TWI247806B - Method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacteria - Google Patents

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1247806 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明是關於構築一種具有高產量之產製胺基酸能力 之細菌突變株的方法，以及經由此突變株的醱酵作用而產 製L-胺基酸的方法。 【先前技術】 構築可經由醱酵而產製胺基酸之突變株的方法大致可 分爲兩種。一種是以一化學突變劑隨機導入突變至DNA 中，另一種是經由基因重組作用。就後者方法而言，若一 品系具有改良之產製所要物質的能力，此能力可經由加強 關於此物質生物合成代謝路徑之基因來達成，或經由減弱 一會破壞此物質的酵素基因。基於此觀點，爲加強指定之 基因’在細胞中利用一個能獨立於染色體外複製的質體。 然而利用質體加強指定基因之方法有一些問題，特別 是指定基因的加強程度常視所用質體的複製數目而異。因 此有一些種類的指定基因複製數目過多而導致表現過度進 而嚴重抑制生長，或所要物質的產製力較低。在此種情況 下，雖然使用小複製數目之質體對指定基因的加強程度較 低，但對指定基因的表現程度之控制是非常重要的。 另一問題是質體的複製通常不穩定，且質體常被移除 舉例言之，日本專利未審查公開案（以後文中稱爲〜 J· P. KOKAI" ) No ·· Sho 6 1 - 268 1 8 5 揭示一衍生启產製 (2) 1247806 麩胺酸之棒狀桿菌的重組DNA，此重組DNA包含一 DNA 片段具有產製麩胺酸去氫酶（GDH )基因（glutamate dehydrogenase gene)，以及揭示一 DNA片段（質體）含 有細胞內自動複製的必要基因。此文獻1也揭示導入此重 組DNA到一細胞內，而形成GDH-加強品系，藉此微生 物生長而促進物質（譬如胺基酸和蛋白質）的產製。 另一方面，在日本專利2,520,895中，將上述的重組 DNA導入棒狀桿菌中得到一具有改良酵素活性的品系， 且經由醱酵此品系而產製L-麩胺酸。然而L-麩胺酸的 產製及產量並不令人滿意。因此，需要進一步改良L-麩 胺酸的產製力。改良方法已達成，亦即將含有衍生自產製 麩胺酸之棒狀桿菌的產製麩胺酸去氫酶基因和異檸檬酸合 成酶基因（ICDH )兩種基因的重組DNA導入至產製麩胺 酸的棒狀桿菌內。 更進一步，JP Kokai No. Hei6 - 502548揭示棒狀桿菌 的表現，和含有一棒狀桿菌品系和一分泌匣的分泌系統； 此分泌匣包含用於在此品系中表現的第一項功能性DNA 序列，用於編碼胺基酸的第二項DNA序列，以及插入介 於第一項DNA序列和第二項DNA序列間的第三項DNA 序列，其中該第三項DNA序列編碼的蛋白質要素是選自 PS1和PS2，其可保證此胺基酸，多胜肽和/或蛋白質的 分泌。具體言之，多胜肽的分泌已揭示於該文獻中。特別 的是誘發棒狀桿菌品系的NTG突變作用，且篩選一具有 4 一氟麩胺酸（4FG )抗性的突變株，由於4FG類似麩胺 (3) 1247806 酸，因此以PCGL141轉形之。該文獻中也揭示可從類似 抗性細菌中取得加強表現GDH的品系。該文獻中也揭示 觀察到GDH啓動子核苷酸序列251到266的突變作用。 【發明內容】 本發明目標是提供構築突變株之方法，使其不需使用 質體就能適當加強或控制指定基因的表現，且可經由重組 作用或突變作用產製高產量的胺基酸。 本發明的另一目標是提供一 GDH啓動子，其在棒狀 桿菌品系中不需要嚴重增加副產物天冬胺酸和丙胺酸的量 就具有產製高產量麩胺酸的能力。 本發明的另一目標是提供一具有上述GDH啓動子序 列的GDH基因。 本發明的進一步目標是提供一具有上述基因的棒狀細 菌品系，其能產製L 一麩胺酸。 本發明的進一步目標是提供一方法，其係藉由醱酵作 用產製胺基酸，其中產製胺基酸的微生物係被構築後使用 〇 本發明的進一步目標是提供一產製麩胺酸的醱酵方法 ，其係經由利用產製麩胺酸之棒狀桿菌在低成本下增加麩 胺酸的產量。 本發明已有效率的解決上述的問題，在染色體上改變 胺基酸-生物合成基因的啓動子而控制指定基因的表現量 。特別的是，本發明已有效率解決上述.問題，是經由在啓 (4) 1247806 動子的特區域一 35區域或一 10區域中導入特殊穿 亦即本發明提供一產製具有改良之胺基酸或 製力之棒狀桿菌的方法，其步驟包括在棒狀桿菌 的胺基酸或核苷酸生物合成基因之啓動子序列中 而使其接近一致序列，或以重組作用在棒狀桿菌 的胺基酸或核苷酸生物合成基因之啓動子序列中 化而使其接近一致序列，以得到棒狀桿菌的胺基 酸產製突變株，培養此突變株，並篩選能大量產 胺基酸或核苷酸的突變株。 本發明也提供一產製麩胺酸去氫酶（GDH ) 動子，其中至少有一 DNA序列是選自下列各組 在一 35 區域的 CGGTCA，TTGTCA，TTGACA 和 ’ （ii ) TATAAT序列或相同於TATAAT序列{ί 中鹼基已被其它鹼基取代而不會在- 10區域抑 功能者，和（iii )該（i )和（ϋ )之組合。 本發明也提供一具有上述啓動子的麩胺酸去 〇 本發明也提供一具有上述基因的產製L-麩 細菌。 本發明也提供一經由醱酵產製胺基酸的處理 步驟包括培養一*經由上述方法所構築的棒狀桿菌 養基中生成具有改良產製胺基酸的能力，以及在 累積指定的胺基酸，並從培養基中收集此胺基酸 本發明也提供一經由醱酵產製L -麩胺酸的 〕突變。 核苷酸產 染色體上 導入突變 染色體上 導入一變 酸或核苷 製指定之 基因的啓 (i )位 TTGCCA 3 ATAAT 制啓動子 氫酶基因 胺酸棒狀 過程，其 ，且在培 培養基中 〇 處理過程 -8- (5) 1247806 ’步驟包括在含有4 -氟麩胺酸之液態培養基中培養-產 製L-麩胺酸的棒狀微生物，以及在培養基中累積L-麩 胺酸，並從培養基中收集此胺基酸。 進行本發明的最佳方法 文中 > 產製麩胺酸的棒狀微生物〃一詞也包括分類爲 短桿菌屬（Brevibacterium) [ Int. J. Syst. Bacteriol., 41，25 5 ( 1 98 1 )〕的細菌，短桿菌屬過去被分類爲棒狀桿 菌屬但現在已不屬於，但仍非接近棒狀桿菌屬。因此本發 明所使用的突變株衍生自產製麩胺酸的短桿菌屬或棒狀桿 菌如下所示。棒狀桿菌屬及短桿菌屬的細菌都集合稱爲y 棒狀桿菌〃，這些尙未牽涉麩胺酸產製力。 ATCC13870 嗜乙醯酸棒狀桿菌（Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC15806 乙醯魅胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 1 599 1 帚石南棒狀桿菌（Corynebacterium c a 11 u n a e) ATCC 1 3 0 3 2 鍵胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum) 分叉短桿菌（Brevibacterium divaricatum) ATCC14020 乳酸醱酵短桿菌（Brevibacterium ATCC 1 3 8 69 lactofermentum) (6) 1247806 百合棒狀桿菌（Corynebacterium lilium) 黃色短桿菌（Brevibacterium flavum) 梅拉司克棒狀桿菌（Corynebacterium melassecola) 解糖短桿菌（Brevibacteriu saccharoly ticum) 伊馬瑞短桿菌（Brevibacteriu immariophilum) 薔薇短桿菌（Brevibacteriu roseum) 嗜硫短桿菌（Brevibacteriu thiogenitalis) 嗜氨微桿菌（Microbacterium ammoniaphilum) 產熱胺棒狀桿菌（Corynebacterium thermoaminogenes) 所產製的胺基酸並沒有特別限制是已 合成及其啓動子的基因。關於生物合物的 括麩胺酸醱酵作用中的GDH，檸檬酸合 檸檬酸去氫酶（ICDH)，丙酮酸去氫酶 酸酶（ACO)。 離胺酸醱酵過程所用的酵素包括生物 天冬胺酸激酶（AK )，二水合吡啶二羧 合吡啶二羧酸還原酶，二胺基庚二酸鹽去 二酸鹽去羧酶。關於離胺酸薄膜排出的離 ATCC 1 5 990 ATCC14067 ATCC 1 7965 ATCC14066 ATCC14068 ATCC 1 3 82 5 ATCC19240 ATCC 1 5 3 5 4 AJ12310(FER Μ 9246) 證實相關於生物 有效酵素範例包 交酶（CS )，異 (PDH )和烏頭 合成酵素，譬如 梭合成酶；二水 氫酶和二胺基庚 胺酸排出蛋白質 -10· (7) 1247806 (lysE基因）也是有效的。 精胺酸醱酵過程所用的酵素包括N-乙醯麩胺酸合成 酶，N-乙醯麩胺酸激酶，N-乙醯麩胺酸磷酸鹽還原酶 ，乙醯鳥胺酸轉胺基酶，N -乙醯鳥胺酸酶；鳥胺酸轉胺 基甲醯酶，精胺基琥珀酸合成酶，和精胺基琥珀酸酶。經 .由這些酵素進行催化反應形成胺基酸。這些酵素是有效用 的。這些酵素依序分別由 argA，argB，argC，argD， aegE，argF，argG和argH所編碼的酵素。 絲胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括3 -磷酸甘油酸 去氫酶，磷酸絲胺酸反式-澱粉酶，磷酸絲胺酸磷酸酶等 等。 苯丙胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括生物合成酵素 ， 譬如去氧阿拉賓庚酸磷酸合成酶 ( deoxyarabinohepturonic acid phosphoric acid synthetic enzyme ) ，3—去氫金雞納酸合成酶，3—去氫金雞納酸去 水合酶，莽草酸去氫酸，莽草酸激酶，5 -烯醇丙酮基莽 草酸—3 —隣酸合成酶，分支酸（ch〇rismic acid)合成酶 ’分支酸變位酶，代丙酮酸去水酶（prephenate dehydroratase)等等。糖代謝酵素譬如轉酮醇酶，轉醛醇 酶，磷酸烯醇丙酮酸合成酶等等。 色胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括屬於色胺酸操縱 子（operoii)的酵素，除了上述苯丙胺酸醱酵所需之各種 有效酵素之外’也包括上述絲胺胺酸醱酵所需之各種有效 酵素。 -11 - (8) 1247806 脯胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括r ，r 一麩胺酸半醛去氫酶，吡咯啉一 5—羧 和上述麩胺酸醱酵所需之各種有效酵素。 麩醯胺酸醱酵過程所用的有效酵素包括 酶，和上述麩胺酸醱酵所需之各種有效酵素 在肌核苷（inosine)的產製中，加強5 1 一二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1 一二磷 磷酸核糖基胺基咪唑羧醯胺轉甲醯基酶等等 是有用的。 在鳥嘌呤核普（guano sine )的產製中 核苷酸去氫酶和5 ’ -黃核苷酸胺酶之表現， 核糖基1 一二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1 基酶，及磷酸核糖基胺基咪唑羧醯胺轉甲醯 是有用的。 在腺苷（adenosine )的產製中，加強！ 合成酶和5-磷酸核糖基1 -二磷酸合成酶， 基1 -二磷酸轉胺基酶，及磷酸核糖基胺基 甲醯基酶等的表現被認爲是有用的。 在核苷酸的產製中，加強磷酸核糖基轉 激酶，鳥嘌呤核苷激酶和腺苷激酶的表現被 〇 在本發明中產製胺基酸的棒狀細菌突變 在一產製胺基酸的棒狀桿菌之染色體上對所 生物合成基因的啓動子序列造成突變而得， -麩胺酸激酶 化鹽還原酶， 麩醯胺酸合成 〇 i -磷酸核糖基 酸轉胺基酶， 的表現被認爲 ，加強5 ’ 一肌 加入5 -磷酸 一二磷酸轉胺 基酶等被認爲 療核苷琥珀酸 5 -磷酸核糖 咪唑羧醯胺轉 移酶，肌核苷 認爲是有用的 株的取得，是 要之胺基酸-此類啓動子序 -12- (9) 1247806 列如上述的GDH，以化學劑對基因重組導入一突變而使 其接近一致序列。 ''一致序列〃一詞是指在各種啓動子排列中出現頻率 最高的鹼基排列。一致序列包括那些位在大腸桿菌和枯草 桿菌的序列。大腸桿菌的一致序列敘述於 Diane K. Hawley and William R. McClure Nuc. Acid. Res. 11: 223 7- 225 5 ( 1 983 )，以及枯草桿菌的一致序列敘述於

Charles et al. Mol. Gen. Genet 1 86: 3 3 9 - 3 4 6 ( 1 9 8 2) o 對如GDH般，突變可只在一啓動子序列中發生，或 對如GDH，檸檬酸合成酶（CS)和異檸檬酸去氫酶（ ICDH )般，係在兩個或多個啓動子中序列發生突變。 在本發明中所得到的突變株，經培養能產製大量所指 定的胺基酸。 目前已證明在麩胺酸的醱酵作用中，衍生自產製麩胺 酸之棒狀桿菌微生物的GDH在其上游部位具有啓動子序 歹}]〔 Sahm et al., Molecular Microbiology (1992)，6，3 17- 3 26〕。 例如，本發明所使用的GDH啓動子。GDH基因具有 GDH和產製L -麩胺酸的啓動子序列，可使用下列方法得 到具有此基因的棒狀桿菌品系： 以UV，X -射線或放射線等處理，或以突變誘發劑 處理以得到一可在包含4 -氟麩胺酸培養基中生長的抗4 -氟麩胺酸品系。也就是突變作用處理過的品系塗於包含 4 -氟麩胺酸瓊脂平板上生長，因4 -氟麩胺酸可抑制親 -13- (10) 1247806 代生長而分離出突變株。 更進一步，GDH基因的啓動子序列可用各種不同序 列經由定位突變的方法置換之，而各別序列和GDH活性 間的關係可檢查其L -麩胺酸高選殖力。 本發明中特別在意的是位在產製GDH基因啓動子-35 區域的 DNA序列，至少有一DNA序列是選自 CGGTCA，TTGTCA，TTGACA 和 TTGCCA，和 / 或位在 啓動子一 10區域TATAAT的DNA序列，或以其它鹼基置 換T ATT AT中之AT A AT鹼基而不抑制啓動子功能者。位 在一 10區域之TATTAT中的ΑΤΑ AT以其它鹼基置換而不 抑制啓動子功能者可以選擇使用的理由如下：因爲觀察到 只以'' T〃置換野生型一 10區域序列之CAT A AT的第1個 ，C〃 （表1中的p6 - 4 )就明顯增加GDH的特殊活性， 因此認爲以另一鹼基置換是可行的。 如上敘述之 GDH基因的啓動子序列敘述於Sahm et al.，Molecular Microbiology (1992)，6，317-326。其中敘 述爲序列號碼 1。而 GDH基因其本身的序列也敘述於 Sahm et al., Molecular Microbiology ( 1 992), 6，3 1 7-3 26， 亦爲序列號碼1。 同樣的，亦可在檸檬酸合成酶（CS)或異檸檬酸去 氫酶（ICDH)的啓動子中製造突變。 如此，則GDH啓動子是那些具有至少一個DNA序列 是選自位在一 35區域 CGGTCA，TTGTCA，TTGACA和 TTGCCA和/或TATAAT或相同之 TATAAT序列但其 -14- (11) 1247806 ataat鹼基已被其它鹼基置換但不抑制位在一 10區域的 啓動子功能。本發明也提供產製麩胺酸去氫酶的基因具有 上述啓動子。 CS的啓動子具有位在一 35區域中的TTGACA序列和 /或位在一 10區域中的TATA AT序列，且沒有任何序列 會抑制啓動子功能。本發明也提供C S基因具有上述啓動 子。 使用於icd的啓動子是具有TTGCCA或TTGACA序 列之第一個或第二個啓動子在一 35區域，和/或具有 TATA AT序列之第一個或第二個啓動子在一 10區域，但 其不抑制啓動子的功能。本發明也提供具有上述啓動子的 icd基因。 使用於PDH的啓動子是具有TTGCCA序列在一 35區 域和/或TATA AT序列在一 10區域，且其不抑制啓動子 的功能。本發明也提供具有上述啓動子的PDH基因。 本發明也提供具有上述基因的產製L-麩胺酸棒狀桿 菌。 藻朊酸琥珀酸合成酶的啓動子是那些具有至少一個 DNA序列是選自位在一 35區域之TTGCCA，TTGCTA和 TTGTCA和/或位在一1〇區域的TATA AT序歹IJ，或以其 它鹼基置換位在TATT AT中之AT A AT鹼基，但其不抑制 此啓動子功能者。本發明也提供具有上述啓動子的藻朊酸 琥珀酸合成酶。 本發明也提供具有上述基因的產製精胺酸之棒狀桿菌 -15- (12) 1247806 培養本發明的棒狀桿菌可得到胺基酸，其中以產製L -麩胺酸爲佳，是在液態培養基中形成所指定的胺基酸並 藉此累積，並從此培養基中收集胺基酸。 使用於培養本發明之上述品系細菌的液態培養基是包 含蔗糖，氮源，無機鹽，生長因子等的一般培養基。 碳源包括碳水化合物類的葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜 和澱粉水解物；醇類的乙醇和甘油；和有機酸類的醋酸。 氮源包括硫酸銨，硝酸銨，氯化銨，磷酸銨，醋酸銨，氨 ，蛋白腺，肉萃取物，酵母菌萃取物和玉米液。當使用需 特別營養素之突變株時，則加入所要求之物質以樣品或天 然物質形式加入培養液中。 在限制生物素之下棒狀桿菌常產製L -麩胺酸。因此 ’在培養基需限制生物素的量或以界面活性劑或青黴素等 對生物素具抑制影響的物質加入培養基中。 醱酵作用最好以搖動培養方法或有氧轉動培養方法在 有氧條件下進行，而培養液p Η維持在5到9持續2到7 天。以尿素，碳酸鈣’氣態氨，氨水等等控制pH値。培 養溫度以24〜37°C爲佳。 利用離子-交換樹脂方法或結晶法等常用方法控制液 體培養液中L 一麩胺酸的產製和累積。L-麩胺酸的分離 可藉由吸附在陰離子-交換樹脂或經由中和結晶作用。 根據本發明’在產製胺基酸的棒狀桿菌胺基酸一生物 合成基因的啓動子區域導入〜突變來調控指定基因的表現 -16- (13) 1247806 ’因此可藉此得到高產量的指定胺基酸。此 明的細菌並未發生任何指定基因的流失，與 能穩定得到高產量的指定胺基酸。如此，本 工業價値。 本發明提供各種啓動子，特別是G D Η .與產製胺基酸的能力，特別是麩胺酸，在棒 不需增加副產物天冬胺基和丙胺酸的量就可 酸。 在本發明中，對產製L_麩胺酸的棒狀 ，使所得品系的突變發生在GDH基因的啓 而此品系對4 -氣魅胺酸具抗性，且能在培 產量的麩胺酸。因此，本發明非常有助於工: 下列範例將更進一步例證本發明。 【實施方式】 範例1 :突變之GDH啓動子的製作

以下列的定位突變方法製備突變的GDH (；1 )具有各種突變型式之啓動子的GDH基丨 野生型棒狀桿菌GDH基因啓動子一 35 ί 域的序列顯示在序列1。野生型的啓動子序 獻[Molecular Microbiology (1 992), 6? 317-

攜帶具有突變啓動子之GDH基因的質 如下：如圖1所示，以1細菌基因體DNA 外，根據本發 質體相較之下 發明具重要的 的啓動子能賦 狀桿菌品系內 得高產量麩胺 桿菌導入突變 動子區域中， 養基中得到高 業上之利用。 啓動子： g之製備： £域和一 1 〇區 列已發表於文 3 26〕。 體之製備方法 純化套組〃（ (14) 1247806

Advanced Genetic Technologies Corp·)製備野生型棒狀 桿菌 ATCC 1 3 8 69的染色體基因作爲模板。經由 PCR在 GDH基因的上游和下游序列中增幅GDH基因。兩末端皆 爲鈍端。所得產物插入到質體PHSG3 99 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)的Smal位置。然後從具有棒狀桿菌複製起源 的質體 PSAK4中取得複製起源，即將上述質體插入 pSAK4的Sal I位置而得到質體pGDH。經由此方法，可 使用序列表中所顯示之GDH基因上游引子序列1到6爲 引子，得到具有上述各別啓動子序列的GDH基因。利用 定序決定確認任何突變，和啓動子序列中的非突變序列。 pSAK4 的構築如下：質體 pHK4 (J. P. KOKAI No. Hei 5-749 1 )具有衍生自質體 PHM1519〔 Agric· Biol· Chem·， 48，290 1 - 1 903 ( 1 984)〕的複製起源，而pHM1519能在已 得到的棒狀桿菌中自動複製，因此以BamHI和Kpnl分解 而得到具有複製起源的DNA片段。然後使用DNA—鈍端 套組（Blunting kit of Takara Shuzo Co·，Ltd·)處理得到 鈍端的DNA片段。然後連結Sal I連接子（linker )所得 之產物插入 pHSG299 (Takara Shuzo Co·，Ltd·)的 Sal I 位置而得到質體pSAK4。 (2 )比較具有各別啓動子序列之GDH的表現程度： 如上述所製備之質體以電穿透作用（】.1>.1<：01<：八1\〇· Hei 2 -20 7 79 1 )導入野生型的棒狀桿菌品系中。爲比較這 些品系的GDH表現程度，GDH的特殊活性是得自Sahm -18· (15) 1247806 et al.的上述方法。結果顯示在表！。 表1 品系 啓動子-3 5 序列-1 〇 G D H的特殊活性 相對値 ATCC 1 3 8 69 TGGTCA CATAAT 7.7 0.1 /pGDH TGGTCA CATAAT 82.7 1.0 /p6-2 CGGTCA CATAAT 33.1 0.4 /p 6 · 4 TGGTCA TATAAT 22 5.9 2.7 /p 6 · 3 TTGACA TATAAT 32 7.2 4.0 /p6-7 TTGCCA TATAAT 407.0 4.9 /p6-8 TTGTCA TATAAT 401.3 4.9 ATCC 1 3 8 69/p6 — 2 至!1 ATCC 1 3 8 6 9 / ρ 6 — 8 分另IJ 牛目 對應到序列號碼2到6。除了下列劃線部分改變之外’這 些序列與序列號碼1 (野生型）相同： -19- (16) 1247806 序列號碼

5’-TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC

CATAATTTGAACGT-3’ 2 CGGTCA CATAAT 3. TGGTCA TATAAT 4. TTGACA TATAAT 5. TTGCCA TATAAT 6. TTGTCA TATATT 這些序列是雙股DNA的合成線形DNA。 範例2 :突變株品系之製備： (1)誘發突變株品系對抗4 一氟麩胺酸： AJ 1 3029是揭示在W 096/ 061 80中的產製麩胺酸之 突變株品系。雖然在3 1 .5 °C的培養溫度下不能產製麩胺酸 ，但若培養在3 7 °C之下即使沒有生物素-抑制劑也能產 製麩胺酸。在此範例中，利用乳酸醱酵短桿菌AJ 1 3 029品 系作爲親代以衍生突變株品系。當然除了 AJ 1 3029之外的 產製麩胺酸品系可使用作爲親代，來衍生具4 -氟麩胺酸 抗性的突變株品系。 將品系AJ 1 3 029之微生物培養於31.5°C的CM2B瓊 脂培養基（表2 ) 24小時以取得細胞。以2 5 0微克/毫升 的N —甲基一 N—硝基—N—亞硝基胍於30 °C處理30分鐘 。然後將具有存活率1 %的細胞懸浮液塗於含有4 一氟麩 -20- (17) 1247806 胺酸（4FG )的瓊脂平板培養（表3 )。於31.5°C培養20 到3 0小時可形成菌落。在此實驗中，首先製備含有1毫 克/毫升4FG的斜面培養基，然後製備相同培養基但不 含4FG的斜面及平面培養基。如此，則可在瓊脂培養基 表面得到4 F G濃度梯度。當上述所得之突變株細胞接種 於此平板時，在此品系的生長限制邊界會形成一界線。此 品系在含有較高濃度4FG的區域所形成的菌落多於界限 的菌落。因此從約1 0,0 00突變株品系得到約50個品系可 抗 4FG。 表2 CM2B壤脂培養基 成分 濃度 蛋白腺（Nippon Seiyaku Co·) 1.0% 酵母菌萃取物（Difco Co·) 1.0% NaCl 0.5% d —生物素 10微克/升 瓊脂 1.5% (ρΗ7·2 :以 KOH 調整） • 21 - (18)1247806 表3瓊脂培養基 組成分 數量/每]公升水 葡萄糖 _ 10克 MgS04 · 7H20 - 1克 FeS04 · 7H20 〇·〇1 克 MnS04 · 4-6H2〇 - 0.01 克 硫胺素鹽酸鹽 0·1毫克 d -生物素 . 〇 · 0 5毫克 (nh4)2so4 5克 Na2HP〇4 · 12H2〇 - 7·1 克 KH2P〇4 1.3 6 克 瓊脂 _ 1 5 克

-22- 1 4FG抗性突變株品系之產製L-魅胺酸能力的確認 約50個上述（1 )所得之突變株品系和親代AJ 1 3 029 品系產製麩胺酸的能力確認如下所述。 將AJ 1 3029和突變株品系各別於31.5°C的CM2B瓊 脂培養基上培養20到30小時。然後培養在具有表4中所 示之、培養基A 〃的液態培養基並取得細胞，而此培養是 在3 1 . 5 °C搖動培養。約2 2小時後加入表4中所示之最終 濃度的B培養基。然後溫度轉移到37t並再培養24小時 。培養完全之後’以生物素分析儀（Asahi Chemical 1247806 (19)

Industry Co·，Ltd·)檢驗是否形成L 一麩胺酸。結果發現 5 0個品系的培養中，有兩個品系的麩胺酸產量高於親代 品系，以及區分出一較高的GDH活性（品系A和品系B )。決定此二品系的GDH活性發現這兩個品系的特殊 GDH 活性皆增力H (表 5 ) °WE.R.Bormannetal· [Molecular Microbiol.，6，317-326 (1996)]的方法決定 GDH活性。分析GDH的鹼基序列發現突變點只在GDH的 啓動子區域內（表6 ) ° 表4 成分 _ 培養基A 培養基Β 葡萄糖 ___ 3克/100毫升 5克/100毫升 ΚΗ2Ρ04 0.14克/100毫升 0.14克/100毫升 MgS04 · 7H2〇__^- 0.0 4克/100毫升 0.04克/1 〇〇毫升 FeS04 · 7H2〇 0.001克/100毫升 0.001克/1 00毫升 Μ n S Γ) >. · 4 Η ^ 0 0.001克/100毫升 0.001克/毫升 γ XI l·! , Ά Π . ___ 1 .5克/100毫升 2.5克/毫升 ^ 1Ν Π 4 / 2 ^ ^ 4_— __-·— 黃豆蛋白質水 Tdx Udz BIS HS^d BM 1.5克/100毫升 0.38毫升/100毫升 0.2毫克/升 〇·2毫克/升 硫fl女累鹽酸鹽-------- /4- rt-Λπ ^ 0.3毫克/升 0.3毫克/升 生初累 ______^ 抗辦袍劑 ___ 0.05毫克/升 〇.〇5毫克/升 VI 5k -Tci _______ 5每〗〇〇克/升 5每1 00克/升 CaC〇3 ______^ 7 . 〇 (以K 0 Η調整） m to m ___一^一— (20) 1247806 表5突變株品系的麩胺酸形成和GDH活性 品系 Glu(g/dl) GDH特殊活性 相對値 AJ 1 3 029 2.6 7.7 1 .0 FGR1 2.9 23.1 3.0 FGR2 3.0 25.9 3.4 表6突變株品系GDH啓動子區域中的鹼基序列

品系 GDH啓動子序列 -35 -10 AJ 1 3 029 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC CATAAT FGR1 TGGTCA TTCTGTGCGACACTGC TATAAT FGR2 TTGTCA T-CTGTGCGACACTGC TATAAT 範例3導入突變到產製麩胺酸棒狀桿菌的Cs基因啓動子 區域內： 在此範例中，一品系能加強編碼麩胺酸去氫酶（G D Η )基因的啓動子，並產製檸檬酸合成酶（CS)。 (1 ) gltA基因的選殖： 棒狀桿菌的gltA基因的鹼基序列是編碼檸檬酸合成 酶，且已被證明〔Microbial. 140，1817· 1 828 ( 1 994)〕。 以這些序列爲基礎的合成引子顯示在序列號碼7和序列號 -24- (21) 1247806 碼 8。另一方面，使用細菌基因體 DNA純化套組（ Advanced Genetic Technologies Corp.)製作乳酸酸酵短 桿菌ATCC 1 3 8 69的染色體DNA。加入無菌水到0.5微克 染色體DNA，10微微莫耳的各別寡核苷酸，8微升dNTP 混合物（每一各2.5毫莫耳濃度），5微升10 X La Ta Q 緩衝液（Takara Shuzo Co·，Ltd·)和 2 單位 La Ta q ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)之混合液中使其最終PCR反應 液爲5 0微升。此反應液於94 °C 3 0秒（分開雙股），5 5 t： 1 5秒（結合）和721： 3秒（加長作用）條件下進行3 0 -循環的 PCR，以熱循環器 TP240 (Takara Shuzo Co·，Ltd. )增幅包含gltA基因及其啓動子的3kbp DNA片段。之 後以 SUPREC02 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)純化所得之增 幅片段，然後使其成爲鈍端。將此產物與Smal完整分解 之 pHSG3 99 ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)混合以連接起來。 使用 DNA 連接套組 ver 2 (Takara Shuzo Co·, Ltd·)進行 連接作用。連接反應完全後，將之轉形到大腸桿菌JM 1 09 反應潛能細胞（Takara Shuzo Co.，Ltd.)內。將轉形產物 塗到含有10微克/毫升IPTG (異丙基硫化半乳糖苷）， 40微克/毫升X— Gal(5—溴—4 —氯—3 —吲哚基—/3 — D —半乳糖苷）和40微克/毫升氯黴素的L培養基（含 有10克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物 ，5克/升NaCl和15克/升瓊脂；ΡΗ7·2 )。過夜培養 之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉形菌落品系。 以驗性方法（由Nippon Seibutsu Kogaku-kai編輯和 -25- 1247806 (22) B ai fukan 發行的 Seibutsu Kogaku Jikken-sho ，p.105, 1 9 92 )從已轉形品系製備質體。並製備限制酶圖譜，相同 之限制酶圖譜顯示在圖2，命名爲’ pHSG3 99CS〃 。 (2 )導入突變到gltA啓動子中： 使用 Mutan-Super Express Km ( Takara Shuzo Co·， Ltd.)將突變導入gltA啓動子區域內。此方法具體描述如 下。以EcoRI和Sail完全分解pHSG3 99CS以得到含有 gltA基因的EcoRI— Sail片段，然後與完全用EcoRI和 Sail 分解的 pKF19kM (Takara Shuzo Co·，Ltd.)片段連接 起來。連接完全之後將其轉形到大腸桿菌JM 109 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有 10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X-Gal和25微克/ 毫升康納黴素（kanamycin)的L培養基。過夜培養之後 ，挑起白色菌落並分別培養這些轉形品系。從這些已轉形 品系中製備質體並將那些含有 gltA基因者命名爲 pKFl9CS。 使用PKF19CS爲模板和顯示在號碼9，10及1 1之序 列的末端磷酸化之合成DNA爲引子進行PCR，而引子是 以Mutan Super Express Km舖選出的。將PCR產物轉形 到大腸桿菌MV1184( Takara Shuzo Co·，Ltd.)反應潛能 細胞內。然後將轉形產物塗於含有25微克/毫升康納黴 素的L _培養基。過夜培養之後，分別得到個別之已轉形 品系菌落。從這些已轉.形品系中製備質體DNA。經由 -26- (23) 1247806

Sanger 方法〔J· Mol. Biol.，143，1 6 1 ( 1 9 8 0)〕以合成的

No· 1 2 DNA序列決定git A啓動子位置的鹼基序列。具體 而言，以染劑終止定序套組（Applied Biosystems)和 Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems)分析決定 序列鹼基。顯示在表7之序列所置換的gltA啓動子區域 的產物分別命名爲pKF19CSl，pKF19CS2和pKF19CS4。

-35區域 -10區域 PKF19CS ATGGCT TATAGC pKFl9CS 1 ATGGCT TATAAC pKF19CS2 ATGGCT TATAAT pKF19CS4 TTGACA TATAAT

(3 )突變株gltA質體的構築： 步驟 （2 )中所構築的 PKF19CS，pKF19CSl， pKFl 9CS2 和 pKF19CS4 以 Sail 和 EcoRI ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)完整分解。另一方面，具有衍生自質體 p A Μ 3 3 0 〔 Japanese Patent Publication for Opposition

Purpose (文中稱爲、、J. Ρ· KOKAI" ) No.Sho 5 8 - 67699 〕的複製起源而能在棒狀桿菌中自動複製的質體pSFK6 ( Japanese Patent Application No. Hei 11-69896 )，使用 EcoRI和Sail完整分解，所得片段與含有gltA的2.5kb -27- (24) 1247806 片段連接在一起。連接完全之後轉形到大腸桿菌JM 1 09 反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有1 0微克/毫升 IPTG，40克/毫升X— Gal和25微克/毫升康納黴素的 L -培養基。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這 些轉形品系。從轉形品系中製備質體。這些含有gltA基 因的質體分別命名爲 pSFKC，pSFKCl，pSFKC2和 pSFKC4。 (4)決定突變株gltA質體在棒狀桿菌內的CS表現： 將上述步驟（3 )所構築的質體導入乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869內。具體而言，此過程是以電脈衝方法（J. Ρ· KOKAI No· Hei 2-0 7 79 1 )進行。使用含有25微克/毫 升康納黴素的 CM2B平板培養基（包含 10克/升 bactotrypton，10克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升 NaCl，10微克/升生物素和15克/升瓊脂；pH7.0)於 3 1 °C篩選轉形產物。培養兩夜之後取得各別的菌落。這些 含有 pSKFC，pSKFCl，pSKFC2 和 p S K F C 4 之轉形子分 命名BLCS，BLCS1，BLCS2和BLCS4。將轉形株接種在 含有表8中所示之成分的培養基中。然後於3 1 °C培養到 葡萄糖完全消耗完之前。離心培養液以區分出細胞。以含 有2 00毫莫耳濃度麩胺酸鈉的50毫莫耳濃度tris緩衝液 (ρΗ7·5 )淸洗細胞，然後再以相同溶液懸浮之。以UD — 201 ( ΤΟΜΥ )超音波分解之後離心（10，〇〇〇g )，移除 剩餘仍未分解之細胞而得到一粗略酵素溶液。根據 -28- (25) 1247806

Methods Enzymol. 13，3 - 1 1 ( 1 969)決定檸檬酸合成酶的活 性。具體而言，將此粗略酶溶液加入含有1 00毫莫耳濃度 Tris HC1 ( pH8 ) ，0.1毫莫耳濃度DTNB，200毫莫耳濃 度麩胺酸鈉和0.3毫莫耳濃度乙醯輔酶A的反應液中，然 後以Hitachi分光光度儀在30t，412nm決定其吸光度增 加。更進一步，加入草醋酸至其最終濃度爲0.5毫莫耳濃 度。決定在41 2nm時增加之吸光度，從背景値推縯獲得 檸檬酸合成酶的活性。以Protein Assay (BIO-RAD)決定 粗略酵素溶液中的蛋白質濃度。使用牛血淸白蛋白爲標準 蛋白質。結果顯示在表9中。比較突變gltA啓動子和野 生型gltA啓動子的檸檬酸合成酶活性之活性增加情形加 以確認。 表8 成分 濃度 葡萄糖 .. 50克/升 K Η 2 P 〇 4 1克/升 MnS04 * 7H2〇 -- -.. 0.4毫克/升 F e S 0 4 · 7 Η 2 〇 1 0毫克/升 黃豆蛋白質水M3_ 20毫克/升 生物素 __..—- 0.5毫克/升 硫胺素鹽酸鹽Aj克乙！- 2毫克/升 -29· (26) 1247806 表9 品系 吸光度/分/毫克 相對活性 相對活性 ATCC13869 6.8 1 .0 ATCC 1 3 869/pSFKC 38.8 5.7 1 .0 ATCC 1 3 869/pSFKCl 5 7.1 8.4 1.2 1 ATCC 1 3 869/pSFKC2 92.5 13.6 1 .9 ATCC 1 3 869/pSFKC4 23 9.5 35.2 4.8 (5 )導入突變gltA基因到溫度一敏感性質體內： 爲將含有突變gltA啓動子序列的基因整合插入到染 色體中，則使用已知之棒狀桿菌溫度-敏感性質體的方法 來進行（J. Ρ· KOKAI No. Hei 5-749 1 )。使用 pSFKT7 ( Japanese Patent Application No. Hei 11-81693 )作爲複製 質體載體，在棒狀桿菌對溫度敏感。使用Sail和BstPI完 整分解pKFCS 1，pKFCS2和pKFCS3並使其成爲鈍端，作 爲突變gltA啓動子序列。然後與已用 Smal完整分解之 PSFKT2連接起來。連接完全之後，轉形到大腸桿菌 JM109 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)內。將轉形產物塗於含 有1〇微克/毫升IPTG，40微克/毫升X—Gal和25微 克/毫升康納黴素的L -培養基。過夜培養之後，挑起白 色菌落並分別培養這些已轉形品系。從已轉形品系中製備 質體。含有gltA基因的溫度-敏感性穿梭載體命名爲 pSFKTCl，pSFKTC2 和 pSFKTC4。 -30- (27) 1247806 (6 )導入突變git A啓動子到染色體內： 將pSFKTCl，pSFKTC2和p S F K T C 4以電脈衝方法分 別導入乳酸醱酵短桿菌FGR2品系。使用含有25微克/ 毫升康納黴素的CM2B平板培養基於25 °C篩選轉形產物 。完整導入之後所得之品系培養於CM2B液態培養基，然 後稀釋濃度爲每一平板1〇3到l〇5dfu塗於含有25微克/ 毫升康納黴素的CM2B平板上於34 °C培養。如此，則具 有溫度-敏感性之質體的品系由於在此溫度之下質體複製 受到抑制而變成對溫度敏感，所以不會形成菌落。另一方 面，質體DNA整合插入到染色體的品系者因可形成菌落 而能被篩選出來而取得個別分開之菌落。然後從此品系萃 取染色體DNA作爲模板，序列號碼8和13爲引子進行 PCR。之後確認約3kb的增幅片段。如此則證明此品系已 經由同質性重組作用將衍生自溫度敏感性質體的突變git A 基因整合插入到宿主染色體接近gltA基因中。衍生自 pSFKTC 1，2和4的品系分別命名爲BLCS 1 1，BLCS 1 2和 BLCS14。 (7 ) gltA啓動子一取代品系之取得： 首先，從BLCS11，BLCS12禾口 BLCS14品系得至IJ突變 gltA基因藉由同質性重組作用整合插入到染色體的康納黴 素一敏感性品系。將此質體整合插入之品系稀釋後塗於 CM2B平板上並於34 °C培養。形成菌落之後複印到含有 -31 - (28) 1247806 25微克/毫升康納黴素的CM2B平板上，然後於34°C培 養。如此則得到康納黴素-敏感性品系。 從康納黴素敏感性品系中萃取染色體作爲模板，序列 號碼7和8爲引子進行PCR以製備gltA基因片段。然後 使用 SUPREC02 ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)純化後以序列 號碼13爲引子進行定序反應決定其中之啓動子區域的序 列。結果，與表7中的pKF19CSl啓動子序列相同之品系 命名爲GB01，與pKF19CS2啓動子序列相同之品系命名 爲GB02，以及和pKF19CS4啓動子序列相同之品系命名 爲GB03。當質體及複製之gltA基因從染色體被移除時， 原先位於染色體上的野生型gltA基因也一起與載體質體 被移除，然而藉由質體導入的突變株gltA基因仍留在染 色體上。此事實指出基因取代已發生。 (8 )檸檬酸合成酶之gltA啓動子突變株的活性測定 檸檬酸合成酶的活性測定可經由步驟（7 )中所得到 的FGR2，GB01，GB03和FGR2/pSFKC品系以相同於步 驟（4 )之方法處理進行。結果顯示在表1。結果確認 gltA啓動子取代之品系的檸檬酸合成酶合性高於其親代品 (29) 1247806 表10 品系 吸光度/分/毫克 相對活性 FGR2 7.9 1.0 GB0 1 9.5 1.2 GB02 15.0 1 .9 GB03 3 1.6 4.0 FGR2/pSFKC 61.6 7.8 (9 ) gltA啓動子取代品系培養的結果： 將上述步驟（7 )所得之每一品系接種到含有表1 1中 所顯示之成分的接種培養基中，在3 1 · 5 °C搖動培養2 4小 時。取300毫升之具有顯示在表丨丨之成分的主要培養基 於500毫升玻璃瓶醱酵器中，然後加熱滅菌。取4〇毫升 之上述接種培養物接種到此培養基內。然後於3 1 .5 t開始 培養，其攪動速率及通氣速率分別控制在8 00到1 3 00rpm 及1 / 2到1 / 1 vvm。以氣態氨維持培養液pH値爲7 5。 初始培養8小時之後將溫轉移到37t。得20到40小時 內葡萄糖完全消耗時就終止培養，而L -麩胺酸則形成且 累積於培養液中。 結果如表12中所顯示，GB02和GB03品系的L 一鍵 胺酸產量有較大改進，而非GB01及FGR2/pSFKC品系 。從這些事實得知藉由導入突變到gltA啓動子中可增加 C S活性2到4倍得到好結果，改良麩胺酸的產製量。 -33- (30)1247806 表11 成分 濃度 接種培養基 主要培養基 葡萄糖 50克/升 150克/升 KH2P〇4 1克/升 2克/升 MgS047H20 0.4克/升 1.5克/升 FeS047H2〇 10毫克/升 15毫克/升 MnS044H2〇 10毫克/升 15毫克/升 黃豆蛋白質水解物 20毫克/升 50毫克/升 生物素 0.5毫克/升 2毫克/升 硫胺素鹽酸鹽 2毫克/升 3毫克/升 表12 品系 L 一麩胺酸（克/升） FGR2 8.9 GB01 9.1 GB02 9.4 GB03 9.4 FGR2/ pSFKC 9. 1

範例4導入突變到麩胺酸產製菌棒狀桿菌的ICDH基因 -34- (31) 1247806 啓動子區域中： 在此範例中製造一品系，能增強編碼麩胺酸去氫酶， 檸檬酸合成酶和異檸檬酸合成酶基因的啓動子。 (1 ) gltA基因的選殖： 編碼棒狀桿菌異檸檬酸去氫酶基因的icd基因鹼基序 列已被證實〔J· Bacteriol· 177，774- 782 ( 1 995 )〕。以此 序列爲基礎，合成如序列號碼1 4和1 5的引子。使用乳酸 醱酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA爲模板進行PCR， 增幅含有icd基因及其啓動子的3 kbp DNA片段。所得之 增幅片段以EcoRI完整分解，然後與已用EcoRI完整分解 的 pHSG399 ( Takara Shuzo Co·，Ltd·)混合以連接起來。 完全連接之後轉形到大腸桿菌：r〇 1 09反應潛能細胞內。將 轉形產物塗到含有10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X 一 Gal和40微克/毫升氯黴素的L一培養基上。過夜培養 之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉形品系。 從這些被轉形品系中製備質體。攜帶icd基因的質體 命名爲 pHSG3 99icd。 (2 )導入突變到icd啓動子內： icd基因啓動子的正確位置目前尙未確定。硏究增加 icd基因niRA轉錄量的可能性，是藉由人造修飾編碼 IC DH基因之上游序列成啓動子一類似序列而得知。具體 而言’在ICDH蛋白質之第一個ATG的上游約i9〇bp (第 -35- (32) 1247806 一個啓動子）和約70bp (第二個啓動子）之位在一 10類 似區域之 DNA 序列中導入突變。使用 Miitan-Siiper Express Km(Takara Shuzo Co·，Ltd·)導入突變到 icd 基 因上游區域內。此方法具體敘述如下。使用PstI完整分 解pHSG3 9 9icd以得到含有icd基因啓動子的PstI片段。 然後將此片段與已使用 PstI完整分解的 pKF18kM ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)連接在一起。完全連接之後轉形 到大腸桿菌JM1 09 ( Takara Shuzo Co.5 Ltd.)反應潛能細 胞內。將轉形產物塗到含有10微克/毫升IPTG，40微 克/毫升X- Gal和25微克/毫升康納黴素的L一培養基 上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉形品 系。從被轉形品系中製備質體，並命名含有icd基因啓動 子的質體爲pKF18icd。 使用PKF18 icd爲模板，及序列號碼16，17，18，19 ，20和21及一篩選引子的5’末端磷酸化合物DNA進行 PCR。將PCR產物轉形到大腸桿菌JM109反應潛能細胞 內。將轉形產物塗於含有2 5微克/毫升康納黴素的L -培養基上。過夜培養之後分別得到個別之已轉形品系菌落 。從被轉形品系中製備質體DNA，並以序列號碼22的合 成 DNA 使用 Sanger 的方法〔J· Mol. Biol.，143，161 ( 1 9 80)〕決定icd啓動子位置的鹼基序列。具體而言，使 用染劑終止定序套組（Applied Biosystems)決定鹼基序 列，並使用 Genetic Analyzer ABI310 ( Applied B i o s y s t e m s )進行分析。以表7中所顯示之序列置換i c d -36- (33) 1247806 啓動子區域所得之質體命名爲PKF18ICD1，PKF18ICD2, p K F 1 8 I C D 3，p K F 1 8 I C D 4，p K F 1 8 I C D 5 h d r p K F 1 8 I C D 6。其 中，以PstI完整分解pKF18ICD2得到含有icd基因的啓 動子 PstI片段。將此片段與已使用 PstI完整分解的 pKF18KM (Takara Shuzo Co·，Ltd.)連接起來。完全連接 之後，轉形到大腸桿菌JM109 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.) 反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有1 〇微克/毫升 IPTG，40微克/毫升X - Gal和25微克/毫升康納黴素 的L -培養基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培 養這些轉形品系。從被轉形品系中製備質體，並將含有 icd基因啓動子者命名爲PKF18ICD2。使用pKF18ICD2爲 模板，及序列號碼20和21及一篩選引子的5’末端磷酸化 合成DNA進行PCR。將PCR產物轉形到大腸桿菌JM109 反應潛能細胞內。將轉形產物塗於含有25微克/毫升康 納黴素的L -培養基上。過夜培養之後，分別得到個別之 已轉形品系菌落。從被轉形品系製備質體DNA，並以序 列號碼22的合成DNA決定位在icd啓動子位置內的鹼基 序列。以表1 3中所顯示之序列置換icd啓動子區域所得 之質體命名爲PKF18ICD25和pKF18ICD26。 (34) 1247806 表13

質體 第一個啓動子 第二個啓動子 -35 -10 -35 -1 0 pKF 1 8ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCAT pKFl 8ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCAT pKF 1 8ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCAT pKFl 8ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCAT pKFl 8ICD04 GCGACT TAAAGT TTTCCA TATAAT pKF 1 8ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAAT pKFl 8ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAAT pKF 1 8ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAAT pKF 1 8ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT (3 )爲決定啓動子活性的質體構築： 爲更簡單決定啓動子活性，利用報告基因來間接決定 啓動子活性是可行的。理想之報告基因的特性是其活性能 簡單被決定，甚至當一胺基酸加到N -末端時其活性並不 會顯著變低，且不能產生背景反應，並具有適合基因操作 的限制酶切入位置。因爲大腸桿菌的yS半乳糖苷酶（LacZ )被廣泛使用作爲報告基因，且棒狀桿菌屬沒有乳糖同化 能力的基因〔J. Gen. Appl. Microbiol·，18，399- 416 ( 1 9 72)〕，因此參考LacZ是適宜的報告基因。然後構築 攜帶LacZ作爲報告基因.的質體pNEOL (圖3 )。此構築 -38- (35) 1247806 過程敘述如下。使用得自大腸桿菌ME845 9 ( ME845 9存 放於基因學國家硏究所（日本））的染色體DNA爲模板 ，顯示在序列號碼23和24之合成DNA爲引子進行PCR 。使用Smal和BamHI完整分解此PCR產物，然後與已 用 Hindm 分解並爲鈍端之 pKF3(Takara Shuzo Co·，Ltd· )片段連接在一起。完全連接之後’轉形到大腸桿菌 JM109 ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)反應潛能細胞內。將轉 形產物塗於含有25微克/毫升康納黴素的L-培養基上 。過夜培養之後，分別得到個別之已轉形品系菌落。從被 轉形品系中製備質體。其中取一質體命爲pKF3nptn。然 後使用 Sail分解pKF3nptn。另一方面，使用 Smal和 Sail完整分解並爲鈍端之範例1 ( 1 )中所敘述的PSAK4 。將這些片段連接在一起以構築一往返載體pNEO，可在 棒狀桿菌中複製。此質體對氯黴素和康納黴素具抗性。更 進一步，使用Smal和Sse8387I完整分解PNE0。所得之 結果片段與已使用 PstI和Smal完整分解之PMC1871 ( Farmacia Biotech)連接在一起。如此，往返載體 pNEOL 能在棒狀桿菌中複製，且具有N-端缺乏第8胺基酸之 LacZ的報告基因就構築完成了（參閱圖3)。 (4 )突變株icd啓動子活性的測定 具有上述步驟（2)中所構築之突變icd啓動子的質 體，亦即 pKFl 8ICD1 ， pKFl 8ICD2 ’ pKFl 8ICD3 ， pKFl 8ICD4，pKF 1 8ICD5，pKF18ICD6，pKF18ICD25， -39- (36) 1247806 PKF18ICD26 和 pKF18ICD 等，使用 SacII 和 PstI 完全分 解然後爲鈍端。之後與已使用Smal切割的pNEOL片段連 接起來。完全連接之後轉形到大腸桿菌JM 1 09反應潛能 細胞內。將轉形產物塗於含有IPTG，X — Gal和40微克 /毫升氯黴素的L-培養基中。過夜培養之後，挑起藍色 菌落並分別培養這些轉形品系。 從已轉形品系中製備質體。具有能產製IC DH和 LacZ結合蛋白質之結構的質體命名爲 pNEOICDl， pNEOICD2 ， pNEOICD3 ， pNEOICD4 ， pNEOICD5 ， pNEOICD6，pNEOICD25，pNEOICD26 和 pNEOLICD。使 用電脈衝方法將這些質體和pNEOL導入乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869內。這些轉形產物的篩選是使用含有25微克 /毫升康納黴素和40微克/毫升X— Gal的CM2B平板培 養基（含有10克/升bactotryptone，10克/升細菌酵母 菌萃取物，5克/升NaCl，10微克/升生物素和15克/ 升瓊脂，ρΗ7·0 )在31 °C培養兩晚。完全導入之後，形成 菌落並分別挑起個別之菌落。含有 pNEOICDl ， pNEOICD2 ， pNEOICDS ， pNEOICD4 ， pNEOICD5 ， pNEOICD6，pNEOICD25，pNEOICD26 和 pNEOLICD 的聿專 形產物分 SU 命名爲 BLAC1，BLAC2，BLAC3，BLAC4， BLAC5， BLAC6， BLAC25， BLAC26， BLAC 和 BNEOL。 除了 BNEO之外，全部轉形產物形成藍色菌落。如範例3 中的步驟（4 )之相同方法，從轉形產物製備粗製的酵素 溶液’除了將細胞改爲由、Z -緩衝液〃（含有1 0毫莫耳 -40- (37) 1247806 濃度KC1，1毫莫耳濃度MgS〇4，270微克/100毫莫耳 濃度2 - ME和NaPi，ρΗ7·5 )的緩衝溶液淸洗及懸浮之。 LacZ的活性測定如下：Ζ -緩衝液與粗製的酵素溶液混合 。將ONPG溶於Z-緩衝液中至最終濃度爲0.8毫克/毫 升加入到反應混合物中，以Hitachi分光光度計U- 3210 於3 0°C測量在420nm的增加吸光度。所得値即爲LacZ的 活性。粗製的酵素溶液中的蛋白質濃度以Protein Assay (BIO-RAD)測定。使用半血淸白蛋白作爲標準蛋白質。結 果顯示在表14中。結果確認表現ICDH - LacZ結合蛋白 質之品系的LacZ活性在icd啓動子的變異高於野生型 ICDH — LacZ結合蛋白質之表現。 表14 品系 吸光度/分/毫克 相對活性 BNEOL 未測定 0.0 BNEOLI 42 1.0 BNEOLI-1 84 2.0 BNE0LI-2 168 4.0 BNE0LI-3 80 1.9 BNE0LI-4 126 3.0 BNE0LI-5 139 3.3 BNE0LI-6 84 2.0 BNEOLI-25 168 4.0 BNEOLI-26 170 4.0 -41 · (38) 1247806 (5 )將突變株icd基因導入溫度一敏感性質體內： 質體載體 pSFKT2 ( Japanese Patent Application No. Hei 1 1 - 8 1 693 )是溫度—敏感性的複製子，可使用於棒狀 桿菌中。使用 PstI完整分解 pKF18ICDl，pKF18ICD2, pKFl 8ICD3 ，pKF 1 8ICD4，pKF 1 8ICD5 ，pKF18ICD6， pKFICD25和pKFICD26，所得之片段使用作爲突變的icd 啓動子。然後將此片段與已使用PstI完整分解的pSFKT2 連接起來。完全連接之後將之轉形到大腸桿菌109 ( Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應潛能細胞內。將轉形產物塗 於含有10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X— Gal和25 微克/毫升康納黴素的L -培養基上。過夜培養之後，挑 起白色菌落並分別培養這些轉形品系。從已轉形品系中製 備質體。含有icd啓動子的溫度-敏感性穿梭載體命名爲 pSFKTIl，pSFKTI2，pSFKTI3，pSFKTI4，pSFKTI5， pSFKTI6，pSFKTI25 和 pSFKTI26。 (6)將突變株icd啓動子導入染色體內

使用電脈衝方法將上述步驟（5 )中所敘述構築的質 體個別導入乳酸醱酵短桿菌GB02品系中。此轉形產物的 篩選是在25 °C，使用含有25微克/毫升康納黴素的M2B 平板培養基（含有10克/升bactotryptone，10克/升細 菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl，10微克/升生物素和 】5克/升瓊脂，ρΗ7·0)。完全導入之後，將培養在M2B -42- (39) 1247806 液態培養基中所得的品系塗到含有2 5微克/毫升康納黴 素的CM2B平板上，以每一平板稀釋爲1〇3到i〇5cfu的濃 度於3 4 °C培養。如此，則具有溫度-敏感性之質體的品 系由於在此溫度之下質體複製受到抑制而變成對溫度敏感 ，所以不會形成菌落。另一方面，質體DNA整合插入到 染色體品系者因可形成菌落而能被篩選出來而取得個別分 開之菌落。從此品系中萃取染色體DNA作爲模板，序列 號碼13和15爲引子進行PCR。之後確認約3kb的增幅片 段。如此則證明此品系已經由同質性重組作用將衍生自溫 度敏感性質體的突變icd基因整合插入到宿主染色體接近 icd基因中。 (7 ) icd啓動子一取代品系之取得·· 首先，從具有突變icd基因如步驟（6 )中之敘述藉 由同質性重組作用整合插入到染色體的品系中得到康納黴 素一敏感性品系。將此質體整合插入之品系稀釋後塗於 CM2B平板上並於34 °C培養。形成菌落之後於含有25微 克/毫升康納黴素的CM2B平板上培養。如此則得到康納 黴素一敏感性品系。 從康納黴素敏感性品系中萃取染色體作爲模板，序列 號碼14和15爲引子進行PCR以製備icd基因片段。然後 使用 SUPREC02(Takara Shuzo Co.，Ltd·)純化後以序列 號碼22爲引子進行定序反應決定其中之啓動子區域的序 歹!J。結果，具有衍生自 pSFKTIl，pSFKTI2，pSFKTI3， -43- (40) 1247806 pSFKTI4，pSFKTI5，pSFKTI6，pSFKTI25 和 pSFKTI26 之icd啓動子序列者分別命名爲 GC01，GC02，GC03， GC04，GC05，GC06，GC25和 GC26。當質體及複製之 icd基因從染色體被移除時，原先位於染色體上的野生型 icd基因也一起與載體質體被移除，然而藉由質體導入的 突變icd基因仍留在染色體上。 (8 )異檸檬酸去氫酶之icd啓動子突變株的活性測定： 使用上述步驟（7 )中所得之8個品系及範例3中相 同方法之步驟（7 )所得的GB 02品系製備IC DH粗製的酵 素溶液。ICDH活性的測定如下：將粗製的酵素溶液加到 含有 35 毫莫耳濃度 Tris HC1 ( ρΗ7·5 ) ，：1·5濃度

MnSO40.1毫莫耳濃度NADP和1·3毫莫耳濃度異檸檬酸 的反應溶液中，在30°C使用Hitachi分光光度計U — 3210 測定34〇nm時的吸光度增加情形。使用 Protein Assay (BIO-RAD)測定粗製的酵素溶液中的蛋白質濃度。結果顯 示在表15中。結果確認異檸檬酸去氫酶之icd啓動子取 代品系的活性高於親代品系。 -44· (41) 1247806 表15 品系 吸光度/分/臺奇 相對活性 GB02 3.9 1.0 GC0 1 8.2 .1 GC02 19.1 4.9 GC03 7.0 1.8 GC04 12.5 3.2 GC05 19.1 4.9 GC06 10.5 2.7 GC025 30.4 7.8 GC026 24.2 ------ 6.2

(9) icd啓動子取代品系的培養結果· 如範例3中步驟（9 )的相同方法培養上述步驟（7 ) 中的8個品系。結果使用品系GC02，GC04，GC05， G C 2 5和G C 2 6時確認其L 一鍵胺酸產量有改善，如表1 6 中所顯示。結果發現導入突變到icd啓動子中所得之品系 的ICDH活性至少增加3倍。 -45- (42) 1247806 表16 品系 L 一麩胺酸（克/100毫升） GB02 9.2 GC01 9.0 GC02 9.5 GC03 9.1 GC04 9.4 GC05 9.6 GC06 9.2 GC25 9.9 GC26 9.8

範例5在棒狀桿菌麩胺酸產製細菌的PDH基因啓動子區 域導入突變 (1 )從棒狀桿菌中選殖pdhA基因 φ 合成的引子序列號碼25和26，是篩選自大腸桿菌， 綠膿桿菌和結核桿菌的丙酮酸去氫酶（PDH )之E1次單 位中具有高同質性的區域。使用細菌基因體DNA純化套 組（Advanced Genetic Technologies Corp.)從乳酸醱酵 短桿菌ATCC 1 3 8 69中製備染色體DNA作爲模板，在PCR Technology ( H. Erlich 編輯，Stockton Press 發行 1989) 第8頁所敘述的標準反應條件下進行PCR。然後將反應液 載入瓊脂凝膠中進行電泳以確約1 .3kb的DNA片段被增 -46- (43) 1247806 幅。使用合成性之序列號碼2 5和2 6的DN A從兩末端測 定所得之鹼基序列。以 Sanger的方法〔Mol. Biol.， 143， 1 6 1 ( 1 9 80)〕利用 DNA 定序套組（Applied

Biosystems Co.)測定鹼基序列。將決定之鹼基序列轉譯 爲胺基酸，並與大腸桿菌，綠膿桿菌和結核桿菌之丙酮酸 去氫酶的E 1次單位比較，以發現其中的高同質性區域。 結果判斷認爲PCR增幅的DNA片段是編碼乳酸醱酵短桿 菌ATCC13869之丙酮酸去氫酶E1次單位的pdhA基因的 一部分。因此進一步選殖此基因的上游及下游。選殖方法 如下：使用限制酶 EcoRI，BamHI，Hind ΙΠ，PstI，Sail 和Xbal ( Takara Shuzo Co·，Ltd·)分解乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 8 69的染色體以得到DNA片段。序列表中的引子 序列號碼27和28使用於選殖上游位置，引子序列號碼 29和30使用於選殖下游位置。利用LA PCR活體外選殖 套組（Takara Shuzo Co·，Ltd.)進行選殖。使用 PCR套 組之後，以EcoRI，Hindffl，PstI，Sail和XabI分解從上 游位置所增幅的〇·5，2·5，3.0，1 .5和1 .8kb的DNA片段 ;以及使用BamHi，HindlE和PstI分解從下游位置所增 幅的1.5，3.5和l.Okb的DNA片段。DNA片段的鹼基序 列以上述之相同方法決定。結果發現此增幅的DNA片段 更進一步包含一約920個胺基酸的開放讀譯區及一位在上 游的假設啓動子區域。由於此開放讀譯區的鹼基序列的胺 基酸產物與已知的大腸桿菌丙酮酸去氫酶的E 1次單位具 高度同質性，因此顯然此開放讀譯區是編碼乳酸醱酵短桿 -47- (44) 1247806 菌ATCC13869之丙酮酸去氫酶El次單位的pdhA基因。 此開放讀譯區的鹼基序列顯示在序列表中的序列號碼3 1 。序列表中的序列3 1，也顯示從鹼基序列所預測之產物 的胺基酸序列。由於位在蛋白質N -端的甲硫胺酸殘基是 衍生自起始密碼 ATG，此胺基酸通常不是蛋白質的必需 功能，因此目前已知此甲硫胺酸殘基在轉譯之後會經由胜 肽酶作用而被移除。上述的蛋白質其N-端的胺基酸殘基 可能已被移除。然而，在序列表中序列號碼31之A TG上 游6個鹼基存在的GTG序列，可能會被轉譯成胺基酸。 其它微生物譬如大腸桿菌的丙酮酸去氫酶是由三個次單元 El，E2和E3所組成，且他們的編碼基因通常構成操縱子 。然而在pdhA基因3kb下游中並沒有可能是丙酮酸去氫 酶E2和E3次單元的開放讀譯區。但很淸楚的是，位在 開放讀譯區下游存在一終止子。從這些事實推測，乳酸醱 酵短桿菌ATCC 1 3 869的丙酮酸去氫酶E2和E3次單元是 位在染色體的另一位置上。 (2 )構築一質體用以增幅pdhA : 目前已有一品系是將編碼大腸桿菌之PDH三個次單 位的基因導入乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869中，而得到一 改良麩胺酸產量的品系（JP Hei 1 0-3 606 1 9 )。然而，乳 酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869的PDH中只有編碼E1次單位 的pdhA基因被選殖到，且不知單獨增幅此基因是否能改 善胺基酸的產量。在此情形下，因此想單獨增幅PdhA基 •48- (45) 1247806 因看看是否可有效改善胺基酸的產量。 以已選殖之鹼基序列爲基礎合成顯示在序列號碼3 3 和34的引子。使用細菌基因體DNA純化套組（Advanced Genetic Technologies Co rp·)製備乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 8 69的染色體爲模板，依據pet Technology (Η· Erlich編輯，Stockton Press發行，1 989 )第8頁上敘述 之標準反應條件進行PCR以增幅pdhA基因。序列號碼 33的合成引子是對應到序列表中序列號碼32中的pdhA 基因第1 3 97鹼基到1416鹼基。序列號碼34則是一反股 引子，其鹼基對應到序列表中序列號碼3 2中的第5 3 5 5到 5 3 74鹼基，從5’位置表示。 利用常用方法純化PCR產物，然後與限制酶Sail和 EcoT22I作用。將此片段與已用Sail和PstI切割的pSFK (Patent A p p 1 i c at i ο η Ν ο · H e i 1 1 - 6 9 8 9 6 )經由連接套組（ Takara Shuzo Co.，Ltd.)連接在一起。之後轉形到大腸桿 菌JM109(Takara Shuzo Co.，Ltd.)反應潛能細胞內，將 轉形產物塗於含有10微克/毫升IPTG (異丙基一 /3 - D 一硫化半乳糖苷），40微克/毫升X — Gal ( 5-溴一 4 一 氣一 3 -卩引卩朵基一 3 - d—半乳糖普）和25微克/毫升康 納黴素的 L —培養基（含有 10克/升bactotryptone，5 克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊 脂，PH7.2)。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養 這些被轉形的菌落品系。 以驗性方法（由Nippon Seibutsu Kogaku kai編輯和 -49- (46) 1247806

Baifukan 發行的 Seibutsu Kogaku Jiken-sho，p.105，1992 )從已轉形品系製備質體。決定DNA片段插入到載體中 的限制酶圖譜，並與序列表中序列號碼32所發表之pdhA 基因的限制酶圖譜作比較，含有DNA片段之質體若其插 入段有相同限制酶圖譜者命名爲pSFKBPDHA。 (3)將pSFKBPDHA導入到乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869 和GC25中並評價其醱酵實驗·· 使用電脈衝方法（J· Ρ· KOKAI No. Hei 2-207791)將 質體pSFKBPDHA轉形到乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869和 GC25內而得到已轉形品系。經由導入質體pSFKBPDHA 到乳酸醱酵短桿菌ATCC13869和GC25而得之產製L —麩 胺酸轉形品系 ATCC13869 / pSFKBPDHA 和 GC25/ pSFKBPDHA 的培養如下：將所得的 A T C C 1 3 8 6 9 / pSFKBPDHA和G C 2 5 / p S F K B P D Η A的培養如下：將所得 的 ATCC 1 3 869 / pSFKBPDHA 和 G C 2 5 / p S F K B P D Η A 細胞 培養在含有25微克/毫升康納黴素的CM2B平板培養基 之後，所得的細胞接種到一培養基中（每1公升包8 0克 葡萄糖，1 克 ΚΗ2Ρ04，0.4 克 MgS04 · 7H20，30 克（NH4 )2S04，0.01 克 FeS04 · 7H2〇，0.01 克 MnS04 · 7H20， 15毫升黃豆蛋白質水解物，200微克硫胺素鹽酸鹽，60 微克生物素，25毫克康納黴素和50克CaC03 ;使用KOH 調整pH到8.0)。於31.5t搖動培養至培養基中的糖分 消耗完。所得產物再接種到上述之相同成分的培養基（用 -50- (47) 1247806 於 GC25/ pSFK6 和 GC25/ pSFKBPDHA )，或刪除生物 素之相同成分培養基（用於 ATCC 1 3 8 69 / pSF6 和 ATCC 1 3 869 / pSFKBPDHA )，以 5% 的量於 3 7 t 搖動培 養至糖分被消耗完。對照組是使用電脈衝方法將質體 PSFK6轉形到乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 8 69和GC25中所 得之品系，PSFK6是得自棒狀桿菌之可以自動複製的質體 ，然後如上述之相同方法培養。完全培養之後，使用 Biotic Analyzer AS-210 ( Asahi Chemical Industry Co.,

Ltd.)測定培養基中L一麩胺酸累積的量。結果如表17中 所示。 表17 品系 L-麩胺酸（克/每100毫升） ATCC 1 3 869/pSFK6 3.6 ATCC1 3869/pSFKBPDHA 3.8 GC25/pSFK6 5.1 GC25/pSFKBPDHA 5.3 從這些結果顯示在乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869和 GC25中單一增幅pdhA基因，能明顯有效改善麩胺酸的 產量。 (4)構築質體用以測定突變之pdhA啓動子活性： -51 - (48) 1247806 爲製造丙酮酸去氫酶（PDH )的突變啓動子，將乳酸 醱酵短桿菌ATCC13869已選殖的pdhA基因先決定其啓動 子區域，經由不同的啓動子區域修飾來決定，可利用点-半乳糖苷酶活性來測定。 從已選殖且證明之鹼基序列評估pdhA基因的啓動子 位置，結果推測可能位在序列表中序列號碼3 2的第2 2 5 2 到222 5 7及22 79到22 84的鹼基，分別是位在—35區域 及一 1 0區域。因此合成序列表中序列號碼3 5和3 6中的 引子，與含有啓動子區域的pdhA基因之來自乳酸醱酵短 桿菌ATCC 1 3 8 69染色體DNA爲模板進行pCR增幅。合 成的引子中，序列號碼3 5對應到序列號碼3 2中的鹼基號 碼2194到222 1 ;但鹼基號碼2198已用C取代，以及鹼 基號碼2200和2202已用G取代，且限制酶SmaI確認序 列已被插入。序列號碼3 6對應到序列號碼3 2中的鹼基號 碼2372到2398;但鹼基號碼293和2394已用G取代， 且具有辨認序列之限制酶SmaI已插入反股中。使用細菌 基因體 DNA 純化套組（Advanced Genetic Technologies Corp·)製備乳酸醱酵短桿菌ATCC13869的染色體作爲模 板，以 PCR Technology ( H. Erlich 編輯，Stockton Press, 1 989 )第8頁所敘述的標準反應條件下進行PCR來增幅 pdhA基因的啓動子區域。利用常用的一般方法純化所得 之PCR產物，然後使用限制酶SmaI作用之。將此片段與 已用限制酶SmaI切割之pNEOL連接在一起，pNEOL能 在缺乏LacZ基因啓動子區域的棒狀桿菌中複製（使用範 -52- (49) 1247806 例4 ( 3 )中的連接套組（Takara Shuzo Co·，Ltd·)。之後 轉形到大腸桿菌JM109反應潛能細胞內（Takara Shuzo Co.，Ltd.)，然後將轉形產物塗於含有40微克/毫升X —Gal (5 —溴一 4 —氯一3 — D引D朵基一 /3 — D —半乳糖脊） 和25微克/毫升康納黴素之L一培養基上（含有10克/ 升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升 NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2 )。過夜培養之後，挑起 藍色菌落並分別培養這些轉形品系。使用鹼性方法（ Nippon Seibutsu Kogaku-kai 編輯，以及 Baifukan 發行之 Seibutsu Kogaku Jikken-sho5 p.105，1 992 )從已轉形品系 中製備質體。經由一般方法定序插入到載體的DNA片段 之後，此含有插入段 DNA 片段的質體命名爲 pNEOLBPDHAprol。 更進一步，爲構築質體而合成之位在序列表中的序列 號碼37，38和39的引子，其中假設是啓動子位置的區域 已改變爲棒狀桿菌啓動子的一致序列。使用乳酸醱酵短桿 菌ATCC 1 3 869染色體DNA爲模板，各引子及序列號碼 36的引子進行PCR，所增幅的DNA片段其中的pdhA基 因啓動子區域已改變爲一致序列。在合成的引子中，序列 號碼37對應到序列號碼32中的鹼基號碼2244到2273 ; 而鹼基2255已被C取代，和鹼基2257已被A取代；且 只有一 3 5區域已被改爲棒狀桿菌的一致序列。序列號碼 38對應到序列號碼32中的鹼基2249到22 8 8 ;鹼基號碼 22 79和22 8 1已被T取代；且只有-10區域已被改爲棒狀 -53- (50) 1247806 桿菌的一致序列。序列號碼3 9對應到序列號碼3 2的鹼基 號碼2249到2288;鹼基號碼2255已被C取代，鹼基號 碼2257已被A取代；以及鹼基號碼2279和2281已被T 取代；且- 3 5區域和一 1 〇區域皆改爲棒狀桿菌的一致序 列。使用細菌基因體純化套組（Advanced Genetic Technologies C〇rp.)製備乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 8 69的 染色體作爲模板，以PCR Technology (H. Erilich編輯， Stockton Press發行，1 989 )第8頁所述的標準反應條件 下進行PCR增幅Pdh A基因的啓動子區域，其中的啓動子 區域已利用引子改爲一致序列。所得的PCR產物以常用 方法純化’然後以限制酶Smal作用之。將此片段與已用 限制酶Smal切割的PNE0L利用連接套組（Takara Shuzo Co.，Ltd·)連接起來，其中的pNE〇L能在缺乏啓動子區 域的lacZ基因的棒狀桿菌中複製。之後轉形到大腸桿菌 JM109反應潛能細胞（Takara Shuzo Co.，Ltd.)內，將轉 形產物塗於含有40微克/毫升χ— Gal (5-溴一 4一氯一 3 -吲哚基一々一 D -半乳糖苷）和2 5微克/毫升康納黴 素的L一培養基（包含10克/升bactotryptone，5克/ 升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCL和15克/升瓊脂， p Η 7 · 2 )。過夜培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些 轉形品系。使用驗性方法（Nippon Seibutsu Kogaku kai 編輯’以及 Baifukan 發 f了之 Seibutsu Kogaku Jikken-sho, p. 105，1 992 )從已轉形品系中製備質體。經由一般方法定 序插入到載體的DN A片段，其中只有—3 5區域已改爲一 -54- (51) 1247806 致序列，而此種質體命名爲pNEOLBPDHApro35 ;所含之 DNA片段中的序列只有一 1 0區域已改爲一致序列的質體 則命名爲pNEOLBPDHAprolO;且若質體所含之 DNA片 段的- 3 5區域及一 1 0區域皆改爲一致序列者則命名爲 pNEOLBPDHApro35 1 0 〇 (5 )突變株pdhA啓動子活性的估計： 使用電脈衝方法（J· Ρ· ΚΟΚΑ I No. Hei 2-207791)將 質體 pNEOLBPDHAprol ， pNEOLBPDHAprolO 和 pNEOLBPDHApro3510轉形到乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869 中而取得被轉形品系。以範例4 ( 4 )中所敘述的方法測 定所得之轉形產物的Θ -半乳糖苷酶活性。啓動子區域之 序列改爲一致序列之後的/3 -半乳糖苷酶活性顯示在表 1 8中，其中pdhA基因啓動子區域的万-半乳糖脊酶酵素 活性定爲1。

品系 点-半乳糖苔酶活性 iilfi 値） ATCC 1 3 869/pNEOLBPDHAprol -.......1 ATCC1 3869/pNEOLBPDHAprol 0 ____6_ ATCC 1 3 869/pNEOLBPDHApro35 10 一 一 ._J7.5 •55- (52) 1247806 這些結果指出假設的啓動子位置爲pdhA基因的啓動 子，且可經由改變此區域之序列爲一致序列而改變pdhA 的表現（增幅）。此事實表示經由改變PdhA基因的啓動 子區域，就能不需使用質體而改變表現。 (6 )構築質體用以製備啓動子變化的品系： 由於已證明可藉由在啓動子導入突變而改變PdhA的 表現，因此構築質體用以製備PdhA基因啓動子變化的品 系。爲構築啓動子變化的品系，因此構築三種質體。此三 質體分別是其中的一 3 5區域，- 1 0區域和兩區域皆改爲 一致序列。 以已被選殖之鹼基序列爲基礎，新合成序列號碼40 和41中的引子。在合成的引子中，序列號碼40是一反股 ，其鹼基序列對應到序列號碼32中的鹼基號碼249 1到 2521，其表示法是從5’開始，且在5’末端附著上3個A 和4個T。序列號碼3 3是反義股，對應到序列號碼3 2中 的pdhA基因的鹼基號碼5020到5039，其表示法是從5’ 開始。使用序列號碼3 3和40爲引子，以細菌基因體 DNA 純化套組（Advanced Genetic Technologies Corp·) 所製備的乳酸醱酵短桿菌ATCC 1 3 869的染色體爲模板， 在 PCR Technology ( H. Erilich 編輯，Stockton Press 發 行，1 989 )第8頁所敘述的標準反應條件下進行PCR。更 進一步使用序列號碼39和41爲引子，乳酸醱酵短桿菌 ATCC 1 3 869的染色體爲模板進行PCR。使用常用方法純 -56- (53) 1247806 化所得到的PCR產物。然後使用PCR產物經由序列號碼 33和40爲引子進行PCR，以及使用序列號碼39和41及 序列號碼33和41爲引子進行PCR。PCR條件如下：在反 應液中此四個DNA濃度爲1 0微莫耳濃度，沒有使用模板 ，並使用 La tag ( Takara Shuzo Co·，Ltd.)。使用一般常 用方法純化PCR產物後與限制酶Sail和Xhol作用。所得 片段利用連接套組（Takara Shuzo Co., Ltd.)與已切割的 溫度—敏感性質體PSFKT2連接在一起，而pSFKT2能在 棒狀桿菌中複製。之後轉形到大腸桿菌JM 1 09反應潛能 細胞（Takara Shuzo Co.，Ltd.)內，轉形產物塗於含有10 微克/毫升IP TG (異丙基一沒一半乳糖苷），25微克/ 毫升康納黴素和40微克/毫升X - Gal ( 5-溴一 4 一氯一 3 —吲哚基一 /3 — D —半乳糖苷）的L —培養基（包含10 克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5克 /升NaCl和15克/升瓊脂，PH7.2 )。過夜培養之後， 挑起白色菌落並分別培養這些被轉形的菌落品系。使用鹼 性方法（由 Nippon Seibutsu Kogaku-kai 編輯和 Baifukan 發行的 Seibutsu Kogaku Jikken-sho5 ρ·105，1992)從已轉 形品系中製備質體。之後定序插入到載體的DNA片段， 然後與序列號碼32中所發表之pdhA基因的鹼基序列作 比較。含有DNA片段的質體，其中的DNA片段序列只有 啓動子的一 3 5區域和- 1 0區域改爲棒狀桿菌的一致序列 ，此質體命名爲pSFKTPDHApro3510。 質體中的pdhA基因啓動子-35區域改爲棒狀桿菌的 -57- (54) 1247806 一致序列，和pdhA基因啓動子一 10區域改爲棒狀桿菌一 致序列的質體，除了分別以序列表中的序列號碼3 7和3 9 取代序列號碼3 9以外，皆是以上述相同方法構築的。這 些質體分別命名爲 pSFKTPDHApro35 和 pSFKTPDHAprolO (7 )啓動子變化品系之製備： pdhA基因啓動子變化品系的製備是經由同質性重組 作用，利用上述步驟（6 )中用於製備啓動子變化品系所 構築的質體來進行。 首先，經由電脈衝方法（J. Ρ· KOKAI No. Hei 2-20779 1 )將質體pSFKTPDHApro 3510轉形到GC25用以製 備啓動子變品系。之後轉形產物塗於C Μ 2 B平板培養基（ 包含10克/升聚蛋白腺，10克/升細菌酵母菌萃取物， 5克/升NaCl，10微克/毫升生物素和15克/升瓊脂， ρΗ7·2)並在25°C培養以獲取被轉形品系。將此產物於含 有CM2B液態培養基的試管中培養過夜。然後塗於含有 25微克/毫升康納黴素的CM2B平板培養基，在34°C培 養以獲取含有質體pSFKTPDHApro3510經由同質性重組 作用插入到染色體中的一次一轉形品系。分離出單一菌落 之後，將此品系於含有液體CM2B培養基的試管中培養過 夜。經過適當稀釋之後，塗於CM2B平板培養基在3 1 .5 °C 培養。菌落開始出現之後，此產物能在含有2 5微克/毫 升康納黴素的CM2B平板培養基中複製而得到康納黴素- -58- (55) 1247806 敏感性品系。由於有兩種品系’亦即具有野生型pdhA基 因啓動子位置的品系，和另一具有突變導入的品系，因此 定序此部分。如此可獲得將突變導入pdhA基因啓動子位 置的啓動子變化品系。在此品系中，pdhA基因的啓動子 一 3 5區域和一 1 0區域已改爲棒狀桿菌的一致序列。此品 系命名爲GD3510。 除了 以質體 pSFKTPDHApro35 和 p S FKTPDH Apro 1 0 取代質體pSFKTPDHApro3510用以製備啓動子變化品系 之外，使用上述的相同方法獲取pdhA基因啓動子的- 35 區域和- 1 0區域已改爲棒狀桿菌一致序列的品系。它們 分別命名爲GD35和GD10。 (8 ) pdhA基因啓動子變化品系之錐形瓶培養結果的評估 將上述所得的三種pdhA基因啓動子變化品系在錐形 瓶中培養以產製L-麩胺酸。將培養於CM2B平板培養基 中的啓動子變化品系 GD3510，GD35，GD10和 GC25細 胞接種於培養基中（每公升水含有30克葡萄糖，1克 ΚΗ2Ρ〇4，〇·4 克 MgS04 · 7Η20，30 克（NH4 ) 2S04，0 01 克 FeS04· 7H20，0.01 克 MnS04· 7H20，15 毫升黃豆水 解物’ 200微克硫胺素鹽酸鹽，6〇微克生物素和50克 CaC03;使用K0H調整pH到8.0)。然後在31.5 °C搖動 培養到培養基中的糖分消耗爲止。所得的產物接種到上述 相同成分的培養基中，以5%的量於37°C搖動培養到培養 -59- (56) 1247806 基中的糖分消耗爲止。培養完全之後，使用 Biotic Analyzer AS-210 ( Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)測 定液態培養基中所累積的L -麩胺酸數量。結果顯示於表 1 9中。 表19 品系 L·麩胺酸（克/每100毫升） GC25 1.9 GD35 2.0 GD10 2.0 GD3510 2.1

從這些結果得知所獲得的啓動子變化品系可提供改良 的麩胺酸產量。 範例6導入突變到精胺基琥珀酸合成酶基因的啓動子區 域內： (1 ) argG基因上游之鹼基序列的測定： 爲了以PCR增幅黃色短桿菌（Brevibacterium flavum )的argG基因，因此需測定此ORF上游及下游區域的鹼 基序列。以已知的麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum) argG 的 ORF 驗基序列（Gen Bank 登錄號 AF03 05 20 )爲基礎合成弓[子，並使用活體外LA PCR選殖 -60- (57) 1247806 套組（Takara Shuzo Co·，Ltd.)依據其說明書進行鹼基 列的測定。這些引子特別使用具有位在序列號碼42和 中之鹼基序列的寡核苷酸（引子1和2 )用於上游區域 以及具有位在序列號碼44和45中之鹼基序列的寡核苷 (引子3和4 )用於下游區域。將野生型品系的黃色短 菌 2245品系（ATCC1406 7 )的染色體 DNA，以限制 EcoRI完整分解，使用引子2或3 (具有序列號碼43 44)進行第1次PCR，和使用引子1或4(具有序列號 42或45 )進行第2次PCR來測定argG上游及下游的 基序列。 (2 )啓動子位置的預測： 將上述序列以購買的軟體（GENETYX)預測argG 因ORF的上游區域中類似啓動子的序列。將突變導入 高分數（約第一個 ATG的上游120 bp)的位置。然後 量此啓動子的活性。 (3 )導入突變到啓動子序列中，並決定突變株啓動子 活性：

使用突變一導入引子9，10，11，12或13和7( 有序列號碼50，51，52，53，54或58)用於最高分數 位置，以AJ 1 2092品系的染色體DNA爲模板進行第一 PCR。使用PCR產物作爲3’位置的引子，以及具有序列 碼49的引子8作爲5’位置的引子，相同的染色體DNA 序 43 酸 桿 酶 或 碼 m 基 最 測 的 具 的 次 號 作 -61 - (58) 1247806 爲模板進行第二次PCR，在可能是啓動子的部分獲得具有 突變導入其中的DNA片段。爲測定此突變株啓動子的活 性，將這些DNA片段插入到啓動子探針載體pNEOL的 Smal位置，而能得到與LacZ報告基因相同方向的質體 pNEOL — 1，pNEOL— 2 ’ pNEOL — 3，pNEOL — 4 和 pNEOL— 7。使用弓丨子7和8’ AJ12092品系染色體DNA 爲模板進行PCR所得之DNA片段插入質體pNEOL的 LacZ報告基因的上游而獲得對照組質體pNEOL - 0。 將 ρΝ Ε Ο L — 0，ρΝ Ε Ο L — 1，ρΝ Ε Ο L — 2，ρΝ Ε Ο L — 3， pNEOL— 4和pNEOL — 7導入AJ 1 2092品系內。使用電脈 衝方法（J. Ρ. ΚΟΚΑ I No· He i 2-207791)將質體導入。把 每一轉形產物塗於含有4微克/毫升氯黴素的CM2G平板 培養（每1公升純水包含1〇克聚蛋白腺，10克酵母菌萃 取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，ΡΗ7·2 )，並 篩選氯黴素-抗性品系。 將這些品系——塗於瓊脂培養基（含有0.5克/ 100 毫升）葡萄糖，1克/100毫升聚蛋腺白腺，1克/100毫 升酵母菌萃取物，〇·5克/100毫升NaCl和5微克/升氯 黴素），在3 1 · 5 °C培養2 0小時。取所得的其中一細胞接 種到一培養基中〔包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/ 100毫升硫酸錢，〇·1克/1〇〇毫升κΗ2Ρ〇4，0.04克/ 100 毫升 MgS〇4，0.001 克 /100 毫升 FeS04，0.01 克 / 100毫升Mn S04，5微克/毫升VB】，5微克/100毫升生 物素和45毫克/ 100毫升（以氮角度而言）的黃豆水解 -62- (59) 1247806 物〕。於3 1 · 5 °C培養1 8小時，所得細胞以範例4 ( 4 )中 所敘述的方法測定/3 -半乳糖苷酶活性。 AJ 1 2092 / pNEOL — 〇所偵測的冷一半乳糖苷酶活性 顯示在表20中，結果發現插入到lacZ基因結構上游的 DNA片段扮演啓動子的功能。此外，每一質體一導入的 品系皆比AJ 1 2092/ pNEOL — 0具有較高的石—半乳糖苷 酶活性。因此發現經由導入突變到可能是啓動子序列的品 系，其轉錄作用活性增加，結果顯示在表20中。 表20 相對活性（AJ 1 2092/pNEOL-0=l) AJ12092 未偵測 A J 1 2092/pNEOL-O 1.0 AJ 1 2092/pNEOL-l 2.8 AJ 1 2092/pNEOL-2 2.7 AJ 1 2092/pNEOL-3 1 .8 AJ 1 2092/pNEOL-4 0.8 AJ 1 2092/pNEOL-7 3.0 (4)用於導入突變之質體的構築： 以AJ 1 2092品系的染色體DNA爲模板，使用引子14 和1 5 (具有序列號碼55和56 )進行PCR。所得的DNA 片段插入選殖用載體pHSG3 9 8 (TaKaRa產品）之多選殖 (60) 1247806 位置中的Smal位置以構築質體p0。然後使用限制酶 EcoRV和BspHI分解p〇，同樣也使用限制酶EcoRV和 Bspn分解pNEOL— 3和pNEOL-7。所得的DNA片段連 接在一起而獲得導入突變的質體P3(衍生自導入突變的 引子11之突變株）和p7(衍生自導入突變的引子13之 突變株）。 (5 )將突變一導入性質體導入到產製精胺酸的細菌內： 使用電脈衝方法（J. Ρ· KOKAI No. Hei 2-207791)將 所得質體導入產製精胺酸的乳酸醱酵短桿菌AJ 1 2092品系 內。由於這些質體的自動複製功能在短桿菌內無效，因此 唯有經由同質性重組作用將主要質體插入整合到染色體的 品系才能被篩選爲C m -抗性品系。將突變一導入性質體 插入整合到染色體者，在含有5微克/毫升氯黴素的 CM2 G平板培養基（每1公升純水包含1〇克聚蛋白腺， 10克酵母菌萃取物，5克葡菊糖，5克NaCl和15克瓊脂 ，p Η 7 · 2 )篩選氯黴素一抗性品系。然後再進行一次同質 性重組作用將指定的變化序列置換arg G基因的啓動子部 分，因此篩選Cm —敏感性品系。 因此得到以P3序列取代的品系（ΑΠ 2092 — P3)和 P7序列取代的品系（AJ 1 2092 -P7)。 (6) argG基因的選殖 以（1 )中所測定的鹼基序列爲基礎，合成具有位在 -64 - (61) 1247806 序列號碼46和47的寡核苷酸（引子5和6 )，及黃色短 桿菌的染色體DNA爲模板進行PCR。PCR反應進行25次 循環，每一循環包括941 : 30秒，55。(： ： 1秒，72 °C : 2 分鐘及3 〇秒。如此所得的DN A片段選殖到選殖用載體 pSTV29 ( Takara Shuzo Co·, Ltd.)中多—選殖位置的 Smal位置。更進一步，將範例；！中的pSAK4以sail處理 所得的複製起源片斷插入pSTV argG的Sail位置而製備 pargG 〇 (7 )將pargG導入到短桿菌內： 使用電脈衝方法（J. Ρ· KOKAI No. Hei 2-207791)將 質體pargG導入乳酸醱酵短桿菌AJ12092品系內。然後將 轉形產物於含有4微克/毫升氯黴素的CM2G平板培養基 (每1公升純水包括1 〇克聚蛋白腺，1 〇克酵母菌萃取物 ，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，ΡΗ7·2)篩選氯黴 素一抗性品系。 (8 )啓動子變化品系的argG活性： 上述的兩種a r g G啓動子變化品系和使用質體經由增 幅argG所得的品系（AJ12092/pargG)測定其argG活性 。將這些品系--塗於瓊脂培養基（含有〇·5克/ 100毫 升葡萄糖，1克/1 0G毫升聚蛋白腺’ 1克/毫升酵母菌 萃取物，〇·5克/毫升NaCl和5微克/升氯黴素），在 3 1 .5 °C培養20 °然後將所得的每一,細胞接種到培養 -65- (62) 1247806 基內〔包含3克/100毫升葡萄糖，κ 5克/ ；! 〇〇毫升硫酸 銨，〇·1 克 /100 毫升 ΚΗ2Ρ〇4，0.04 克 /1〇〇 毫升 MgS04 ’ 0.001 克 /100 毫升 FeS〇4’ 〇·〇1 克 /100 毫升 MnS04， 5微克/毫升VBi，5微克/100毫升生物素和45毫克/ 100毫升（以氮而言）的黃豆水解物〕。在31.5 〇c培養18 小時後’使用上述方法〔Journal of General Microbiology (1 9 9 0 )測定所得細胞的a r g G活性。上述兩種a r g G啓動 子變化品系和使用質體經由增幅a r g G所得品系的A r g G 活性顯不在表21中。從表21顯然得知，將突變導入啓動 子的AJ 1 2092 - P3的ArgG活性比親代品約高兩倍，而 AJ12092 — P7比親代品系商約3倍。AJ12092/pargG的 ArgG活性比親代品系高約4.5倍。 表21 相對活性（A J 1 2 0 9 2 = 1 ) AJ12092 1.0 AJ12092-P3 … 2.1 AJ12092-P7 _ 2.9 AJ12092/pargG ___4.4 (9)由啓動子變化品系產製精胺酸： 在錐形瓶內培養每一 argG啓動子變化的品系。爲對 照用’也培養親代品系AJ 1 2092和AJ 1 2092/pargG。將 -66- (63) 1247806 這些品系各別接種到培養基上（含有0.1克/ 100毫升 KH2P〇4，0.04 克 / 毫升 MgS04，0.001 克 / 100 毫升 FeS04，0.01 克 /100 毫升 MnS04，5 微克 / 毫升 VB!，5 微克/100毫升生物素和45克/100毫升（以氮而言）的 黃豆水解物）；然後再塗於瓊脂培養基（包含0.5克/ 1〇〇毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白腺，1克/100毫 升酵母菌萃取物，0.5克/100毫升NaCl和5微克/升氯 黴素），於31 .5°C培養20小時。然後取這些細胞培養在 含有4克/100毫升葡萄糖和6.5克/100毫升硫酸銨的 錐形瓶中，於3 1 . 5 °C培養到葡萄糖完全消耗爲止。使用 〇·2當量濃度的HC1溶液將此培養液稀釋到1/ 51的濃度 測其吸光度（CD620 )，精胺酸的形成量（濃度：克/ 1〇〇毫升）及培養時間顯示在表22中。 從表22顯然得知使用argG啓動子變化品系時，精胺 酸的產量增加程度相當於使用質體增幅argG。啓動子變 化品系 AJ 1 2092 — P3和 AJ 1 2092 — P7的培養時間與親代 品系相同，但質體增幅品系的培養時間較長。由此得知精 胺酸產製力高於質體增幅品系。 -67- (64) 1247806 表22 OD 精胺酸 (克 /100 毫升） 培養 時間 (小時） 產製力 (克/100毫 升/小時） AJ12092 0.502 1.25 48 0.026 AJ12092-P3 0.5 10 1.47 48 0.03 1 AJ12092-P7 0.514 1.43 48 0.030 AJ12092/pargG 0.520 1.47 52 0.028 範例7將突變導入產製麩胺酸之棒狀桿菌的GDH基因啓 動子區域內 (1 )突變株gdh質體的構築： 使用定位突變法來構築具有範例2中所敘述之FGR1 品系和FGR2品系之GDH啓動子序列的質體。爲取得 FGR1品系的GDH啓動子序列，使用序列號碼57和60的 合成DNA爲引子及ATCC 1 3 869的染色體DNA爲模板進 行PCR ;另一方面也使用序列號碼58和59的合成DNA 及ATCC13869的染色體DNA爲模板進行PCR。更進一步 ，以這些PCR產物作爲模板，使用序列號57和58的合 成 DNA爲引子進行 PCR。將所得的 PCR產物插入 pSFKT2 ( Japanese Patent Application No. Hei 11-69896) 的Smal位置而構築出pSFKTGl 1。爲取得FGR2品系的 GDH啓動子序列，使用序列號碼57和62的合成DNA爲 -68- (65) 1247806 引子及ATCC13869的染色體DNA爲模板進行PCR ;另一 方面也使用序列號碼58和61的合成DNA爲引子，及 ATCC 1 3 8 69的染色體D N A爲模板進行P C R。更進一步， 以這些P C R產物爲模板，使用序列號碼5 7和5 8的合成 DNA爲引子進行PCR。所得的PCR產物插入PSFKT2( Japanese Patent Application No. Hei 11-69896)的 Smal 位置而構築出pSFKTG07。插入pSFKTGl 1和pSFKTG07 Smal位置的DNA片段必需測定其鹼基序列，以確認除了 啓動子區域以外沒有突變導入GDH內。 (2 ) gdh啓動子變化品系的構築： 使用電脈衝方法將 pSFKTGll和 pSFKTG07導入 AJ 1 3 029品系內，然後將轉形產物生長於含有25微克/ 毫升康納黴素的CM2B平板上，於25t進行篩選。將轉 形產物在34°C培養，以篩選可在34°C對康納黴素具抗性 的品系。事實上有一品系在34 °C對康納黴素具抗性，表 示pSFKTGl 1或PSFKTG07整合插入到AJ 1 3029品系的染 色體中。因此康納黴素-敏感性品系則從那些質體插入整 合到染色體中的品系中削減。測定這些品系的GDH啓動 子序列，具有相同於pSFKTGll和PSFKTG07之gdh啓動 子序列的品系分別命名爲G A 0 1和G A 0 2。 (3 ) gdh啓動子變化品系之L 一麩胺酸產製力的確認： 使用上述範例2 ( 2 )中的相同確認品系 GA01和 -69· (66) 1247806 GA02和其親代品系的麩胺酸產製力。結果得知GA01和 G A 0 2顯者增加麩胺酸的累積，結果顯示在表23。 表23 品系 麩胺酸（克/100毫升） GDH的專一活性 相對値 AJ 1 3 029 2.6 7.7 1.0 GA01 3.0 22.3 2.9 GA02 2.9 27.0 3.5 (4 )自行選殖（self-cloning)型式之gdh質體的構築： 首先’構築自行選殖載體pAJ220。使用EcoRV和 PstI 處理 pAJ226 ( J. Ρ· KOKAI No· Sho 6 1 - 1 5 22 89 )，以 製備含有可在棒狀桿菌內自動複製之區域的片段。將此片 段與約〇.7kb的DNA片段連接起來而得到質體AJ220，而 0.7kb 的 DNA 片段是以 EcoRV 和 PstI 處理 pAJ224 ( J. P· KOKAI No. Sho 6 1 - 1 52289 )所得到。此質體能在棒狀桿 菌內自動複製，且可使宿主對抗生素—trimethoprim具抗 使用序列號碼63和64的合成DNA爲引子，野生型 晶膜成長系統品系ATCC 1 3 869的染色體DNA爲模板進行 PCR。將所得的gdh基因片段插入pAJ2 20的Ball位置而 構築PAJ220G。啓動子位在靠近PAJ220的Ball位置，且 表現的增加視基因插入到Ball位置的方向而定。使用電 -70- (67) 1247806 脈衝方法將PAJ220G和pGDH導入ATCC13869內。如此 構築之品系的GDH活性測定，可經由上述步驟（1 )中的 方法進行。結果顯示於表24中，導入paJ22 0G之品系的 GDH活性比導入dGDH的品系高約1 ·5倍。 表2 4 品系 GDH的專一活性 相對値 ATCC 1 3 869 7.7 1 ·0 ATCC 1 3 869/pGDH 82.7 10.7 ATCC 1 3 869/pAJ220G 120.1 15.3 (5 ) gdh活性對產量及副產物天冬胺酸之影響的硏究調 查 利用電脈衝方法將pGDH和pAJ220G導入AJ13029 內。將這些品系及上述步驟（2 )中所得的品系一 一接種 到具有表2 5中所示之接種培養基內，於3〗.5艽搖動培養 24小時以獲取這些接種物。取300毫升的主要培養基於 5 00毫升的玻璃醱酵瓶內，主要培養基成分如表25中所 示，然後加熱滅菌。將40毫升之上述的接種培養基內的 品系接種到主要培養基內，在3 1 · 5 °C開始培養並伴隨8 0 0 到1 3 00rpm的轉動及1/ 2到1/ ivvm的通氣量。使用氣 態氨維持1 / 1 P Η 7.5。開始培養8小時後將溫度移到3 7 °C 。約20到40小時內葡萄糖完全耗盡時就終止培養，測定 -71 · (68) 1247806 所形成及累積在液態培養基中的L -麩胺酸數量（表2 6 ) 。GDH的活性最高可得到約3倍高的產量。當GDH活性 更進一步再提高時，則產量的改良程度就會降低。當 GDH活性提高到16倍時，產量會稍微減少。使用Hitachi Amino Acid Analyzer L-8500來分析副產物胺基酸的形成 ，結果發現GDH活性提高時，天冬胺酸和丙胺酸的累積 量增加。這些結果證明下列事實：要增加麩胺酸的產量必 需適當增加Η的活性，才不致導致天冬胺酸和丙胺酸 的顯著增加。其中一有效方法就是將各種gdh啓動子的突 變導入以調控GDH活性至3倍的親代品系即可。 表2 5 濃度 成分 接種培養 主要培養 葡萄糖 50克/升 150克/升 KH2P〇4 1克/升 2克/升 MgS04 · 7H2〇 0.4克/升 1·5克/升 FeS04 · 7H2〇 1 〇毫克/升 15毫克/升 MnS04 · 4H20 1 0毫克/升 15毫克/升 黃豆蛋白質水解物 20毫克/升 5〇毫克/升 生物素 〇·5毫克/升 2毫克/升 硫胺素鹽酸鹽 2毫克/升 3毫克/升 -72- (69) 1247806 表26 品系 麩胺酸 (克 /100 毫升） 天冬胺 酸（毫克 /100 毫升） 丙胺酸 (毫克 /100 毫升） GDH 相對 活性 相對 値 AJ 1 3 029 8.3 49 60 7.7 1 .0 GAO 1 9.0 145 152 22.3 2.9 GA02 8.9 153 155 27.0 3.5 AJ 1 3 029/pGDH 8.8 201 190 82.7 10.7 AJ 1 3 029/pAJ220G 7.5 290 590 120.12 15.6 【圖式簡單說明】 圖1顯示含有突變啓動子之GDH基因的構築流程。 圖2顯示含有突變啓動子之CS基因的構築流程。 圖3顯示攜帶lacZ爲報告基因之穿梭載體的構築流 -73- 1247806 序列表 <110>味之素股份有限公司 <120>構築產製胺基酸之細菌的方法，及藉由醱酵該經構築之產製胺基酸的細菌以 製備胺基酸之方法 <130> YIG-0426 <140>TW 088116544 <141>1999-09-27 <150> JP 10/271,786 和 JP 10/271，787 <151> 1998-9-25 <160>6 <210〉1 <211>46 <212>核酸 <400〉1 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210>2 <211>46 <212>核酸 <400〉 2 ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210>3 <211>46 <212>核酸 <400> 3 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210〉4 1247806 <211>46 <212>核酸 <400〉4 ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210>5 <211>46 <212>核酸 <400〉 5

ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210>6 <211>46 <212>核酸 <400〉 6 ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210>7 <211>30 <212>核酸

<220>用於選殖乳酸醱酵短桿菌之g 1 t A的引子A <400〉 7 gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg <210>8 <211>30 <212>核酸 <220>用於選殖乳酸醱酵短桿菌之g 1 t A的引子B <400〉 8 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt <210>9 <211〉20 -2- 1247806 <212>核酸 <220>用於導入突變到g 1 t A啓動子的引子1 <400〉9 atcggtataa cgtgttaacc <210> 10 <211>20 <212>核酸 <220>用於導入突變到g 1 t A啓動子的引子2 <400〉10 atcggtataa tgtgttaacc <210> 11 <211>40 <212>核酸 <220>用於導入突變到g 1 t A啓動子的引子4 <400〉11 gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc <210〉 12 <211>28 <212>核酸 <220> g 1 t A啓動子序列引子 <400〉12 agggatccgt ccagtctcag acagcatc <210〉 13 <211> 17 <212〉核酸 <220>通用引子Ml 3RV <400〉 13 caggaaacag ctatgac 1247806 <210> 14 <211>20 <212>核酸 <220>用於選殖I C D H的引子A <400> 14 gaattcgctc ccggtgcagc <210> 15 <211>20 <212>核酸 <220>用於選殖I C D H的引子B <400> 15 gatgcagaat tccttgtcgg <210〉16 <211>28 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H的引子1 <400> 16 tggattgctg gctataatgg tgtcgtga <210〉 17 <211>53 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H的引子2 <400> 17 caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga <210〉18 <211>53 <212〉核酸 <220>用於導入突變到I C D H啓動子的引子3 primer 3 for introducing a mutation of ICD promoter 1247806 <400〉 18 caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga <210> 19 <211>28 <212>核酸 <220〉用於導入突變到I C D H的引子4 <400〉 19 ggctgaaact gctataatag gcgccagc

<210 20 <211>51 <212>核酸 <220>用於導入突變到I C D H的引子5 <400> 20 ggaaacacgg cgttgccatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210 21 <211>51 <212>核酸

<220>用於導入突變到I C D H的引子6 <400 21 ggaaacacgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210 22 <211〉 22 <212>核酸 <220>ICDH啓動子序列引子 <400> 22 gtgcgggtcc agatgatctt ag <210 23 <211>20 <212〉核酸 -5- 1247806 <220〉用於增幅n p t Π的引子A <400> 23 gggatcccgg atgaatgtca <400> 24 <211>23 <212>核酸 <220>用於增幅n p t Π的引子B <400〉 24 gcccggggtg ggcgaagaac tcc <210> 25 <211>23 <212>核酸 <220>用於增幅乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> 25 aci gti tci atg ggi cti ggi cc <210〉26 <211>23 <212>核酸 <220>用於增幅乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400〉 26 cct tci ccg tti agi gti gti eg <210> 27 <211>30 <212>核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400〉27 ttg cag tta acc aeg aag gtc agg ttg tec <210 28 1247806 <211>30 <212〉核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400 28 tgg atg aga cca cgt gat tct ggc teg tee <210 29 <211>30 <212>核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400〉29 aca gat cct gca ega agg cat caa ega ggc <210>30 <211>30 <212〉核酸 <220>用於活體外選殖乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A的引子 <400> tea teg ctg egg gta cct cct aeg cca ccc <210 31 <211> 2766 <212>核酸 <213〉乳酸醱酵短桿菌ATCC13869

<220>乳酸醱酵短桿菌ATCC13869的pdhA基因LA <400〉 31 atg gee gat caa gca aaa ett ggt ggt aag ccc teg gat gac tct aac 48 Met Ala Asp Gin Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn 1 5 10 15 ttc geg atg ate ege gat ggc gtg gca tct tat ttg aac gac tea gat 96 Phe Ala Met lie Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp 20 25 30 1247806 ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tea etc gac gga tta etc cag 144 Pro Glu Glu Thr Asn Glu Tip Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gin 35 40 45 gag tet tet cca gaa cgt get cgt tac etc atg ett cgt ttg ett gag 192 Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu 50 55 60 cgt gca tet gca aag ege gta tet ett ccc cca atg aeg tea acc gac 240

Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp 65 70 75 80 tac gtc aac acc att cca acc tet atg gaa cct gaa ttc cca ggc gat 288 Tyr Val Asn Thr lie Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp 85 90 95 gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att ege tgg aac gca gee 336 Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp lie Arg Trp Asn Ala Ala 100 105 110 ate atg gtt cac ege get cag ega cca ggc ate ggc gtc ggc gga cac 384 lie Met Val His Arg Ala Gin Arg Pro Gly lie Gly Val Gly Gly His 115 120 125 att tee act tac gca ggc gca gee cct ctg tac gaa gtt ggc ttc aac 432 lie Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn 130 135 140 cac ttc ttc ege ggc aag gat cac cca ggc ggc ggc gac cag ate ttc 480

His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gin lie Phe 145 150 155 160 ttc cag ggc cac gca tea cca ggt atg tac gca cgt gca ttc atg gag 528 Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu 165 170 175 ggt ege ett tet gaa gac gat etc gat ggc ttc cgt cag gaa gtt tee 576 -8- 1247806

Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gin Glu Val Ser 180 185 190 cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac cca cac ggt atg aag 624 Arg Glu Gin Gly Gly lie Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys 195 200 205 gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt ctt ggc cca atg gat 672 Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp 210 215 220

gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac etc gaa aac cgt ggc ate 720

Ala lie Tyr Gin Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly lie 225 230 235 240 aag gac acc tet gac cag cac gtc tgg gcc ttc ctt ggc gac ggc gaa 768 Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 atg gac gag cca gaa tea cgt ggt etc ate cag cag get gca ctg aac 816 Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu lie Gin Gin Ala Ala Leu Asn 260 265 270

aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc aac ctg cag cgt etc 864 Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gin Arg Leu 275 280 285 gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag ate ate cag gaa etc gag tcc 912 Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys lie lie Gin Glu Leu Glu Ser 290 295 300 ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tet gtg ate aag gtt gtt tgg ggt cgc 960

Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val lie Lys Val Val Trp Gly Arg 305 310 315 320 gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat ggt gca ctt gtt gag 1008 Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp Gly Ala Leu Val Glu 325 330 335 1247806 ate atg aac aac acc tee gat ggt gac tac cag acc ttc aag get aac 1056 lie Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga cgt gac cca ege acc 1104 Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr 355 360 365 gca aag etc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa ate tgg aag ctg cca 1152 Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu lie Trp Lys Leu Pro 370 375 380

cgt ggc ggc cac gat tac ege aag gtt tac gca gee tac aag ega get 1200

Arg Gly <31y His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala 385 390 395 400 ett gag acc aag gat ege cca acc gtc ate ett get cac acc att aag 1248 Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val lie Leu Ala His Thr lie Lys 405 410 415 ggc tac gga etc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt aac gca acc cac cag 1296 Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gin 420 425 430

atg aag aag ctg aeg ett gat gat ctg aag ttg ttc ege gac aag cag 1344 Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gin 435 440 445 ggc ate cca ate acc gat gag cag ctg gag aag gat cct tac ett cct 1392 Gly lie Pro lie Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro 450 455 460 cct tac tac cac cca ggt gaa gac get cct gaa ate aag tac atg aag 1440

Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu lie Lys Tyr Met Lys 465 470 475 480 gaa cgt ege gca geg etc ggt ggc tac ctg cca gag cgt cgt gag aac 1488 Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn -10- 1247806 485 490 495 TAC GAT CCA ATT CAG GTT CCA CCA CTG GAT AAG CTT CGC TCT GTC CGT 1536

Tyr Asp Pro lie Gin Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg 500 505 510 aag ggc tcc ggc aag cag cag ate get acc act atg geg act gtt cgt 1584 Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin lie Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg 515 520 525

acc ttc aag gaa ctg atg ege gat aag ggc ttg get gat ege ett gtc 1632 Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val 530 535 540 cca ate att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt ett gac tet tgg ttc 1680

Pro lie lie Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe 545 550 555 560 cca acc ttg aag ate tac aac ccg cac ggt cag aac tac gtg cct gtt 1728 Pro Thr Leu Lys lie Tyr Asn Pro His Gly Gin Asn Tyr Val Pro Val 565 570 575

gac cac gac ctg atg etc tec tac cgt gag gca cct gaa gga cag ate 1776 Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gin lie 580 585 590 ctg cac gaa ggc ate aac gag get ggt tec gtg gca teg ttc ate get 1824 Leu His Glu Gly lie Asn Glu Ala Gly Ser Val Ala Ser Phe lie Ala 595 600 605 geg ggt acc tec tac gee acc cac ggc aag gee atg att ccg ctg tac 1872 Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met lie Pro Leu Tyr 610 615 620 ate ttc tac teg atg ttc gga ttc cag ege acc ggt gac tec ate tgg 1920 lie Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr Gly Asp Ser lie Trp 625 630 635 640 -11 - 1247806 gca gca gcc gat cag atg gca cgt ggc ttc etc ttg ggc get acc gca 1968 Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala 645 650 655 ggt ege acc acc ctg acc ggt gaa ggc etc cag cac atg gat gga cac 2016 Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin His Met Asp Gly His 660 665 670

tee cct gtc ttg get tee acc aac gag ggt gtc gag acc tac gac cca 2064 Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro 675 680 685 tee ttt geg tac gag ate gca cac ctg gtt cac cgt ggc ate gac ege 2112 Ser Phe Ala Tyr Glu lie Ala His Leu Val His Arg Gly lie Asp Arg 690 695 700 atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt ate tac tac ate acc ate 2160 Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val lie Tyr Tyr lie Thr lie 705 710 715 720 tac aac gag cca acc cca cag cca get gag cca gaa gga ctg gac gta 2208 Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val 725 730 735

gaa ggc ctg cac aag ggc ate tac etc tac tee ege ggt gaa ggc acc 2256 Glu Gly Leu His Lys Gly lie Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr 740 745 750 ggc cat gag gca aac ate ttg get tee ggt gtt ggt atg cag tgg get 2304 Gly His Glu Ala Asn lie Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gin Tip Ala 755 760 765 etc aag get gca tee ate ett gag get gac tac gga gtt cgt gcc aac 2352 Leu Lys Ala Ala Ser lie Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn 770 775 780 att tac tee get act tet tgg gtt aac ttg get ege gat ggc get get 2400 -12 - 1247806 lie Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala 785 790 795 800 cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca gat get ggc gag gca 2448 Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala 805 810 815 ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc cca tac gtt gca gtg 2496 Phe Val Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val 820 825 830

tet gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag ate cgt gaa tgg gtc cca 2544 Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin lie Arg Glu Trp Val Pro 835 840 845 ggc gac tac acc gtt etc ggt gca gat ggc ttc ggt ttc tet gat acc 2592 Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr 850 855 860 cgc cca get get cgt cgc ttc ttc aac ate gac get gag tcc att gtt 2640 Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn lie Asp Ala Glu Ser lie Val 865 870 875 880

gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc aag ate gac gtc tcc 2688 Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys lie Asp Val Ser 885 890 895 gtt get get cag get get gag aag ttc aag ttg gat gat cct aeg agt 2736 Val Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser 900 905 gtt tcc gta gat cca aac get cct gag gaa Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 910 2766 <210〉32 <211> 8556 <212>核酸 -13- 1247806 <213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 <400〉32 tcacgttacg gcgatcaaca ccgcaaccac tacgagaaga tctccaaacg agaccaagag 60 cgcttctaag cccgtctcat tttgcacctg ccattctgtg aggatatggc aggtgctttt 120 tcatgccact atcttggggt tctcggtatt agatcttctg ataaaaaccc gatagttttc 180 ttgcgctaga cactaattac ggcaccgctt aagcatggtc gtgacacgta aaacctgact 240 taggccattt tgatgtggtg tagatcatat tgacgtcaat gaatgaagtg actaactccg 300 ccgaatccac atcgtctaaa aggcctgggc gaccacgtaa agacgggcac gacgagaaga 360 tcatcgacgc aactttacgg ctcatcgaca gcaatcgtcc cgtcacggtc aatgcagttg 420

tcaaagaaag cggagtggca cgtgcagcgg tttatcgacg ctggcccagg ctagtggatc 480 tagtagcgga agctttagat gccgggcgag ctccagttga aatagatacc ccaggggaca 540 tcaaagagac cttgattgat gggctgttta caaatcaggc gaaaaccact ggagtctcct 600 atcctcgtca gcgatttcgc aaacggctcg agttggtgat gtcagatcaa gaattacagc 660 tcgcctaatg gaattcacat gtgaagagac gtcgagaagc aaatattcgc gcgctgcaag 720 tcgcgcaaga aaaaggccaa atccgggcgg atctagacat cgaggcgtgc ctcgatgcaa 780 tccttggggt gttttattac caatcggtcg cgcgtggagt aaatttcacc gaccaaggta 840 caacgcaacg atgcagagaa gccttggagg tgatctggca tggaatggaa ccttaaattc 900 aggttctgac gaggtgcgaa gcaagttgtc gcgcgccgca cctcagtatc cggatcaact 960 taatttcgaa gtgctgggtt ttcicgcgca tacccaatgc gtaccgatgt gcccatgagc 1020 gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa cttatcgtgg cctgcttcta tatttgtgcg 1080 ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt ccagctgagc 1140

taaaggcgcg cacgtgcttt tctagaacca ccttggtggc ctcgaaagca acgagtgaaa 1200 tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260 gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt 1320 ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtt gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380 gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440 agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500 gcacgacatc gcacagctcg tcggtttctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560 cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620 gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680 gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740 ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800 ggtactttga accacctttc cctggaattt tttccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860 atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920 acaattctct tcaaaataat ggtggctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980 cagacctgta gttttatgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040 -14- 1247806 aactacccga taattctttg caaaactttg caaagggtaa tgaacatgca gctagtttcc 2100 gtagaaatgt tctttaaaaa atccacaaca attgccagga agcacaccga ttgatggata 2160 cctgaaatcc cagtgagcgc accactcccc ttacgtcaca gtctgtaaaa caaatcttcg 2220 gtgttgcgta tccttgttaa taacttatgc gttgacccat tcgtgcactt cggtgtgcca 2280 caattaggta cgaccaagaa tgggaccggg aaaccgggac gtataaacga aataaaacat 2340 tccaacagga ggtgtggaa atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc 2392

Met Ala Asp Gin Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro - 5 teg gat gac tet aac ttc geg atg ate ege gat ggc gtg gca tet tat 2440

Ser Asp Asp Ser Asn Phe Ala Met lie Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr 15 20 25 ttg aac gac tea gat ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tea etc 2488

Leu Asn Asp Ser Asp Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu 30 35 40 gac gga tta etc cag gag tet tet cca gaa cgt get cgt tac etc atg 2536

Asp Gly Leu Leu Gin Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met 45 50 55 ctt cgt ttg ctt gag cgt gca tet gca aag ege gta tet ctt ccc cca 2584

Leu Arg Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro 60 65 70 atg aeg tea acc gac tac gtc aac acc att cca acc tet atg gaa cct 2632

Met Thr Ser Thr Asp Tyr Val Asn Thr lie Pro Thr Ser Met Glu Pro 80 85 90 gaa ttc cca ggc gat gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att 2680

Glu Phe Pro Gly Asp Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp lie 95 100 105 ege tgg aac gca gcc ate atg gtt cac ege get cag ega cca ggc ate 2728

Arg Trp Asn Ala Ala lie Met Val His Arg Ala Gin Arg Pro Gly lie 110 115 120 277.6 ggc gtc ggc gga cac att tee act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac 1247806

Gly Val Gly Gly His lie Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr 125 130 135 gaa gtt ggc ttc aac cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc 2824

Glu Val Gly Phe Asn His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly 140 145 150 ggc gac cag ate ttc ttc cag ggc cac gca tea cca ggt atg tac gca 2872

Gly Asp Gin lie Phe Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala 160 165 cgt gca ttc atg gag ggt cgc ett tet gaa gac gat etc gat ggc ttc 2920

Arg Ala Phe Met Glu Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe 175 180 185 cgt cag gaa gtt tcc cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac 2968

Arg Gin Glu Val Ser Arg Glu Gin Gly Gly lie Pro Ser Tyr Pro His 190 195 200 cca cac ggt atg aag gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt 3016

Pro His Gly Met Lys Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly 205 210 215 ett ggc cca atg gat gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac etc 3064

Leu Gly Pro Met Asp Ala lie Tyr Gin Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu 220 225 230 gaa aac cgt ggc ate aag gac acc tet gac cag cac gtc tgg gcc ttc 3112

Glu Asn Arg Gly lie Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Val Trp Ala Phe 240 245 ett ggc gac ggc gaa atg gac gag cca gaa tea cgt ggt etc ate cag 3160

Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu lie Gin 255 260 265 cag get gca ctg aac aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc 3208

Gin Ala Ala Leu Asn Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys 270 275 280 1247806 aac ctg cag cgt etc gac gga cct gtc ege ggt aac acc aag ate ate 3256 Asn Leu Gin Arg Leu Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys lie lie 285 290 295 cag gaa etc gag tee ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tet gtg ate aag 3304 Gin Glu Leu Glu Ser Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val lie Lys 300 305 310 315 gtt gtt tgg ggt ege gag tgg gat gaa ett ctg gag aag gac cag gat 3352 Val Val Trp Gly Arg Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp 320 325 330 ggt gca ett gtt gag ate atg aac aac acc tee gat ggt gac tac cag 3400 Gly Ala Leu Val Glu He Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin 335 340 345 acc ttc aag get aac gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga 3448 Thr Phe Lys Ala Asn Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly 350 355 360 cgt gac cca ege acc gca aag etc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa 3496 Arg Asp Pro Arg Thr Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu 365 370 375 ate tgg aag ctg cca cgt ggc ggc cac gat tac ege aag gtt tac gca lie Trp Lys Leu Pro Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala 380 385 390 gee tac aag ega get ett gag acc aag gat ege cca acc gtc ate ett Ala Tyr Lys Arg Ala Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val lie Leu 400 405 get cac acc att aag ggc tac gga etc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt Ala His Thr He Lys Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg 415 420 aac gca acc cac cag atg aag aag ctg aeg ett gat gat ctg aag ttg

3544 3592 3640 3688 395 425 410 •17- 1247806

Asn Ala Thr His Gin Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu 430 435 440 ttc cgc gac aag cag ggc ate cca ate acc gat gag cag ctg gag aag 3736

Phe Arg Asp Lys Gin Gly lie Pro lie Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys 445 450 455 gat cct tac ett cct cct tac tac cac cca ggt gaa gac get cct gaa 3784

Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu 460 465 470 475

ate aag tac atg aag gaa cgt cgc gca geg etc ggt ggc tac ctg cca 3832 lie Lys Tyr Met Lys Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro 480 485 490 gag cgt cgt gag aac tac gat cca att cag gtt cca cca ctg gat aag 3880

Glu Arg Arg Glu Asn Tyr Asp Pro lie Gin Val Pro Pro Leu Asp Lys 495 500 505 ett cgc tet gtc cgt aag ggc tee ggc aag cag cag ate get acc act 3928

Leu Arg Ser Val Arg Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin lie Ala Thr Thr 510 515 520 atg geg act gtt cgt acc ttc aag gaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg 3976

Met Ala Thr Val Arg Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu 525 530 535 get gat cgc ett gtc cca ate att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt 4024

Ala Asp Arg Leu Val Pro lie lie Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly 540 545 550 555 ett gac tet tgg ttc cca acc ttg aag ate tac aac ccg cac ggt cag 4072

Leu Asp Ser Trp Phe Pro Thr Leu Lys lie Tyr Asn Pro His Gly Gin 560 565 570 aac tac gtg cct gtt gac cac gac ctg atg etc tee tac cgt gag gca 4120

Asn Tyr Val Pro Val Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala 575 580 585 -18- 1247806 cct gaa gga cag ate ctg cac gaa ggc ate aac gag get ggt tee gtg 4168

Pro Glu Gly Gin lie Leu His Glu Gly lie Asn Glu Ala Gly Ser Val 590 595 600 gca teg ttc ate get geg ggt acc tee tac gee acc cac ggc aag gee 4216

Ala Ser Phe lie Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala 605 610 615 atg att ccg ctg tac ate ttc tac teg atg ttc gga ttc cag ege acc 4264

Met lie Pro Leu Tyr lie Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr 620 625 630 ggt gac tee ate tgg gca gca gee gat cag atg gca cgt ggc ttc etc 4312

Gly Asp Ser lie Trp Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu 640 645 ttg ggc get acc gca ggt ege acc acc ctg acc ggt gaa ggc etc cag 4360

Leu Gly Ala Thr Ala Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin 655 660 665 cac atg gat gga cac tee cct gtc ttg get tee acc aac gag ggt gtc 4408

His Met Asp Gly His Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val 670 675 680 gag acc tac gac cca tee ttt geg tac gag ate gca cac ctg gtt cac 4456

Glu Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Ala Tyr Glu lie Ala His Leu Val His 685 690 695 cgt ggc ate gac ege atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt ate 4504

Arg Gly lie Asp Arg Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val lie 700 705 710 tac tac ate acc ate tac aac gag cca acc cca cag cca get gag cca 4552

Tyr Tyr lie Thr lie Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro 720 725 gaa gga ctg gac gta gaa ggc ctg cac aag ggc ate tac etc tac tee 4600 1247806

Glu Gly Leu Asp Val Glu Gly Leu His Lys Gly lie Tyr Leu Tyr Ser 735 740 745 cgc ggt gaa ggc acc ggc cat gag gca aac ate ttg get tcc ggt gtt 4648

Arg Gly Glu Gly Thr Gly His Glu Ala Asn lie Leu Ala Ser Gly Val 750 755 760 ggt atg cag tgg get etc aag get gca tee ate ett gag get gac tac 4696

Gly Met Gin Trp Ala Leu Lys Ala Ala Ser He Leu Glu Ala Asp Tyr 765 770 775 gga gtt cgt gee aac att tac tee get act tet tgg gtt aac ttg get 4744

Gly Val Arg Ala Asn lie Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala 780 785 790 ege gat ggc get get cgt aac aag gca cag ctg ege aac cca ggt gca 4792

Arg Asp Gly Ala Ala Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala 800 805 gat get ggc gag gca ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tee ggc 4840

Asp Ala Gly Glu Ala Phe Val Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly 815 820 825 cca tac gtt gca gtg tet gac ttc tee act gat ctg cca aac cag ate 4888

Pro Tyr Val Ala Val Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin lie 830 835 840 cgt gaa tgg gtc cca ggc gac tac acc gtt etc ggt gca gat ggc ttc 4936

Arg Glu Trp Val Pro Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe 845 850 855 ggt ttc tet gat acc ege cca get get cgt ege ttc ttc aac ate gac 4984

Gly Phe Ser Asp Thr Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn lie Asp 860 865 870 get gag tee att gtt gtt gca gtg ctg aac tee ctg gca ege gaa ggc 5032

Ala Glu Ser lie Val Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly 880 885 1247806 aag ate gac gtc tee gtt get get cag get get gag aag ttc aag ttg 5080

Lys lie Asp Val Ser Val Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu 895 900 905 gat gat cct aeg agt gtt tee gta gat cca aac get cct gag gaa taaat 5130 Asp Asp Pro Thr Ser Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 910 915 920

cacctcaagg gacagataaa tcccgccgcc agacgttagt ctggcggcgg gattegtegt 5190 aaagcaagct ctttttagcc gagaaaegee ttgtcagaca atgttgcgcc ettgatattg 5250 gcgaactcct gcagcaaatc gcgcacagtc aacttcgact tggtagcctg atctgcctgg 5310 tagacaatct ggccttcatg catcatgatc aggegattge ccaggcgaat tgcctgttcc 5370 atgttgtgcg tgaccataag egtagteaga gttccatctg ccacgatctt ttcggtcaag 5430 gtggtcacaa gctctgcacg ctgtggatca agegetgegg tgtgctcatc caacagcatg 5490 attttaggtt gagtaaaacc agccatcagc agggacaatg cctgacgctg accgccagag 5550 agcaaaccaa ctttggcagt gagcctgttt tccagaccca gctcaaggcg ctcaagttcc 5610 tgettgaatt gctcacggcg cttcgaggtc agtgcaaagc ccaatccacg gcgcttgccg 5670 cgcagcaacg cgatggccag attetettea atggtgagat teggegeggt gcctgccaaa 5730 ggatcctgaa aaacgcggcc gatgtagegg gcacgcttgt gctctgacat cttgtttacc 5790 ttgttgccgt cgatggaaat ctcgccggaa tcaacaagca aacggccaga aacagcgttg 5850 agcagggtgg atttacccgc accgttagaa ccgatgacgg tgacaaaatc gccctcagcc 5910 atategagtt tgagctgctg caacgcgcgg cgctcattca cagtgccggg gaagaaggtt 5970 ttggaaattc cgttgatgga taacatgtct taagcctcca ctgctactgg ttgettagge 6030 ttcggtgcct tggagaaett cgcacgccac ctcggcagca gcatggcgac aaccaccaag 6090 atcgcagaaa ttgccttcat atcgttgggg tcaaggccaa cgcgcagtgc tgcgaaaatg 6150 atcaggcggt aegegatgge accgacgatg acagccaaca cagccaacca cacgcgacgc 6210 tgaccgaaga tggcctggcc ccaaaataac egatgegaga ccgatcacga tgaggccaat 6270 acccatcgaa atatetgega agccctggta ctgagcgatg agtgcaccgg caagaccaac 6330 agaaccattg gacagggaga tggtgaggat tttggtgaaa tccgttgaaa caccaaagga 6390 ctgcaccatc ggcccgttgt cgccggtgga tcgcagcgac agteegatat cagtgttgag 6450 gaaccagatg aegatgagte ccaaaaatcc cactgcaacg gegaggateg ccgggcctgc 6510 ccatgtgccg aggaggeegg egtegegaag cggggtgaag aggttatcgg tgcgcaacaa 6570 tggcacgttc gcgccaccca tgatgcgcaa gttaaccgac cacaacgcaa tcatggtcaa 6630 aatacctgcg agcaaaccat cgatcttgcc cttggtgtgc agcaaaccgg tgatcatgcc 6690 agegataaag ccagtaacga aaccagcggc agtagccata agaggaggee agccagacat 6750 aagagctgtc gcagctgttg ccgcgccagt ggtcaggctg ccgtcaacgg tgaggtcggg 6810 aaagttgagc acacggaacg tcaaatagac gcccaatgcg acaactccgt acaacaatcc 6870 -21 - 1247806 gaactcaaaa gcgccgatca tacgcgttcg gccttatcca aaatctcttg agggatctcc 6930 acgccctggc gctctgctgc atcttcgttg atcacgtagg tgaactcagt tgcagtctcc 6990 acaggcatgg ttgctgggtc ttcgccgtcc tgcagaatac gcagagccat ctcgccagtc 7050 tggcggccaa gctcggtgta atcgataccc agggttgcca gtgcgccacc ctcaacagtg 7110 ccggactcag caccgatcac agggatctgc ttctgctcag caacctgaac cagagaagaa 7170

ataccggaaa caaccatgtt gtcagttgga acgtagatga catcaacatc gccgagagct 7230 tcaacagcct gctgaatctc gttcacggta gtgacagtct gagtattaac ggacagcccc 7290 agtggctcag cagccttggt gacctcatcg acctgcacct gagagttgac ctcaccagac 7350 gcgtagacga tgccgatgga ctttgcgtca ggaaccagct gctgcaaaag ctccaactgc 7410 tgctcaatcg gtgcgatatc agaagtaccg gtgacgtttc cgccaggtgc ttcattagaa 7470 tccaccagct ctgccgacac tgcatcggta actgcggtga acaggactgg gatatcagtg 7530 atattctgcg cagttgcctg tgctgctgga gttgcaacag ccaacacgag atccaaattg 7590 tcagaagcga actgctgaga aatagtcagt gcagtgccct gctcgccgtt agcgttttgc 7650 tcatcaaagg tgacgtcaac gcctgcctct tcaaaagctt ccttgaaacc agtggtcgct 7710 gcatcaagtg cagggtgctg aacaagctgg ttgatgccaa ctcggtaaga gtcgccacct 7770 gcagcatcag tggaggtgga gctgtcactg gaatcgcttg agcacgaagc caacgccaag 7830 gcgccaacag taaagatgct tgcgagtacc ttcgaacggg aagaaaacat agcacatctc 7890 cttaaagtgt tattttcaaa aaggggcaga cagcgtcaac acatgtctcg gataaagaac 7950 catatgtgaa atgtctcatg atttaaacta cttgttctac cagtcatatg cgcaattccc 8010 cctggatatc ccgcaggaca tggacaaaat gggtggatag cgggtgcacc aattcaatct 8070 tttaaaggcc ctagacaccg cgatttcctt aatcgatcat taaagaggga tcctctcccc 8130 taacaaacct ccaaagacta gagtggggaa caccatgaac gtttcctcaa ataaacccag 8190

tgactctgac cgcgaatatc ttcaatcaga actcacccgg ctcgttggcc aggggcgact 8250 cgatctagat acttaccaag acgtggttga taccgtttgg tctactgatg atctaggcga 8310 gttgatgagg atccgtgccc gcttcctggg agggccgcag gtttcgcagc agcggcccca 8370 gcagccgcag caaccacatc agcggccgca acagcaaccg ccacagcatt atggacaacc 8430 cggctacggc caatcacctc aatatccacc gcagcagcct ccgcataatc agcccggcta 8490 ttaccccgat cccggccctg gccagcagca accaccgatg caccagccac caacgcgtcc 8550 aaatca <210 33 <211>20 <212>核酸 <220>用於構築乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A增幅質體的引子 <400> 33 aat gcc agg agt caa cac cc -22- 1247806 <210〉34 <211>20 <212>核酸 <220>用於構築乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A增幅質體的引子 <400〉 34 aca tgg aac agg caa ttc gc <210 35 <211>28 <212>核酸

<220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400> 35 cgt ccc ggg ctg taa aac aaa tct teg g <210 36 <211>27 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A啓動子的引子 <400〉 36 ate ccc ggg ett acc acc aag ttt tgc

<210 37 <211>30 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400> 37 ett atg cgt tgc cac att cgt gca ett egg <210〉38 <211>40 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A啓動子的引子 <400〉38 -23- 1247806 gcg ttg acc cat teg tgc act teg gtg tgc tat aat tag g <210 39 <211>40 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A啓動子的引子 <400〉39 gcg ttg cca cat teg tgc act teg gtg tgc tat aat tag g

<210 40 <211>38 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因L A啓動子的引子 <400> 40 ttt taa aac gtt ctg gag aag act cct gga gta ate eg <210 41 <211>20 <212>核酸 <220>用於導入突變到乳酸醱酵短桿菌p d h A基因LA啓動子的引子 <400〉 41

ega tet tgc ett ege gtg cc <210 42 <211〉 30 <212>核酸 <400〉 42 agaccgccgg agtatgcaag aaegatgegg <210 43 <211>30 <212>核酸 <400〉43 -24- 1247806 gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta <210〉44 <211>30 <212>核酸 <400> 44 accttcgacc agaccctggc taagggcttt <210 45 <211>30 <212>核酸 <400> 45 gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac <210 46 <211>25 <212>核酸 <400 46 gcgatgacac cgtttttgtt ctcgc <210 47 <211〉 25 <212>核酸 <400〉47 ggcgacatcc ttgcccagat gatca <210 48 <211〉 25 <212>核酸 <400> 48 gacttcacca tcaatcatct tcttc <210> 49 1247806 <211>24 <212>核酸 <400> 49 gccaggtaca actgtctgaa ttgc <210〉 50 <211>40 <212>核酸 <220> primer for introducing a mutation <400〉50 gttaatcgct tgccaatgca ggcaggtaag gtataacccg <210 51 <211>40 <212>核酸 <400> 51 gttaatcgct tgctaatgca ggcaggtaag gtataacccg <210> 52 <211>40 <212>核酸 <400〉 52 gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataacccg <210 53 <211>40 <212>核酸 <400〉53 gttaatcgct tgttaatgca ggcaggtaag gtataatccg <210 54 <211>40 <212>核酸 1247806 <400〉 54 gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataatccg <210 55 <211>30 <212>核酸 <400> 55 gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag <210 56 <211>25 <212>核酸 <400〉56 gcgttaccca gagctggatc ctcgg <210 57 <211〉16 <212>核酸 <400〉57 cagttgtggc tgatcg <210 58 <211> 17 <212>核酸 <400> 58 ctttcccaga ctctggc <210> 59 <211>21 <212>核酸 <400> 59 gctataattt gacgtgagca t 1247806 <210 60 <211>25 <212>核酸 <400> 60 gctcacgtca aattatagca gtgtc <210〉 61 <211>54 <212>核酸

<400〉 61 ttgttgtcat tctgtgcgac actgctataa tttgaacgtg agcagttaac agcc <210 62 <211>63 <212>核酸 <400〉 62 gttaactgct cacgttcaaa ttatagcaft gtcgcacaga atgacaacaa agaattaaaa ttg

<210 63 <211>25 <212>核酸 <400〉 63 gctagcctcg ggagctctct aggag <210 64 <211>25 <212>核酸 <400〉64 gatctttccc agactctggc cacgc -28-

Claims (1)

1. 1247806 (1)

   十、申請專利範圍 附件（A): 第93 1 29852號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國94年8月15曰修正 1. 一種藉由醱酵產製麩胺酸之方法，其包含下述之 步驟：

   a )藉由基因重組於棒狀桿菌之染色體上的檸檬酸合 成酶（CS)基因之啓動子序列中導入突變以使該啓動子 序列接近一致序列，以得到具有改良之胺基酸生產力之棒 狀桿菌； b )於培養基中培養所得到之棒狀桿菌並因此於該培 養基中累積胺基酸；及 c )自該培養基中收集該胺基酸，

   其中該細菌之CS基因的突變或改變之啓動子序列具 有至少1個選自下述之序列： i)位於-35區域之TTGACA序列以替代野生型序列 ATGGCT ； ii )位於-1 〇區域之TATAAT或TATAAC序列以替代 野生型序列TATAGC ;及 iii) i)和Π)之組合。 2. 一種源自棒狀桿菌的經分離之檸檬酸合成酶 (CS )基因，其具有啓動子，該啓動子含有至少1個選 自下述之序列： (2) 1247806 i)位於-35區域之TTGACA序列以替代野生型序列 ATGGCT ； ii )位於-1 〇區域之TATA AT或T AT AAC序列以替代 野生型序列TATAGC ;及 iii) i)和ii)之組合。

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