与するため、アルファ－ケトグルタル酸の還元的アミノ酸化反応が能率的に進行してＬ－グルタミン酸が生成される。
Ｌ－グルタミン酸の生産に際して、通常、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株およびその変異株を用いて発酵により生産する。微生物の培養によるＬ－グルタミン酸の生産量を増加させるためには、Ｌ－グルタミン酸の生合成に関与する遺伝子の発現を調節する方法が利用されてきた。主に、当該遺伝子のコピー数を増加させたり、遺伝子のプロモーターを変形させて生合成経路上の酵素活性を調節することができる。具体的には、ｐｙｃ遺伝子やｆａｓＲのような特定遺伝子の増幅（米国登録特許第６，８５２，５１６号）や、ｇｄｈ、ｇｌｔＡ、ｉｃｄ、ｐｄｈおよびａｒｇＧ遺伝子のプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）部位を操作して（米国登録特許第６，９６２，８０５号）Ｌ－グルタミン酸の生産量を増加させた。このように、グルタミン酸の生合成経路に関与する遺伝子については大部分すでに知られていて、グルタミン酸の生産量を高められる新たな遺伝子を発掘し、これを反映した新たなグルタミン酸生産菌株を開発することが要求されている。
そこで、本発明者らは、Ｌ－グルタミン酸の排出を助ける新たな遺伝子を発掘し、その遺伝子をＬ－グルタミン酸生産菌株に導入して変異株を作製することにより、変異株のＬ－グルタミン酸の生産能が向上したことを確認して、本発明を完成するに至った。
本発明は、コリネバクテリウム属菌株由来の機械感受性イオンチャネル（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）遺伝子を含み、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株を提供することを目的とする。
また、本発明は、コリネバクテリウム属菌株由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子を導入するステップを含む、前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ｉ）前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株をＬ－グルタミン酸生産培地で培養するステップと、ｉｉ）前記変異株または変異株が培養された培養液からＬ－グルタミン酸を回収するステップとを含むＬ－グルタミン酸の生産方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様は、コリネバクテリウム属菌株由来の機械感受性イオンチャネル（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）遺伝子を含み、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供する。
本発明者らは、Ｌ－グルタミン酸の生産能を向上させることができる新たなコリネバクテリウムグルタミクム変異株を開発すべく努力した結果、Ｌ－グルタミン酸を生産するコリネバクテリウムグルタミクム菌株にコリネバクテリウム属菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来する機械感受性イオンチャネル関連遺伝子を導入することにより、Ｌ－グルタミン酸の排出を助けて変異株のＬ－グルタミン酸の生産性が著しく向上することを確認した。
本発明において、「コリネバクテリウム属菌株」は、コリネバクテリウムグルタミクム菌株に導入しようとする機械感受性イオンチャネル遺伝子由来の菌株で、すべてのコリネバクテリウム属微生物を含むことができる。具体的には、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムスラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウムルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウムドオサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウムウテレクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウムスタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウムパケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムシングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウムヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウムマリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウムハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウムスフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウムフレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウムカニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムレナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムカスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウムシュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）、またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムカスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウムシュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）、またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。
本発明において、「機械感受性イオンチャネル」は、バクテリアだけでなく、真核生物の細胞膜に存在するチャネルで、浸透恒常性（ｏｓｍｏｔｉｃ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）に関与する。このような機械感受性イオンチャネルを暗号化する遺伝子は、コリネバクテリウム属菌株由来のものであってもよいし、好ましくは、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）由来のものである配列番号１の塩基配列、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）由来のものである配列番号２、またはコリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）由来のものである配列番号３の塩基配列であってもよい。この時、配列番号１～３の塩基配列と相同性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である塩基配列を含むことができる。前記「相同性が％以上」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することにより確認され、比較領域でのポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。また、機械感受性イオンチャネルを暗号化する遺伝子は、自然的にまたは非自然的に（例えば、遺伝子組換え、放射能、化学的処理など）発生した変異があり得、このような変異により遺伝子の機能が弱化または強化される。
本発明の一具体例によれば、前記機械感受性イオンチャネル遺伝子は、配列番号１～５の塩基配列のいずれか１つに暗号化されたものであってもよい。
前記配列番号１の塩基配列は、コリネバクテリウムデゼルティ由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子であってもよく、配列番号２の塩基配列は、コリネバクテリウムクルディラクティス由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子であってもよいし、配列番号３～５の塩基配列は、コリネバクテリウムカルナエ由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子であってもよい。ここで、配列番号４および５の塩基配列は、コリネバクテリウムカルナエ由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子のアミノ酸配列のうち１０７番目のアミノ酸がロイシン（ＬＥＵ）からアラニン（ＡＬＡ）またはバリン（ＶＡＬ）に置換されたものを暗号化するものであってもよい。
本発明者らは、コリネバクテリウムグルタミクムのグルタミン酸の排出に関与する機械感受性イオンチャネル遺伝子と相同性が７０％以上（コリネバクテリウムデゼルティ７４％、コリネバクテリウムクルディラクティス７２％、コリネバクテリウムカルナエ７０％）である塩基配列により同一のグルタミン酸の排出の役割を行うと推定しており、他のグルタミン酸生産用菌株に比べて、本発明における機械感受性イオンチャネル遺伝子が含まれた変異株のグルタミン酸の生産性が著しく向上したことを確認した。
本発明において、「生産能が向上した」菌株は、親菌株に比べて、Ｌ－グルタミン酸の生産性が増加したものを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になるか、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株または野生型から変異された菌株であってもよい。好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株であってもよい。
本発明の一具体例によるＬ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株に比べて、Ｌ－グルタミン酸の生産量が５％以上、具体的には５～２０％増加して、菌株培養液１ｌあたり３６～５０ｇのＬ－グルタミン酸を生産することができ、好ましくは３８～４５ｇのＬ－グルタミン酸を生産することができる。
本発明の他の態様は、コリネバクテリウム属菌株由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子を導入するステップを含む、前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造方法を提供する。
前記ステップは、機械感受性イオンチャネル遺伝子を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターを親菌株に形質転換させる過程である。
本発明において、「ベクター」は、宿主細胞に塩基のクローニングおよび／または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合して、結合した断片の複製をもたらす複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよい。前記「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。本発明において、ベクターは、宿主のうち複製可能なものであれば特に限定されず、当業界にて知られた任意のベクターを用いることができる。前記組換えベクターの作製に使用されたベクターは、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとして、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。使用可能なベクターは特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを使用することができるが、これに限定されない。
本発明において、「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させるようにすることであり、形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものであれ、制限なく含まれる。本発明において、形質転換方法の一例としては、電気穿孔方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１－５４５，１９９９）などであってもよい。
本発明の他の態様は、ｉ）前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株をＬ－グルタミン酸生産培地で培養するステップと、ｉｉ）前記変異株または変異株が培養された培養液からＬ－グルタミン酸を回収するステップとを含むＬ－グルタミン酸の生産方法を提供する。
前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われ、通常の技術者であれば培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、バッチ培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリア属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。さらに、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によってバッチまたは連続で添加できるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液内に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば、２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続してもよいし、例えば、１０～１６０時間であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記培養された変異菌株および培養培地からＬ－グルタミン酸を回収するステップは、培養方法により当該分野にて公知の適した方法を用いて培地から生産されたＬ－グルタミン酸を収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を用いることができるが、これに限定されない。
本発明の一具体例によれば、グルタミン酸を回収するステップは、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。
本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－グルタミン酸を回収するステップは、Ｌ－グルタミン酸を精製する工程を含むことができる。
本発明の一具体例によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、コリネバクテリウム属菌株由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されることにより、グルタミン酸の排出を強化させてＬ－グルタミン酸の生産収率が向上するので、前記変異菌株を用いると、より効果的にＬ－グルタミン酸を製造することができる。
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解を助けるために例示的に提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるものではない。
実施例１．コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造
１－１．コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃ．ｄｅｓｅｒｔｉ）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されたベクターの製造
機械感受性イオンチャネル遺伝子ｍｓｃＳ１を導入するために、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃ．ｄｅｓｅｒｔｉ ＧＩＭＮ１．０１０）から染色体ＤＮＡを分離、精製した後、鋳型として用いて、下記表１のプライマー３および４を用いてＰＣＲ（９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分、３０回繰り返し）で増幅した。
１－１．コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃ．ｄｅｓｅｒｔｉ）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されたベクターの製造
機械感受性イオンチャネル遺伝子ｍｓｃＳ１を導入するために、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃ．ｄｅｓｅｒｔｉ ＧＩＭＮ１．０１０）から染色体ＤＮＡを分離、精製した後、鋳型として用いて、下記表１のプライマー３および４を用いてＰＣＲ（９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分、３０回繰り返し）で増幅した。
増幅された遺伝子を挿入しようとするベクターの位置を認識する下記表１のプライマー１および２、プライマー５および６を用いてＰＣＲ（９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分、３０回繰り返し）で増幅した。ＰＣＲ産物は電気泳動でそれぞれ約１，５００ｂｐ、１，６００ｂｐ、１，５００ｂｐのバンドを確認した。
精製されたそれぞれのＰＣＲ産物（ｍｓｃＳ１遺伝子およびベクター）はさらにクロスオーバー重合酵素連鎖反応（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）のための鋳型として用いて、下記表１のプライマー１および６を用いてクロスオーバーＰＣＲ手法（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：６２２８－６２３７，１９９７）でもう一度増幅させた。以後、４．６ｋｂのＰＣＲ産物は精製した後、ＢａｍＨＩ制限酵素（Ｔａｋａｒａ、日本）で切断し、同一の制限酵素で切断したｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクター（Ｇｅｎｅ，１４５：６９－７３，１９９４）にクローニングしてｍｓｃＳ１遺伝子導入用ｐＫｍｓｃＳ１ベクターを製造した（図１）。
１－２．コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されたベクターの製造
前記１－１のコリネバクテリウムデゼルティの代わりにコリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＺ１６）を用い、下記表２のプライマーを用いたことを除けば、同様に製造してｍｓｃＳ２遺伝子導入用ｐＫｍｓｃＳ２ベクターを製造した。
前記１－１のコリネバクテリウムデゼルティの代わりにコリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＺ１６）を用い、下記表２のプライマーを用いたことを除けば、同様に製造してｍｓｃＳ２遺伝子導入用ｐＫｍｓｃＳ２ベクターを製造した。
１－３．コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子が導入されたベクターの製造
前記１－１のコリネバクテリウムデゼルティの代わりにコリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ ＤＳＭ ２０１４７）を用い、下記表３のプライマーを用いたことを除けば、同様に製造してｍｓｃＳ３遺伝子導入用ｐＫｍｓｃＳ３ベクターを製造した。
前記１－１のコリネバクテリウムデゼルティの代わりにコリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ ＤＳＭ ２０１４７）を用い、下記表３のプライマーを用いたことを除けば、同様に製造してｍｓｃＳ３遺伝子導入用ｐＫｍｓｃＳ３ベクターを製造した。
１－４．コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子のアミノ酸残基変異が導入されたベクターの製造
機械感受性イオンチャネル遺伝子ｍｓｃＳ３の１０７番目のアミノ酸残基を置換して導入するために、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ ＤＳＭ ２０１４７）から染色体ＤＮＡを分離、精製した後、鋳型として用いて、下記表４のプライマー１および２、プライマー３および４を用いてＰＣＲ（９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分、３０回繰り返し）で増幅した。
機械感受性イオンチャネル遺伝子ｍｓｃＳ３の１０７番目のアミノ酸残基を置換して導入するために、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ ＤＳＭ ２０１４７）から染色体ＤＮＡを分離、精製した後、鋳型として用いて、下記表４のプライマー１および２、プライマー３および４を用いてＰＣＲ（９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で２分、３０回繰り返し）で増幅した。
精製されたそれぞれのＰＣＲ産物（ｍｓｃＳ３遺伝子およびベクター）はさらにクロスオーバー重合酵素連鎖反応（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）のための鋳型として用いて、下記表４のプライマー１および４を用いてクロスオーバーＰＣＲ手法（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：６２２８－６２３７，１９９７）でもう一度増幅させた。以後、７１８ｂｐのＰＣＲ産物は精製した後、ＢａｍＨＩ制限酵素（Ｔａｋａｒａ、日本）で切断し、同一の制限酵素で切断したｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクター（Ｇｅｎｅ，１４５：６９－７３，１９９４）にクローニングしてｍｓｃＳ３遺伝子の１０７番目のロイシン残基をアラニンに置換する変異導入用ｐＫｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ａベクターを製造した（図２）。
１－５．コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ）由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子のアミノ酸残基変異が導入されたベクターの製造
前記１－４のプライマーの代わりに下記表５のプライマーを用いたことを除けば、同様に製造してｍｓｃＳ３遺伝子の１０７番目のロイシン残基をバリンに置換する変異導入用ｐＫｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖベクターを製造した。
前記１－４のプライマーの代わりに下記表５のプライマーを用いたことを除けば、同様に製造してｍｓｃＳ３遺伝子の１０７番目のロイシン残基をバリンに置換する変異導入用ｐＫｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖベクターを製造した。
１－６．コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株の形質転換および変異株の製造
コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株の形質転換のための方法としてｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔなどの方法に基づいて修飾したエレクトロコンピテントセル（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）の製造法を使用した。
コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株の形質転換のための方法としてｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔなどの方法に基づいて修飾したエレクトロコンピテントセル（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）の製造法を使用した。
まず、２％ブドウ糖が添加された２ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）１００ｍｌでコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株を１次培養し、ブドウ糖を除いた同一の培地に１ｍｇ／ｍｌの濃度のイソニコチン酸ヒドラジン（ｉｓｏｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）および２．５％グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）を添加した。その後、ＯＤ６１０値が０．３となるように種培養液を接種した後、１８℃、１８０ｒｐｍで１２～１６時間培養してＯＤ６１０値が１．２～１．４となるようにした。氷で３０分間放置した後、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、上澄液を捨てて沈殿したコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株を１０％グリセロール溶液で４回洗浄し、最終的に１０％グリセロール溶液０．５ｍｌに再懸濁してコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を用意した。電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）社の電気穿孔機（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）を用いた。電気穿孔キュベット（０．２ｍｍ）に用意されたコンピテントセルと製造されたそれぞれのｐＫｍｓｃＳ１、ｐＫｍｓｃＳ２、ｐＫｍｓｃＳ３、ｐＫｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ａ、ｐＫｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖベクターを添加した後、２．５ｋＶ、２００Ωおよび１２．５μＦの条件で電気衝撃を加えた。電気衝撃が終わってすぐに再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ １８．５ｇ／ｌおよびソルビトール０．５Ｍ含有）１ｍｌを添加し、４６℃で６分間熱処理した。その後、室温で冷やした後、１５ｍｌのキャップチューブに移して、３０℃で２時間培養し、選別培地（トリプトン５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／ｌ、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｐｏｗｄｅｒ１８．５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ソルビトール９１ｇ／ｌおよびカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）２０μｇ／ｌ含有）に塗抹した。３０℃で７２時間培養して生成されたコロニーはＢＨＩ培地で静止期まで培養して２次組換えを誘導し、１０－５～１０－７まで希釈して抗生剤のない平板（１０％ｓｕｃｒｏｓｅ含有）に塗抹して、カナマイシン耐性度がなく１０％スクロースが含まれた培地
から成長性のある菌株を選別した。得られたコロニーを前記表１～３の各プライマー７および８を用いてｍｓｃＳ１、ｍｓｃＳ２、ｍｓｃＳ３遺伝子がそれぞれ導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３）を確認し、前記表４および５の各プライマー５および６を用いてｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ａ、ｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖ遺伝子がそれぞれ導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＩＳ３－Ａ、ＩＳ３－Ｖ）を確認した。
から成長性のある菌株を選別した。得られたコロニーを前記表１～３の各プライマー７および８を用いてｍｓｃＳ１、ｍｓｃＳ２、ｍｓｃＳ３遺伝子がそれぞれ導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３）を確認し、前記表４および５の各プライマー５および６を用いてｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ａ、ｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖ遺伝子がそれぞれ導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＩＳ３－Ａ、ＩＳ３－Ｖ）を確認した。
実験例１．変異株のＬ－グルタミン酸の生産性の比較
実施例１で製造されたｍｓｃＳ１、ｍｓｃＳ２、ｍｓｃＳ３遺伝子導入変異株（ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３）と、親菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に対して、Ｌ－グルタミン酸の生産性を比較した。
実施例１で製造されたｍｓｃＳ１、ｍｓｃＳ２、ｍｓｃＳ３遺伝子導入変異株（ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３）と、親菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に対して、Ｌ－グルタミン酸の生産性を比較した。
下記表６のような組成を有する活性平板培地（ｐＨ７．５）に変異株と親菌株をそれぞれ塗抹して、３０℃で２４時間培養した。以後、１００ｍＬのフラスコに下記表７のような組成を有するフラスコ培地（ｐＨ７．６）１０ｍＬを入れて、これに平板培地で培養された菌株をそれぞれ１ループ（ｌｏｏｐ）接種して、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間培養した。培養が完了した後、培養液中でＬ－グルタミン酸の量を測定し、その結果は下記表８の通りである。
前記表８に示すように、コリネバクテリウムグルタミクム変異株ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３は、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃ．ｄｅｓｅｒｔｉ）由来のｍｓｃＳ１、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）由来のｍｓｃＳ２、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ）由来のｍｓｃＳ３遺伝子が、それぞれ導入されていない親菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に比べて、Ｌ－グルタミン酸の生産性がそれぞれ約８％、７％、９％ずつ増加したことが確認された。
実験例２．アミノ酸残基の置換の有無による変異株のＬ－グルタミン酸の生産性の比較
実施例１で製造されたｍｓｃＳ３、ｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ａ、ｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖ遺伝子導入変異株（ＩＳ３、ＩＳ３－Ａ、ＩＳ３－Ｖ）と、親菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に対して、Ｌ－グルタミン酸の生産性を比較した。
実施例１で製造されたｍｓｃＳ３、ｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ａ、ｍｓｃＳ３－Ｌ１０７Ｖ遺伝子導入変異株（ＩＳ３、ＩＳ３－Ａ、ＩＳ３－Ｖ）と、親菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に対して、Ｌ－グルタミン酸の生産性を比較した。
実験例１と同様の方法で菌株を培養してＬ－グルタミン酸の量を測定し、その結果は下記表９の通りである。
前記表９に示すように、コリネバクテリウムグルタミクム変異株ＩＳ３、ＩＳ３－Ａ、ＩＳ３－Ｖは、親菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＴＣ １１５５８ＢＰ菌株に比べて、Ｌ－グルタミン酸の生産性がそれぞれ約９％、１２％、４％ずつ増加したことが確認された。
特に、１０７番目のアミノ酸残基がロイシンからアラニンに置換された場合（ＩＳ３－Ａ）には、アミノ酸残基が置換されていない場合（ＩＳ３）、ロイシンからバリンに置換された場合（ＩＳ３－Ｖ）に比べて、Ｌ－グルタミン酸の生産性が増加したことが分かり、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃ．ｃａｌｌｕｎａｅ）由来のｍｓｃＳ３遺伝子の１０７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸の生産能に関与する重要な位置であることが分かった。
これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれたものと解釈されなければならない。
これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれたものと解釈されなければならない。
Claims (5)
- コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）を含み、Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。
- 前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）およびコリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株。
- 前記機械感受性イオンチャネル遺伝子は、配列番号１～５の塩基配列のいずれか１つに暗号化されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株。
- コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株由来の機械感受性イオンチャネル遺伝子を導入するステップを含む、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造方法。
- ｉ）請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株をＬ－グルタミン酸生産培地で培養するステップと、
ｉｉ）前記変異株または変異株が培養された培養液からＬ－グルタミン酸を回収するステップと
を含むＬ－グルタミン酸の生産方法。
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