BRPI9909409B1

BRPI9909409B1 - processos para produzir um ácido l-glutâmico

Info

Publication number: BRPI9909409B1
Application number: BRPI9909409A
Authority: BR
Inventors: Eiichiro Kimura; Hisao Ito; Jun Nakamura; Kazuhiko Matsui; Mikiko Suga; Osamu Kurahashi; Sohei Kanno; Tsuyoshi Nakamatsu; Tsuyoshi Ohsumi; Yoko Asakura
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2016-03-22
Also published as: TW200504215A; HUP0100045A3; MY130756A; KR20010032426A; TW200504214A; HU225541B1; ATE447039T1; KR100630604B1; EP1033407A4; TWI247805B; US20040002143A1; EP1033407A1; HU224975B1; TW200504213A; WO2000018935A1; CN1170938C; BR9909409A; HUP0100045A2; ES2335828T3; US6962805B2

Abstract

"processo para produzir bactérias corineformes tendo uma melhorada produtividade de aminoácido ou ácido nucleico, genes sintetizando ácido glutâmico, e arginina sintetase, bactérias corineformes produzindo ácido glutâmico, e produzindo arginina, e, processos para produzir um aminoácido ou ácido nucleico por fermentação, e para produzir ácido l-glutâmico por fermentação". um processo para produzir bactérias corineformes tendo uma melhorada produtividade de aminoácido ou ácido nucleico compreende as etapas de introduzir uma mutação em uma seqüência de promotor de genes bio-sintetizando aminoácido ou ácido nucleico em um cromossomo de uma bactéria corineforme para o tornar mais próxima de uma seqüência de consenso ou introduzir uma mudança em uma seqüência de promotor de genes biosintetizando aminoácido ou ácido nucleico em um cromossomo de uma bactéria corineforme por recombinação de genes, para a tornar mais próxima de uma seqüência de consenso, para obter mutantes de microorganismo produzindo aminoácido ou ácido nucleico corineforme, cultivar os mutantes e selecionar um mutante capaz de produzir o aminoácido ou ácido nucleico pretendido em uma grande quantidade. este processo pode construir um mutante capaz de enriquecer ou controlar de modo apropriado a expressão de um gene pretendido sem usar um plasmídeo e também capaz de produzir aminoácidos em um alto rendimento, pela recombinação ou mutação.

Description

"PROCESSOS PARA PRODUZIR UM ÁCIDO L-GLUTÂMICO." Antecedentes da Invenção A presente invenção refere-se a um processo para construir uma cepa mutante capaz de produzir aminoácidos com alto rendimento, e a um processo para produzir L-aminoácidos pela fermentação com o mutante.

Os processos de construção de cepas mutantes utilizáveis para a produção de aminoácidos pela fermentação pode ser grosseiramente classificado em dois processos. Um dos mesmos compreende a introdução de mutações aleatórias em DNA com um mutagene químico, e o outro compreende a recombinação genética. No último processo, uma cepa tendo uma melhorada capacidade para produzir uma substância pretendida pode ser desenvolvida por melhora de um gene na via metabólica com relação à biossíntese de uma substância pretendida, ou por enfraquecimento de um gene de uma enzima com relação à destruição. Nesta conexão, para melhora de um gene pretendido, um plasmídeo capaz de replicar autonomamente independentemente do cromossomo em uma célula foi principalmente usado.

No entanto, o processo para melhorar o gene pretendido com um plasmídeo tem problemas. Particularmente, o grau de enriquecimento do gene pretendido é uma variável dependendo do número de cópias do próprio plasmídeo. Assim, para alguns tipos de genes pretendido, as cópias são com freqüência de número muito elevado e, como resultado, a expressão se toma excessiva, o crescimento é seriamente inibido ou a capacidade de produzir a substância pretendida é abaixada. Em tal caso, apesar do grau de melhora do gene pretendido poder ser abaixada por uso de um plasmídeo de um número pequeno de cópias, a variedade do plasmídeo é limitada em muitos casos, e o controle pretendido do nível de expressão do gene pretendido é impossível.

Outro problema é que porque a replicação do plasmídeo é com frequência instável, o plasmídeo é eliminado.

Por exemplo, o pedido de patente JP publicado, não examinado, (a seguir referido como J.P. KOKAI) no. 61-268185 descreve um DNA recombinante compreendendo um fragmento de DNA contendo um gene produzindo glutamato dehidrogenase (GDH) derivado ide uma bactéria corineforme produzindo glutamato, e um fragmento de DNA (plasmídeo) contendo um gene necessário para a replicação autônoma na célula. Também é aqui descrito que por introdução do DNA recombinante em uma célula, uma cepa enriquecendo GDH pode ser cultivada para melhorar a produção de substâncias (como aminoácidos ou proteínas), com microorganismos.

Por outro lado, na patente JP no. 2 520 895, o DNA recombinante acima descrito é introduzido em Corinebacterium para obter uma cepa tendo a melhorada atividade enzimática, e ácido L-glutâmico é produzido pela fermentação com a cepa. No entanto, a produção e rendimento de ácido L-glutâmico ainda são insatisfatórios. Assim, é demandado ainda melhorar a produtividade de ácido L-glutâmico. É registrado que a demanda foi atingida por introdução de um DNA recombinante compreendendo dois tipos de genes, isto é, um gene produzindo glutamato dehidrogenase derivado de uma bactéria corineforme produzindo glutamato, e um gene ísocitrato dehidrogenase (ICDH), em uma bactéria corineforme produzindo glutamato.

Além disso, JP Kokai No. 6-502548 descreve um sistema de expressão e um sistema de secreção de Corynebacterium compreendendo uma cepa de Corynebacterium e um cassete secretório compreendendo a primeira seqüência de DNA funcional para a expressão na cepa, a segunda seqüência de DNA codificando para aminoácidos, polipeptídeos e/ou proteínas e a terceira seqüêncía de DNA inserida entre a primeira seqüência de DNA e a segunda seqüêncía de DNA, em que a terceira seqüência de DNA codifica o elemento de proteína selecionado dentre PS1 e PS2 que garante a secreção dos aminoácidos, polipeptídeos e /ou proteínas. Especifícamente, a secreção de polipeptídeos é descrita aqui e particularmente mutagenese de NTG foi conduzida com Corynebacterium e um mutante resistente a 4-fluoroglutamato (4FG) que é um análogo a glutamato é selecionado e submetido à transformação com PCGL141. Descreve-se aqui que uma cepa tendo uma expressão melhorada de GDH pode ser obtida da bactéria resistente análoga. É também descrito aqui que uma mutação foi observada na seqüência de nucleotídeos no. 251 a 266 de promotor GDH.

Descrição da Invenção O objeto da presente invenção é prover um processo para construir um mutante capaz de melhorar ou controlar de modo apropriado a expressão de um gene pretendido sem usar um plasmídeo e também capaz de produzir aminoácidos em um alto rendimento, por recombinação de gene ou mutação.

Outro objeto da presente invenção é prover um promotor para GDH capaz de conferir uma capacidade de produzir ácido glutâmico em um alto rendimento a uma cepa Corynebacterium sem aumentar de modo sério a quantidade de ácido aspártico sub-produzido e alanina.

Ainda outro objeto da presente invenção é prover gene GDH tendo uma seqüência do promotor acima descrito para GDH.

Um outro objeto da presente invenção é prover uma cepa Corynebacterium tendo o gene acima descrito e capaz de produzir ácido L-glutâmico.

Um outro objeto da presente invenção é prover um processo para produzi aminoácidos por fermentação em que o microorganismo produzindo aminoácido assim construído é usado.

Um outro objeto da presente invenção é prover um processo de fermentação para produzir ácido glutâmico em um baixo custo por aumento do rendimento de ácido glutâmico por uso de bactéria corineforme produzindo ácido glutâmico. A presente invenção foi completada com base em uma descoberta de que os problemas acima descritos podem ser resolvidos de modo eficiente por variação da modificação do promotor de genes bio-sintetizando aminoácidos em um cromossomo para controlar a quantidade da expressão dos genes pretendidos. Particularmente, a invenção foi completada com base em uma descoberta de que o problema acima descrito pode ser resolvido de modo eficiente por introdução de uma mutação específica na região 35 ou região 10. que é uma região específica do promotor.

Ou seja, a presente invenção provê um processo para produzir bactéria corineforme tendo uma melhorada produtividade de aminoácido ou ácido nucleico, que compreende as etapas de introduzir mutações em uma seqüência de promotor de genes bio-sintetizando aminoácido ou ácido nucleico em um cromossomo de bactéria corineforme para a tomar próxima de uma seqüência de consenso ou introduzir uma mudança em uma seqüência de promotor de genes bio-sintetizando aminoácido ou ácido nucleico, em um cromossomo de uma bactéria corineforme por recombinação de genes para o tomar mais próximo de uma seqüência de consenso, para obter mutantes do microorganismo produzindo aminoácido ou ácido nucleico corineforme, cultivando os mutantes, e selecionando um mutante capaz de produzir o aminoácido ou ácido nucleico pretendido em uma grande quantidade. A presente invenção também provê um promotor para gene produzindo glutamato dehidrogenase (GDH), que tem a seqüência de (i) pelo menos uma seqüência de DNA selecionada dentre o grupo consistindo de CGGTCA, TTGTCA, TTGACA e TTGCCA na região 35, (ii) seqüência TATAAT ou a mesma seqüência TATAAT mas em que a base de ATAAT é substituída por outra base na região-10, ou (iií) uma combinação de (i) e (ii), em que a seqüência não inibe a função de promotor. A presente invenção também provê um gene produzindo glutamato dehidrogenase tendo o promotor acima descrito. A presente invenção também provê um microorganismo produzindo L-glutamato corineforme tendo o gene acima descrito. A presente invenção também provê um processo para produzir um aminoácido por fermentação, que compreende as etapas de cultivar uma bactéria corineforme construída pelo processo acima descrito e tendo uma melhorada capacidade de produção de aminoácido em um meio para formar e também para acumular o aminoácido pretendido no meio, e coletar o aminoácido do meio. A presente invenção também provê um processo para produzir ácido L-glutâmico por fermentação, quê compreende as etapas de cultivar um microorganismo produzindo ácido L-glutâmico corineforme resistente a ácido 4-fluoroglutâmico em um meio líquido para formar e também para acumular ácido L-glutâmico no meio, e coletar o ácido L-glutâmico do meio.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra um fluxo de construção de gene GDH tendo um promotor mutante. A figura 2 mostra um fluxo de construção de gene CS tendo um promotor mutante. A figura 3 mostra um fluxo de construção de um vetor shuttle tendo lacZ como um gene repórter.

Melhor Modo de Realizar a Invenção O termo "microorganismo produzindo ácido glutâmico corineforme" como usado aqui inclui também bactérias que foram classificadas para o gênero Brevibacterium antes mas agora integrada no gênero Corynebacterium {Int. J. Syst. Bacteriol. 41,255 (1981), e também bactérias do gênero Brevibacterium que são muito próximas das do gênero Corynebacterium. Assim, os mutantes usados na presente invenção podem ser derivados de bactérias produzindo ácido glutâmico corineforme de gênero Brevibacterium ou Corynebacterium mostrados abaixo. As bactérias do gênero Corynebacterium e as do gênero Brevibacterium serão coletivamente referidas como "bactérias corineformes" desde que não se apliquem à produtividade de ácido glutâmico.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium calfunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium roseum ATCC13825 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310(FERM 9246) Os aminoácídos a serem produzidos não são particularmente limitados desde que os genes com relação à biossíntese e promotores dos mesmos tenham sido elucidados. Exemplos de enzimas efetivas com relação a biossíntese incluem GDH, citrato sintase (CS), isocitrato dehidrogenase (ICDH), piruvato dehidrogenase (PDH) e aconitase (ACO) para fermentação de ácido glutâmico.

Enzimas para fermentação de lisina incluindo biossíntese de enzimas como aspartato quinase (AK), dihidrodipicolinato sintase, dihidrodipicolinate reductase, diaminopimelato dehidrogenase e diaminopimelato decarboxilase são também efetiva. A proteína lisina eccrise (gene lysE) com relação à ecrrise de membrana de lisina é também efetiva.

As enzimas efetivas para fermentação de arginina incluem N-acetilglutamato sintase, N-acetilglutamato quinase, N-acetilglutamil Fosfato reductase, acetilomitina aminotransferase, N-acetilomitinase, omitina carbamiltransferase, argininosuccinato sintase, e arginosuccinase. Arginina é formada pela reação catalisada pelas enzimas. Estas enzimas são efetivas. Estas enzimas são codificadas por enzimas argA, argB, argC, argD, aegE, argF, argG e argH, relativamente .

As enzimas efetivas para fermentação de serina incluem ácido 3-fosfoglicérico dehidrogenase, fosfoserina trans-amilase, fosfoserina fosfatase e outras.

As enzimas como deoxiarabinohepturonico fosfato síntetase, 3-dehidroquinato sintetase, ácido 3-dehidroquinico dehidroratase, ácido shiquímico dehidrogenase, shiquimico quinase, ácido 5-enol pirvilshiquimico-3-fosfate sintetase, ácido corismíco enzima sintética, corismato sintetase, corismato mutase, prefenato dehidroratase, e outras . As metabólicas enzimas de açúcar, como transcetorase, transaldolase, enzima sintética de ácido fosfoenolpirúvico são também efetivas..

As efetivas enzimas para fermentação de triptofano incluem enzimas pertencendo a triptofano operon, além de várias enzimas efetivas na fermentação de fenilalanina acima descrita e várias enzimas efetivas na fermentação de serina acima mencionada.

As efetivas enzimas para fermentação de prolina incluem-(glutamilquinase, γ-glutamilcemialdeído dehidrogenase, pirrolina-5-carboxilato reductase, além de várias enzimas efetivas na acima mencionada fermentação de ácido glutâmico.

As efetivas enzimas para fermentação de glutamina incluem glutamina sintetase, além de várias enzimas efetivas na acima mencionada fermentação de ácido glutâmico.

Na produção de inosina, considera-se como sendo utilizável melhorar a expressão de 5-fosforibosil 1-difosfato sintetase, 5-fosforibosil 1-difosfato aminotransferase, fosforibosilaminoimidazolcarboxamida formiltransferase e outras.

Na produção de guanosina, considera-se utilizável melhorar a exemplo de dehidrogenase de ácido 5-inosínico, e ácido 5f-xantilíco aminase além de 5-fosfolibosiI-1-difosfato sintetase, 5-fosfoIibosiI I-difosfato aminotransferase, fosforibosilaminoimidazolcarboxamida formiltransferase e outras.

Na produção de adenosina, é considerado como sendo utilizável a expressão de adenirosuccinato sintase, além de enzima sintética 5-fosforibosil 1-ácido difosfórico, ácido 5-fosforibosil 1-difosfórico aminotransferase, fosforibosilaminoimidazol-carboxamida formiltransferase e outras.

Na produção de nucleotídeos, é considerado como sendo utilizável a expressão de fosforibosil transferase, inosina quinase, guanosina quinase e adenosina quinase.

Na presente invenção, um mutante de uma bactéria corineforme produzindo aminoácido é obtido, por introdução de uma mutação na seqüência de promotor de desejados genes de biossíntese de aminoácido em um cromossoma de uma bactéria produzindo aminoácido corineforme, como a seqüência de promotor acima descrita para GDH, para a tomar mais próxima de uma seqüência de consenso com um químico ou por introdução da mutação por recombinação genética para obter um mutante do microorganismo produzindo aminoácido corineforme. O termo "seqüência de consenso" é uma seqüência que parece com maior frequência em várias sequências de promotor. Estas seqüências de consenso incluem, por exemplo, as em E. coli e Bacillus subtilis. A seqüência de consenso de E. coli é descrita em Diane K. Hawley e William R. McClure Nuc. Acid. Res. 11-2237-2255 (1983), e de B. subtilis é descrita em Charles et al Mol. Gen. Genet. 186: 339-346 (1982). A mutação pode ser causa por ou somente uma seqüência de promotor como a para GDH ou duas ou mais seqüências de promotor como as para GDH, citrato sintase (enzima sintetizando citrato) (CS) e isocitrato dehidrogenase (enzima sintetizando isocitrato) ((ICDH).

Na presente invenção, o mutante assim obtido é cultivado para obter o mutante capaz de produzir uma grande quantidade de um aminoácido pretendido. Já foi elucidado que na fermentação de ácido glutâmico, GDH derivado de um microorganismo produzindo glutamato corineforme tem sua própria seqüência de promotor na região a montante da mesma (Sham et al, Molecular Microbiology (1992), 6,317-326).

Por exemplo, o promotor para GDH da presente invenção, gene GDH tendo a seqüência de promotor para GDH e cepa Corynebacterium produzindo L-glutamato tendo este gene podem ser obtidos, por exemplo, pelos seguintes processos.

Ou seja, a cepa é submetida a um tratamento de mutagenese como a irradiação com UV, raios X ou radiação, ou tratamento com um mutagene para obter uma cepa resistente a ácido 4-fluoroglutâmico em um meio de cultura de placa agar contendo ácido 4-fluoroglutâmico. Ou seja, as células mutageneizadas são espalhadas nas placas agar do meio de cultura contendo ácido 4-fluoroglutâmico em tal concentração que inibe o crescimento do originário, e o mutante assim cultivado é separado.

Além disso, a seqüência de promotor dos genes GDH pode ser substituída com sequências modificadas de vários modos, pela mutagênese dirigida ao sítio, e a relação entre as seqüências respectivas e a atividade GDH é examinada de modo a selecionar as tendo uma alta produtividade de L-glutamato. É particularmente preferido na presente invenção que a região 35 na sequência de DNA do promotor para gene produzindo GDH é pelo menos uma seqüência de DNA selecionada dentre o grupo consistindo de CGGTCA, TTGTCA, TTGACA E TTGCCA e/ou a seqüência de DNA na região 10 do promotor é TATAAT, ou as bases de ATAAT em seqüência TATTAT na região 10 é substituída com outra base, enquanto elas não inibem a função de promotor. A razão porque a cepa em que as bases de seqüência ATAAT em TATAAT na região-10 é substituída com outra base e a função de promotor não é inibida pode ser selecionada como a seguir: porque um aumento notável na atividade específica de GDH foi observado por mera substituição do primeiro "C" de CATAAT com "T" na seqüência-10 tipo selvagem, (referir a p6-4 na tabela 1), foi considerado que esta substituição com outra base é possível. A seqüência de promotor de gene GDH é descrita em, por exemplo, Sahm et al, Molecular Microbiology (1992) 6, 317-326, acima descrito, É descrita aqui como SEQ ID NO: 1. A seqüência do próprio gene GDH é também descrita por Sahm et al, Molecular Microbiology (1992) 6, 317-326 como sendo a SEQ ID NO: 1.

Similarmente, a mutação pode ser introduzida no promotor para enzima sintetizando citrato (CS) ou isocitrato dehidrogenase (ICDH).

Assim, os promotores para GDH são os tendo pelo menos uma seqüência de DNA na região-10 selecionada dentre o grupo consistindo de CGGTCA, TTGTCA, TTGACA e TTGCCA na região-35 e/ou a seqüência TATAAT ou a seqüência TATAAT mas em que a base de ATAAT é substituída com outra base, em que elas não inibem a função de promotor. Os genes para produzir glutamato dehidrogenase, que tem o promotor acima descrito, são também providos.

Os promotores para CS são os tendo seqüência TTGACA na região-35 e/ou seqüência TATAAT na região-10, que não inibem a função de promotor. Os genes CS tendo o promotor acima descrito são também providos.

Os promotores para ICDH são os tendo seqüência TTGCCA ou TTGACA no primeiro ou no segundo promotor na região-35 e/ou seqüência TATAAT no primeiro ou no segundo promotor na região-10, que não inibem a função do promotor. Os genes icd tendo o promotor acima descrito são também providos.

Os promotores para PDH são os tendo seqüência TTGCCA na região-35 e/ou seqüência TATAAT na região-10, que não inibem a função do promotor. Os genes PDH tendo o promotor acima descrito são também providos. A presente invenção também provê bactéria corineforme produzindo glutamato, tendo os genes acima descritos.

Os promotores para algininosuccinato sintase são os tendo pelo menos uma seqüência de DNA selecionada dentre o grupo consistindo de TTGCCA, TTGCTA e TTGTCA na região-35 e/ou a seqüência TATAAT na região-10, ou a base de ATAAT na seqüência TATTAT é substituída com outra base, que não inibe a função do promotor. Os genes argininosuccinato sintases tendo o promotor acima descrito são também providos. A presente invenção também provê bactéria corineforme produzindo arginina tendo os gentes acima descritos.

Aminoácidos podem ser obtidos por cultivo de uma bactéria corineforme da presente invenção, que provê um aminoácido, preferivelmente ácido L-glutâmico, em um meio de cultura líquido, para formar e assim acumular o aminoácido pretendido, preferivelmente ácido L-glutâmico, e coletar o aminoácido do meio de cultura. O meio de cultura líquido usado para cultivar a cepa acima descrita da bactéria na presente invenção é um meio de nutrição comum contendo fontes de carbono, fontes de nitrogênio, saís inorgânicos, fatores de crescimento, etc.

As fontes de carbonos incluem carboidratos, como glucose, frutose, sacarose, melaços, e hidrolisados de amido, álcoois como etanol e glicerol, e ácidos orgânicos como ácido acético. As fontes de nitrogênio incluem sulfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio, amônia, peptona, extrato de carne, extrato de levedura, e licor de milho. Quando se usa um mutante auxotrófico, as substâncias requeridas são adicionadas ao meio como reagentes ou substâncias naturais contendo os mesmos. A bactéria corineforme geralmente produz ácido L-glutâmico sob condição de biotina reduzida. Assim, a quantidade de biotina no meio é limitada ou uma substância inibindo o efeito de biotina como um tensoativo ou penicila é adicionado. A fermentação é preferivelmente conduzida por agitação da cultura ou agitação da cultura com aeração enquanto o pH da cultura líquida é mantido na faixa de 5 a 9 durante 2 a 7 dias. O pH é preferivelmente controlado com uréia, carbonato de cálcio, amônia gasosa, água amônia ou outros. A temperatura da cultura é preferivelmente 24 a 37 °C. O ácido L-glutâmico assim produzido e acumulado no líquido de cultura é coletado por um processo comum como processo de resina de troca de íons ou processo de cristalização. Especificamente, ácido L-glutâmico é separado pela adsorção ou uma resina de troca de ânions ou por cristalização com neutralização.

De acordo com a presente invenção, o aminoácido pretendido pode ser obtido em um alto rendimento por introdução de uma mutação na região de promotor de genes biossintetizando aminoácido de uma bactéria corineforme produzindo aminoácido para controlar a expressão dos genes pretendidos. Além disso, porque qualquer eliminação do gene pretendido não ocorre na bactéria, de acordo com a presente invenção, contrário aos casos usando plasmídeo, o aminoácido pretendido pode ser obtido de modo estável em um alto rendimento. Assim, o mérito industrial da invenção é grande. A presente invenção provê vários promotores, particularmente promotores para GDH, capazes de conferir uma força de produzir aminoácidos, particularmente ácido glutâmico, em um alto rendimento para cepas de Coiynebacterium sem aumentar a quantidade de ácido aspártico e alanina sub-produzidos.

Na presente invenção, uma bactéria corineforme produzindo L-glutamato é mutageneizada, uma cepa em que a mutação introduzida em uma região de promotor de gene GDH e que é resistente a ácido 4-fluoroglutâmico é coletado, e a cepa é cultivada para obter ácido glutâmico em um alto rendimento. Assim, a presente invenção é industrialmente muito vantajosa.

Os seguintes exemplos ainda irão ilustrar a presente invenção. Exemplo 1-Produção de um promotor GDH mutante Um promotor GDH mutante foi preparado pelo processo de mutagênese dirigida ao sítio como a seguir: (1) Preparação de genes GDH tendo vários promotores mutantes A seqüência tipo selvagem na região-35 e região-10 de um promotor de gene GDH de uma bactéria corineforme é mostarda na seqüência 1. A seqüência de promotor de tipo selvagem já foi registrada (Molecular Microgiology, (1992), 6, 317-326). O processo para preparar um plasmídeo contendo o gene GDH tendo um promotor mutante é como a seguir.

Como mostrado na figura 1, um gene cromossômico de uma cepa tipo selvagem de uma bactéria corineforme ATCC 13869 preparado com "kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp.) foi usado como um gabarito para PCR. A amplificação do gene foi conduzida por PCR usando seqüências a montante e a jusante de gene GDH. Ambas as terminações foram terminadas cegas. O produto assim obtido foi inserido no sítio Smal de plasmídeo pHSG399 (um produto da Takara Shuzo Co., Ltd.). Então, uma origem de replicação tomada de plasmídeo pSAK4 tendo a origem de replicação capaz de replicar em uma bactéria corineforme foi introduzida em sítio Sal I de plasmídeo para obter plasmídeo pGDH. Por este processo, os genes GDH tendo cada a seqüência de promotor acima descrita pode ser obtido usando um iniciador tendo cada um da seqüência de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6 mostrada na Listagem da Seqüência, como o iniciador a montante para gene GDH, respectivamente. Foi confirmado por sequenciamento do fragmento de PCR amplificado que qualquer mutação, diferente da mutação introduzida na seqüência de promotor, não ocorreu no fragmento amplificado. pSAK4 é construído como a seguir: plasmídeo previamente obtido pHK4'(J.P. Kokai no. 5-7491) tendo uma origem de replicação autônoma derivada de plasmídeo pHM1519 (Agric. Biol. Chem. 48, 2901-1903 (1984)), que é capaz de replicar de modo autônomo em microorganismo Corynebacterium, é digerida com enzimas de restrição BamHI e Kpnl para obter um fragmento de DNA tendo a origem de replicação. Então, o fragmento assim obtido é terminado cego com kit de DNA (kit de cegamento de Takara Shuzo Co., Ltd.). Após a ligação com um ligador Sall, o produto assim obtido foi inserido no sítio Sal I de pHSG299 (um produto da Takara Shuzo Co., Ltd.) para obter plasmídeo pSAK4. (2) Comparação dos graus de expressão de GDH tendo cada seqüência de promotor Cada plasmídeo preparado como descrito acima foi introduzido em cepa tipo selvagem de bactéria corineforme ATCC13869 por processo de eletroporação (referir a J.P. Kokai No. 2-207791. Para comparar os graus de expressão de GDH para estas cepas, a atividade específica de GDH foi determinada pelo processo acima descrito de Sahm et al. Os resultados são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 ATCC13869/p6-2 a ATCC 13869p6-8 correspondeu às seqüências de SHQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 6, respectivamente. Estas seqüências foram iguais que a seqüência no. 1 (tipo selvagem) exceto que as partes sublinhadas foram mudadas como a seguir Seqüência No. 1 ς ' -TT»aTTrTTTfiTf;c;Tr.a.TaTCTGCGACACTGC CATAAITTGAACGT-3 T

2 CGGTCA CATAAT 3. TGGTCA ΤΑΤΑΑΓ 4. TTGACA TATAA.T

5. TTGCCA TATAAT

6. TTGTCA TATATT

Estas foram as de DNA de filamento duplo linear, sintético. Exemplo 2-preparação de cepas mutantes (1) preparação de cepas mutantes resistentes a ácido 4-fluoroglutâmico ΑΠ3029 é uma cepa mutante produzindo ácido glutâmico descrita em WO96/06180. Apesar de não produzir ácido glutâmico como em uma temperatura de cultura de 31,5 °C, produz ácido glutâmico mesmo na ausência de um inibidor de biotina quando a temperatura de cultura é mudada para 37 °C. Neste exemplo, cepa de Brevibacterium lactofermentum AJ13029 foi usada como a cepa originária para preparar as cepas mutantes. Como uma questão, qualquer uma das cepas produzindo ácido glutâmico diferente de aJ 13029 pode ser usada como uma cepa originária para preparar cepas mutantes resistentes a ácido 4-fluoroglutâmico. AJ 13029 foi cultivado em um meio agar CM2B (Tabela 2) a 31,5 °C durante 24 h para obter as células bacterianas. As células foram tratadas com 250 μg/ml de solução aquosa de N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina a 30 °C durante 30 min. Então, uma suspensão de células tendo uma taxa de sobrevivência de 1 % 'foi espalhada em meio de cultura em placas agar (tabela 3) contendo ácido 4-fluoroglutâmico (4FG). As colônias foram formadas após incubação da placa a 31,5 °C durante 20 a 30 h. nesta experiência, um meio contendo 1 mg/ml de 4FG foi preparado primeiro, e então uma camada de mesmo meio sem 4EG foi formada de modo horizontal. Assim, o gradiente de concentração de 4FG foi obtido na superfície de meio agar. Quando a placa foi inoculada com as células mutantes obtidas como descrito, uma linha de limite foi formada na borda do limite de crescimento da cepa. As cepas bacterianas que formaram colônias em uma área contendo 4FG de uma concentração maior do que da linha de limite foram tomadas. Assim, cerca de 50 cepas resistentes a 4FG foram obtidas de cerca de 10.000 células mutageneizadas.

Tabela 2-Meio agar CM2B Tabela 3 Meio de agar (2) Confirmação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico de cepas mutantes resistentes a 4FG A capacidade de produção de ácido glutâmico de cerca de 50 cepas mutantes obtidas em (1) acima e cepa AJ13029 originária foi confirmada como abaixo descrito.

Cepas AJ 13029 e mutante foram cada cultivadas em meio de agar CM2B a 31,5 °C durante 20 a 30 h. Um meio líquido tendo uma composição mostrada como "meio A" na tabela 4 foi inoculado com as células assim obtidas, e a cultura de agitação foi iniciada a 31,5 °C. Após 22 h, o meio novo foi adicionado de modo que a concentração final deve ser a de meio B como descrito na tabela 4. A temperatura foi trocada a 37 °C, e então a cultura foi continuada por mais cerca de 24 h. Após completar a cultura, a cultura foi examinada com um Biotic Analyzer (um produto de Asahi Chemical Industry Co. Ltd.) para determinar se ácido L-glutâmico foi produzido ou não. Foi ainda verificado que quando as 50 cepas foram cultivadas, duas cepas tendo um rendimento de ácido glutâmico maior do que a obtida das cepas originárias e uma alta atividade GDH foram separadas (cepa A e cepa B). A atividade GDH de cada uma das mesmas foi determinada para encontrar que a atividade de GDH específica de ambos foi aumentada (tabela 5). A atividade GDH foi determinada pelo processo de E. R. Bormarm et al [ Molecular Microbiol. 6, 317-326 (1996)). Por sequenciamento dos genes GDH, foi identificado que os pontos de mutação foram encontrados somente na região de promotor de GDH (tabela 6).

Tabela 4 Tabela 5 formação de ácido glutâmico e atividade GDH de cepas mutantes Exemplo 3-Introdução de mutação em região de promotor de gene GS de bactéria produzindo glutamato corineforme Neste exemplo, uma cepa tendo o promotor melhorado para os genes que codificam glutamato dehidrogenase (GDH) e enzima sintetizando citrato (CS) foi produzida, (1) Clonagem de gene gltA A seqüência de gene gltA de uma bactéria corineforme, que codifica enzima sintetizando citrato, já foi elucidada (Microbial. 140, 181 ΤΙ 828 (1994)). Com base nesta seqüência, os iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 foram sintetizados. Por outro lado, DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi preparado usando o kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced t Genetic Technologies Corp). Agua esterilizada foi adicionada a uma mistura de 0,5 de DNA cromossômico, 10 pmol de cada um dos oligonucleotídeos, 8 μΐ de mistura dNTP (2,5 mM cada), 5 μΐ de tampão Taq lOxLa (Takara Shuzo Co. Ltd.) e 2 U de La Taq (Takara Shuzo Co. Ltd.). para obter 50 μΐ de coquetel de reação PCR. O coquetel de reação foi submetido a PCR. As condições de PCR foram 30 ciclos de desnaturação a 94 °C, durante 30 s, recombinação a 55 °C durante 15 s, e extensão a 72 °C durante 3 s usando ciclador térmico TP240 (Takara Shuzo Co. Ltd.) para amplificar cerca de 3 Kbp de fragmentos de DNA contendo gene gltA e promotor do mesmo. Os fragmentos amplificados assim obtidos foram purificados com SUPREC02 (Takara Shuzo Co. Ltd.) e então terminados cegos. A terminação foi conduzida com kit de Takara Shuzo Co. Ltd.. O fragmento terminado cego foi misturado com pHSG399 (Takara Shuzo Co. Ltd.) completamente digerido com Saml para conduzir a ligação. A reação de ligação foi conduzida com kit de ligação de DNA ver 2 (Takara Shuzo Co. Ltd.). Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co. Ltd.). As células foram espalhadas em placas de meio L (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 5 g/1 de extrato de bacto levedura, 5 g/I de NaCl e 15 g/1 de agar, pH 7,2) contendo 10 pg/ml de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo), 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galactosídeo) e 40 pg/ml de cloranfenicol. Após cultivar durante a noite, as colônias brancas foram tomadas para obter as cepas transformadas após isolamento de colônia único. A partir das cepas transformadas, plasmídeos foram preparados pelo processo alcalino (Seibutsu Kogaji Jikken sho-editado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai e publicado por Baifukan p. 105, 1992). Os mapas de enzima de restrição foram preparados, e o plasmídeo que tem o mesmo mapa que o mapa da figura 2 foi nomeado "pHSG399CS".

(2) Introdução de mutações em promotor gltA

Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo Co. Ltd.) foi usado para a introdução de mutação em região de promotor gltA. O processo é especificamente descrito abaixo. PHSG399CS foi completamente digerido com EcoRI e Sall para obter fragmento EcoRI-Sall contendo genes gltA, que foram ligados ao fragmento obtido por digestão completa de pKF 19kM (Takara Shuzo Co. Ltd.) com EcoRI e Sall. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JM 109 (Takara Shuzo Co. Ltd.). As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias brancas foram tomadas e transformantes obtidos por isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, plasmídeos foram preparados e o plasmídeo contendo gene gltA foi nomeado pKF19CS. PCR foi conduzido usando pKF19CS como o gabarito e DNA sintético 5' fosforilado mostrado na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 junto com o iniciador de seleção de Mutan super Express Km. A transformação foi conduzida com células competentes de E. coli MV 1184 (Takara Shuzo Co. Ltd.) usando produto PCR. As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias foram tomadas e transformantes obtidos por isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, DNA plasmídeo foi preparado. A seqüência de região de promotor gltA foi determinada pelo processo de Sanger (J. Mol. Biol. 143, 161 (1980) usando DNA sintético tendo a seqüência de SEQ ID NO: 12. Especificamente, a seqüência foi determinada pelo kit de sequenciamento de terminador de corante (Applied Biosystems) e analisada pelo analisador genético ABI310 (Applied Biosystems). Os plasmídeos em que região de promotor de gltA foi substituída com a seqüência da tabela 7 foram nomeados pKF19CSl, pKF19CS2 e pKF19CS4, respectivamente.

Tabela 7 -3 5 região -10 região pKF19CS ATGGCT TATAGC

pKF19CSl ATGGCT TATAAC

pKF19CS2 ATGGCT TATAAT

pKFI9CS4 TTGACA TATAAT (3) Construção de plasmídeo gltA mutante pKF19CSl, pKF19CS2 e pKF19CS4, construídos na etapa (2) foram completamente digeridos com Sall e EcoRI (Takara Shuzo Co. Ltd,). Por outro lado, plasmídeo pSFKÓ (pedido de patente JP no. 11-69896) tendo uma origem de replicação derivada de plasmídeo pAM330 que pode replicar de modo autônomo em uma bactéria corineforme (publicação de patente JP para fins de oposição (a seguir referida "J.P.Kokai") no. 58-67699) foi completamente digerido com EcoRJ e Sall. O fragmento obtido foi ligado com fragmento de cerca de 2,5 kb contendo gltA. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JMI09. As células foram espalhadas nas placas de meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 g/ml de X-gal e 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias foram tomadas e transformantes obtidos por isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, plasmídeos foram preparados. Os plasmídeos contendo gene gltA foram nomeados pSFKC, pSFKCl, pSFKC2 e pSFKC4, respectivamente. (4) determinação de expressão CS de plasmídeo gltA mutante em bactéria corineforme O plasmídeo construído na etapa acima (3) foi introduzido em Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Especificamente, este tratamento foi conduzido por processo de pulso elétrico (J.P. Kokai no. 2-07791). Os transformantes foram selecionados a 31 °C com placa de meio CM2B (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 10 g/1 de extrato de bacto-levedura, 5 g/1 de Nacl, 10 pg/l de biotina e '15 g/1 de agar, pH 7,0) contendo 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante dois dias, colônias foram tomadas e transformantes contendo pSFKC, pSFKC 1, pSFKC2 e pSFKC4 foram nomeados BLCS, BLCS1, BLCS2 E BLCS4, respectivamente, após isolamento de colônia única. Um meio tendo a composição da tabela 8 foi inoculado com o transformante. A cultura foi continuada a 31 °C e terminada antes da glucose ter sido completamente consumida. O líquido de cultura foi centrifugado para separar as células. As células foram lavadas com 50 mM solução tampão tris (pH 7,5) contendo 200 m de glutamato de sólido e então suspensas na mesma solução tampão. Após tratamento com som com UD-201 (TOMY), seguido pela centrifugação (10.000 g), as células permaneceram não rompidas foram removidas para obter uma solução de enzima bruta. A atividade de citrato sintase pode ser determinada de acordo com Methods Enzymol. 13, 3-11 (1969). Especificamente, a solução de enzima bruta foi adicionada à mistura de reação contendo 100 mM de Tris-HCl, (pH 8), 0,1 mM, de DTNB, 200 mM de glutamato de sódio e 0,3 mM de acetil CoA, e o fundo foi determinado como o aumento na absorbância a 412 nm a 30 °C, determinado por espectrofotômetro Hitachi U 3210. Além disso, ácido oxaloacético foi adicionado em tal quantidade que concentração final deve ser 0,5 mM. O aumento na absorbância a 412 nm foi determinado, do qual o valor de fundo foi deduzido para determinar a atividade do citrato sintase. A concentração de proteína na solução de enzima bruta foi determinada por teste de proteína (BIO RAD). Albumina de soro bovino foi usada como a proteína padrão. Os resultados são mostrados na tabela 9. Foi confirmado que a atividade de citrato sintase de promotores gltA mutantes foi aumentada em comparação com promotor gltA tipo selvagem.

Tabela 8 Tabela 9 (5) Introdução de gene gltA mutante em plasmídeo sensível a temperatura Para integração de seqüências de promotor gltA mutantes em um cromossomo, um processo é conhecido em que um plasmídeo em que a replicação em bactéria corineforme é sensível a temperatura é usado (J.P. Koaki no. 5-7491). PSFKT2 (pedido de patente JP 11-81693) foi usado como o vetor plasmídeo, cuja replicação em uma bactéria corineforme é sensível a temperatura. PKFCS1, pKFCS2 e pKFCS3 completamente digeridos com Sall e BstPI e terminados cegos foram usados como as seqüências de promotor gltA mutantes. Eles foram ligados a pSFKT2 completamente digerido com Saml. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JM 109 (Takara Shuzo Co. Ltd.) . As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 10 pg/ ml de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias foram tomadas e transformantes obtidos por isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, plasmídeos foram preparados. Os vetores shuttle sensíveis a temperatura contendo gene gltA foram nomeados pSFKTCl, pSFKTC2 e pSFKTC4, respectivamente. (6) introdução de promotor gltA mutante em cromossomo pSFKTCl, pSFKTC2 e pSFKTC4 foram cada introduzidos em Brevibacterium lactofermentum cepa FGR2 por processo de pulso elétrico. Os transformantes foram selecionados em placas de meio CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina a 25 °C. Após introdução de cada plasmídeo, cada cepa obtida foi cultivada em meio líquido CM2B, espalhada em placas CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina, após a diluição a uma concentração de 103 a 105 cfu por placa e cultivadas a 34 °C. A cepa tendo o plasmídeo sensível a temperatura se tomou sensível a canamicina devido à replicação do plasmídeo ser inibida nesta temperatura e, assim não pode formar colônias. Por outro lado, a cepa tendo DNA plasmídeo integrado no cromossomo deve ser selecionada porque formou as colônias. As colônias assim obtidas foram tomadas e separadas em colônias respectivas. DNA cromossômico foi extraído da cepa. PCR foi conduzido por uso de DNA cromossômico como o gabarito e iniciadores de seqüência mostrados na SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 13. Cerca de 13 kb de fragmentos amplificados foram confirmados. Foi assim provado que esta cepa, gene gltA mutante derivado de plasmídeo sensível a temperatura foi integrado próximo do gene gltA no cromossomo hospedeiro por recombinação homóloga. As cepas 'derivadas de pSFKTCl, 2 e 4 foram nomeadas BLCSl 1, BLCS12 E BLCS14, respectivamente. (7) preparação de promotores gltA substituídos Primeiro, cepas sensíveis a canamicina foram obtidas a partir das cepas BLCSl 1, BLCSl2 e BLCSl4 tendo gene gltA mutante integrado na mesma por recombinação homóloga. As cepas tendo plasmídeo integrado foram diluídas e espalhadas em placas CMM2B e então cultivadas a 34 °C. Após formação de colônias, as réplicas das placas foram feitas usando placas CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina e foram cultivadas a 34 °C. Assim, cepas sensibilizadas com canamicina foram obtidas. O cromossomo foi extraído da cepa sensível a canamicina e PCR foi conduzido com iniciadores tendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 para preparar fragmentos de gene gltA. Os fragmentos amplificados assim obtidos foram purificados com SUPRJEC02 (Takara Shuzo Co. Ltd.) e então submetidos a região de sequeciamento usando o íniciador de SEQID NO: 13 para determinar a seqüência na região de promotor do mesmo. Como resultado, a cepa tendo a mesma seqüência de promotor como de pKF19CSl na tabela 7 foi nomeada GB01, a cepa tendo a mesma seqüência de promotor que de pKF19CS2 foi nomeada GB02 e a cepa tendo a mesma seqüência de promotor que de pKF19CS4 foi nomeada GB03. Foi indicado que em todas estas cepas, o gene gltA de tipo selvagem originalmente localizado no cromossomo foi excisado junto com o plasmídeo vetor enquanto o gene gltA mutante introduzido pelo plasmídeo permaneceu no cromossomo quando o plasmídeo e gene gltA duplicado foram excisados do cromossomo. (8) determinação de atividade de citrato sintase de cepas de promotor gltA mutantes: As atividades de citrato sintase foram determinadas por tratamento de cepas FGR2 GB01, GB02, GB03 e FGR2/ pSFKC obtidas na etapa (7) do mesmo modo que de etapa (4). Os resultados são mostrados na tabela 10. Foi confirmado que a atividade de citrato sintase de cepa de promotor gltA substituído foi maior do que de cepas originárias do mesmo.

Tabela 10 (9) Resultados de cultura de cepas de promotor gltA substituídas Cada uma das cepas obtidas na etapa acima descrita (7) foi inoculada em um meio de cultura de semente tendo a composição da tabela 11, e a cultura foi agitada a 31,5 °C durante 24 h. 300 ml do meio de cultura principal tendo uma composição da tabela 11 foram colocados em fermentadores de jarra de vidro de 500 ml e então esterilizados por aquecimento e inoculados por 40 ml de sementes cultivadas como descrito acima. A cultura foi iniciada a uma temperatura de cultura de 31,5 °C enquanto a taxa de agitação e taxa de aeração foram controladas a 800 a 1300 rpm e 1/2 a 1/1 vvm, respectivamente. O pH do líquido de cultura foi mantido a7,5 com amônia gasosa. A temperatura foi trocada a 37 °C durante 8 h após iniciar a cultura. A cultura foi terminada quando glucose tinha sido completamente consumida em 20 a 40 h, e a quantidade de ácido L-glutâmico formada e acumulada no líquido de cultura foi determinada.

Como resultado, a melhor melhora no rendimento de ácido L-glutâmico foi confirmada quando cada uma das cepas GB02 e GB03 em vez de GB01 e FGR2/pSFKC foi usado como descrito na tabela 12. A partir destes fatores, verificou-se que bons resultados foram obtidos por introdução de mutação no promotor gltA para aumentar a atividade CS a 2 a 4 vezes para a melhora do rendimento de ácido glutâmico produzido por estas cepas.

Concentração Tabela 12 Exemplo 4-introdução de mutação em região de promotor de gene ICDH de bactéria produzindo glutamato corineíorme Neste exemplo, cepas tendo melhorados promotores para genes que codificam glutamato dehidrogenase, citrato sintase e isocitrato dehidrogenase foram produzidas. (1) clonagem de gene icd A seqüência de DNA de gene icd de bactéria corineforme, que codifica isocitrato dehidrogenase, já foi elucidada (J. Bacteriol. 177, 774-782 (1995)). Com base nesta seqüência, iniciadores mostrados em SEQID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 foram sintetizados. PCR foi conduzido por uso de DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 como o gabarito para amplificar cerca de 3 Kbp de fragmento de DNA contendo gene icd e promotor do mesmo. O fragmento amplificado assim obtido foi completamente digerido com EcoRI, e misturado com o obtido por completa digestão de pHSG399 (Takara Shuzo Co. Ltd.) com EcoRI para conduzir a ligação. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida usando células competentes de E. coli JM109. As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 40 pg/ml de cloranfenicol. Após incubação durante a noite, as colônias brancas foram tomadas e os transformantes obtidos após isolamento de colônia única. O plasmídeo contendo gene icd foi chamado pHSG399icd. (2) Introdução de mutações em promotor icd O local preciso do promotor do gene icd não foi ainda determinado. A possibilidade de aumentar o nível de transcrição de mRNA de gene icd foi investigada por modificação artificial de seqüência a montante do gene que codifica ICDH na seqüência semelhante a promotor. Especificamente, mutações foram introduzidas na região semelhante a-10 existentes na seqüência de DNA cerca de 190 bp a montante (o primeiro promotor) e cerca de 70 bp (o segundo promotor) a montante do primeiro ATG de proteína ICDH.

Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo Co. Ltd.) foi usado para a introdução de mutação em região a montante do gene icd. O processo é especificamente descrito abaixo. PHSG399icd foi completamente digerido com PstI para obter fragmento PstI contendo o promotor do gene icd. Os fragmentos foram ligados com o fragmento obtido por digestão completa de pKF18kM (Takara Shuzo Co. Ltd.) com PstI. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JM 109 (Takara Shuzo Co. Ltd.). As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias brancas foram tomadas e transformantes obtidos por isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, plasmídeos foram preparados e o plasmídeo contendo o promotor do gene icd foi nomeado pKF18icd. PCR foi conduzido usando pKF 18icd como o gabarito e DNA sintético 5' fosforilado mostrado na SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21, e o iniciador de seleção. Estes produtos PCR foram usados para transformar células competentes de E. coli JM109. As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias foram tomadas e transformantes obtidos por isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, DNA plasmídeo foi preparado e a seqüência de região de promotor icd foi determinada usando o DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 22 pelo processo de Sanger (J. Mol. Biol. 143, 161 (1980). Especificamente, a seqüência foi determinada pelo kit de sequeciamento de terminador de corante (Applied Biosystems) e analisada pelo analisador genético ABI310 (Applied Biosystems). Os obtidos por substituição de região de promotor icd com uma seqüência mostrada na tabela 7 foram nomeados pKF181CDl, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5 e pKF18ICD6m, respectivamente. Dentre estes, pKF18ICD2 foi completamente digerido com PstI para obter o fragmento Pstl contendo o promotor de gene icd. O fragmento foi ligado com o fragmento obtido por digestão de Pstl completa de pKF18kM (Takara Shuzo Co. Ltd.). Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. colí JM109 (Takara Shuzo Co. Ltd.). As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, colônias brancas foram tomadas e as cepas transformadas obtidas por isolamento de colônia única. A partir das cepas transformadas, os plasmídeos foram preparados, e o plasmídeo contendo o promotor de gene icd foi chamado pKF18ICDM2. PCR foi conduzido usando pKF18ICDM2 como o gabarito e DNA sintético 5'-fosforilado mostrado na SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21 e o iniciador de seleção. A transformação de células competentes de E. coli JM109 foi conduzida com o produto PCR. As células foram espalhada em placas de meio L contendo 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, as colônias assim formadas foram tomadas e os transformantes obtidos após isolamento de colônia única. A partir dos transformantes, os DNA plasmídeos foram preparados, e a seqüência de região de promotor icd foi determinada usando DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 22. Os obtidos por substituição de região de promotor icd com a seqüência mostrada na tabela 13 foram nomeados pKF18ICD25 e pKFl 8ICD26, respectivamente.

Tabela 13 (3) Construção de plasmídeo para determinação de atividade de promotor Para facilmente determinar a atividade de promotor, um processo possível é a determinação indireta de atividade de promotor usando um gene repórter. Propriedades desejáveis requeridas do gene repórter são que a atividade pode ser facilmente determinada, que mesmo quando um aminoácido é adicionado para um N-terminal, a atividade não é seriamente abaixada, que a reação de fundo não ocorre e que se tem um sítio de divagem de enzima de restrição apropriado para a manipulação do gene. Porque β-galactosidase (LacZ) de E. coli é amplamente usado com um gene repórter e bactérias do gênero Corynebacterium não tem assimilabilidade de lactose (J. Gen. Appl. Microbiol. 18, 399-416 (1972)), LacZ foi determinado como sendo o gene repórter ótimo. Então, plasmídeo pNEOL contendo LacZ como o gene repórter foi construído (ver figura 3). O processo para a construção é descrito em detalhes abaixo. PCR foi conduzido por uso de DNA de cromossomo obtido de E coli ME8459 (ME8459 foi depositado com o National Institute of Genetics (Japão)) como o gabarito com DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 23 e SEQID NO: 24 como o iniciador. O produto PCR foi completamente digerido com Saml e BamHI e então ligado com fragmentos obtidos por digestão de pKF3 (Takara Shuzo Co. Ltd.) com HindIII e terminado cego. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co. Ltd.) . As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, as colônias assim formadas foram tomadas e separadas em colônias respectivas para obter a cepa transformada. O plasmídeo obtido da cepa transformada foi chamado pKF3nptII. Então, este plasmídeo foi digerido com SalL Por outro lado, pSAK4 descrito no exemplo 1(1) foi completamente digerido com Saml e Sall e terminado cego. Estes fragmentos foram ligados juntos para construir um vetor shuttle pNEO que pode replicar em uma bactéria corineforme. Este plasmídeo é capaz de conferir uma resistência a cloranfenical e resistência a canamicina aos hospedeiros. Além disso, pNEO foi completamente digerido com Saml e Sse8387I. Os fragmentos resultantes foram ligados aos obtidos por completa digestão de pMC1871 (Farmacia Biotech) com PstI e Saml. O vetor Shuttle pNEOL que pode ser replicado em uma bactéria corineforme e tendo LacZ faltando 8 aminoácidos em N-terminal como o gene repórter foi construído (ver figura 3). (4) Determinação de atividade de promotor icd mutante Os plasmídeos tendo promotor icd mutante construído na etapa acima descrita (2), isto é, pKF18ICDl, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, pKF18ICD26, e pKFISICD, foram completamente digeridos com SacII e PstI e então terminados cegos. Eles foram ligados com fragmento obtido por digestão de pNEOL com Smal. Após completar a ligação, a transformação foi conduzidas com células competentes de E. coli JM109. As células foram espalhadas em placas de meio L contendo IPTG, X-Gal e 40 pg/ml de cloranfenicol. Após incubação durante a noite, as colônias de cor azul foram tomadas e as cepas transformadas foram obtidas por isolamento de colônia única. A partir das cepas transformadas, os plasmídeos foram preparados. Os plasmídeos tendo uma estrutura capaz de produzir uma proteína fundida de ICDH e LacZ foram chamadas pNEOICDl, pNEOICD2, pNEOICD3, pNEOICD4, pNEOICD5, pNEOICDb, pNEOICD25, pNEOICD26 e pNEOICD, respectivamente. Cada um dos três plasmídeos ou pNEOL foram introduzidos em Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 por processo de pulso elétrico. Os transformantes foram selecionados por uso de placas de meio CM2B (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 10 g/1 de extrato de bacto-levedura, 5 g/1 de Nacl, 10 pg/l de biotina e '15 g/1 de agar, pH 7,0) contendo 25 pg/ml de canamicina e 40 pg/ml de X-Gal a 31 °C durante dois dias. Após completar a introdução, as colônias assim formadas foram tomadas e isoladas como colônias únicas. Os transformantes contendo pNEOICDl, pNEOICD2, pNEOICD3, pNEOICD4, pNEOICDS, pNEOICDÓ, pNEOICD25, pNEOICD26 e pNEOICD, foram chamados BLAC1, BLAC2, BLAC3, BLAC4, BLAC5, BLAC6, BLAC25, BLAC26 e BNEOL, respectivamente. Todos os transformantes diferentes de BNEO formaram colônias de cor azul. As soluções de enzima bruta foram preparadas a partir de transformantes do mesmo modo que na etapa (e) no exemplo 3 exceto que "tampão Z (compreendendo 10 mM de KCI, 1 mM de MgS04, 270 pg/ 100 mM de 2-ME e NaPi e tendo pH 7,5), foi usado como um tampão de lavagem e suspensão. A atividade de LacZ foi determinada como a seguir: tampão Z foi misturado com a solução de enzima bruta, ONPG em tampão Z tendo a concentração final de 0,8 mg/ml foi adicionado à mistura resultante, e o aumento na absorbância a 420 nm a 30 °C foi determinado com espectrofotômetro Hitachi U-3210 como a atividade de LacZ. A concentração de proteína na solução de enzima bruta foi determinada por teste de proteína (BIORAD). A albumina de soro bovino foi usado como a proteína padrão. Os resultados são mostrados na tabela 14. Foi confirmado que a atividade LacZ da cepa tendo uma mutação no promotor icd e expressando a proteína fundida ICDH-LacZ foi maior do que a expressando a proteína fundida ICDH-LacZ tipo selvagem.

Tabela 14 (5) Introdução de gene icd mutante em plasmídeo sensível a temperatura O vetor plasmídeo pSFKT2 (pedido de patente JP 11-81693), cuja replicação em uma bactéria corineforme foi sensível a temperatura foi usado. pKF18ICDl, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25 e pKF18ICD26 foram completamente digeridos com PstI e os fragmentos obtidos foram usados como as sequências de promotor icd mutantes. Os fragmentos assim obtidos foram ligados com pSFKT2 completamente digerido com PstI. Após completar a ligação, a transformação foi conduzida com células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo Co. Ltd.). As células foram espalhadas em placas de meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal e 25 pg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite, as colônias brancas foram tomadas e as cepas transformadas foram obtidas após isolamento de colônia única. Das cepas transformadas, os plasmídeos foram preparados. Os vetores shuttle sensíveis a temperatura contendo promotor icd foram chamados pSFKTIl, pSFKTI2. PSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTIÓ, pSFKTI25 e pSFKTI26, respectivamente. (6) Integração de promotor icd mutante em cromossomo Os plasmídeos construídos na etapa acima descrita (5) foram cada introduzidos em Brevibacterium lactofermentum cepa GB02 por processo de pulso elétrico. Os transformantes foram selecionados com meio CM2B (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 10 g/1 de extrato de bacto-levedura, 5 g/1 de Nacl, 10 pg/l de biotina e '15 g/1 de agar, pH 7,0) contendo 25 pg/ml de canamicina a 25 °C. Após completar a introdução, as cepas obtidas foram cultivadas em meio líquido CM2B, espalhadas em placas CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina após a diluição a uma concentração de 103 a 105 cfu por placa e cultivadas a 34 °C. A cepa tendo o plasmídeo sensível a temperatura se toma sensível a canamicina devido à réplicação do plasmídeo ser inibida nesta temperatura e, assim, não pode formar colônias. Por outro lado, a cepa tendo DNA plasmídeo integrado no cromossomo deve ser selecionada porque pode formar colônias. As colônias assim obtidas foram tomadas e separadas em colônias isoladas. O DNA de cromossomo foi extraído da cepa e PCR conduzido por uso de DNA cromossômico como o gabarito com iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15. Cerca de 3 kb de fragmentos amplificados foram confirmados. Foi assim provido que, nesta cepa, gene icd mutante derivado de plasmídeo sensível a temperatura foi integrado próximo do gene icd em cromossomo hospedeiro por recombinação homóloga. (7) Preparação de cepas tendo promotor icd substituído Primeiro, cepa sensível a canamicina foi obtida das cepas tendo gene icd mutante integrado ai pela recombinação homóloga como descrito acima na etapa (6). As cepas tendo o plasmídeo integrado foram diluídas e espalhadas em placas CM2B e então cultivadas a 34 °C. Após a formação de colônias, réplicas foram feitas em placas CM2B contendo 25 pg/tnl de canamicina, e elas foram incubadas a 34 °C. Assim, cepas sensíveis a canamicina foram obtidas. O cromossomo foi extraído da cepa resistente a canamicina e PCR foi conduzido usando iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 14, e SEQ ID NO: 15 para preparar fragmentos de genes icd. Os fragmentos ampliados assim obtidos foram purificados com SUPREC02 (Takara Shuzo Co. Ltd.) e então submetidos a reação de sequeciamento usando um iniciador mostrado em SEQ ID NO: 22 para determinar a seqüência de região de promotor do mesmo. Como resultado, cepas tendo seqüências de promotor icd derivadas de pSFKTIl, pSFKTI2, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTIÓ, pSFKTI25 e pSFKTI26 foram chamadas GCOl, GC02, GC03, GC04, GC05, GC06, GC25 e GC26, respectivamente. Nestes cepas, quando o plasmídeo e gene icd duplicado foram excisados do cromossomo, o gene icd de tipo selvagem originalmente localizado no cromossomo foi excisado junto com o plasmídeo vetor, enquanto o gene icd mutante introduzido pelo plasmídeo permaneceu no cromossomo, (8) Determinação de atividade de isocítrato dehidrogenase das cepas mutantes tendo promotor icd mutante: Solução de enzima bruta ICDH foi preparada usando cada uma das 8 cepas obtidas na etapa acima descrita (7) e cepa GB02 do mesmo modo que na etapa (7) no exemplo 3. As atividades ICDH foram determinadas como a seguir. A solução de enzima bruta foi adicionada a uma solução de reação contendo 35 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 mM de MnS04, 0,1 mM de NADP, e 1,3 mM de ácido isocítrico, e o aumento na absorbância a 340 nm a 30 °C foi determinado com espectrofotômetro Hitachi U-3210 como a atividade de IcDH. A concentração de proteína na solução de enzima bruta foi determinada por teste de proteína (BIO-RAD). A albumina de soro bovina foi usada como a proteína padrão. Os resultados são mostrados na tabela 15. Foi confirmado que a atividade de isocitrato dehidrogenase de cepas de promotor icd substituídas foi maior do que a da cepa originária.

Tabela 15 (9) Resultados do cultivo de cepas contendo promotor icd substituído Cada uma das 8 cepas obtidas na etapa acima descrita (7) foi cultivada do mesmo modo que na etapa (9) no exemplo 3. Como resultado, a melhora no rendimento de ácido L-glutâmico foi confirmada quando qualquer uma das cepas GC02, GC04, GC05, GC25 e GC26 foi usada como descrito acima na tabela 16. Verificou-se que bons resultados foram obtidos por introdução de mutação em promotor icd para aumentar a atividade ICDH em pelo menos 3 vezes.

Tabela 16 Exemplo 5-Introdução de mutação em região de promotor de gene PDH de bactéria produzindo glutamato corineforme (1) Clonagem de gene pdhA de bactéria corineforme Os iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 foram sintetizados por seleção de regiões tendo uma alta homologia dentre subunidades ΕΪ de piruvato dehidrogenase (PDH) de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Mycobacterium tuberculosis. PCR foi conduzido por uso de cromossomo de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, preparado com um kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp) como o gabarito sob condições de reação padrões descritas na página 8 de PCR Technology (ed. Por H. Erlich e publicado por Stockton Press, 1989). A solução de reação foi submetida à eletroforese em gel agarose para verificar que cerca de 1,3 quilobases de fragmento de DNA foram amplificadas. A seqüência de ambas as terminações de DNA obtido foi determinada com DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. A seqüência foi obtida pelo processo de Sanger (J. Mol. Biol. 143, 161 (1980) usando kit de sequeciamento de DNA (Applied Biosystems). A seqüência determinada foi deduzida em aminoácidos, e comparada com subunidades El de piruvato dehidrogenase derivado de cada um dentre Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Mycobacterium tubérculo si s, para verificar uma alta homologia entre os mesmos. Consequentemente, foi determinado que o fragmento de DNA amplificado por PCR foi uma parte do gene pdhA que codifica subunidade EI de piruvato dehidrogenase de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. A clonagem da região a montante e a jusante do gene foi conduzida. O processo de clonagem foi como a seguir: um cromossomo de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi digerido com enzima de restrição EcoRI, BamHI, HindlII, PstI, Sal I e Xba I (Takara Shuzo Co. Ltd.) para obter fragmentos de DNA . Kit de clonagem PCR LA in vitro (Takara Shuzo Co. Ltd) foi usado para a clonagem, usando as seqüências na SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 28, na Listagem da Seqüência, como iniciadores para clonagem da região a montante, e seqüências mostradas em SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30 como iniciadores para clonagem na região a jusante. Após PCR usando o kit, os fragmentos de DNA de cerca de 0,5, 2,5, 3,0, 1,5 e 1,8 quilobases foram amplificados para a região a montante dos fragmentos obtidos por digestão com EcoRI, Hind III, Pst I, Sal I e Xba I, respectivamente; os fragmentos de DNA de cerca de 1,5, 3,5 e 1,0 quilobases foram amplificados da região a jusante do fragmento obtido por digestão com BamHI, HindlII e Pst I, respectivamente. As seqüências destes fragmentos de DNA foram determinados do mesmo modo que como descrito acima. Verificou-se que os fragmentos de DNA amplificados ainda continham uma matriz de leitura aberta de cerca de 920 aminoácidos, e também que uma região que se supunha ser a região de promotor estava presente na região a montante. Porque a seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de DNA de matriz de leitura aberta é altamente homóloga a subunidade EI conhecida de piruvato dehidrogenase como que E. coli, foi evidente que a matriz de leitura aberta foi o gene pdhA que codifica a subunidade EI de piruvato dehidrogenase de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. A seqüência de DNA da matriz de leitura aberta foi mostrada na SEQ ID NO: 31 da Listagem da Seqüência. Na SEQ ID NO: 31, na Listagem da Seqüência, a seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de DNA é também mostrada. Porque o resíduo de metionina em N-terminal da proteína é derivado de ATG que é um códon de iniciação, ele geralmente não se refere à função essencial de proteína, e é também bem sabido que o resíduo metionina é removido pelo efeito de peptidase após a tradução. Assim, na processo acima descrita, é possível que o resíduo metionina no N-terminal tenha sido removido. No entanto, a seqüência de GTG está presente em 6 bases a montante de ATG mostrada na SEQ ID NO: 31 na Listagem da Seqüência, e é também possível que aminoácidos sejam traduzidos a partir deste ponto. As piruvato dehidrogenases de outros microorganismos como E. coli são compostas de 3 subunidades de El, E2 e E3, e genes que codificam os mesmos constituem um operon em muitos casos. No entanto, não se tem uma matriz de leitura aberta considerada como sendo subunidade E2 e E3 de piruvato dehidrogenase em cerca de 3 quilobases a jusante de gene pdhA. Ao contrário, foi mostrado que uma seqüência suposta como sendo um terminador estava presente a jusante da matriz de leitura aberta . A partir destes fatos, foi suposto que as subunidades E2 e E3 de piruvato dehidrogenase de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 estavam presentes em outra região do cromossomo.

(2) Construção de um plasmídeo para amplificar pdhA Já foi evidente que uma cepa obtida por introdução de um gene que codifica três subunidades constituindo PDH de E. coli em Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 dá um rendimento em ácido glutâmico melhorado (JP No. 10-360619). No entanto, em PDH de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, somente o gene pdhA que codifica subunidade EI foi clonado, e não foi feita exame para saber se a amplificação do gene sozinho é efetiva para melhorar o rendimento de ácido glutâmico. Sob estas circunstâncias, o exame foi feito para saber se a amplificação de gene pdhA é efetiva para melhorar o rendimento de ácido glntâmico ou não.

Os iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 foram sintetizados na base de seqüências DNA previamente clonadas. PCR foi conduzido por uso de cromossomo de Brevibacterium iactofermentum ATCC13869, preparado com um kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp .) como o gabarito sob condições de reação padrões descritas na página 8 de PCR Technology (editado por H. Erlich e publicado por Stockton Press, 1989) para amplificar gene pdhA. Dentre os iniciadores assim sintetizados, SEQ ID NO: 33 correspondeu a uma seqüência de base no. 1397 para no. 1416 no gene pdhA descrito na SEQ ID NO: 32 na Listagem da Seqüência. SEQ ID NO: 34 e o filamento complementar de seqüência de DNA correspondendo à seqüência de base no. 5355 a no. 5374 em SEQ ID NO: 32 na Listagem da Seqüência, que foi representada do lado 5'. O produto PCR assim obtido foi purificado por processo comum e reagido com enzima de restrição Sal I e EcoT221. O fragmento foi ligado com pSFK (pedido patente no. 11-69896), clivado com enzima de restrição Sal I e Pst I, com um kit de ligação (Takara Shuzo Co. Ltd.). Após a transformação com células competentes (Takara Shuzo Co. Ltd.) de E. coli JM109, as células foram espalhadas em placas contendo meio L (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 5 g/1 de extrato de bacto levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar, pH 7,2) contendo 10 pg/ml de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo), 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galactosídeo) e 25 μg/ml de canamicina. Após cultivar durante a noite, as colônias brancas foram tomadas para obter as cepas transformadas após isolamento de colônia único. A partir das cepas transformadas, plasmídeos foram preparados pelo processo alcalino (Seibutsu Kogaji Jikken sho-editado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai e publicado por Baifukan p. 105, 1992). Os mapas de enzima de restrição de fragmentos de DNA inseridos nos vetores foram preparados, e comparados com o mapa de enzima de restrição de gene pdhA registrado na seqüência 32 da Listagem da Seqüência. Um plasmídeos contendo fragmentos de DNA inseridos ai tendo o mesmo mapa de enzima de restrição que do gene pdhA foi nomeado pSFKBPDHA. (3) Introdução de pASFKBPDHA em Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 e GC25 e avaliação das experiências de fermentação Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e GC25 foram transformados com plasmídeo pSFKBPDHA por processo de pulso elétrico (J.P. Kokai no. 2-207791) para obter as cepas transformadas. A cultura para produzir ácido L-glutâmico foi conduzida com cepa transformada ATCC13869/Psfkbpdha E gc25/pSFKBPDHA obtido por introdução de um plasmídeo pSFKBPDHA em Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e GC25 como a seguir: células de~ ATCC13869/pSFKBPDHA e GC25/ pSFKBPDHA obtidas pela cultura em placas de meio CM2B contendo 25 ug/ml de canamicina foram inoculadas em um meio (compreendendo 1 litro de água pura contendo 80 g de glucose, 1 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04, 7H20, 30 g de (NH4)2S04, 0,01 g de FeS04, 7H20, 0,01 g de MnS04, 7H20, 15 ml de hidrolisado de proteína de soja, 200 pg de hidrocloreto de tiamina, 60 pg de biotina, 25 mg de canamicina e 50 g de CaC03, e tendo um pH ajustado a 8,0 com KOH). Então a cultura foi agitada a 31,5 °C, até açúcar no meio ter sido consumido. Os produtos obtidos foram inoculados no meio da mesma composição que como descrito acima (para GC25/pSFK6 e GC25/pSFBDHA) ou o meio eliminou biotina da composição como descrito acima (para ATCC 13869/ pSFK6 e ATCC 13869/ pSFKBPDHA) em uma quantidade de 5%, e a cultura de agitação foi conduzida a 37 °C até açúcar no meio ter sido consumido. Como um controle, cepas obtidas por transformação de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e GC25 com plasmídeo previamente obtido pSFKó capaz de replicação autônoma em bactéria corineforme por processo de pulso elétrico (J.P. KOKAI no. 2-207791) foram cultivados no mesmo modo que como descrito acima. Após completar a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico acumulada no meio foi determinada com analisador Biotic AS-210 (um produto de Asahi Chemical Industry Co. Ltd.). Os resultados são mostrados na tabela 17 Tabela 17 A partir dos resultados, é evidente que mesmo a amplificação de gene pdhA sozinho é suficientemente efetiva para melhorar o rendimentos de Glu em Brevibacterium lactofermentüm ATCC 13869 e GC25. (4) construção de plasmídeos para determinação de atividade de promotor pdhA mudado Para produzir mutante promotor de piruvato dehidrogenase (PDH), a determinação da região de promotor previamente clonada de gene pdhA de Brevibacterium lactofermentüm ATCC 13869 foi conduzida e também a determinação de diferença na expressão causada pela modificação de região de promotor foram conduzidas por determinação da atividade de β-galactosidase. A região de promotor de gene pdhA foi presumida da seqüência de DNA que já tinha sido elucidada por clonagem. Como resultado, foi suposto como sendo possível que base no. 2252 a no. 2257 e no. 2279 para no. 2284 na SEQ ID NO: 32, na Listagem da Seqüência, foram a região-35 e região-10, respectivamente. Assim, os iniciadores mostrados como SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36 na Listagem da Seqüência foram sintetizados, e os fragmentos de DNA contendo região de promotor de gene pdhA foram amplificados pelo processo PCR por uso de DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 como um gabarito. Dentre os iniciadores sintetizados, SEQ ID NO: 35 correspondeu à seqüência na faixa de base no. 2194 para base 2221 na SEQ ID NO: 32, mas a base no. 2198 já tinha sido substituída com C, e a base no. 2200 e no. 2202 já foram substituídas com G, e a seqüência de reconhecimento para enzima de restrição Saml foi inserida. A SEQ ID NO: 36 correspondia à seqüência na faixa de base no. 2372 a base no. 2398 na SEQ ID NO: 32, mas a base no. 2393 e no. 2394 foi substituída com G, e o filamento complementar de seqüência de DNA tendo uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição Saml inserida ai foi representada da extremidade 5'. PCR foi conduzido por uso de cromossomo de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, preparado com kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp) como o gabarito sob condições de reação padrões descritos na pag. 8 de PCR Technology (ed. Por H. Erlich e publicado por Stockton Press, 1989) para amplificar a região de promotor de gene pdhA. O produto PCR assim obtido foi purificado por um processo comum e reagido com enzima de restrição Smal. Os fragmentos foram ligados com pNEOL faltando em região de promotor de gene lacZ que pode replicar em uma bactéria corineforme e que foi digerido com enzima de restrição Sma I (exemplo 4 (3) com um kit de ligação (Takara. Shuzo Co. Ltd.). Após a transformação com células competentes (Takara Shuzo Co. Ltd.), de E. coli JM109, as células foram espalhadas em placas de meio L (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 5 g/1 de extrato de bacto levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar, pH 7,2) contendo 10 pg/ml de IPTG (ίεορΓορϋ-β-ϋ-tiogalactopiranosídeo), 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil~P-D-galactosídeo) e 25 pg/ml de canamicina. Após cultivar durante a noite, as colônias de cor azul foram tomadas para obter as cepas transformadas após isolamento de colônia único. A partir dos transformantes, plasmídeos foram preparados pelo processo alcalino (Seibutsu Kogaji Jikken sho-editado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai e publicado por Baífukan p. 105, 1992). Após sequeciamento dos fragmentos de DNA inseridos no vetor por um processo comum, o plasmídeo contendo o fragmento de DNA inserido ai foi chamado pNEOLBPDHAprol.

Além disso, iniciadores indicados como SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, e SEQ ID NO: 39, na Listagem da Seqüência, foram sintetizados para construir plasmídeos em que uma região suposta como sendo o sítio de promotor foi mudada para a seqüência de consenso de promotores de bactéria corineforme. Ao usar cada um dos iniciadores e iniciador mostrado na SEQ ID NO: 36, os fragmentos de DNA em que a região de promotor de gene pdhA foi mudado para a seqüência de consenso foram amplificados por processo PCR por uso de DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como um gabarito. Dentre os iniciadores sintetizados, SEQ ID NO: 37 correspondeu a seqüência na faixa de base no. 2244 para base no. 2273 na SEQ ID NO: 32, base 2255 foi substituída com C, e base no. 2257 foi substituída com A; assim somente região-35 foi mudada para a seqüência de consenso de bactéria corineforme. A SEQ ID NO: 38 correspondeu à seqüência na faixa de base no. 2249 para base no. 2288 na seqüência no. 32, base 2279 e no. 2281 foi substituída com T; assim somente região-10 foi mudada para a seqüência de consenso de bactéria corineforme. A seqüência no. 39 correspondeu à seqüência na faixa de base no. 2249 para base no. 2288 na SEQ ID NO: 32; base no 2255 foi substituída com C, base no. 2257 foi substituída com A, e base no. 2279 e no. 2281 foi substituída com T; assim tanto a região-35 como região-10 foi mudada para a seqüência de consenso da bactéria corineforme. PCR foi conduzido por uso de cromossomo de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, preparado com um kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp) como o gabarito sob condições de reação padrões descritos na pag. 8 de PCR

Technology (ed. Por H. Erlich e publicado por Stockton Press, 1989) para amplificar a região de promotor de gene pdhA com estes iniciadores de modo que a região de promotor foi mudada para sequência de consenso. Produtos PCR assim obtidos foram purificados por processo comum e reagidos com enzima de restrição SamI. Os fragmentos foram ligados com pNEOL faltando a região de promotor de gene lacZ, que iria replicar em uma bactéria corineforme e que tinha sido clivado com enzima de restrição Sma I, com um kit de ligação (Takara Shuzo Co. Ltd.). Após a transformação com células competentes (Takara Shuzo Co. Ltd.) de E. coli JM109, as células foram espalhadas em placas de meio L (compreendendo 10 g/1 de bactotriptona, 5 g/1 de extrato de bacto levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar, pH 7,2) contendo 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo) e 25 pg/ml de canamicina. Após cultivar durante a noite, as colônias de cor azul foram tomadas e as cepas transformadas foram obtidas após isolamento de colônia único. A partir das cepas transformadas, plasmídeos foram preparados pelo processo alcalino (Seibutsu Kogaji Jikken sho-editado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai e publicado por Baifúkan p. 105, 1992). Após sequeciamento, os fragmentos de DNA inseridos no vetor por um processo comum, o plasmídeo contendo fragmentos de DNA, em que somente a sequência na região-35 tinha sido mudada para a seqüência de consenso, inserida ai foi chamada pNEOLBPDHApro35; o plasmídeo contendo fragmento de DNA, em que somente a seqüência na região-10 foi mudada para referida a seqüência de consenso, foi inserida ai foi chamada pNEOLBPDHAprolO, e o plasmídeo contendo fragmentos de DNA, em que as seqüências tanto na região-35 como região-10 foram mudadas para a seqüência de consenso, foi inserida ai e chamada pNEOLBPDHApro3510. (5) A avaliação de atividade de promotor pdhA mudado Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi transformado com plasmídeos chamados pNEOLBPDHAprol, pNEOLBPDHAprolO e pNEOLBPDHApro3510 por processo de pulso elétrico (JP Kokai no. 2-207791) para obter as cepas transformadas. A atividade β-galactosídase dos transformantes obtidos foi determinada pelo processo como descrito no exemplo 4 (4). Após mudar a seqüência na região de promotor para a sequência de consenso, atividades de β-galactosidade são como mostrado na tabela 18, em que a atividade enzimática de β-galactosidade tendo a região de promotor de gene pdhA foi dada como 1.

Tabela 18 Estes resultados indicam que a região de promotor suposta foi o promotor do gene pdhA e que a expressão de PdhA pode ser mudada (melhorada) por mudança da seqüênci¥ nesta região na seqüência de consenso. Este fato indica que a expressão pode ser mudada, sem usar plasmídeo, por mudança da região de promotor do gene pdhA. (6) construção de plasmídeo para preparação de uma. cepa variada no promotor Desde que foi provado que a expressão de pdhA pode ser mudada por introdução de mutações no promotor, plasmídeos para preparar cepas modificadas com promotor pdhA foram construídos. Estas construções dos plasmídeos para as cepas modificadas com promotor foram construídas. Eles são plasmídeos em que a região-35, região-10 e ambas foram mudadas para a seqüência de consenso, respectivamente.

Os iniciadores mostrados na SEQ ID NO; 40 e SEQ ID NO: 41 foram recentemente sintetizados com base na seqüência de DNA que já tinha sido clonada. Dentre os iniciadores sintetizados, SEQ ID NO: 40 foi o filamento complementar da seqüência de DNA correspondendo a uma seqüência na faixa de no. 2491 a base no. 2521 na SEQ ID1 NO: 32, que foi representada da extremidade 5', e em que a seqüência compreendendo três A's seguida por quatro Ts no terminal 5'. A SEQ ID NO: 33 foi o filamento complementar para a seqüência de DNA correspondendo à seqüência na faixa de base no. 5020 para base no. 5039 de gene pdhA em SEQ ID NO: 32, que foi representado da extremidade 5'. PCR foi conduzido usando SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 40 como os iniciadores e cromossomo de Brevibacterium Iactofermentum ATCC 13869, preparado do kit de purificação de DNA de genoma bacteriano" (Advanced Genetic Technologies Corp) como um gabarito sob condições de reação padrões descritas na página 8 de PCR. Technology (ed. Por H. Erlich e publicado por Stockton Press, 1989). Além disso, PCR foi conduzido por uso de SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e cromossomo de Brevibacterium Iactofermentum ATCC 13869 como um gabarito. Os produtos PCR assim obtidos foram purificados por um processo comum. PCR foi conduzido por uso de produtos PCR obtidos usando SEQ ID NO: 33 e 40, produtos PCR obtidos usando SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, e SEQ ID NO: 33 e 41, como os iniciadores. A condição PCR foi a seguinte. A concentração destes quatro DNA deve ser de 10 μΜ no coquetel de reação e La ta (Takara Shuzo Co. Ltd.) foi usado sem gabarito. Os produtos PCR foram purificados por um processo comum e reagidos com enzima de restrição Sal I e Xho I. Os fragmentos assim obtidos foram ligados com fragmentos obtidos por digestão de plasmídeos sensível a temperatura pSFKT2 com Sall, que podem replicar em uma bactéria corineforme por uso de kit de ligação (Takara Shuzo Co. Ltd.). Após a transformação com células competentes, (Takara Shuzo Co. Ltd.) de E. Coli JM 109, as células foram espalhadas em placas de meio L (10 g/1 de bactotriptona, 5 g/I de extrato de bacto levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar, pH 7,2) contendo 10 pg/ml de IPTG (isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo), 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo) e 40 pg/ml de cloranfenicol. Após cultivar durante a noite, as colônias brancas foram tomadas para obter as cepas transformadas após isolamento de colônia único. A partir dos transformantes, plasmídeos foram preparados pelo processo alcalino (Seibutsu Kogaji Jikken sho-edítado por Nippon Seibutsu Kogaku-kai e publicado por Baifukan p. 105, 1992). Após sequeciamento de fragmentos de DNA inseridos no vetor, a seqüência de base foi comparada com a do gene pdhA registrado na SEQ ID NO: 32. O plasmídeo contendo fragmentos de DNA, em que somente as seqüências em região-35 e região-10 do promotor foram mudadas para a seqüência de consenso de bactéria corineforme, inserido ai, foi chamado pSFKTPDHApro3 510.

Um plasmídeo em que a região-35 do promotor do gene pdhA foi mudado para a seqüência de consenso de bactéria corineforme, e também plasmídeo em que região-10 de promotor de gene pdhA foi mudado para a seqüência de consenso de bactéria corineforme foram construídos no mesmo modo que descrito acima exceto quê SEQ ID NO: 39 na Listagem da Seqüência foi substituído com SEQ ID NO: 37 e 38, respectivamente. Estes plasmídeos foram chamados pSFKTPDHApro35 e pSFKTPDHAprolO, respectivamente. (7) Preparação de cepas modificadas com promotor As cepas tendo promotor de gene pdhA modificadas foram preparadas pela recombinação homóloga por uso de plasmídeo para preparar cepa variada em promotor construída na etapa acima descrita (6).

Primeiro, GC25 foi transformado com plasmídeo pSFKTPDHApro3510 para preparar cepa modificada com promotor por processo de pulso elétrico (ver J.P, Kokai no. 2-207791). As células foram espalhadas em placas de meio CM2B (compreendendo 10 g/1 de polipeptona, 5 g/1 de extrato de bacto levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar, pH 7,2) e cultivadas a 25 °C para obter cepas transformadas. Estes transformantes foram cultivados em meio líquido CM2B em um tubo de teste durante a noite e então espalhados em placas de meio CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina e cultivadas a 34 °C para obter uma cepa causada por recombinação de uma vez que contém plasmídeo pSFKTPDHpro3510 em seu cromossomo inserido por recombinação homóloga. Após isolamento de colônia única, esta cepa foi cultivada em meio líquido CM2B em um tubo de teste durante a noite. Após a diluição apropriada, ela foi espalhada em placas de meio CM2B e cultivadas a 31,5 °C. Após as colônias começarem a aparecer, as réplicas foram feitas em placas de meio CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina para obter cepas sensíveis a canamicina. Porque dois tipos de cepas, isto é, uma cepa tendo a seqüência de cepa tipo selvagem para a região de promotor de gene pdhA e outra cepa tendo a mutação introduzida ai, pode ter ocorrido, esta região foi sequenciada. Assim, uma cepa modificada por promotor, em que a mutação foi introduzida na região de promotor do gene pdhA, foi obtida. Nesta cepa, a região-35 e região-10 de promotor de gene pdhA foi mudada para a seqüência de consenso de bactéria corineforme. Esta cepa foi chamada GD3510.

As cepas em que a região-35 ou região-10 do promotor de gene pdhA foi mudada para a seqüência de consenso de bactéria corineforme foi obtida do mesmo modo que descrito acima exceto que o plasmídeo acima descrito pSFKTPDHApro3510 para produzir a cepa modificada por promotor foi substituída com plasmídeo pSFKTPDHApro35 e pSFKTPDHAprolO, para produzir cepas modificadas com promotor e elas foram chamadas GD35 e GD10, respectivamente. (8) Avaliação dos resultados de cultura de frasco de cepas modificadas com promotor de gene pdhA. O frasco de cultura para produzir ácido L-glutâmico foi conduzido com três tipos de cepas modificadas com promotor de gene pdhA obtidas como descrito acima. Cada uma das células das cepas modificadas por promotor GD3510, GD35, GD10, e GC25 obtidas por cultura em placas de meio CM2B foi inoculada em um meio (compreendendo 1 litro de água pura contendo 30 g de glucose, 1 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04, 7H20, 30 g de (NH4)2S04, 0,01 g de FeS04, 7H20, 0,01 g de MnS04, 7H20, 15 ml de hidrolisado de proteína de soja, 200 μg de hidrocloreto de tiamina, 60 de biotína, 50 g de CaC03, e tendo um pH ajustado a 8,0 com KOH). Então a cultura foi agitada a 31,5 °C, até açúcar no meio ter sido consumido. Os produtos obtidos foram inoculados no meio da mesma composição que como descrito acima em uma quantidade de 5%, e a cultura de agitação foi conduzida a 37 °C até o açúcar no meio ser consumido. Após completar a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico acumulada no líquido de cultura foi determinada com Biotic Analyser AS-210 (da Asahi Chemical Industry, Co. Ltd.). Os resultados são mostrados na tabela 19.

Tabela 19 É evidente dos resultados que as cepas modificadas com promotor obtidas proveram melhorados rendimentos em Glu.

Exemplo 6-Introdução de mutação na região de promotor de gene arginossuccinato sintase 1) Determinação de seqüência de DNA a montante do gene argG A fim de amplificar gene argG de Brevibacterium flavum por PCR, as seqüências de DNA nas regiões a montante e a jusante do ORF foram determinadas. A determinação de seqüências de DNA foi conduzida por síntese de um iniciador com base na seqüência de DNA conhecida (Gen Bank Acesso AF030520) de ORF de gene argG de Corynebacterium glutamicum e usando kit de clonagem LA PCR (Takara Shuzo Co. Ltd.), de acordo com o manual de instrução incluído no kit. Como iniciadores, eles são oligonucleotídeos especificamente usados (iniciadores 1 e 2) tendo as seqüências de DNA especificadas como SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43 para a região a montante, e oligonucleotídeos (iniciadores 3 e 4) tendo as seqüências de DNA especificadas como SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 para a região a jusante. As seqüências de DNA na região a montante e a jusante de argG foram determinados por digestão completa de cromossomo DNA de cepa 2247 (ATCC14067), isto é cepa de tipo selvagem de Brevibacterium flavum, com uma enzima de restrição EcoRI, conduzindo primeiro PCR com o iniciador 2 ou 3 (tendo seqüência no. 43 ou 44) e conduzindo o segundo PCR com o iniciador 1 ou 2 (tendo seqüência no. 42 ou 45). 2) Previsão de região de promotor Uma seqüência semelhante a promotor a montante de ORF de gene argG foi procurada para as seqüências acima descritas com um software comercialmente disponível (GENETYX). A mutação foi introduzida em uma região de maior escore (cerca de 120 bp a montante de primeiro ATG). Então, a atividade do promotor foi medida. 3) Introdução de mutações em seqüência de promotor e determinação de atividade de promotores mutantes Os iniciadores de introdução de mutação 9, 10, 11,12, ou 13 ou 7 (tendo seqüência no. 50, 51, 52, 53, 54 ou 48, respectivamente) para uma região de maior escore, foram usados, e o primeiro PCR foi conduzido com DNA cromossômico de cepa AJ12092 como um gabarito. O segundo PCR foi conduzido com o mesmo DNA cromossômico como um gabarito por uso do produto PCR como o iniciador para a extremidade 3' e também usando o iniciador 8 tendo seqüência no. 49 como o iniciador na extremidade 5' para obter fragmentos de DNA tendo a mutação introduzida na região de promotor pretendida. Para determinar a atividade de promotores mutantes, estes fragmentos de DNA foram inseridos em sítio Smal de vetor de sonda de promotor pNEOL, de modo que eles estavam na mesma direção com gene repórter lacZ para obter plasmídeos pNEOL-1, pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL_4, e pNEOL-7. Como um controle para a atividade, plasmídeo pNEOL-O foi construído por inserção do fragmento de DNA, obtido por PCR usando DNA cromossômico de cepa AJ12092 e iniciadores 7 e 8, a montante do gene IacZ de pNEOL. PNEOL-O, pNEOL-Ι, pNEOL-2, pNEOL-3, Pneol-4, e pNEOL-7 foram introduzidos em cepa AJ 12092, respectivamente. Os plasmídeos foram introduzidos por processo de pulso elétrico (J.P. Kokai no. 2-207791). Os transformantes foram selecionados em placas de meio CM2G (compreendendo 1 litro de água pura contendo 10 g de polipeptona, 10 g de extrato de levedura, 5 g de glucose, 5 g de NaCl e 15 g de agar, e tendo pH 7,2), contendo 4 pg/ml de cloranfenicol, como cepas resistentes a cloranfenicol.

Estas cepas são cada espalhadas em meio agar (contendo 0,5 g/dl de glucose, 1 g/dl de polipeptona, Γ g/dl de extrato de levedura, 0,5 g/dl de NaCl e 5 pg/l de cloranfenicol) e cultivadas a 31,5 °C durante 20 hl. Algumas das células assim obtidas foram inoculadas em um meio (contendo 3 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de sulfato de amônio, 0,1 g de KH2P04, 0,04 g de MgS04, 0,001 g/dl de FeS04, 0,01 g de MnS04, 5 pg/cl de VB:, 5 pg/dl de biotina, e 45 mg/dl (em termos de N) de hidrolisado de proteína de soja). Após a cultura a 31,5 °C durante 18 h, atividade de β-galactosidase das células obtidas foi determinada como descrito no exemplo 4 (4).

Porque a atividade de β-galactosidase foi detectada em AJ12092/pNEOL_0, como mostrado na tabela 20, verificou-se que o fragmento de DNA inserido a montante do gene de estrutura lacZ funcionou como um promotor. Além disso, a atividade de β-galactosidase de cada uma das cepas introduzidas em plasmídeo foi maior do que de AJ12092/pNEOL-O. Foi assim verificado que a atividade de transcrição foi aumentada pela introdução de mutação na sequência semelhante a promotor, como mostrado na tabela 20.

Tabela 20 4) Construção de um plasmídeo para introdução de mutação PCR foi conduzido por uso de iniciadores 14 e 15 (tendo a seqüência de SEQ ID NO: 55 e SEQ ÍD NO: 56), com DNA cromossômico de cepa Aj 12092 como o gabarito. Estes fragmentos de DNA assim obtidos foram inseridos em um sítio smal em um sítio de múltipla clonagem de vetor de clonagem pHSG398 (um produto de TaKaRa) paia construir plasmídeo pO. Então, pO foi digerido com enzima de restrição EcoRV e BspHI, e também pNEOL-3 e pNEOL-7, foram digeridos com enzima de restrição EcoRV e BspHI. Os fragmentos de DNA assim obtidos foram ligados para obter plasmídeo de introdução de mutação p3 (mutante derivado de iniciador de introdução de mutação 11) e p7 (mutante derivado de iniciador de introdução de mutação 13). 5) Introdução de plasmídeos introduzindo mutação em bactérias produzindo Agr: Cada um dos plasmídeos assim obtidos foi introduzido em bactéria produzindo Arg de cepa Brevibacterium lactofermentum AJ12092 por processo de pulso elétrico (J.P. Kokai no. 2 207791). Porque estes plasmídeos não replicam de modo autônomo em Brevibacterium, somente as cepas obtidas por integração destes plasmídeos no cromossomo por recombinação homóloga devem ser selecionadas como cepas resistentes a Cm. As cepas em que o plasmídeo de introdução de mutação foram integradas no cromossomo foram selecionadas como cepas resistentes a cloranfenicol em placas de meio CM2G (compreendendo 1 litro de água pura contendo 10 g de polipeptona, 10 g de extrato de levedura, 5 g de glucose, 5 g de NaCl e 15 g de agar, e tendo pH 7,2), contendo 5 pg/ml de cloranfenicol. Então, as cepas sensíveis a Cm foram selecionadas em que a região de promotor de gene argG foi substituída com a seqüência modificada pretendida.

Como resultado, uma cepa substituída com seqüência P3 (AJ12092-P3) e uma cepa substituída com uma seqüência P7 (AJ12092-P7) foram obtidas.

6) Clonagem de gene argG

Com base na seqüência de DNA determinada como (1), oligonucleotídeo s (iniciadores 5 e 6) tendo a seqüência de DNA de SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 47 foram sintetizadas para conduzir PCR usando DNA cromossomo de Brevibacterium flavum como um gabarito. A reação PCR foi conduzida em 25 ciclos, cada consistindo de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante um segundo, e 72 °C durante 2 min e 30 s. O fragmento de DNA assim obtido foi clonado em sítio Saml em sítio de múltipla clonagem de vetor de clonagem pSTV29 (Takara Shuzo Co. Ltd.) para obter pSTVargG. Além disso, pargG foi preparado por inserção em sítio Sall de pSTVargG um fragmento contendo a origem de replicação obtida por tratamento de pSAK4 especificado no exemplo 1 com Sall. 7) Introdução de pargG em Brev.: pargG foi introduzido na cepa Brevibacterium lactofermentum AJ12092. Plasmídeo foi introduzido por processo de pulso elétrico (J.P. Kokai no. 2 207791). O transformante foi selecionado como cepa resistente a cloranfenicol em meio CM2G (compreendendo 1 litro de água pura contendo 10 g de polipeptona, 10 g de extrato de levedura, 5 g de glucose, 5 g de NaCl e 15 g de agar, e tendo pH 7,2) contendo 4 μg/ml de cloranfenicol. 8) . Atividade ArgG de cepas modificadas com promotor: As atividades de ArgG de dois tipos acima descritos de cepas modificadas com promotor argG e uma cepa obtida por amplificação de argG com plasmídeo (AJ12092/pargG) foram determinadas. Estas cepas foram cada espalhadas em um meio agar (contendo 0,5 g/dl de glucose, 1 g/dl de polipeptona, 1 g/dl de extrato de levedura, 0,5 g/dl de NaCl e 5 pg/l de cloranfenicol) e cultivadas a 31,5 °C durante 20 h. Algumas das células assim obtidas foram inoculadas em um meio (contendo 3 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de sulfato de amônio, 0,1 g de KH2P04, 0,04 g de MgS04, 0,001 g/dl de FeS04, 0,01 g de MnSG4,5 pg/cl de VBj, 5 pg/dl de biotina, e 45 mg/dl (em termos de N) de hidrolisado de proteína de soja). Após a cultura a 31,5 °C durante 18 h, atividade ArgG das células obtidas foi determinada como descrito acima (Journal of General Microbiology (1990), 136, 1177-1183). As atividades ArgG de dois tipos acima descritos dé cepas modificadas com promotor ArgG e a cepa (AJ12092/pargG) obtidas por amplificação de argG com plasmídeo são mostrados na tabela 21. Como é evidente da tabela 21 que por introdução de mutação no promotor, a atividade ArgG de AJ12092-P3 foi aumentada a cerca de duas vezes tão elevado como de cepa originária, e a atividade de AJ12092-P7 foi aumentada a cerca de três vezes tão alta como da cepa originária. A atividade ArgG de AJ12092/pargG foi cerca de 4,5 vezes tão alta como da cepa originária.

Tabela 21 9) Produção de Arg por cepas modificadas pelo promotor: Uma cultura em frasco de cada uma das cepas modificadas com promotor argG foi conduzida. Como controles, cepas originárias AJ12092 e AJ12092/pargG foram também cultivas. Estas cepas foram cada inoculadas em um meio contendo 0,1 g/dl de KH2P04,0,04 g-de MgS04, 0,001 g/dl de FeS04, 0,01 g de MnS04, 5 pg/cl de VBh 5 pg/dl de biotina, e 45 mg/dl (em termos de N) de hidrolisado de proteína de soja), e então espalhadas em um meio agar (contendo 0,5 g/dl de glucose, 1 g/dl de polipeptona, 1 g/dl de extrato de levedura, 0,5 g/dl de NaCl e 5 pg/l de cloranfenícol) e cultivadas a 31,5 °C durante 20 h. Algumas das células foram cultivadas em um frasco contendo 4 g/dl de glucose, e 6,5 g/dl de sulfato de amônio a 31,5 °C até glucose ser completamente consumida. A absorbância (CD620) do líquido de cultura diluída a uma concentração de 1/51 com 0,2 N solução HC1, a quantidade de arginina produzida (concentração: g/dl) e tempo de cultura foram mostrados na tabela 22. É evidente da tabela 22 que quando a cepa modificada por promotor argG foi usada, o rendimento de arg foi aumentado a um nível igual ao de argG amplificado com plasmídeo. Como para as cepas variadas com promotor, tanto AJ12092-P3 como AJ12092-P7 tinham o tempo de cultura igual ao de cepa originária, enquanto o tempo de cultura da cepa amplificada por plasmídeo foi aumentado. Foi assim evidente que a produtividade de Arg do mesmo foi maior do que da cepa amplificada por plasmídeo.

Tabela 22 Exemplo 7-íntrodução de mutação em região de promotor de gene GDH de bactéria produzindo glutamato corineforme (1) Construção de plasmídeos gdh mutantes Os plasmídeos tendo seqüência de promotor GDH de cepa FGR1 e cepa FGR2 descritas no exemplo 2 foram construídos por mutagenese dirigida ao sítio. Para obter a seqüência de promotor GDH de cepa FGR1, PCR foi conduzido usando DNA sintético, mostrado na SEQ ID NO: 57 e DNA sintético da SEQ ID NO: 60, como os iniciadores e DNA de cromossomo de ATCC13S69 como o gabarito, e por outro lado, PCR foi conduzido usando DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 58 e DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 59 como os iniciadores com DNA de cromossomo de ATCC13869 como o gabarito. Além disso, PCR foi conduzido usando DNAs sintéticos mostrados na SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58 como os iniciadores com uma mistura destes produtos PCR como o gabarito. O produto PCR assim obtido foi inserido em um sítio Smal de pSFKT2 (pedido de patente JP no. 11-69869) para construir pSFKTGl 1. Para obter'á seqüência de promotor GDH de cepa FGR2, PCR foi conduzido usando DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 58 e DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 62 como os iniciadores com DNA de cromossomo de ATCC 13869 como o gabarito, e por outro lado, PCR foi conduzido usando DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 58 e DNA sintético mostrado em SEQ ID NO: 61, como os iniciadores e DNA de cromossomo de ATCC 13869 como o gabarito. Além disso, PCR foi conduzido por uso de DNA sintético mostrado na SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58 como os iniciadores e uma mistura destes produtos PCR como o gabarito. O produto PCR assim obtido foi inserido em um sítio Smal de pSFKT2 (pedido de patente JP 110-69896) para construir pSFKT607. As seqüências de DNA de fragmentos inseridos nos sítios Smal de pSFKTGll e pSFKTG07 foram determinadas para confirmar que nenhuma mutação foi introduzida em outras regiões do que a região de promotor em GDH. (2) Construção de cepas modificadas por promotor gdh Então, pSFKTGll e pSFKTG07 foram introduzidos em cepa AJ13029 por processo de pulso elétrico, e transformantes que cresceram em placas CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina a 25 °C foram selecionados. Os transformantes foram cultivados a 34 °C para cepas selecionadas que foram resistentes a canamicina a 34 °C. O fato que uma cepa é resistente a canamicina a 34 °C indica que pSFKTGl 1 ou pSFKTG07 foi assim integrado no cromossomo de cepa AJ 13029. As cepas sensíveis a canamicina foram obtidas das cepas em que o plasmídeo foi integrado no cromossomo. As seqüências de promotor de GDH nestas cepas foram determinadas. As cepas tendo a mesma seqüêncía de promotor gdh como de pSFKTGll e pSFKTG07 foram nomeadas GAOl e GA02, respectivamente. (3) Confirmação de produtividade de ácido JL-glutâmico de cepas modificadas por promotor gdh As produtividades de ácido glutâmico de cepas GAOl e GA02 e a cepa originária AJ 13029 foram confirmadas do mesmo modo que de exemplo 2 (2) acima. Como resultado, uma melhora notável no acúmulo de ácido glutâmico foi reconhecida em GAOl e GA02 como na tabela 23. (4) Construção de plasmídeo gdh de tipo de auto-clonagem: Primeiro, vetor de auto-clonagem pAJ220 foi construído. PAJ226 (J.P. Kokai no. 61-152289) foi tratado com EcoRV e PstI para preparar um fragmento contendo uma região que podería ser replicada de modo autônomo em bactéria corineforme. O fragmento foi ligado com cerca de 0,7 kb de fragmento de DNA obtido por tratamento de pAJ224 (J.P. Kokai no. Sho 61-152289) com EcoRV e PstI para obter um plasmídeo pAJ220. Este plasmídeo pode replicar de modo autônomo em uma bactéria corineforme e podería dar resistência a trimetoprina ao hospedeiro. A reação PCR foi conduzida usando DNA sintético da SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64, como os iniciadores e DNA de cromossomo de bactéria coríneforme de tipo selvagem cepa ATCC 13869 como o gabarito. O fragmento de gene gdh assim obtido foi inserido em sítio Bali de pAJ220 para construir pAJ220G. O promotor estava presente próximo sítio Bali de pAJ220, e a expressão do gene inserido foi aumentada dependendo de direção do gene inserido no sítio Bali. PAJ220G e pGDH foram inoculados em cepa ATCC 23869 por processo de pulso elétrico. As atividades GDH das cepas assim construídas foram determinadas pelo processo da etapa (1) acima. Como resultado, atividade GDH de cepa em que pAJ220 G foi introduzido foi cerca de 1,5 vezes tão alto como de cepa em que dGDH foi introduzido como mostrado na tabela 24. (5) Investigações na influência de atividade gdh no rendimento e Asp sub-produzido: pGDH e pAJ220G foram introduzidos em AJ13029 por processo de pulso elétrico. Cada uma destas cepas e as obtidas na etapa (2) acima foi inoculada em um meio de cultura de semente tendo uma composição mostrada na tabela 25, e a cultura de agitação foi conduzida a 31,5 °C durante 24 h para obter uma cultura de semente. 300 ml de meio para a cultura principal tendo uma composição mostrada na tabela 25 foi colocada em cada um dos fermentadores de jarra de vidro de 500 ml e então esterilizados por aquecimento. 40 ml de culturas de semente, como descrito acima, foram inoculados no meio. A cultura foi iniciada a uma temperatura de 31, 5 °C, enquanto a taxa de agitação e a taxa de aeração foram controladas a 800 a 1300 rpm e 1/2 a 1/1 vvm, respectivamente. O pH do líquido de cultura foi mantido a 7,5 com amônia gasosa. A temperatura foi trocada a 37 °C 8 h após iniciar a cultura. A cultura foi terminada quando glucose tinha consumido completamente em 20 a 40 h, e a quantidade de ácido L-glutâmíco produzida e acumulada no liquido de cultura foi determinada (tabela 26). A atividade GDH para obter o maior rendimento foi cerca de 3 vezes tão elevada. Quando a atividade GDH foi ainda elevada, o grau de melhora no rendimento foi reduzido. Quando a atividade GDH foi elevada a cerca de 16 vezes, o rendimento foi ao contrário reduzido. Os aminoácidos produzidos como subprodutos foram analisados com analisador de aminoácido Hitachi L-8500 para verificar se a atividade de GDH foi elevada, a quantidade de ácido aspártico e alanina acumulados foi aumentada. Estes resultados provaram os seguintes fatos, para aumentar o rendimento de ácido glutâmico, é necessário aumentar de modo apropriado atividade GDH de modo a não causar um aumento notável na quantidade de ácido aspártico é’alanina. Um dos processos efetivos compreende a introdução de várias mutações no promotor gdh para controlar a atividade de GDH a cerca de 3 vezes tão elevada como a de cepa originária.

Tabela 25 LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA <110> Ajinomoto Co. Inc. <120> Processo para construir bactérias produzindo aminoácido, e processo para preparar aminoácidos por fermentação com a bactéria produzindo aminoácido construída <130> OP 99052 <150> JP 10-271786 <151> 1998-9-25 <150> JP 10-271787 <151> 1993-9-25 <16 0> 6 <210> 1 <211> 46 <212> ácido nucleico <4 0 0> 1 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt < 2 1 0 > 2 <2 11> 46 <212 > ácido nucleico <4 0 0> 2 ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210> 3 <211> 46 <212> ácido nucleico < 4 0 0 > 3 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210> 4 <211> 46 <212> ácido nucleico < 4 0 0> 4 ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210> 5 <211> 46 < 212 > ácido nucleico <4 0 0> 5 ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210> 6 <211> 46 < 212 > ácido nucleico <4 0 0> 6 ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210> 7 <211> 30 <2i2> ácido nucleico <220 > xniciador A para clonagem de gltA a partir de Brevibacterium , lactofermentum <400> 7 gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg <210> 8 <211> 30 <2ΐ2> ácido nucleíco <220> iniciador Β para clonagem de gltA a partir de Brevibacterium lactofermentum <400> 8 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt <210> 9 <211> 20 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 1 para introduzir uma mutação de promotor gltA <400> 9 atcggtataa cgtgttaacc <210> 10 <211> 20 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 2 para introduzir uma mutação de promotor gltA <4 00> 10 atcggtataa tgtgttaacc <210> 11 <211> 40 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 4 para introduzir uma mutação de promotor gltA <400> 11 gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc <210> 12 <211> 28 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador de sequência de promotor gltA <400> 12 agggatccgt ccagtctcag acagcatc <210> 13 <211> 17 <212 > ácido nucl ei c o <220> iniciador universal M13RV <400> 13 caggaaacag ctatgac <210> 14 <211> 20 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador A para clonagem de ICDH <400> 14 gaattcgctc ccggtgcagc <210> 15 <211> 20 <212> ácido nucleico <220> iniciador B para clonagem de ICDH <400> 15 gatgcagaat tccttgtcgg <210> 16 <211> 28 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 1 para introduzir uma mutação de promotor ICD <400> 16 tggattgctg gctataatgg tgtcgtga <210> 17 <21Ι> 53 <2ΐ2> ácido nucleico <220> iniciador 2 para introduzir uma mutação de promotor ICD <400> 17 caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga <210> 18 <211> 53 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 3 para introduzir uma mutação de promotor ICD <4G0> 18 caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga <210> 19 <211> 28 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 4 para introduzir uma mutação de promotor ICD <400> 19 ggctgaaact gctataatag gcgccagc <210> 20 <211> 51 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 5 para introduzir uma mutação de promotor ICD <400> 20 ggaaacacgg cgttgccatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210> 21 <211> 51 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador 6 para introduzir uma mutação de promotor ICD <400> 21 ggaaacacgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210> 22 <211> 22 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador de sequência de promotor ICD <4 00> 22 gtgcgggtcc agatgatctt ag <210> 23 <211> 20 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador A para amplificação de nptll <400> 23 gggatcccgg atgaatgtca <400> 24 <Z11> 23 c2i2> ácido nucleico <220> iniciador B para amplificação de nptll <4 0 0 > 24 gcccggggtg ggcgaagaac tcc <210> 25 <21Z> 23 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para amplificação de Brevibacterium lactofermentum pdhA gene LA <400> 25 aci gti tci atg ggi cti ggi cc <210> 26 <211> 23 <2ΐ2> ácido nucleico ' <220 iniciador para amplificação de Brevibacterium lactofermentum pdhA gene LA <40G> 26 cct tci ccg tti agi gti gti cg <210> 27 <211> 30 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para a clonagem in vitro de Brevibacterium lactofermentum pdhA geneticamente <400> 27 ttg cag tta acc acg aag gtc agg ttg tcc <210> 2Θ <211> 30 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para a clonagem in vitro de Brevibacterium lactofermentum pdhA geneticamente <400> 28 tgg atg aga cca cgt gat tct ggc tcg tcc <210> 29 <211> 30 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para a clonagem in vitro de Brevibacterium lactofermentum pdhA geneticamente <40Q> 29 aca gat cct gca cga agg cat caa cga ggc <21Q> 30 <211> 30 < 212 > ácido nucleico <220> iniciador para a clonagem in vitro de Brevibacterium lactofermentum pdhA geneticamente <400> tca tcg ctg cgg gta cct cct acg cca ccc <210> 31 <211> 2766 <2i2> ácido nucleico <213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 <220> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 pdhA gene LA <400> 31 atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc tcg gat gac tct aac 48 Met Ala Asp Gin Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn 1 5 10 15 ttc gcg atg ate cgc gat ggc gtg gca tct tat ttg aac gac tca gat 96 Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Vai Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp 20 25 30 ccg gag gag acç aac gag tgg atg gat tca ctc gac gga tta ctc cag 144 Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gin 35 40 45 gag tct tct cca gaa cgt gct cgt tac ctc atg ctt cgt ttg ctt gag 192 Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu 50 55 60 cgt gca tct gca aag cgc gta tct ctt ccc cca atg acg tca acc gac 240 Arg Ala Ser Ala Lys Arg Vai Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct gaa ttc cca ggc gat 288 Tyr Vai Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp 85 90 95 gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att cgc tgg aac gca gcc 336 Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp As π Ala Ala 100 105 110 ate atg gtt cac cgc gct cag cga cca ggc ate ggc gtc ggc gga cac 384 Ile Met Vai His Arg Ala Gin Arg Pro Gly Ile Gly Vai Gly Gly His 115 120 125 att tcc act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac gaa gtt ggc ttc aac 432 Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Vai Gly Phe Asn 130 135 140 cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc ggc gac cag ate ttc 480 His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gin Ile Phe 145 150 155 160 ttc cag ggc cac gca tea cca ggt atg tac gca cgt gca ttc atg gag 528 Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu 165 170 175 ggt cgc ctt tet gaa gac gat ctc gat ggc ttc cgt cag gaa gtt tcc 576 Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gin Glu Vai Ser 180 185 190 cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac cca cac ggt atg aag 624 Arg Glu Gin Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys 195 200 205 gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt ctt ggc cca atg gat 672 Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Vai Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp 210 215 220 gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac ctc gaa aac cgt ggc ate 720 Ala Ile Tyr Gin Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile 225 23Q 235 240 aag gac acc tct gac cag cac gtc tgg gcc ttc etc ggc gac ggc gaa 758 Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Vai Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 atg gac gag cea gaa tea cgt çgt ctc ate cag cag gct gea ctg aac 816 Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gin Gin Ala Ala Leu Asn 260 265 270 aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc aac ctg cag cgt ctc 864 Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Vai Vai Asn Cys Asn Leu Gin Arg Leu 275 280 285 gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag ate ate cag gaa ctc gag tcc 912 Asp Gly Pro Vai Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gin Glu Leu Glu Ser 290 295 300 ttc ttc cgt ggc gea ggc tgg tct gtg ate aag gtt gtt tgg ggt cgc 960 Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Vai Ile Lys Vai Vai Trp Gly Arg 305 310 315 320 gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat ggt gea ctt gtt gag 1008 Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp Gly Ala Leu Vai Glu 325 330 335 ate atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag acc ttc aag gct aac 1056 Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 gac ggc gea tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga cgt gac cca cgc acc 1104 Asp Gly Ala Tyr Vai Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr 355 360 365 gea aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa ate tgg aag ctg cca 1152 Ala Lys Leu Vai Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro 370 375 380 cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca gcc tac aaç cga gct 1200 Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Vai Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala 385 390 395 400 ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc ate ctt gct cac acc att aag 1248 Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Vai Xle Leu Ala His Thr Ile Lys 405 410 415 ggc tac gça ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt aac gca acc cac cag 1296 Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gin 420 425 430 atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg ttc cgc gac aag cag 1344 Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gin 435 440 445 ggc ate cca ate acc gat gag cag ctg gag aag gat cct tac ctt cct 1392 Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro 450 455 460 cct tac tac cac cca ggt gaa gac gct cct gaa ate aag tac atg aag 1440 Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys 465 470 475 480 gaa cgt cgc gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca gag cgt cgt gag aac 1488 Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn 485 490 495 TAC GAT CCA ATT CAG GTT CCA CCA CTG GAT AAG CTT CGC TCT GTC CGT 1536 Tyr Asp Pro Ile Gin Vai Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Vai Arg 500 505 510 aag ggc tec ggc aag cag cag ate gct acc act atg gcg act gtt cgt 1584 Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin Ile Ala Thr Thr Met Ala Thr Vai Arg 515 520 525 acc ttc aag çaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg gct gat cgc ctt gtc 1632 Thr Phe Lys 'Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Vai 530 535 540 cea ate att cct gat gag gea cgt acc ttc ggt ctt gac tet tgg ttc 1680 Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe 545 550 555 560 cea acc ttg aag ate tac aac ccg cac ggt cag aac tac gtg cct gtt 1728 Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gin Asn Tyr Vai Pro Vai 565 570 575 gac cac gac ctg atg etc tcc tac cgt gag gea cct gaa gga cag ate 1776 Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gin Ile 580 585 590 ctg cac gaa ggc ate aac gag gct ggt tcc gtg gea tcg ttc ate gct 1824 Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Vai Ala Ser Phe Ile Ala 595 600 ' 605 gcg ggt acc tcc tac gcc acc cac ggc aag gcc atg att ccg ctg tac 1872 Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met Ile Pro Leu Tyr 610 615 620 ate ttc tac tcg atg ttc gga ttc cag cgc acc ggt gac tcc ate tgg 1920 Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr Gly Asp Ser Ile Trp 625 630 635 640 gea gea gcc gat cag atg gea cgt ggc ttc etc ttg ggc gct acc gea 1968 Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala 645 650 655 ggt cgc acc acc ctg acc ggt gaa ggc etc cag cac atg gat gga cac 2016 Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin His Met Asp Gly His 660 665 670 tcc cct gtc ttg gct tcc acc aac gag ggt gtc gag acc tac gac cca 2064 Ser Pro Vai Leu Ala Ser Thr Asn. Glu Gly Vai Glu Thr Tyr Asp Pro 675 680 685 tcc ttt gcg tac gag ate gea cac ctg gtt cac cgt ggc ate gac cgc 2112 Sér Phe Ala Tyr GLu Ile Ala His Leu Vai His Arg Gly Ile Asp Arg 690 695 700 atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt ate tac tac ate acc ate 2160 Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Vai Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile 705 710 715 720 tac aac gag cca acc cca cag cca gct gag cca gaa gga ctg gac gta 2208 Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Vai 725 730 735 gaa ggc ctg cac aag ggc ate tac etc tac tcc cgc ggt gaa ggc acc 2256 Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr 740 745 750 ggc cat gag gea aac ate ttg gct tcc ggt gtt ggt atg cag tgg gct 2304 Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Vai Gly Met Gin Trp Ala 755 760 765 ctc aag gct gea tcc ate ctt gag gct gac tac gga gtt cgt gcc aac 2352 Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Vai Arg Ala Asn 770 775 780 att tac tcc gct act tet tgg gtt aac ttg gct cgc gat ggc gct gct 2400 Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Vai Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala 785 790 795 800 cgt aac aag gea cag ctg cgc aac cca ggt gea gat gct ggc gag gea 2448 Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala 805 810 815 ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc cca tac gtt gca gtg 2496 Phe Vai Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly Pro Tyr Vai Ala Vai 820 825 830 tct gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag ate cgt gaa tgg gtc cca 2544 Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin Ile Arg Glu Trp Vai Pro 835 840 845 ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc ggt ttc tct gat acc 2592 Gly Asp Tyr Thr Vai Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr 850 855 860 cgc cca gct gct cgt cgc ttc ttc aac ate gac gct gag tcc att gtt 2640 Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn He Asp Ala Glu Ser Ile Vai 865 870 875 880 gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc aag ate gac gtc tcc 2688 Vai Ala Vai Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile.Asp Vai Ser 885 890 895 gtt gct gct cag gct gct gag aag ttc aag ttg gat gat cct acg agt 2736 Vai Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser 900 905 910 gtt tcc gta gat cca aac gct cct gag gaa 2766 Vai Ser Vai Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu <210> 32 <21I> 8556 <2i2> ácido nucleico <213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 <400> 32 tcacgttacg gcgatcaaca ccgcaaccac tacgagaaga tctccaaacg agaccaagag 60 cgcttctaag cccgtctcat tttgcacctg ccattctgtg aggatatggc aggtgctttt 120 tcatgccact atcttggggt Cctcggtatt agatcttctg ataaaaaccc gatagttttc 180 ttgcgctaga cactaattac ggcaccgctt aagcatggtc gtgacacgta aaacctgact 240 taggccattt tgatgtggtg tagatcatat tgacgtcaat gaatgaagtg actaactccg 300 ccgaatccac atcgtctaaa aggcctgggc gaccacgtaa agacgggcac gacgagaaga 360 tcatcgacgc aactttacgg ctcatcgaca gcaatcgtcc cgtcacggtc aatgcagttg 420 tcaaagaaag cggagtggca cgtgcagcgg tttatcgacg ctggcccagg ctagtggatc 480 tagtagcgga agctttagat gccgggcgag ctccagttga aatagatacc ccaggggaca 540 tcaaagagac cttgattgat gggctçttta caaatcaggc gaaaaccact ggagtctcct 600 atcctcgtca gcgatttcgc aaacggctcg agttggtgat gtcagatcaa gaattacagc 660 tcgcctaatg gaattcacat gtgaagagac gtcgagaagc aaatattcgc gcgctgcaag 720 tcgcgcaaga aaaaggccaa atccgggcgg atctagacat cgaggcgtgc ctcgatgcaa 780 tccttggggt gCCttattac caatcggtcg cgcgtggagt aaatttcacc gaccaaggta 840 caacgcaacg atgcagagaa gcctCggagg tgatctggca tggaatggaa ccttaaattc 900 aggttctçac gaggtgcgaa gcaagctgtc gcgcgccgca cctcagtatc cggatcaact 960 taatttcgaa gtgctgggtt ttctcgcgca tacccaatgc gtaccgatgt gcccatgagc 1020 gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa ctCatcgtgg cctgcttcta Catttgtgcg 1080 ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt 'ccagctgagc 1140 taaaggcgcg cacgtgcCCt tctagaacca cctKggtggc cCcgaaagca acgagtgaaa 1200 tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260 gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt: 1320 ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtit gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380 gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440 agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500 gcacgacatc gcacagçtcg tcggttCctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560 cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620 gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680 gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740 ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800 ggtactttga accacctttc cctggaattt tCtccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860 atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920 acaattctcC tcaaaataat ggtgçctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980 cagacctgta gttttaCgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040 aactacccga taattctttg caaaactttg caaagggtaa tgaacatgca gctagtttcc 2100 gtagaaatgt tctttaaaaa atccacaaca attgccagga agcacaccga ttgatggata 2160 cctgaaatcc cagtgagcgc accactcccc ttacgtcaca gtctgtaaaa caaatcttcg 2220 gtgttgcgta tccttgttaa taacttatgc gttgacccat tcgtgcactt cggtgtgcca 2230 caattaggta cgaccaagaa tgggaccggg 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Arg Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp 320 325 330 ggt gca ctt gtt gag ate atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag 3400 Gly Ala Leu Vai Glu Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin 335 340 345 acc ttc aag gct aac gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga 3448 Thr Phe Lys Ala Asn Asp Gly Ala Tyr Vai Arg Glu His Phe Phe Gly 350 355 360 cgt gac cca cgc acc gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa 3496 Arg Asp Pro Arg Thr Ala Lys Leu Vai Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu 36S 370 375 ate tgg aag ctg cca cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca 3544 Ile Trp Lys Leu Pro Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Vai Tyr Ala 380 385 390 395 gcc tac aag cga gct ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc ate ctt 3592 Ala Tyr Lys Arg Ala Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Vai Ile Leu 400 405 410 gct cac acc att aag ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt 364 0 Ala His Thr lie Lys Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg 415 420 425 aac gca acc cac cag atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg 3688 Asn Ala Thr His Gin Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu 430 435 440 ttc cgc gac aag cag ggc ate cca ate acc gat gag cag ctg gag aag 3736 Phe Arg Asp Lys Gin Gly Ile Pro Xle Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys 445 450 455 gat cct tac ctt cct cct tac tac cac cca ggt gaa gac gct cct gaa 3784 Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu 460 465 470 475 ate aag tac atg aag gaa cgt cgc gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca 3832 Ile Lys Tyr Met Lys Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro 480 485 4 90‘ gag cgt cgt gag aac tac gat. cca att cag gtt cca cca ctg gat aag 3880 Glu Arg Arg Glu Asn Tyr Asp Pro Ile Gin Vai Pro Pro Leu Asp Lys 495 500 505 ctt cgc tet gtc cgt aag ggc tcc ggc aag cag cag ate gct acc act 3928 Leu Arg Ser Vai Arg Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin Ile Ala Thr Thr 510 515 520 atg gcg act gtt cgt acc ttc aag gaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg 3976 Met Ala Thr Vai Arg Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu 525 530 535 gct gat cgc ctt gtc cca ate att cct gat 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gea ggt cgc acc acc ctg acc ggt gaa ggc etc cag 4360 Leu Gly Ala Thr Ala Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin 655 660 665 cac atg gat gga cac tcc cct gtc ttg gct tcc acc aac gag ggt gtc 4408 His Met Asp Gly His Ser Pro Vai Leu ALa Ser The Asn Glu Gly Vai 670 675 680 gag acc tac gac cca tcc ttt gcg tac gag ate gea caç ctg gtt cac 4456 Glu Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Vai His 685 690 695 cgt ggc ate gac cgc atg tac ggc cea ggc aag ggt gaa gat gtt ate 4504 Arg Gly Ile Asp Arg Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly GXu Asp Vai IXe 700 705 7X0 715 tac tac ate acc ate tac aac gag cea acc cea cag cea gct gag cea 4552 Tyr Tyr Ile Thr IXe Tyr Asn GXu Pro Thr Pro GXn Pro AXa GXu Pro 720 725 730 gaa gga ctg gac gta gaa ggc ctg cac aag ggc ate tac etc tac tcc 4600 GXu GXy Leu Asp VaX GXu GXy Leu His Lys GXy IXe Tyr Leu Tyr Ser 735 740 745 cgc ggt gaa ggc acc ggc cat gag gea aac ate ttg gct tcc ggt gtt 4648 Arg GXy GXu GXy Thr GXy His GXu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly VaX 750 755 760 ggt atg cag tgg gct etc aag gct gea tcc ate ctt gag gct gac tac 4695 Gly Met Gin Trp Ala Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr 765 770 775 gga gtt cgt gcc aac att tac tcc gct act tet tgg gtt aac ttg gct 4744 Gly VaX Arg Ala Asn Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Vai Asn Leu Ala 780 785 790 795 cgc gat ggc gct gct cgt aàc aag gea cag ctg cgc aac cea ggt gea 4792 Arg Asp Gly Ala Ala Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala 800 805 610 gat gct ggc gag gea ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc 4840 Asp Ala Gly Glu Ala Phe Vai Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly 815 820 825 cea tac gtt gea gtg tet gac ttc tcc act gat ctg cea aac cag ate 4888 Pro Tyr Vai Ala Vai Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin Ile 830 835 840 cgt gaa tgg gtc cca ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc 4936 Arg Glu Trp Vai Pco Gly Asp Tyr Thr Vai Leu Gly Ala Asp Gly Phe 845 350 855 ggt ttc tct gat acc cgc cca gct gct cgt cgc ttc ttc aac ate gac 4984 Gly Phe Ser Asp Thr Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp 860 365 870 875 gct gag tcc att gtt gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc 5032 Ala Glu Ser Ile Vai Vai Ala Vai Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly 880 885 890 aag ate gac gtc tcc gtt gct gct cag gct gct gag aag ttc aag ttg 5080 Lys Ile Asp Vai Ser Vai Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu 895 900 9C5 gat gat cct acg agt gtt tcc gta gat cca aac gct cct gag gaa taaat 5130 Asp Asp Pro Thr Ser Vai Ser Vai Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 910 915 920 cacctcaagg gacagataaa tcccgccgcc agacgttagt ctggcggcgg gattcgtcgt 5190 aaagcaagct ctttttagcc gagaaacgcc ttgtcagaca atgttgcgcc cttgatattg 5250 gcgaactcct gcagcaaatc gcgcacagtc aacttcgact tggtagcctg atctgcctgg 5310 tagacaatct ggccttcatg catcatgatc aggcgattgc ccaggcgaat tgcctgttcc 5370 atgttgtgcg tgaccataag cgtagtcaga gttccatctg ccacgatctt tteggtcaag 5430 gtggtcacaa gctctgcacg ctgtggatca agcgctgcgg tgtgctcatc caacagcatg 5490 attttaggtt gagtaaaacc agccatcagc agggacaatg cctgacgctg accgccagag 5550 agcaaaccaa ctttggcagt gagcctgttt 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mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium lactofermentum <4Q0> 35 cgt ccc ggg ctg taa aac aaa tct tcg g <210> 36 <211> 27 <2ΐ2> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir uma mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium Iactofermentum <400> 36 ate ccc ggg ctt acc acc aag ttt tgc <210> 37 <211> 30 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir uma mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium Iactofermentum <400> 37 ctt atg cgt tgc cac att cgt gea ctt cgg <210> 38 <211> 40 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir uma mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium Iactofermentum <400> 38 gcg ttg acc cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g <210> 39 <211> 40 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir uma mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium Iactofermentum <400> 39 gcg ttg cca cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g <210> 40 <211> 38 <2ΐ2> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir uma mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium iactofermentum <400> 40 ttt taa aac gtt ctg gag aag act cct gga gta ate cg <21Q> 41 <211> 20 <2i2> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir uma mutação de promotor LA de gene pdhA de Brevibacterium Iactofermentum <400> 41 cça tet tgc ctt cgc gtg cc <21Q> 42 <211> 30 < 212 > ácido nucleico <4 0 0 > 42 agaccgccgg agtatgcaag aacgatgcgg <210> 43 <211> 30 < 212 > ácido nucleico <400> 43 gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta <210> 44 <211> 3 Q <212> ácido nucleico <400> 44 accttcgacc agaccctggc taagggcttt <210> 45 <211> 30 < 212 > ácido nucleico <400> 45 gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac <210> 46 <211> 25 <2i2> ácido nucleico <400> 46 gcgatgacac cgtttttgtt: ctcgc <210> 47 <211> 25 < 212 > ácido nucleico <400> 47 ggcgacatcc ttgcccagat gatca <210> 48 <211> 25 <2i2> ácido nucleico <400> 48 gacttcacca tcaatcatct tcttc <210> 49 <211> 24 < 212 > ácido nucleico <400> 49 gccaggtaca acCgtctgaa ttgc <21Q> 50 <211> 40 <212> ácido nucleico <220> iniciador para introduzir umaTnutação <400> 50 gttaatcgct tgccaatgca ggcaggtaag gtacaacccg <210> 51 <211> 40 <212 > ácido nucleico <400> 51 gttaatcgct tgctaatgca ggcaggcaag gcataacccg <210> 52 <2 11> 40 <212> ácido nucleico <400> 52 gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtacaacccg <210> 53 <211> 40 <212> ácido nucleico <400> 53 gttaatcgct tgttaatgca ggcaggtaag gtataatccg <210> 54 <211> 40 <212 > ácido nucleico <400> 54 gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataatccg <210> 55 <211? 30 . <212> ácido nucleico <400> 55 gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag <210> 55 <211> 25 <212> ácido nucleico <400> 56 gcgttaccca gagctggaCc ctcgg <210> 57 <211> 16 <2i2> ácido nucleico <í400> 57 cagttgtggc tgatcg <210> 58 <211> 17 <212> ácido nucleico <4 00> 58 ctttcccaga ctctggc <210> 59 <211> 21 < 212 > ácido nucleico <40Q> 59 gctataattt gacgtgagca t <210> 60 <211> 25 <212> ácido nucleico <400> 60 gctcacgtca aattatagca gtgtc <210> 61 <2 11> 54 <212> ácido nucleico <40Q> 61 ttgttgtcat tctgtgcgac actgctataa tCtgaacgtg agcagttaac agcc <210> 62 <211> 63 <212> ácido nucleico <400> 62 gttaactgct cacgttcaaa ttatagcaft gtcgcacaga atgacaacaa agaattaaaa ttg <210> 63 <211> 25 <212 > ácido nucleico <4 00> 63 gctagcctcg ggagctctct aggag <210> 64 <211> 25 <2i2> ácido nucleico <400> 64 gatctttccc agactctggc cacgc Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Outras Informações: - Nome do Arquivo: 068775e008.txt - Data de Geração do Código: 20-05-2013 - Hora de Geração do Código: 08:36:47 - Código de Controle: - Campo 1: 663537B4319822A2 - Campo 2: E39E0BCE8CE9A2ED

Claims

1. Processo para produzir um ácido L-glutâmico, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de cultivar Brevibacterium lactofermentum expressando uma glutamato dehidrogenase (GDH), em que a sequência promotora do gene GDH localizada em um cromossomo da bactéria é modificada de modo a conter: (i) sequência TGGTCA ou TTGTCA na região -35 da sequência promotora; e (ii) sequência TATAAT na região -10 da sequência promotora.

2. Processo para produzir um ácido L-glutâmico, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de cultivar Brevibacterium lactofermentum expressando uma citrato sintase (CS), em que a sequência promotora do gene gltA localizada em um cromossomo da bactéria é modificada de modo a conter: (i) sequência ATGGCT ou TTGACA na região -35 da sequência promotora; e (ii) sequência TATAAT na região -10 da sequência promotora.