EP0551506A1 - Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries - Google Patents

Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries

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EP0551506A1
EP0551506A1 EP92917803A EP92917803A EP0551506A1 EP 0551506 A1 EP0551506 A1 EP 0551506A1 EP 92917803 A EP92917803 A EP 92917803A EP 92917803 A EP92917803 A EP 92917803A EP 0551506 A1 EP0551506 A1 EP 0551506A1
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EP
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sequence
protein
ala
strain
expression
Prior art date
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Withdrawn
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EP92917803A
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Gwennael Joliff
Armel Guyonvarch
Purfication Relano
Gérard LEBLON
Francis Duchiron
Michel Renaud
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Orsan
Original Assignee
Orsan
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Publication date
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    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates in particular to expression and secretion systems of proteins which can be used, in particular in corynebacteria, as well as a method using these systems, as well as new proteins linked to these expression systems.
  • Corynebacteria constitute a group of gram positive bacteria, of irregular morphology, represented by a wide variety of strains.
  • the invention relates to an expression and secretion system in a corynebacterium type bacterium comprising the secretory elements of two proteins found mainly in the culture supernatant of certain corynebacteria.
  • a system of expression / secretion of an amino acid, polypeptide or protein determined by a corynebacterial strain characterized in that the sequence which codes for said amino acid, polypeptide or said protein is located in a region of chromosomal or plasmid DNA where said sequence is transcribed with towards the 5 'end at least part of the sequence coding for the signal sequence of the protein PS 1 or PS2, said part ensuring the secretion of said amino acid, polypeptide or said protein after translation when the system is incorporated into said corynebacterial strain.
  • the present invention relates to an expression and secretion system in a corynebactery comprising:
  • a secretion cassette containing a first functional DNA sequence for expression in said corynebacterial strain, a second DNA sequence which codes for an amino acid, a polypeptide and / or a protein, and a third DNA sequence inserted between said first and second DNA sequences which code for elements of a protein chosen from PS 1 or PS2, which ensure the secretion of said amino acids, polypeptides and / or proteins by said corynebacterial strain.
  • corynebacterie designates not only the strains of the genus Corynebacterium but also related bacteria, such as Brevibacterium.
  • the expression system of the present invention can be found on a self-replicating piasmide in corynebacteria and in this case, the piasmide will have an origin of functional replication in the strain, for example in Corynebacterium an origin of replication PBL 1, but may also be carried by a non-replicating piasmid intended in particular for chromosomal integration, in this case the piasmide will include elements allowing recombination and chromosomal integration; in the case of integration, the expression system will ultimately be found in the chromosome of the bacteria in question.
  • heterologous expression elements that is to say that they may be elements which already exist in the host bacterium or which, on the contrary, come from a different bacterium.
  • These expression elements will essentially comprise a promoter and a ribosome binding site, but it is also possible to provide other elements, in particular of the expression regulation type type.
  • the expression elements which can be used in corynebacteria use will be made more particularly of the Ptac promoter which is a strong, hybrid trp / lac promoter inducible by IPTG and which proves to be functional in corynebacteria as in E. coli; but it is possible to use other promoters, for example, as will be described below, promoters or other elements of expression of corynebacterial structure gene, for example the promoter of gdhA. It is also possible to plan to use, for example, the expression elements, in particular the promoter of one of the proteins PS 1 and / or PS2 as they are identified in the context of the present invention.
  • the expression elements may also include DNA sequences ensuring the regulation of the expression of downstream genes.
  • the expression system of the present invention may finally comprise other elements, in particular elements such as transcription terminators, for example the terminator of the proteins PS 1 and / or PS2, or of gdhA.
  • elements such as transcription terminators, for example the terminator of the proteins PS 1 and / or PS2, or of gdhA.
  • it may be advantageous to add to the expression and secretion sequences, all or part of the PS 1 protein in order to obtain fused proteins, the secretion and the expression level of which can under these conditions be improved.
  • the expression systems according to the invention may include heterologous elements which allow the construction in bacteria different from corynebacteria, for example as has been said previously, an origin of functional replication in E. coli but also other elements such as a -marker gene which can facilitate transfer into Corynebacterium.
  • the marker gene can, of course, be of a very varied type as long as it is functional in corynebacteria, it could be a positive or negative selection gene such as a specific resistance, nevertheless in the current state research into these genes is not readily available.
  • the celA gene of Clostridium thermocellum cellulase (celA), which confers the CMC + phenotype, will therefore preferably be used, but it is possible to use other marker genes, in particular lacZ of E. coli.
  • the transformed bacteria are selected for the CMC + character after insertion of the coding sequence into an appropriate restriction site such as BstXI.
  • the marker gene in the method according to the invention, provision will preferably be made for the marker gene to be easily eliminated after verification of the construction, in particular by placing restriction sites between the marker gene and the coding sequence.
  • the coding sequence may be natural, synthetic or mixed.
  • the expression and secretion system of the present invention is of course intended more particularly for ensuring the production of products of industrial interest, this is why the coding sequences will more particularly code for a peptide, a polypeptide, or a protein d 'industrial interest but it may also be a sequence coding not directly for a protein of industrial interest, but for a protein which may be involved in the maturation and / or the preparation of an amino acid, a polypeptide, or a protein of industrial interest.
  • the methods according to the invention are more particularly intended for the expression of amino acid sequences, in particular repetitive sequences, they are therefore mainly synthetic sequences.
  • This second DNA sequence coding for these different products may also include certain elements intended to ensure the maturation of the secreted product.
  • the sequence expressed codes for a polypeptide of structure (ala-gln) 20 and (ala-gln-lys) 1 0 .
  • the ala-gln or ala-gln-lys sequence can be released by subsequent enzymatic treatment. It is possible to provide other polymers of this type such as Ala-Gln-Tyr or Ala-Gln-Met which can be released by enzymatic or chemical treatment.
  • codons of the coding sequence can influence expression in corynebacteria, it is preferable to provide a sequence having a richness in GC of the order of 50 to 60%.
  • the percentage of GC is of the order of 75%, which may constitute a limitation, this is why the use of polymers comprising 3 amino acids is envisaged, the third of which is rich in A and T for reduce the percentage to 55%.
  • Tyr, Lys and Met have two A or T in the first two bases of their codon and therefore allow the percentage of GC to be lowered from 75% to around 60%, which becomes closer to the percentage of GC found in corynebacteria.
  • the industrial interest for these two amino acids in the COOH-terminal position of glutamine (Q) has been considered and exists.
  • the present invention also relates to the strains of corynebacteria comprising an expression and secretion system as it has been described previously, and more particularly when the strain is a Brevibacterium, in particular a strain of Brevibacterium lactofermentum.
  • the present invention relates to a process for obtaining amino acids, polypeptides, or proteins, characterized in that a transformed corynebacterial strain as described above is cultivated in a culture medium, in which the second DNA sequence codes for said amino acids, said polypeptide, and / or said protein and in that said product is optionally separated after culture from the culture medium.
  • the product of interest has been secreted and is therefore found in the culture medium from which it can be isolated by known methods, whether separation techniques such as chromatography, precipitation selective for example, this obviously having to be adapted to the nature of the molecule produced.
  • PS 1 and PS2 being wall proteins, part of the proteins secreted with this system remain anchored in the wall, which can facilitate their separation because with certain detergents the bacteria is not lysed.
  • corynebacteria by plasmids is preferably carried out by electroporation (Bonamy C., Guyonvarch A., Reyes O., David F. and Leblon G. (1990) FEMS Microbiology Letters 66: 263-270) or by any other method appropriate.
  • the present invention also relates to expression systems comprising all or part of the expression signals of csp1, csp2 and gdhA or all or part of these three genes, as well as the strains expressing this type of system, in particular the strains of corynebacteria.
  • the expression / secretion of the determined amino acid, polypeptide or protein will be regulated by the temperature, the culture medium and / or the nature of the sugars for PS 1 and PS 2 and the concentration of salts (NH 4 + in particular), metabolites (glutamate) and sugars (glucose / fructose) for gdhA systems.
  • the present invention also relates to proteins comprising all or part of the sequence of PS 1 or PS2, in particular comprising one or more antigenic sites of these proteins.
  • Said proteins can be used as an atypical element, in particular in diagnostic kits, as can the corresponding antibodies.
  • the invention also relates to the strains of corynebacteria in which the determined protein is anchored on the wall by the part of PS 1 or PS2 fulfilling this anchoring function or in which the antigenic epitopes of PS 1 or PS2 are exposed on the wall .
  • FIG. 1 Diagram of the pCGL612 piasmid.
  • PUN121-derived plasmid (Nilsson, B., Uhlén, M., Josephson, S., Gatenbeck, S., and Philipson, L. (1983) An improved positive selection plasmid vector constructed by oligonucleotide mediated mutagenesis. Nucleic Acids Res 11: 8019-8029.) Containing a 2.6 kb fragment of C. melassecola ATCC17965 carrying the entire cspl gene allowing the synthesis of the PS 1 protein.
  • FIG. 1 Nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of the cspl gene of Corynebacterium glutamicum called Corynebacterium melassecola ATCC 17965. The numbering of the nucleotides is present on the right side of the figure. The repeated nucleotide sequences are surrounded. The probable Shine-Dalgarno sequence is underlined. A 24 bp palindrome that presumably corresponds to the transcription terminator is indicated by reverse arrows. This sequence appears in the EMBL nucleotide sequence database under the access number X66078.
  • FIG. 4 Alignment of the sequences of the PS 1 protein of C. glutamicum and the proteins of the antigenic complex 85 of Mycobacterium.
  • 85B M. k. represents M. kansaii 85-B antigen (MIPSG16235).
  • 85B M. b. represents M. bovis antigen 85-B (MIPSC83179).
  • 85B M. I represents M. leprae's 85-B antigen
  • 85A M. t. represents V antigen 85-A of M. tuberculosis (MIPS 160062).
  • the sequences were aligned using the FastA program from the "Genetics Computer Group” (University of Wisconsin, USA). The numbering of the residues is given for each protein at the beginning of each line. Similar amino acid residues found between different proteins are surrounded. The residues cosidered as similar are the following; acids or amides (D, E, N, Q); basic (H, K, R); polar (P, A, G, S, T); non-polar (I, L, M, V) and aromatic (F, W, Y). The identical amino acid residues between the seven proteins are indicated by a star above the relevant residues.
  • accession number is specified associated with the name of the database in question and appear in parentheses.
  • Figure 5. Interruption of the cspl gene.
  • pCGL613 is non-replicative in C. glutamicum, it contains cspl (blackened area) interrupted by the aphA3 (Km) gene, wt, wild B. lactofermentum and Acspl, integrating it containing interrupted csp1.
  • the pCSI616 piasmid corresponds to the pCGL125 piasmide with the C. glutamicum cspl gene.
  • FIG. 8 Construction of the pCGL1030 piasmid.
  • the region named A in the scheme contains the cspl promoter followed by the DNA region corresponding to the signal sequence of PS 1 and the first 30 amino acids of its mature sequence.
  • FIG. 9 Construction of piasmid 1031. The region named A is described in Figure 8. The junction region between PS 1 and EGA has been sequenced and the details of this sequence are presented.
  • FIG. 10 Construction of piasmid 1032. The region named A is described in Figure 8. The junction region between PS 1, (AQK) 10 and EGA has been sequenced and the details of this sequence are presented.
  • FIG. 1 Construction of piasmid 1033. The region named A is described in Figure 8. The junction region between PS 1, (AQ) 19 and EGA has been sequenced and the details of this sequence are presented.
  • ATCC 17965 The numbering of the nucleotides is shown on the right side of the figure. The probable Shine-Dalgarno sequence is underlined. A 22 bp palindrome that presumably corresponds to the transcription terminator is indicated by reverse arrows.
  • the non-replicative pCGL830 piasmid in C. glutamicum carries the csp2 gene interrupted by the aphlll gene.
  • the meaning of transcription of the genes aphIII and csp2 is represented by an arrow on the piasmid pCGL830.
  • Wt represents the strain B. lactofermentum 15 and csp2 :: aphIll, integrating it with the interrupted csp2 gene.
  • Figure 17 Complete sequence of the Nhel-Blgl fragment containing the gdhA gene of C. melassecola.
  • FIG. 1 Construction of pCGL141 and pCGL142, fusion vectors between the promoter of the gdhA gene and the lacZ gene.
  • Figure 21 Detail of construction placing the synthetic gene between ptac and the celA gene - a) construction placing ceLA under the control of ptac, b) becoming of the construction after introduction of the AQ polypeptide.
  • RBS ribosome binding site
  • DNA sequence equivalent to part of the EGA signal sequence DNA sequence equivalent to the coding sequence of EGA
  • FIG. 22 Structure of pCGL125.
  • Example 1 Identification of PS1 and PS2 in the culture supernatant and in the wall of Corynebacterium slutamicum.
  • the concentrations of PS 1 and PS2 follow the growth curve of the bacteria and reach their maximum in the stationary phase.
  • An important secreted fraction of these proteins and especially for PS2 is also located in the wall of the bacteria.
  • an SDS treatment of bacteria is used, which does not cause significant lysis of the bacteria.
  • PS 1 and PS2 it is therefore possible to combine the two secreted fractions, culture supernatant and parietal fraction, and to obtain a final preparation where PS 1 and PS2 are strongly in the majority.
  • Polyclonal antibodies have been prepared against PS 1 and PS2, there is no cross immunological reaction between the two proteins which clearly shows that these proteins are different.
  • Proteins with strong immunological cross reactions with PS 1 and PS2 have been found in the culture supernatant of bacterial strains related to Corynebacterium melassecola ATCC 17965 such as the strain Brevibacterium lactofermentum 15 (Bonnassie, S., Oreglja, J., Trautwetter, A ., and Sicard, AM (1990) Isolation and characterization of a restriction and modification deficient mutant of Brevibacterium lactofermentum. FEMS Microbiol Letters 72: 143-146.), Brevibacterium lactofermentum ATCC21086 and Brevibacterium flavum ATCC 14067.
  • PS 1 and PS2 have been tested for several enzymatic activities including invertase, pectinase, nuclease, collagenase, amylase, bacteriocin, endoglucanase and protease broad spectrum activity. None of these enzymatic activities could be associated with PS 1 or PS2.
  • Example 2. Evidence of the functionality of the signal peptide of PS1 in Escherichia coli ( Figure 1).
  • the Western blotting analysis of a crude extract of this recombinant with anti-PS 1 antibodies reveals the presence of a major protein which has the same molecular mass as the PS 1 protein present in the culture supernatant of C. melassecola.
  • a minor protein of slightly higher molecular weight is also detected.
  • the major protein band corresponds to the mature form of PS 1 (without signal sequence) and the minor protein band to the precursor form of PS 1 (with the signal sequence).
  • FIG. 3 represents the restriction map of this sequenced region.
  • the putative translation start (GAGAAGGAAAACTTCATG) and transcription start (TACATA (-35) and TAAGAT (-10) signals have been identified.
  • the AGAAGGA sequence extracted from the ribosome binding site described above is complementary (underline ) from the 3 'end of the rRNA of Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and Steptomyces' lividans (5'-GAUCACCUCCUUUC UOH-3') (McLaughlin, JR, Murray, CL, and Rabinowitz, JC (1981) Unique features of the ribosome binding site sequence of the Gram positive Staphylococcus aureus ⁇ -lactamase gene. J. Biol Chem.
  • a sequence at the NH2 end of the protein has the characteristics of a signal sequence of Gram-positive bacteria (Watson, MEE (1984) Compilation of published signal sequences. Nucleic Acids Res .12: 5145-5164.).
  • This signal sequence comprises an excess of positive charge in NH2-terminal position (7 amino acids with positive charge in the first 18 amino acids), followed by a sequence with an excess of non-polar amino acids (18 non-polar amino acids in the next 23 amino acids) then two putative amino acid sequences of a signal sequence cleavage site (pro thr ala ile ala, in position 28 to 32) (pro met ala ser ala, in position 39 to 43) .
  • the second pro met ala ser ala at position 39 to 43 seems the most likely; in fact, the PS 1 protein has been purified from the culture supernatant of
  • the calculated molecular mass corresponding to the 657 amino acids contained in the open reading phase is 70,874.
  • the molecular mass of the most probable signal sequence site of cleavage between amino acid 42 and 43 is 4411, which gives a molecular mass calculated for the mature protein of 66463 and which is very close to the value of 67000 estimated on denaturing polyacrylamide gel
  • Example 4 Sequence homologies between PS1 of Corynebacterium glutamicum and the proteins of the antigenic complex 85 of Mycobacterium. ( Figure 4). The NH2 half of the PS 1 protein is very similar to the three secreted mycobacterial antigens named 85-A, 85-B and 85-C (Closs, O, Harboe, M., Axelsen-Christensen, NH, and Magnussen, M. ( 1980) The antigens of Mycobacterium bovis, strain BCG, studied by crossed immuno-electrophoresis: a reference System Scand J.
  • Mycobacterium bovis BCG1173P2 Mycobacterium tuberculosis antigen 85-A (Borremans, M., De Wit, L., Volckaert, G., Ooms, J., De Bruyn , J., Huygen, K., Van Vooren, J.-P., Stelandre, M., Verhofstadt, R., and Content, J. (1989) Cloning, sequence determination, and expression of a 32-kilodalton-protein gene of Mycobacterium tuberculosis.
  • Bacteriol 170: 3847-3854. (Matsuo, K., Yamaguchi, R., Yamazak i, A., Tasaka, H., Terasaka, K., and Yamada, T. (1990) Cloning and expression of the gene for the cross-reactive a antigen of Mycobacterium kansaii. Infect Immun 58: 550-556.) (De Mendonça Lima, L., Content, J., Van Heuverswyn, H., and Degrave, W. (1991) Nucleotide sequence of the gene coding for the 85-B antigen of Mycobacterium leprae.
  • Protocol 1 PS1 and PS2 purification protocols used for the determination of the N-terminal sequence. Protocol 1:
  • the proteins PS 1 and PS2 were purified from the culture supernatant of C. glutamicum ATCC 17965 by preparative electrophoresis on polyacrylamide gel and electroelution.
  • the bacteria cultivated in 200 ml of LB rich medium at 34 ° C., are harvested in the stationary growth phase by centrifugation at 8000 g for 15 minutes and at 4 ° C.
  • the proteins of the culture supernatant are then precipitated with 60% ammonium sulphate and harvested by centrifugation at 13000 g for 15 minutes at 4 ° C.
  • the pellet is dissolved in 4 ml of 10 mM Tris HCl buffer pH 6.8 and the solution is then dialyzed for 24 hours at 4 ° C. in this same buffer.
  • the dialysis protein extract obtained after precipitation with ammonium sulphate is deposited on an electrophoresis gel of format 16 ⁇ 20 ⁇ 0.75 cm.
  • the electrophoresis is carried out according to the protocol described by Laemmli (1970) using a 4% concentration gel and a 7.5% separation gel. The migration is done in fifteen hours at 40mA. The gels are then stained with copper chloride according to the protocol described by Lee et al (1987). The protein bands corresponding to the proteins PS 1 and PS2 are cut out and then completely discolored. The proteins are then electroeluted from the gel for 5 hours at 48mA and at 4 ° C., then dialyzed several times in a 10 mM Tris HCl buffer pH 6.8 before being distributed into several aliquots and frozen at ⁇ 20 ° C. The purification yield is of the order of 25% with a purity greater than 90%.
  • the proteins PS 1 and PS2 are purified from the culture supernatant of C. glutamicum ATCC 17965 by ultrafiltration, electrophoresis and transfer to a PVDF membrane.
  • the bacteria cultivated in the LB rich medium at 34 ° C., are harvested in the stationary growth phase by centrifugation at 8000 g for 15 minutes and at 4 ° C. 4 ml of supernatant are diluted 50 times in a 50 mM phosphate buffer pH 7.0 before being centrifuged on an ultrafiltration membrane whose cutoff threshold is 30 kD. This step makes it possible to obtain a protein extract of 80 ⁇ l which is then deposited on an electrophoresis gel composed of a concentration gel at 4% and a separation gel at 7.5%.
  • the electrophoresis is carried out according to the protocol described by Laemmli with the following modifications.
  • the solutions used to prepare the gels as well as the migration buffer are degassed and contain 0.1 M of thioglycolate.
  • the separation gel is subjected to a "pre-run" before its use. All these precautions are taken in order to avoid as much as possible the formation of free radicals which could lead to modifications of the N-terminal end of the proteins and consequently to a possible blocking of this end.
  • the proteins are transferred onto a PVDF membrane. This step is carried out in a 50 mM Tris, 50 mM borate pH 8.0 buffer for 60 minutes and at 50V. The membrane is then stained with amidoblack, which makes it possible to locate and cut the bands corresponding to the proteins PS 1 and PS2.
  • Example 6 Obtaining a strain of Corynebacterium glutamicum no longer synthesizing PS1, called PS1-. ( Figure 5).
  • the C. glutamicum strain called Brevibacterium lactofermentum 15 is permissive to the modified DNA of E. coli K12 (Bonnassie, S., Oreglia, J., Trautwetter, A., and Sicard, AM (1990) Isolation and characterization of a restriction and modification deficient mutant of Brevibacterium lactofermentum. FEMS Microbiol Letters 72: 143-146), while the C. glutamicum strain called C. melassecola 'ATCC17965 is a very restrictive strain with regard to the DNA of E. coli ( Reyes O., Guyonvarch, A., Bonamy, C, Salti, V., David, F., and Leblon, G.
  • the cspl gene is contained in a fragment of approximately 7.5 kb in the wild strain, while the integrating pCGL613 'contains a fragment of approximately 9 kb corresponding to the 1.5 kb aphA3 gene inserted into the cspl gene.
  • the BamHI-EcoRI digestion confirms the structure of the integrant presented in FIG. 5.
  • the integrating Km r -Tets was also analyzed by Western blotting for the production of PS 1 using anti-PS 1 polyclonal antibodies. There is no PS 1 protein, neither in the culture supernatant, nor in the crude extract of this strain. This confirms that the cspl gene cloned in ⁇ gt11 corresponds to a single gene which codes well for PS 1 in C. glutamicum.
  • This C. glutamicum PS 1- strain is completely viable and does not seem to be affected in its growth rate. This result shows that it is possible to use the region of the cspl gene as a target for integration of homologous or heterologous DNA into a strain of C. glutamicum, without a priori affecting its viability.
  • Example 7 Expression in C. elutamicum of the csul gene in multicopy. Analysis of the important regions of PS1, necessary for its synthesis and its secretion.
  • the pCAM616 piasmid was constructed. It contains the entire cspl gene and was constructed from the piasmid pCGL125, corresponding to the piasmid pBL1 (Santamaria, R., Gil, JA, Mesas, JM and JF Martin (1984) Characterization of an endogenous plasmid and development of cloning vectors and a transformation System in Brevibacterium lactofermentum, J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246.), replicative in C.
  • glutamicum provided with a cloning cassette comprising the aphA3 gene of Streptococcus faecalis and the piasmid pCSP1G, replicative in E. coli, containing the cspl gene.
  • the piasmid, pCGL616, resulting from this construction ( Figure 6) is replicative in C. glutamicum. Restoration of the synthesis of PS1 in a strain of C. glutamicum PS1-.
  • the largest deletion allowing this result corresponds to the deletion of the Ncol-BspEl (BspM11) fragment of approximately 1.3 kb from the cspl gene (pCGL1041) giving a size of protein precursor for PS 1 equal to approximately 29 kD and to approximately 24kD for the mature form secreted.
  • B. lactofermentum 15 PS 1 strain harboring this piasmid pCGL1041 it is well detected by Western blotting with anti-PS 1 antibodies a protein of approximately 23 kD.
  • Example 8 Construction of an expression and secretion vector in C. glutamicum named pCGL1030 based on the cspl system. ( Figure 8. 9, 10, 11)
  • This replicative piasmid in C. glutamicum (contains the piasmid pBL1 of C. glutamicum) carries the promoter of the cspl gene of C. glutamicum and the DNA region of this gene corresponding to the signal sequence plus the first 30 amino acids of the sequence mature of PS 1.
  • a mutiple cloning site (polylinker 2 in FIG. 8) was placed immediately behind the 30 th amino acid of the mature sequence of PS 1, in order to allow easy phase cloning of any heterologous gene to be expressed in C. glutamicum.
  • this piasmid is endowed with the PS 1 elements necessary for secretion and therefore corresponds to a tool for expression and secretion.
  • the celA gene from C. thermocellum (Cornet, P., Millet, J., Béguin, P. and J.-P. Aubert (1983) Characterization of two cel (cellulose degradation) genes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases. Bio / Technology 1: 589-594.) Encoding an endoglucanase called endoglucanase A or EGA, was cloned into the vector pCGL1030 at the Sma I site, giving rise to the piasmid pCGL 1031 (FIG. 9).
  • This celA gene comes from the piasmid pCGL1008 where a restriction site BstX1 has been introduced artificially, very close to the translation start-up site of the protein.
  • EGA for chimeric construction purposes (see Figure 10, 11).
  • CMC carboxymethylcellulose
  • This CMC test will be used to confirm the synthesis of the EGA protein of C. thermocellum in C. glutamicum.
  • a CMC test of activity on a dish carried out on whole cells or on the culture supernatant, in rich medium highlights in both cases, the endoglucanase activity of 'a strain of C. glutamicum called Brevibacterium lactofermentum 15 harboring the piasmide pCGL1031.
  • Brevibacterium lactofermentum 15 harboring the piasmide pCGL1031.
  • We will note a stronger activity on LB medium + fructose, or + glucose, indicating a stimulating effect of these two sugars on the expression of celA under control of the promoter cspl.
  • a synthetic gene corresponding to the alanine-glutamine-lysine polypeptide repeated 10 times was chemically synthesized and cloned at the BstX1 site of the piasmide pCGL1008, giving rise to the piasmide pCGL1017.
  • the EcoRl fragment of the piasmid pCGL1017 was cloned at the Smal site of the piasmid pCGL1030, located downstream of the cspl promoter of the signal sequence and of the first 30 amino acids of PS 1 (and upstream of the reporter gene celA), giving rise to the piasmid pCGL1032 ( Figure 10).
  • the detection of the chimeric protein PS1- (AQK) 10-EGA is carried out as described above, by CMC test on dish by zymogram or by Western blotting. Use of the csp1 system for the expression and secretion of the synthetic polypeptide (AQ) 19 ( Figure 11).
  • a synthetic gene corresponding to the alanine-glutamine polypeptide repeated 20 times has been chemically synthesized and cloned at the BstXI site of the piasmide pCGL1008, giving rise to the piasmide pCGL1002.
  • the ERI co fragment of the pCGL1002 piasmid was cloned at the Smal site of the PCGL1030 piasmid, located downstream of the cspl promoter of the signal sequence and of the first 30 amino acids of PS 1 (and upstream of the reporter gene celA), giving rise to the piasmid pCGL1033 (FIG. 11).
  • the detection of the chimeric protein PS1- (AQ) 19-EGA is carried out as described above, by CMC test on dish, by zymogram or by Western blotting.
  • the sequence in B. lactofermentum in the piasmide pCGL1033 revealed the loss of an AQ coding sequence (passage from AQ 20 to AQ 19 during cloning in B. lactofermentum).
  • glutamicum the production of EGA or chimeric proteins (AQK) 10-EGA or (AQ) 19-EGA, is better on LB medium than on BHI medium, it is strongly stimulated by glucose or fructose on LB medium.
  • the cspl promoter of C. glutamicum seems stronger than the natural promoter of celA from C. thermocellum; indeed, the so-called B. lactofermentum 15 strain hosting the piasmide pCGL602, which contains the natural promoter of celA exhibits significantly less endoglucanase activity than this same strain hosting the piasmid pCGL1031, where this celA is under the control of the cspl promoter of C. glutamicum .
  • a Shine Dalgarno type sequence has been identified, AAGGAG, just upstream from the translation start codon (-12 to -17).
  • the proposed signal sequence of 30 amino acids reveals a glutamine (position 31) as the first amino acid of the mature sequence, easily converted into pyroglutamic acid making it impossible to amino-terminal sequencing of the protein by the technique of Edman.
  • a putative independent rho-type terminator site is found in the 3 'region of the gene 76 nucleotides from the stop codon.
  • Example 10 Obtaining a Corynebacterium glutamicum strain no longer synthesizing PS2. called PS2-. ( Figure 14).
  • the interruption of the csp2 gene was carried out in C. glutamicum called B. lactofermentum 15 using the vector pCGL830 ( Figure 14), a non-replicating vector in corynebacteria, and carrying a copy of the csp2 gene inactivated by the insertion of the aphlll gene (cloning of the aphlll gene at the unique Nru I site of cspl carried by the plasmid pCGL811).
  • No PS2 signal was demonstrated by immunological detection with anti-PS2 polyclonal antibodies, on cell extracts from the E.
  • Example 12 Construction of a Corynebacterium melassecola ATCC 17965 chromosomal DNA library and cloning of the gdhA gene
  • the chromosomal DNA of the C. melassecola ATCC 17965 strain was prepared according to the method described by Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (Eds) ((1987) Current protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York).
  • the cloning piasmide pUN121 (Nilsson B, Uhlen M, Josephson S, Gatenberg S, Philipson L (1983) An improved positive selection plasmid vector constructed by oligonucleotide mediated mutagenesis. Nucleic Acids Res 11: 8019-8030) was prepared by the method de Birnboim HC, Doly J ((1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7: 1513-1523), from the strain of E. coli GM 2929 freely available from Dr. B. Bachmann. The piasmid was linearized by the restriction endonuclease Bcl I (Boehringer).
  • the bank was built by ligation with T4 DNA ligase
  • the plasmids of all the tetracycline resistant clones were prepared by the method of Birnboim and Doly (1979). All of these plasmids correspond to the DNA library.
  • the E. coli strain CLR207 recA (Mattaj IW, McPherson MJ, Wooton JC (1982) Localization of a strongly conserved section of coding sequence in glutamate dehydrogenase genes. FEBS Letters 147: 21-25), deficient in glutamate dehydrogenase activity was transformed with the DNA library of C. melassecola ATCC 17965. A transforming clone of E.
  • coli CLR 207 recA capable of growing on minimum selection medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin was selected.
  • This clone carries a recombinant plasmid, pCGL310.
  • Glutamate dehydrogenase activity measured according to the method of Meers JL, Tempest DW, Brown CM ((1970) Glutamine (amide): 2-oxoglutarate amino transferase oxido-reductase (NADP), an enzyme involved in the synthesis of glutamate by some bacteria J Gen Microbiol 64: 187-194), is restored in the strain of E. coli CLR207 recA carrying the piasmid pCGL310.
  • promoter (nucleotides 1 to 572)
  • TTCACA signal having a similarity with the sequence TTGAC (Pu) characteristic of the -35 zone of the promoters of Streptomyces sp. (Strohl)
  • the reading phase extending from position 573 to 1913 corresponds to that of glutamate dehydrogenase due to the following data: _
  • the protein deduced from this reading phase contains 447 amino acids, with a predicted molecular weight of 48,957 Daltons. This molecular weight is very close to that of the polypeptide (48300 D) observed after denaturing gel electrophoresis of a preparation of glutamate dehydrogenase of the strain of C. melassecola ATCC 17965.
  • the primary structure of glutamate dehydrogenase deduced from the nucleotide sequence of the gdh A gene of C. melassecola has strong similarities with the primary structures of glutamate dehydrogenases of other organisms (Teller JK, Smith RJ, McPherson MJ, Engel PC, Guest JR ((1992) The glutamate dehydrogenase gene of Clostridium symbiosum: cloning by polymerase chain reaction, sequence analysis and over-expression in Escherichia coli. Eur J Biochem 206: 151-159).
  • the regulation of the expression of the gdh A gene of C. melassecola ATCC 17965 was studied by measuring variations in the specific activity of glutamate dehydrogenase as a function of the nature of the medium in which this strain was cultivated. Glutamate dehydrogenase activity was measured by the method of Meers et al. (1970) from acellular extracts of C. melassecola obtained by ultrasonication.
  • the culture media used for this study are synthetic media, the base of which is that described by Liebl W, Klamer R, Schleifer KH (1989) (Requirement of chelating eompounds for the growth of
  • the carbon source is either glucose at 11 g / l final (media 1, 2 and 4) or fructose at 10 g / l (media 3).
  • the concentration of NH4 + ions is 125 mM in media 1, 3 and 4. It is 1.25 mM in media 2 (limitation in NH4 +).
  • Medium 4 contains 50 g / l final L-glutamate.
  • the functionality of the gdh A - lac fusion has been shown by demonstrating a ⁇ -galactosidase activity in the strains of C. melassecola ATCC 17965 transformed by pCGL 141 and pCGL142, activity absent from the same strain transformed by pCGL 125.
  • the ⁇ -galactosidase activity is demonstrated by culture of the bacteria on a solidified complete medium (BHI, Difco) containing the chromogenic substrate X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolyl ⁇ -D-galactopyranoside). Colonies from bacteria with ⁇ -galactosidase activity turn blue on such a medium.
  • NTG mutagenesis of a strain derived from C. melassecola ATCC 17965 was carried out. From this mutagenesis, a first selection was applied on the criterion of resistance to a glutamate analog, 4-fluoroglutamate. Mutants resistant to this analog can belong to different classes including the catabolic non-repression class. Indeed, in such mutants, it can be expected that the increase in specific activity of glutamate dehydrogenase will lead to an overproduction of intracellular glutamate, and thus to a dilution of the toxic analog, hence the resistance phenomenon. Mutants of resistance to 4-fluoroglutamate were pooled and all of the cells were subjected to transformation by pCGL 141.
  • the transformed bacteria were spread on solidified medium 1 containing X-Gal and kanamycin. The bacterial colonies showing the most intense blue color were isolated, and cultured in medium 1 liquid containing kanamycin. Glutamate dehydrogenase activity was measured from a cell-free extract, ⁇ -galactosidase activity from whole toluene cells (Miller, 1972). The results obtained for one of the selected mutants are presented below. glutamate dehydrogenase ⁇ -galactosidase activity
  • mutant 90 12.1 23.66 The results obtained therefore clearly show that it is possible to select, by phenotypic screening, mutants for regulating the gdh A gene with the constructed tool. It should be noted that it is very easy to remove pCGL 141 and pCGL 142 from the cells after selection, simply by culture in the absence of kanamycin selection pressure.
  • the celA gene available in the form of a HindIII fragment of 3.5 kb containing the promoter region, the gene and the start of another unidentified gene, was subcloned in the form of a HindIII-EcoRI fragment of 2, 6kb deleted from the unknown gene piece, in a replicative vector of E. coli, pMTL23 (Chambers, SP, Prior, SE, Barstow, DA and Minton NP (1988) The pMTL nie - cloning vectors.
  • I Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. Gene. 68: 139-149.
  • the Eco RI site was introduced by site-directed mutagenesis immediately behind the gene transcription terminator. This intermediate subcloning, taking into account the restriction sites introduced, is necessary for the next stage of cloning; in particular, cloning into the polylinker of pMTL23 allows the introduction of an Ncol restriction site just behind the Eco RI site, which makes it possible to extract the fragment containing the coding region of celA in the form of a Nael-Ncol fragment. This step also makes it possible to have a celA gene lacking unidentified 3 'sequences.
  • the cloning of cel A in the form of a HindIII-EcoRI fragment was carried out in the piasmid pMTL23 using the receptor strain of E. coli TGl.
  • the strain of E. coli possessing this piasmid is well endowed with the CMC + phenotype associated with the expression of EGA; the analysis of the restriction fragments obtained is in accordance with what is expected.
  • This replicative plasmid in E. coli containing the tac promoter (Brossius et al. Gene 27: 161, 1984) is hydrolyzed by EcoRI-NcoI.
  • the piasmid thus obtained is called pPROK-celA. It contains the celA gene under the control of the tac promoter separated by a BstXl site introduced using the DGF1 / DGF2 adapters.
  • Example 14 Construction of a piasmid allowing the expression of multiple AQ sequences
  • DGF5 / DGF6 (FIG. 1.9) which correspond to the synthetic gene is used:
  • [AQ] representing the sequence coding for Ala-Gln.
  • the ends of the DGF5 and DGF6 sequences are compatible with the BstX1 site and the sequence can therefore be cloned into this site.
  • DGF5 and DGF6 are such that, on the one hand, they direct the direction of cloning, and, on the other hand, they destroy the BstXI site following cloning.
  • pPROK (AQ) 20 celA having the structure represented in FIG. 20.
  • FIG. 21 details in particular the structure of the AQ / EGA fusion site and shows the advantage of the BstX1 site used. This site is structured:
  • the insertion of the DGF5 / DGF6 adapter can only be done in one direction and does not introduce any foreign base to the targeted object.
  • This piasmid is treated with BamHI and ligated with the restriction product of the pCGL125 piasmid treated with the same enzyme.
  • the pCGL125 piasmid (FIG. 22) is a functional piasmid of
  • Brevibacterium lactofermentum 15 having an origin of replication pBL1.
  • the piasmid pCGL 125- (AQ) 20 -celA
  • selection of the transformed strains a strain is obtained according to the present invention.
  • the translation begins with a methionine immediately followed by (AQ) 20 ; we also took the precaution of border (AQ) 20 with a methionine in COOH-terminal; the detection of the AQ polypeptide fused or not fused to the celA protein can be done using specific antibodies or by analytical detection after summary purification of the fusion protein and hydrolysis with cyanogen bromide or vice versa.
  • AQ border
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium melassecola
  • the DH5alpha strain is available in the catalog of
  • ATCC strains are available at American Type Culture Collection c / o Sales and Marketing Department, 12301 Parkiawn Drive, Rockville, MD 20852 USA.
  • ORGANISM Corynebacterium melassecola
  • GCT GGT GAA GTC ACC TAC CCA GAG ATC GCC GGG CTG CCT 689 Ala Gly Glu Val Thr Tyr Pro Glu Ile Ala Gly Leu Pro
  • GAG CGC CCA ATC AAG GTG CAG CTG CTG CTT CCG CGT GAC 806 Glu Arg Pro Ile Lys Val Gln Leu Leu Leu Leu Arg Arg
  • GGT GCA GAT GAC TTC GGT AAG GAA GAC TCT GTA GCT ATT 1391 Gly Ala Asp Asp Phe Gly Lys Glu Asp Ser Val Ala Ile
  • ORGANISM Corynebacterium melassecola
  • BIOLOGICAL ACTIVITY precursor of the protein constituting the outer surface layer of the wall and of the antigen
  • ORGANISM Corynebacterium melassecola
  • FIGURE 8
  • FIGURE 9 is a diagrammatic representation of FIGURE 9
  • FIGURE 1 0
  • FIGURE 22
  • Polylinker1 0.001 / Sacll.BstXI.Notl.Xbal.
  • Polylinker2 1.531 / Clal.Sall.Aatl.Mlul.Ncol.Bglll.Xhol.Stul.Pstl.
  • Polylinker3 1.561 / Xbal.Notl.Sacll.BstXI.

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Abstract

La présente invention concerne un système d'expression et de sécrétion d'un amino-acide, polypeptide ou protéine déterminé par une souche de corynébacterie, caractérisé en ce que la séquence qui code pour ledit amino-acide, polypeptide ou ladite protéine est située dans une région d'ADN chromosomique ou plasmidique où ladite séquence est transcrite avec vers l'extrémité 5' au moins une partie de la séquence codant pour la séquence signal de la protéine PS1 ou PS2, ladite partie assurant la sécrétion de ladite protéine après traduction lorsque le système est incorporé dans ladite souche de corynébactérie.

Description

SYSTEME D'EXPRESSION ET DE SECRETION DE PROTEINES UTILISABLES EN PARTICULIER CHEZ LES CORYNEBACTERIES
La présente invention concerne notamment des systèmes d'expression et de sécrétion de protéines utilisables, en particulier, chez les corynébactéries, ainsi qu'un procédé mettant en oeuvre ces systèmes, ainsi que de nouvelles protéines liées à ces systèmes d'expression.
Les corynébactéries constituent un groupe de bactéries gram positif, de morphologie irrégulière, représenté par une grande variété de souches.
En dépit du fait que les cellules gram positif ont une structure simple facilitant la sécrétion de protéines dans le milieu extérieur, la sécrétion des protéines par les corynébactéries a été très peu étudiée jusqu'ici. Seules la toxine diphtérique sécrétée par certaines souches de Corynebacterium diphteriae infectées par des phages lysogéniques tox+ (Smith 1980 : J. Bacteriol. 141 pp 1142 ; Smith et al. 1980 : J. Bacteriol. 141 pp 184 ; Greenfield et al. 1983 : PNAS USA 80 pp 6853) et l'étude de la séquence nucléotidique d'un gène impliqué dans la sécrétion d'une DNase par Corynebacterium glutamicum (W. Liebl et A.S. Sinskey 1986 : Genetics and Biotechnology of Bacteria, Vol. 2 pp 383-388) ont été rapportées.
Le brevet américain US 4 965 197 décrit un système d'expression et de sécrétion utilisable chez Corynebacterium sur la base de la DNAse décrite précédemment ; néanmoins il semble que cette protéine ne soit pas majoritaire et que dans ces conditions, le système de sécrétion correspondant soit peu intéressant.
C'est pourquoi l'invention concerne un système d'expression et de sécrétion dans une bactérie de type corynébacterie comportant les éléments de sécrétion de deux protéines se trouvant majoritairement dans le surnageant de culture de certaines corynébactéries.
Il s'agit notamment d'un système d'expression/sécrétion d'un amino-acide, polypeptide ou protéine déterminé par une souche de corynébacterie, caractérisé en ce que la séquence qui code pour ledit amino-acide, polypeptide ou ladite protéine est située dans une région d'ADN chromosomique ou plasmidique où ladite séquence est transcrite avec vers l'extrémité 5' au moins une partie de la séquence codant pour la séquence signal de la protéine PS 1 ou PS2, ladite partie assurant la sécrétion dudit amino-acide, polypeptide ou de ladite protéine après traduction lorsque le système est incorporé dans ladite souche de corynébacterie.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un système d'expression et de sécrétion dans une corynébacterie comprenant :
- une souche de corynébacterie,
- une cassette de sécrétion contenant une première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression dans ladite souche de corynébacterie, une seconde séquence d'ADN qui code pour un aminoacide, un polypeptide et/ou une protéine, et une troisième séquence d'ADN insérée entre lesdites première et seconde séquences d'ADN qui codent pour des éléments d'une protéine choisie parmi PS 1 ou PS2, qui assurent la sécrétion desdits amino-acides, polypeptides et/ou protéines par ladite souche de corynébacterie.
II doit tout d'abord être compris que dans le cadre de la présente invention la terminologie "corynébacterie" désigne non seulement les souches du genre Corynebacterium mais également les bactéries apparentées, telles que Brevibacterium.
Le système d'expression de la présente invention peut se trouver sur un piasmide autoréplicatif dans corynébacterie et dans ce cas, le piasmide comportera une origine de réplication fonctionnelle dans la souche, par exemple dans Corynebacterium une origine de réplication PBL 1, mais peut également être portée par un piasmide non réplicatif destiné notamment à l'intégration chromosomique, dans ce cas le piasmide comportera des éléments permettant la recombinaison et l'intégration chromosomique ; dans le cas de l'intégration, le système d'expression se trouvera finalement dans le chromosome de la bactérie en cause.
En particulier, dans le cas de l'intégration chromosomique, on a pu démontrer que l'insertion d'une séquence d'ADN hétéroiogue dans le gène csp1 codant pour PS 1 ou csp2 codant pour PS2 n'affectait pas la croissance de la souche correspondante. Dans ces conditions, il est possible d'intégrer une séquence codant pour un amino-acide, un polypeptide ou une protéine en phase dans csp1 ou csp2 afin d'obtenir l'expression/sécrétion des produits d'expression de la séquence codante insérée.
Parmi les séquences d'ADN fonctionnelles pour l'expression dans la souche de corynébacterie il faut citer aussi bien des éléments d'expression homologues que des éléments d'expression hétérologues, c'est-à-dire qu'il peut s'agir d'éléments qui existent déjà dans la bactérie hôte ou bien qui au contraire, proviennent d'une bactérie différente.
Ces éléments d'expression comporteront essentiellement un promoteur et un site de fixation des ribosomes, mais il est possible également de prévoir d'autres éléments notamment du type éléments de régulation de l'expression.
Parmi les éléments d'expression utilisables dans les corynébactéries, on utilisera plus particulièrement le promoteur Ptac qui est un promoteur fort, hybride trp/lac inductible par IPTG et qui se révèle fonctionnel chez les corynébactéries comme chez E. coli ; mais il est possible d'utiliser d'autres promoteurs, par exemple, comme cela sera décrit ci-après, des promoteurs ou d'autres éléments d'expression de gène de structure de corynébacterie, par exemple le promoteur de la gdhA. Il est possible également de prévoir d'utiliser, par exemple, les éléments d'expression, notamment le promoteur de l'une des protéines PS 1 et/ou PS2 tels qu'ils sont identifiés dans le cadre de la présente invention.
Les éléments d'expression peuvent également comporter des séquences d'ADN assurant la régulation de l'expression des gènes en aval.
Parmi les éléments assurant une bonne expression on peut prévoir de pouvoir placer à la fin de la séquence codante un élément d'arrêt de traduction, sous forme d'un ou plusieurs codons stop, ou un élément d'arrêt de la transcription.
Parmi les éléments assurant la sécrétion il faut citer, comme cela a été indiqué précédemment, tout ou partie de la séquence signal de l'une des protéines PS 1 ou PS2 ainsi que les équivalents de ces séquences, sans modification ou perte de la propriété de sécrétion.
En effet, il est certain qu'il est possible d'apporter grâce à des techniques connues telles que des mutations ponctuelles des modifications mineures aux séquences de sécrétion, tout en conservant le même type de propriété de sécrétion, c'est pourquoi la présente invention entend également couvrir ces séquences équivalentes.
Le système d'expression de la présente invention peut enfin comporter d'autres éléments, notamment des éléments tels que des terminateurs de transcription, par exemple le terminateur des protéines PS 1 et/ou PS2, ou de la gdhA. Dans certains cas, il peut être intéressant d'adjoindre aux séquences d'expression et de sécrétion, toute ou partie de la protéine PS 1 afin d'obtenir des protéines fusionnées, dont la sécrétion et le taux d'expression peuvent dans ces conditions être améliorés.
Les systèmes d'expression selon l'invention, peuvent comporter des éléments hétérologues qui permettent la construction dans des bactéries différentes des corynébactéries par exemple comme cela a été dit précédemment une origine de réplication fonctionnelle dans E. coli mais également d'autres éléments comme un gène -marqueur qui peuvent faciliter le transfert dans Corynebacterium.
Le gène marqueur peut être, bien entendu, de type très varié pour autant qu'il soit fonctionnel chez corynébacterie, il pourrait s'agir d'un gène de sélection positif ou négatif tel qu'une résistance spécifique, néanmoins dans l'état actuel des recherches ces gènes ne sont pas aisément disponibles. On utilisera donc de préférence le gène celA de la cellulase de Clostridium thermocellum (celA) qui confère le phénotype CMC+, mais il est possible d'utiliser d'autres gènes marqueurs, notamment lacZ d'E. coli.
Dans le cas où le gène marqueur est celA, les bactéries transformées sont sélectionnées pour le caractère CMC+ après insertion de la séquence codante dans un site de restriction approprié comme BstXI.
Dans le procédé selon l'invention, on prévoiera, de préférence, que le gène marqueur puisse être facilement éliminé après vérification de la construction notamment en plaçant des sites de restriction entre le gène marqueur et la séquence codante.
La séquence codante pourra être naturelle, synthétique ou mixte.
Le système d'expression et de sécrétion de la présente invention est bien entendu destiné plus particulièrement à assurer la production de produits d'intérêt industriel, c'est pourquoi les séquences codantes coderont plus particulièrement pour un peptide, un polypeptide, ou une protéine d'intérêt industriel mais il pourra également s'agir d'une séquence codant non pas directement pour une protéine d'intérêt industriel, mais pour une protéine pouvant intervenir dans la maturation et/ou l'élaboration d'un aminoacide, d'un polypeptide, ou d'une protéine présentant un intérêt industriel.
Les procédés selon l'invention sont plus particulièrement destinés à l'expression de séquences d'acides aminés, notamment des séquences répétitives, il s'agit donc principalement de séquences synthétiques.
Cette seconde séquence de DNA codant pour ces différents produits pourra également comporter certains éléments destinés à assurer la maturation du produit sécrété.
Dans le cas d'une séquence synthétique, le choix de la séquence codante permet la constitution :
- d'une séquence d'acides aminés quelconque ;
- d'une séquence d'acides aminés répétitive à n répétitions du type (aa l ...... aax )n ;
- d'une séquence répétitive contenant en position COOH- terminale aax un acide aminé chargé positivement ou négativement. Cet acide aminé peut permettre d'améliorer l'expression génétique mais permet avantageusement
(i) d'isoler le polypeptide du fait de son caractère ionique marqué ;
(ii) de cliver par protéase spécifique le polypeptide en unité (aa l .....aax) ;
(iii) d'enlever si nécessaire l'acide aminé terminal aa par des carboxy peptidases spécifiques ;
- d'une séquence répétitive contenant en portion NH2 ou COOH terminale aa. ou aa un acide aminé conférant un avantage désiré. Dans les exemples, la séquence exprimée code pour un polypeptide de structure (ala-gln)2 0 et (ala-gln-lys) 1 0. La séquence ala-gln ou ala-gln-lys peut être libérée par traitement enzymatique ultérieur. On peut prévoir d'autres polymères de ce type tels que Ala-Gln-Tyr ou Ala-Gln-Met qui peuvent être libérés par traitement enzymatique ou chimique.
Le choix des codons de la séquence codante peut influencer l'expression dans les corynébactéries, il convient de préférence de prévoir une séquence ayant une richesse en GC de l'ordre de 50 à 60 %. Dans le cas de l'exemple la séquence codant pour (AQ)20 est GCX CAG avec X = A ou T ou C ou G ; en effet sl aucun des codons n'est préféré pour Paianine, par contre le codon CAG est très nettement préféré pour la glutamine. Dans ce cas, le pourcentage de GC est de l'ordre de 75 %, ce qui peut constituer une limitation, c'est pourquoi on envisage l'utilisation de polymères comportant 3 amino-acides dont le troisième est riche en A et T pour ramener le pourcentage à 55 % .
Tyr, Lys et Met possèdent deux A ou T dans les deux premières bases de leur codon et permettent donc de faire descendre le pourcentage en GC de 75 % à environ 60 %, ce qui devient plus proche du pourcentage en GC trouvé chez les corynébactéries. D'autres part, bien sûr, l'intérêt industriel pour ces deux acides aminés en position COOH-terminal de la glutamine (Q) a été considéré et existe.
La présente invention concerne également les souches de corynébactéries comportant un système d'expression et de sécrétion tel qu'il a été décrit précédemment, et plus particulièrement lorsque la souche est une Brevibacterium notamment une souche de Brevibacterium lactofermentum.
Enfin, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'aminoacides, de polypeptides, ou de protéines caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu de culture une souche de corynébacterie transformée telle que cela a été décrit précédemment, dans laquelle la seconde séquence de DNA code pour lesdits aminoacides ledit polypeptide, et/ou ladite protéine et en ce que l'on sépare éventuellement après culture ledit produit du milieu de culture. En effet, grâce à ce procédé, le produit intéressant a été sécrété et se trouve donc dans le milieu de culture duquel il peut être isolé par des procédés connus, qu'il s'agisse de techniques de séparation telles que la chromatographie, la précipitation sélective par exemple, celle-ci devant être adaptée évidemment à la nature de la molécule produite.
Il est également possible de prévoir la séparation du concentrât bactérien puis la séparation de la protéine déterminée, fusionnée ou non avec PS 1 ou PS 2 à partir de ce concentrât, par exemple par utilisation d'un agent tensio-actif. En effet, PS 1 et PS2 étant des protéines pariétales, une partie des protéines sécrétées avec ce système restent ancrées dans la paroi, ce qui peut faciliter leur séparation car avec certains détergents la bactérie n'est pas lysée.
La transformation des corynébactéries par des plasmides est réalisée de préférence par électroporation (Bonamy C., Guyonvarch A., Reyes O., David F. and Leblon G. (1990) FEMS Microbiology Letters 66 : 263-270) ou par tout autre procédé approprié.
Les conditions de fermentation permettant la préparation d'amino acides, peptides et/ou protéines dépendent évidemment du type de produit obtenu ainsi que de la souche spécifique mise en oeuvre, il s'agit là d'éléments qui doivent être déterminés spécifiquement pour chaque souche en fonction des connaissances de l'homme de métier.
La présente invention concerne également des systèmes d'expression comportant tout ou partie des signaux d'expression de csp1, csp2 et de la gdhA ou tout ou partie de ces trois gènes, ainsi que les souches exprimant ce type de systèmes, notamment les souches de corynébactéries.
Dans les procédés mettant en oeuvre les constructions décrites, l'expression/sécrétion de l'amino-acide, polypeptide ou protéine déterminé sera régulée par la température, le milieu de culture et/ou la nature des sucres pour PS 1 et PS2 et la concentration en sels (NH4 + notamment), métabolites (glutamate) et sucres (glucose/fructose) pour les systèmes à gdhA.
La présente invention concerne également les protéines comportant tout ou partie de la séquence de PS 1 ou PS2, en particulier comportant un ou plusieurs sites antigeniques de ces protéines. Lesdites protéines peuvent être utilisées à titre d'élément atypique, notamment dans des trousses de diagnostic, de même que les anticorps correspondants.
L'invention concerne également les souches de corynébactéries dans lesquelles la protéine déterminée est ancrée sur la paroi par la partie de PS 1 ou PS2 remplissant cette fonction d'ancrage ou bien dans lesquelles les épitopes antigeniques de PS 1 ou PS2 sont exposés sur la paroi.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention et ne sont en aucun cas limitatifs. Figure 1. Schéma du piasmide pCGL612. Piasmide dérivé du pUN121 ( Nilsson, B., Uhlén, M., Josephson, S., Gatenbeck, S., and Philipson, L. (1983) An improved positive sélection plasmid vector constructed by oligonucleotide mediated mutagenesis. Nucleic Acids Res 11: 8019-8029.) contenant un fragment de 2,6 kb de C. melassecola ATCC17965 portant l' intégralité du gène cspl permettant la synthèse de la protéine PS 1.
Figure 2. Séquence nucléotidique et séquence d' acides aminés correspondante du gène cspl de Corynebacterium glutamicum dite Corynebacterium melassecola ATCC 17965. La numérotation des nucléotides est présente sur le côté droit de la figure. Les séquences nucléotidiques répétées sont entourées. La séquence probable Shine-Dalgarno est soulignée. Un palindrome de 24 pb qui correspond vraisemblablement au terminateur de transcription est indiqué par des flèches inversées. Cette séquence apparait dans la banque de données de séquences nucléotidiques EMBL sous le numéro d' accès X66078.
Figure 3. Carte de restriction de la région d' ADN de C. melassecola ATCC 17965 séquencée portant cspl.
Figure 4. Alignement des séquences de la protéine PS 1 de C. glutamicum et des protéines du complexe antigènique 85 de Mycobacterium. 85B M. k. représente l' antigène 85-B de M. kansaii (MIPSG16235). 85B M. b. représente l' antigène 85-B de M. bovis (MIPSC83179). 85B M. I représente l' antigène 85-B de M. leprae
(EMBLX60934). 85C M. t. représente l' antigène 85-C de M. tuberculosis
(EMBLX57229). 85A M. b. représente l' antigène 85-A de M. bovis (MIPSA28544).
85A M. t. représente V antigène 85-A de M. tuberculosis (MIPS 160062). Les séquences ont été alignées en utilisant le programme FastA de "Genetics Computer Group" (University of Wisconsin, USA). La numérotation des résidus est donnée pour chaque protéine au début de chaque ligne. Les résidus d' acides aminés similaires trouvés entre les différentes protéines sont entourés. Les résidus cosidérés comme similaires sont les suivants; acides ou amides (D, E, N, Q); basiques (H, K, R); polaires (P, A, G, S, T); non polaires (I, L, M, V) et aromatiques (F, W, Y). Les résidus d' acides aminés identiques entre les sept protéines sont indiqués par une étoile au-dessus des résidus concernés.
remarque: pour chaque antigène, le numéro d' accession est précisé associé au nom de la banque de données considérée et figurent entre parenthèses. Figure 5. Interruption du gène cspl.
Intégration dans le chromosome d' un gène cspl interrompu. pCGL613' est non réplicatif chez C. glutamicum , il contient cspl ( zone noircie ) interrompu par le gène aphA3 (Km), wt, B. lactofermentum 15 sauvage et Acspl, l' intégrant contenant csp1 interrompu.
Figure 6. Construction du piasmide pCGL616.
Le piasmide pCGL616 correspond au piasmide pCGL125 doté du gène cspl de C. glutamicum.
Figure 7. Plasmides permettant la synthèse de protéines PS 1 tronquées.
Schéma des vecteurs dérivés de pCGL616, précision de la taille des protéines attendues et de leur détection (+) ou non (-) par Western blotting avec des anticorps polyclonaux anti-PS 1.
Figure 8. Construction du piasmide pCGL1030. La région nommée A dans le' schéma contient le promoteur de cspl suivi de la région d' ADN correspondant à la séquence signal de PS 1 et des 30 premiers acides aminés de sa séquence mature.
Figure 9. Construction du piasmide 1031. La région nommée A est décrite dans la figure 8. La région de jonction entre PS 1 et EGA a été séquencée et le détail de cette séquence est présenté.
Figure 10. Construction du piasmide 1032. La région nommée A est décrite dans la figure 8. La région de jonction entre PS 1, (AQK) 10 et EGA a été séquencée et le détail de cette séquence est présenté.
Figure 11. Construction du piasmide 1033. La région nommée A est décrite dans la figure 8. La région de jonction entre PS 1, (AQ)19 et EGA a été séquencée et le détail de cette séquence est présenté.
Figure 12. Séquence nucléotidique et séquence d' acides aminés correspondante du gène cspl de Corynebacterium glutamicum dite Corynebacterium melassecola
ATCC 17965. La numérotation des nucléotides est présentée sur le côté droit de la figure. La séquence probable Shine-Dalgarno est soulignée. Un palindrome de 22 pb qui correspond vraisemblablement au terminateur de transcription est indiqué par des flèches inversées.
Figure 13. Carte de restriction de la région d' ADN de C. melassecola ATCC 17965 séquencée portant csp2.
Figure 14. Interruption du gène csp2 chez C. glutamicum.
Intégration chromosomique du gène interrompu. Le piasmide pCGL830 non réplicatif chez C. glutamicum, porte le gène csp2 interrompu par le gène aphlll. Le sens de transcription des gènes aphIII et csp2 est représenté par une flèche sur le piasmide pCGL830. Wt, représente la souche B. lactofermentum 15 et csp2 :: aphIll, l'intégrant avec le gène csp2 interrompu.
Figure 15. Translocation de PS 1 en fonction de la température. 10 ml de culture en phase exponentielle (DO650=1) à 34°C ont été marqués avec la méthionine 35S (37 TBq/mmole, 16nM en concentration finale) durant 1 mn. A la fin du puise du chloramphénicol (100μg/ml) et de la méthionine 32S (concentration finale 0,5 raM) sont alors ajoutés. 1ml d' aliquote est prélevé et rapidement refroidi à la température indiquée. L' incubation est continuée à cette température pendant 30 mn et la fraction sécrétée pariétale de PS 1 est extraite. L' extrait est alors soumis à un SDS-PAGE et autoradiographié (a). L' intensité des bandes est déterminée par densitométrie (b, axe de gauche) et est donnée en unité arbitaire, sur une base de 100 à 34°C. La translocation est fonction de la transition de phase des lipides de la membrane.
Figure 16. Carte de restriction du gène gdhA.
Figure 17. Séquence complète du fragment Nhel-Blgl contenant le gène gdhA de C. melassecola.
Figure 18. Construction de pCGL141 et pCGL142, vecteurs de fusion entre le promoteur du gène gdhA et le gène lacZ.
Figure 19. Oligonucléotides utilisés dans les constructions.
Figure 20. Construction de pPROK(AQ)20celA
Figure 21. Détail de construction plaçant le gène synthétique entre ptac et le gène celA - a) construction plaçant ceLA sous le contrôle de ptac, b) devenir de la construction après introduction du polypeptide AQ.
ptac : promoteur toc
RBS : site de liaison au ribosome
: séquence synthétique en 5 du gène celA permettant I'introduction de la séquence équivalente du polypeptide AG et sa fusion à d'autres gènes éventuels
(DGF1 DGF2) .
: nucléotides intraduits du site BstXl équivalents au polypeptide AQ
(DGF5 DGF6 )
: sefience d'ADN équivalent à une partie de la séquence signal d'EGA : séquence d'ADN équivalent à la séquence codante d'EGA
: terminateur de transcription
P : premier acide aminé appartenant à la séquence signal d'EGA
Figure 22. Structure de pCGL125. Exemple 1. Identification de PS1 et de PS2 dans le surnageant de culture et dans la paroi de Corynebacterium slutamicum.
L' analyse d' un gel de polyacrylamide en condition dénaturante (SDS-PAGE) (Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.) d' un surnageant de culture de la souche Corynebacterium melassecola ATCC 17965, actuellement redéfinie comme une souche de Corynebacterium glutamicum (Jones, D., and Collins, M. D. ( 1986) irregular nonsporing Gram-positive rods. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins (eds). Baltimore, vol. 2, pp. 1261-1434.) montre deux protéines majeures nommées PS 1 et PS2 de masse moléculaire approximative 67000 et 63000 respectivement. Les concentrations de PS 1 et de PS2 suivent la courbe de croissance de la bactérie et atteignent leur maximum en phase stationnaire. Une fraction sécrétée importante de ces protéines et surtout pour PS2 est également située dans la paroi de la bactérie. Pour extraire PS 1 et PS2 de la paroi un traitement des bactéries au SDS est utilisé, qui ne provoque pas de lyse significative de la bactérie. Ainsi, pour obtenir une concentration maximale de PS 1 et de PS2, il est donc possible de cumuler les deux fractions sécrétées, surnageant de culture et fraction pariétale, et d' obtenir une préparation finale où PS 1 et PS2 sont fortement majoritaires. Des anticorps polyclonaux ont été préparés contre PS 1 et PS2, il n' y a pas de réaction immunologique croisée entre les deux protéines ce qui montre bien que ces protéines sont différentes. Des protéines ayant de fortes réactions immunologiques croisées avec PS 1 et PS2 ont été trouvées dans le surnageant de culture de souches bactériennes apparentées à Corynebacterium melassecola ATCC 17965 comme la souche Brevibacterium lactofermentum 15 (Bonnassie, S., Oreglja, J., Trautwetter, A., and Sicard, A. M. (1990) Isolation and characterization of a restriction and modification déficient mutant of Brevibacterium lactofermentum. FEMS Microbiol Letters 72: 143-146.), Brevibacterium lactofermentum ATCC21086 et Brevibacterium flavum ATCC 14067. PS 1 et PS2 ont été testées pour plusieurs activités enzymatiques incluant l' activité invertase, pectinase, nucléase, collagénase, amylase, bactériocine, endoglucanase et protéase à large spectre. Aucune de ces activités enzymatiques n' a pu être associée à PS 1 ou PS2. Exemple 2. Evidence de la fonctionalité du peptide signal de PS1 chez Escherichia coli (Figure 1).
Lorsque le gène cspl porté par le piasmide pCGL612 (Figure 1) est exprimé chez E. coli TG1, l' analyse par Western blotting d' un extrait brut de ce recombinant avec les anticorps anti-PS 1 révèle la présence d' une protéine majeure qui a la même masse moléculaire que la protéine PS 1 présente dans le surnageant de culture de C. melassecola . Une protéine mineure de masse moléculaire légèrement supérieure est également détectée. En fait la bande protéique majeure correspond à la forme mature de PS 1 (sans séquence signal) et la bande protéique mineure à la forme précurseur de PS 1 (avec la séquence signal).
En effet, dans une première expérience, la libération des protéines périplasmiques (enzymes sécrétées) de la souche recombinante E. coli- TGl(pCGL612) par choc osmotique (Heppel, L. A. (1967) Sélective release of enzymes from bacteria. Science 156: 1451-1455.) et la détection du contenu en protéines libérées par Western blotting avec des anticorps anti-PS 1 ne révèle que la protéine majeure. L' activité isocitrate dehydrogenase (Shiio, I., and Ujigawa, K. (1978) Enzymes of the glutamate and aspartate synthetic pathways in a glutamateproducing bacterium, Brevibacterium flavum. J Biochem 84: 647-657.) de la souche a été mesurée en guise de contrôle de lyse; cette lyse a été estimée dans cette expérience à moins de 1%. Ceci amène à la conclusion que la bande protéique majeure correspond à la forme mature de PS 1 et que la protéine est exportée à travers la membrane cytoplasmique d' E. coli.
Dans une deuxième expérience, l' extrait brut de la souche recombinante E. coli TGl(pCGL612) a été analysé par Western blotting avec les anticorps anti-PS 1 avant et après addition de chloramphénicol pour inhiber la synthèse protéique. La bande mineure disparait progressivement après l' inhibition de la synthèse protéique.
Cette bande mineure de PS 1 ne disparait pas si on ajoute 5 minutes avant l' addition de chloramphénicol, le CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone), un protonophore qui dissipe la force proton-motrice à travers la membrane cytoplasmique. La disparition de la bande mineure de PS 1 n' est donc pas le résultat d' une dégradation par les protéases. Sa disparition progressive après inhibition de la synthèse protéique et son absence du périplasme sont en accord avec l' hypothèse de la maturation de cette forme précurseur par une séquence signal peptidase située dans la membrane et sa translocation à travers la membrane cytolasmique. Ce résultat montre également que chez E. coli la maturation de PS 1 est dépendante de la force proton-motrice, in vivo. Exemple 3. Séquence nucléotidique du gène csp1 codant pour PS1
Le séquençage d' un fragment de 2547 paires de base contenant le gène codant pour PS 1 , nommé cspl , et de la région en amont a été réalisé. La séquence nucléotidique est présentée dans la figure 2 (séquence ID n° 1). La figure 3 représente la carte de restriction de cette région séquencée.
Par analyse informatique, une phase ouverte de lecture de 1971 paires de base a été identifiée correspondant à 657 acides aminés.
Les si gnaux putatifs de démarrage de traduction (GAGAAGGAAAACTTCATG) et de démarrage de transcription (TACATA(-35) et TAAGAT(-10) ont été identifiés. La séquence AGAAGGA extraite du site de fixation aux ribosomes décrit ci-dessus est complémentaire (soulignage) de l' extrémité 3' de l' ARNr des bactéries de type Gram positive Staphylococcus aureus et Steptomyces' lividans (5'-GAUCACCUCCUUUC UOH-3') (McLaughlin, J. R., Murray, C. L., and Rabinowitz, J. C. (1981) Unique features of the ribosome binding site séquence of the Gram positive Staphylococcus aureus β-lactamase gène. J. Biol Chem.256: 11283-11291.) (Bibb, M. J., and Cohen, S. N. (1982) Gène expression in Streptomyces: Construction and application of promoter-probe plasmid vectors in Streptomyces lividans. Mol Gen Genêt 187: 265-277.). La région d' ADN en 5' précédant le codon de démarrage de la traduction contient deux séquences nucléotidiques AAAAGTTATCCACAG et ATTGAAAAA répétées chacune deux fois, de 28 à 42 et de 70 à 84 pour la première, puis de 100 à 108 et de 171 à 179 pour la deuxième. Ces deux séquences pourraient être impliquées dans la régulation de la transcription du gène cspl.
En ce qui concerne les signaux de sécrétion, une séquence à l' extrémité NH2 de la protéine présente les caractéristiques d' une séquence signal de bactérie de type Gram-positive (Watson, M. E. E. ( 1984) Compilation of published signal séquences. Nucleic Acids Res.12: 5145-5164.). Cette séquence signal comporte un excès de charge positive en position NH2-terminale (7 acides aminés à charge positive dans les 18 premiers acides aminés), suivi d' une séquence avec un excès d' acides aminés non polaires (18 acides aminés non polaires dans les 23 acides aminés suivants) puis de deux séquences d' acides aminés putatives d' un site de clivage de séquence signal (pro thr ala ile ala, en position 28 à 32) (pro met ala ser ala, en position 39 à 43). Parmi ces deux séquences d' acides aminés putatives d' un site de clivage de séquences signal, la deuxième = pro met ala ser ala en position 39 à 43 semble la plus probable; en effet, la protéine PS 1 a été purifiée du surnageant de culture de
Corynebacterium glutamicum jusqu' à homogénéité électrophorétique par deux protocoles différents (voir exemple 5) et les préparations ont été utilisées pour déterminer la séquence amino-terminale par la dégradation d' Edman. Aucun signal n' a été obtenu, bien que 5 nmoles de protéine purifiée aient été utilisées. Comme deux protocoles de purification ont été utilisés, il est probable que la protéine PS 1 soit bloquée in vivo et que le blocage ne soit pas une conséquence de la technique de purification utilisée. La deuxième séquence de clivage proposée ferait apparaître une glutamine (position 44) comme premier acide aminé de la séquence mature, facilement convertie en acide pyroglutamique rendant impossible le séquençage amino-terminal de la protéine par la technique d' Edman.
Un site putatif de terminateur de type rho dépendant est trouvé dans la région 3' du gène à 55 nucléotides des trois codons stop och-amb-opa (Rosenberg, M., and Court, D. (1979) Regulatory séquences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Annu Rev Genêt 13: 319-353.). Le ΔG de cette structure en épingle à cheveux est égal à -35,7 kcal/mole (Freier, S. M., Kierzek, R., Jaeger, J. A., Sugimoto, N., Caruthers, M. H., Neilson, T., and Turner, D. H. (1986) Improved free-energy parameters for prédictions of RNA duplex stability. Proc Natl Acad Sci USA 83: 9373-9377.)
La masse moléculaire calculée correspondant aux 657 acides aminés contenus dans la phase de lecture ouverte est de 70874. Or la masse moléculaire de la séquence signal la plus probable (site de clivage entre l' acide aminé 42 et 43) est de 4411, ce qui donne une masse moléculaire calculée pour la protéine mature de 66463 et qui est très proche de la valeur de 67000 estimée sur gel de polyacrylamide dénaturant
Les caractéristiques de la séquence sont rappelées ci-après:
de 239 à 244 TACATA (signal -35)
de 269 à 274 TAAGAT (signal -10)
de 405 à 414 GAGAAGGAAA site de fixation des ribosomes
de 420 à 2390 séquence codante
de 420 à 548 peptide signal de protéine sécrétée
de 2455 à 2506 structure en épingle à cheveux, signal de terminateur de type rho dépendant . Exemple 4. Homologies de séquences entre PS1 de Corynebacterium glutamicum et les protéines du complexe antigènique 85 de Mycobacterium. (Figure 4). La moitié NH2 de la protéine PS 1 est très similaire aux trois antigènes mycobactériens sécrétés nommés 85-A, 85-B et 85-C (Closs, O, Harboe, M., Axelsen-Christensen, N. H., and Magnussen, M. ( 1980) The antigens of Mycobacterium bovis, strain BCG, studied by crossed immuno-electrophoresis: a référence System Scand J. Immunol 12: 249-263. )(Wiker, H. G., Harboe, M., Nagai, S., and Bennedsen, J. (1990) Quantitative and qualitative studies on the major extracellular antigen of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and Mycobacterium bovis BCG. Am Rev Respir Dis 141: 830-838.). Les trois gènes correspondants de différentes espèces mycobactériennes ont été clones et séquences: antigène 85-A de Mycobacterium bovis BCG1173P2 et de Mycobacterium tuberculosis ( Borremans, M., De Wit, L., Volckaert, G., Ooms, J., De Bruyn, J., Huygen, K., Van Vooren, J.-P., Stelandre, M., Verhofstadt, R., and Content, J. (1989) Cloning, séquence détermination, and expression of a 32-kilodalton-protein gène of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 57: 3123-3130.) ( De Wit, L., De la Cuvellerie, A., Ooms, J., and Content, J. ( 1990) Nucleotide séquence of the 32 kDa-protein gène (antigen 85A) of Mycobacterium bovis BCG. Nucleic Acids Res 18: 3995.), l' antigène 85-B de Mycobacterium bovis Tokyo, Mycobacterium kansaii et Mycobacterium leprae (Matsuo, K., Yamaguchi, R., Yamazaki, A., Tasaka, H., and Yamada, T. (1988) Cloning and expression of the Mycobacterium bovis BCG gène for extracellular a antigen. J. Bacteriol 170: 3847-3854.) (Matsuo, K., Yamaguchi, R., Yamazaki, A., Tasaka, H., Terasaka, K., and Yamada, T. (1990) Cloning and expression of the gène for the cross-reactive a antigen of Mycobacterium kansaii. Infect Immun 58: 550-556.) (De Mendonça Lima, L., Content, J., Van Heuverswyn, H., and Degrave, W. (1991) Nucleotide séquence of the gène coding for the 85-B antigen of Mycobacterium leprae. Nucleic Acids Res 19: 5789.), et l' antigène 85-C de Mycobacterium tuberculosis ( Content, J., De La Cuvellerie, A., De Wit, L., Vincent-Levy-Frébault, V., Ooms, J., and De Bruyn, J. (1991) The gènes coding for the antigen 85 complexes of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG are members of a gène family: cloning, séquence détermination, and genomic organization of the gène coding for antigen 85-C of M. tuberculosis. Infect Immun 59: 3205-3212.). La protéine PS 1 de Corynebacterium glutamicum présente environ 33% de résidus identiques (σ=1,1) et environ 52% de résidus similaires (σ=1,1) avec ces six protéines sur une longueur d' environ 330 acides aminés (+/- 5). Cette longueur d' environ 330 acides aminés correspond pour les antigènes mycobactériens à la longueur totale de la protéine. Toutes ces protéines mycobactériennes, tout comme PS 1, contiennent une séquence signal d' une longueur comparable aux plus longues séquences signal trouvées chez les bactéries de type Gram-positives (environ 42 acides aminés, σ=2,4). La protéine 85-B de M. bovis et la protéine 85-C de M. tuberculosis, tout comme PS 1, ont une plus longue région NH2 hydrophile (5 ou plus, de résidus chargés positivement) que la plupart des séquences signal. Une autre caractéristique intéressante de toutes ces séquences signal est la présence en position 3 ou 5 d' un résidu acide, l' acide aspartique, sauf pour l' antigène 85-C de M. tuberculosis où il s' agit d' un acide glutamique. La présence d' un résidu chargé acide est commun aux extrémités NH2 des séquences signal Eucaryotes, mais est tout à fait inhabituelle aux extrémités NH2 des séquences signal Procaryotes (Perlman, D., and Halvorson, H. O. (1983) A putative signal peptidase récognition site and séquence in eucaryotic and procaryotic signal peptides. J Mol Biol 167: 391-409.) (Watson, M. E. E. (1984) Compilation of published signal séquences. Nucleic Acids Res.12: 5145- 5164.). La raison de cette particularité n' est pas connue. Aucune autre similitude significative n' a été trouvée entre PS 1 et d' autres protéines présentes dans les banques de données EMBL/ MIPS.
Exemple S. Protocoles de purification de PS1 et PS2 utilisés en vue de la détermination de la séquence N-terminale. Protocole 1 :
Les protéines PS 1 et PS2 ont été purifiées à partir du surnageant de culture de C. glutamicum ATCC 17965 par électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide et électroélution.
Les bactéries, cultivées dans 200 ml de milieu riche LB à 34°C, sont récoltées en phase stationnaire de croissance par centrifugation à 8000 g pendant 15 minutes et à 4°C. Les protéines du surnageant de culture sont ensuite précipitées au sulfate d'ammonium 60% et récoltées par centrifugation à 13000 g pendant 15 minutes à 4°C. Le culot est solubilisé dans 4 ml de tampon Tris HC1 10 mM pH 6.8 et la solution est ensuite dialysée pendant 24 heures à 4°C dans ce même tampon. L'extrait protéique dialyse obtenu après précipitation au sulfate d'ammonium est déposé sur un gel d'électrophorèse de format 16 x 20 x 0,75 cm. L'électrophorèse est réalisé selon le protocole décrit par Laemmli (1970) en utilisant un gel de concentration à 4% et un gel de séparation à 7,5%. La migration se fait en quinze heures à 40mA. Les gels sont ensuite colorés au chlorure de cuivre selon le protocole décrit par Lee et al ( 1987). Les bandes protéiques correspondant aux protéines PS 1 et PS2 sont découpées puis totalement décolorées. Les protéines sont ensuite électroéluées du gel pendant 5 heures à 48mA et à 4°C, puis dialysées plusieurs fois dans un tampon Tris HCl 10 mM pH 6.8 avant d'être réparties en plusieurs parties aliquotes et congelées à - 20°C. Le rendement de la purification est de l'ordre de 25% avec une pureté supérieure à 90%.
Protocole 2 :
Les protéines PS 1 et PS2 sont purifiées à partir du surnageant de culture de C. glutamicum ATCC 17965 par ultrafiltration, électrophorèse et transfert sur membrane de PVDF.
Les bactéries, cultivées dans le milieu riche LB à 34°C, sont récoltées en phase stationnaire de croissance par centrifugation à 8000 g pendant 15 minutes et à 4°C. 4 ml de surnageant sont dilués 50 fois dans un tampon phosphate 50 mM pH 7.0 avant d'être centrifugés sur une membrane d'ultrafiltration dont le seuil de coupure est de 30 kD. Cette étape permet d'obtenir un extrait protéique de 80μl qui est ensuite déposé sur un gel d'électrophorèse composé d'un gel de concentration à 4% et d'un gel de séparation à 7,5%. L'électrophorèse est réalisée selon le protocole décrit par Laemmli avec les modifications suivantes. Toutes les solutions servant à la préparation des gels ainsi que le tampon de migration sont dégazés et contiennent 0,1 M de thioglycolate. De plus, le gel de séparation est soumis à un "pré-run" avant son utilisation. Toutes ces précautions sont prises dans le but d'éviter au maximum la formation de radicaux libres qui pourraient conduire à des modifications de l'extrémité N-terminale des protéines et par conséquent à un éventuel blocage de cette extrémité. A l'issue de l'électrophorèse, les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF. Cette étape se fait dans un tampon 50 mM Tris, 50 mM borate pH 8.0 pendant 60 minutes et à 50V. La membrane est ensuite colorée à l'amidoblack, ce qui permet de localiser et découper les bandes correspondant aux protéines PS 1 et PS2. Les bandes protéiques sont ensuite décolorées et utilisées telles quelles pour le séquençage N-terminal. (Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structure proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227 : 680-685. - Lee, C. Levin, A. Branton, D. 1987. Copper staining : afive minute protein stain for sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Anal. Biochom., 166 : 308-312.)
Exemple 6. Obtention de souche de Corynebacterium glutamicum ne synthétisant plus PS1, dite PS1-. (Figure 5).
La souche C. glutamicum dite Brevibacterium lactofermentum 15 est permissive à l' ADN modifié d' E. coli K12 (Bonnassie, S., Oreglia, J., Trautwetter, A., and Sicard, A. M. (1990) Isolation and characterization of a restriction and modification déficient mutant of Brevibacterium lactofermentum. FEMS Microbiol Letters 72: 143-146), alors que la souche C. glutamicum dite C. melassecola' ATCC17965 est une souche très restrictive vis à vis de l' ADN d' E. coli (Reyes O., Guyonvarch, A., Bonamy, C, Salti, V., David, F., and Leblon, G. (1991) 'Integron'-bearing vectors: a method suitable for stable chromosomal intégration in highly restrictive Corynebacteria. Gène 107: 61-68.). Pour cette raison, la souche B. lactofermentum 15 a été choisie pour effectuer l' interruption du gène cspl. Il a été vérifié que la carte physique du gène cspl est identique chez C. melassecola ATCC 17965 et chez B. lactofermentum 15.
Le fragment Clal de 1;5 kb du piasmide pAT21 (Trieu-Cuot, P., and Courvalin, P. (1983) Nucleotide séquence of the Streptococcus faecalis plasmid gène encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gène 23: 331-341.) contenant le gène aphA3 de Streptococcus faecalis, qui confère la résistance à la kanamycine (Kmr), a été inséré dans le site unique Kpnl (Asp718) du gène cspl présent dans le piasmide pCGL612, pour donner le piasmide pCGL613'. Par Western blotting avec des anticorps polyclonaux anti-PS 1, il a été montré que la souche recombinante E. coli hébergeant le piasmide pCGL613' est bien de phénotype PS1-. Ce piasmide est capable de se répliquer chez E. coli mais pas chez C. glutamicum. Il a été introduit dans la souche de C. glutamicum dite B. lactofermentum 15 par électro- transformation (Bonamy, C, Guyonvarch, A., Reyes, O., David, F., and Leblon, G. (1990) Interspecies electro- transformation in Corynebacteria. FEMS Microbiol Letters 66: 263-270.) et les transformants Kmr ont été sélectionnés. Dans les transformants Kmr, le piasmide pCGL613' est supposé s' être intégré dans le chromosome de C. glutamicum par recombinaison homologue avec la région cspl du génome de l' hôte. Dans 22,5% des transformants, un événement de double crossing-over s' est produit, résultant dans la substitution du gène cspl sauvage par la construction csp1::aphA3 du piasmide transformant, donnant un phénotype Km r-Tets (Figure 5). L' ADN total chromosomal de la souche sauvage et d' un des recombinants Kmr-Tets digéré par soit BglIl soit BamH l et EcoRl a été analysé par Southern blotting (Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a Laboratory manual, second édition. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Publications.) avec la sonde pCGL613'. Le gène cspl est contenu dans un fragment d' approximativement 7,5 kb dans la souche sauvage, alors que l' intégrant pCGL613' contient un fragment d' approximativement 9 kb correspondant au gène aphA3 de 1, 5 kb inséré dans le gène cspl. La digestion BamHl-EcoRI confirme la structure de l' intégrant présentée dans la figure 5.
L' intégrant Km r-Tets a également été analysé par Western blotting pour la production de PS 1 en utilisant des anticorps polyclonaux anti-PS 1. Il n' y a pas de protéine PS 1, ni dans le surnageant de culture, ni dans l' extrait brut de cette souche. Ceci confirme que le gène cspl clone dans λgt11 correspond à un gène unique qui code bien pour PS 1 dans C. glutamicum.
Cette souche C. glutamicum PS 1- est tout à fait viable et ne semble pas affectée dans son taux de croissance. Ce résultat montre qu' il est possible d' utiliser la région du gène cspl comme cible d' intégration d' ADN homologue ou hétérologue dans une souche de C. glutamicum, sans en affecter, a priori, la viabilité.
Exemple 7. Expression chez C. elutamicum du gène csul en multicopies. Analyse des régions importantes de PS1, nécessaires à sa synthèse et à sa sécrétion. Pour cette série d' expériences, le piasmide pCGL616 a été construit. Il contient l' intégralité du gène cspl et a été construit à partir du piasmide pCGL125, correspondant au piasmide pBL1 (Santamaria, R., Gil, J. A., Mesas, J. M. and J. F. Martin (1984) Characterization of an endogenous plasmid and development of cloning vectors and a transformation System in Brevibacterium lactofermentum. J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246.), réplicatif chez C. glutamicum, doté d' une cassette de clonage comportant le gène aphA3 de Streptococcus faecalis et du piasmide pCSP1G, réplicatif chez E. coli, contenant le gène cspl. Le piasmide, pCGL616, résultant de cette construction (Figure 6) est réplicatif chez C. glutamicum. Restauration de la synthèse de PS1 dans une souche de C . glutamicum PS1-.
On observe la restauration dans la souche dite, B. lactofermentum 15 PS 1-, de la synthèse de PS 1, après introduction dans celle-ci du piasmide pCGL616. Dans cette souche B. lactofermentum 15 PS 1- hébergeant le piasmide pCGL616, une quantité plus importante de PS1 sécrétée est détectée en comparaison de la souche sauvage B . lactofermentum 15 (naturellement PS1+). Ceci signifie qu' il est possible d' augmenter la concentration de PS 1 sécrétée dans une souche de C. glutamicum en augmentant le nombre de copies du gène cspl.
Ce résultat est également démontré dans la souche dite C. melassecola ATCC17965.
Constructions de plasmides dérivés de pCGL616 permettant la synthèse de protéines PS1 tronquées. (Figure 7).
Cette expérience montre qu' une protéine PS 1 tronquée d' une masse moléculaire alors égale à environ 23000 (Mw), au lieu de 67000 (Mw) pour la protéine naturelle, peut encore être sécrétée chez C. glutamicum.
Sept délétions ont été effectuées dans la région du gène cspl donnant naissance à sept plasmides différents, à partir du piasmide pCGL616. Toutes ces délétions conservent la région de l' ADN équivalente à la séquence signal de PS 1 ainsi que le terminateur de transcription du gène cspl. Dans tous les cas la synthèse et la sécrétion de la protéine PS 1 tronquée a été analysée par Western blotting avec les anticorps polyclonaux anti-PS 1. Ces résultats montrent qu' il est possible de déléter une grande partie du gène cspl (figure 7) tout en rendant encore possible la synthèse et la sécrétion d'une protéine PS 1 tronquée. La plus grande délétion permettant ce résultat correspond à la délétion du fragment Ncol-BspEl (BspMll) d' environ 1,3 kb du gène cspl (pCGL1041) donnant une taille de protéine précurseur pour PS 1 égale à environ 29 kD et à environ 24kD pour la forme mature sécrétée. Dans le surnageant de culture de la souche dite B. lactofermentum 15 PS 1- hébergeant ce piasmide pCGL1041, il est bien détecté par Western blotting avec les anticorps anti-PS 1 une protéine d' environ 23 kD.
Exemple 8. Construction d' un vecteur d' expression et de sécrétion chez C. glutamicum nommé pCGL1030 basé sur le système cspl . (Figure 8. 9, 10, 11)
Constuction du piasmide pCGL1030 (Figure 8).
Ce piasmide réplicatif chez C. glutamicum (contient le piasmide pBL1 de C. glutamicum) porte le promoteur du gène cspl de C. glutamicum et la région d' ADN de ce gène correspondant à la séquence signal plus les 30 premiers acides aminés de la séquence mature de PS 1. Un site mutiple de clonage (polylinker 2 dans la figure 8) a été placé immédiatement derrière le 30 ième acide aminé de la séquence mature de PS 1, afin de permettre le clonage aisé en phase de tout gène hétérologue devant être exprimé chez C. glutamicum. Enfin, ce piasmide est doté des éléments de PS 1 nécessaires à la sécrétion et correspond donc à un outil et d' expression et de sécrétion.
Expression du gène c e lA de Clostridium thermocellum chez Corynebacterium glutamicum et sécrétion de la protéine correspondante (Figure 9).
Le gène celA de C. thermocellum, (Cornet, P., Millet, J., Béguin, P. and J.-P. Aubert (1983) Characterization of two cel (cellulose dégradation) gènes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases. Bio/Technology 1:589-594.) codant pour une endoglucanase nommée endoglucanase A ou EGA, a été clone dans le vecteur pCGL1030 au site Sma I, donnant naissance au piasmide pCGL 1031 (Figure 9). Ce gène celA provient du piasmide pCGL1008 où un site de restriction BstXl a été introduit artificiellement, très près du site de démarrage de traduction de la protéine EGA, à des fins de constructions chimères (voir Figure 10, 11). La synthèse de la protéine EGA est facilement détectable grâce à un test coloré d' activité enzymatique sur boite utilisant un substrat des endoglucanases, la carboxyméthylcellulose dite CMC (Cornet, P., Millet, J., Béguin, P. and J.-P. Aubert (1983) Characterization of two cel (cellulose dégradation) gènes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases. Bio/Technology 1:589-594.). Ce test CMC sera utilisé pour confirmer la synthèse de la protéine EGA de C. thermocellum chez C. glutamicum. Un test CMC d'activité sur boîte effectué sur des cellules entières ou sur le surnageant de culture, en milieu riche (LB -Luria Broth- ou BHI -Brain Heart Infusion-) met en évidence dans les deux cas, l' activité endoglucanase d' une souche de C. glutamicum dite Brevibacterium lactofermentum 15 hébergeant le piasmide pCGL1031. On notera une activité plus forte sur milieu LB + fructose, ou + glucose, indiquant un effet stimulant de ces deux sucres sur l' expression de celA sous contrôle du promoteur cspl. Ceci se confirme dans le zymogramme (Béguin, P. (1983) Détection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red stained agar replicas Anal. Biochem. 131: 333-336.), et dans le Western blotting réalisé sur les surnageants de culture avec des anticorps polyclonaux anti-EGA.
Utilisation du système cspl pour l' expression et la sécrétion du polypeptide synthétique (AQK) 10 (Figure 10).
Un gène synthétique correspondant au polypeptide alanine-glutamine-lysine répété 10 fois a été synthétisé chimiquement et clone au site BstXl du piasmide pCGL1008, donnant naissance au piasmide pCGL1017. Le fragment EcoRl du piasmide pCGL1017 a été clone au site Smal du piasmide pCGL1030, situé en aval du promoteur cspl de la séquence signal et des 30 premiers acides aminés de PS 1 (et en amont du gène reporter celA), donnant naissance au piasmide pCGL1032 (Figure 10). La détection de la protéine chimère PS1-(AQK)10-EGA est effectuée comme décrit ci-dessus, par test CMC sur boîte par zymogramme ou par Western blotting. Utilisation du système csp1 pour l' expression et la sécrétion du polypeptide synthétique (AQ)19 (Figure 11).
Un gène synthétique correspondant au polypeptide alanine-glutamine répété 20 fois a été synthétisé chimiquement et clone au site BstXI du piasmide pCGL1008, donnant naissance au piasmide pCGL1002. Le fragment E coRI du piasmide pCGL1002 a été clone au site Smal du piasmide PCGL1030, situé en aval du promoteur cspl de la séquence signal et des 30 premiers acides aminés de PS 1 (et en amont du gène reporter celA), donnant naissance au piasmide pCGL1033 (Figure 11). La détection de la protéine chimère PS1-(AQ)19-EGA est effectuée comme décrit ci-dessus, par test CMC sur boîte, par zymogramme ou par Western blotting. La séquence chez B. lactofermentum dans le piasmide pCGL1033 a fait apparaître la perte d'une séquence codante AQ (passage de AQ20 à AQ19 lors du clonage chez B. lactofermentum).
Cette série d' expériences montre que le promoteur du gène cspl permet l' expression chez C. glutamicum du gène hétérologue celA de Clostridium thermocellum et des constructions chimères (AQK) 10 -celA et (AQ)19 -celA. De plus, ces expériences montrent que les éléments de PS 1, en l'occurrence, sa séquence signal suivie des 30 premiers acides aminés de sa séquence mature placés en amont desgènes hétérologues, permettent la sécrétion des produits correspondants. L' effet du milieu de culture et de l' adjonction ou non de sucre dans ce milieu, en l'occurrence de glucose ou de fructose, a un effet sur la production du produit correspondant. En particulier, sous le contrôle du promoteur de cspl et chez C. glutamicum, la production d' EGA ou des protéines chimères (AQK)10-EGA ou (AQ)19-EGA, est meilleure sur milieu LB que sur milieu BHI, elle est fortement stimulée par le glucose ou le fructose sur milieu LB. Le promoteur cspl de C. glutamicum semble plus fort que le promoteur naturel de celA de C. thermocellum ; en effet la souche dite B. lactofermentum 15 hébergeant le piasmide pCGL602, qui contient le promoteur naturel de celA présente une activité endoglucanase nettement moins importante que cette même souche hébergeant le piasmide pCGL1031, où celA est sous le contrôle du promoteur cspl de C. glutamicum.
L' expérience de Western blotting réalisée sur les surnageants de culture de différentes souches contenant pCGL1032 ou pCGL1033 montre que plusieurs bandes protéiques réagissent avec des anticorps polyclonaux anti-EGA. Ces différentes bandes sont spécifiques de l' endoglucanase EGA (absentes du témoin) et correspondent vraisemblablement à des produits de dégradation de la protéine et des protéines chimères. Cependant des bandes de plus hautes masses moléculaires sont bien observées avec (AQK)10-EGA (pCGL1032) et (AQ)19-EGA (pCGL1033) et de façon cohérente (Mw (AQ)19-EGA> Mw (AQK)10-EGA). Exemple 9. Séquence nucléotidique du gène csp2 codant pour la protéine PS2 de Corynebacterium glutamicum (Figure 12, 13).
Le séquençage d' un fragment de 2702 paires de base contenant le gène codant pour PS2, nommé csp2, et de la région en amont a été réalisé. La séquence nucléotidique est présentée dans la figure 12 (séquence ID n° 2). La figure 13 représente la carte de restriction de cette région séquencée.
Par analyse informatique, une phase ouverte de lecture de 1532 paires de base a été identifiée correspondant à 510 acides aminés.
Une séquence de type Shine Dalgarno a été identifiée, AAGGAG, juste en amont du codon de démarrage de la traduction (-12 à -17).
A I' extrémité NH2 de la protéine se trouve une séquence signal tout à fait banale de bactérie de type Gram-positive de 30 acides aminés. Une séquence d' acides aminés, ile pro ala phe ala, putative d' un site de clivage de séquence signal a été trouvée. La détermination de la séquence amino-terminale de la protéine par la technique de dégradation d' Edman, purifiée à partir du surnageant de culture de Corynebacterium glutamicum, n' a donné aucun signal bien que 5 nmoles de protéine purifiée ait été utilisée. Comme deux protocoles de purification ont été utilisés, il est probable que la protéine PS2 soit bloquée in vivo, tout comme PS 1, et que le blocage ne soit pas une conséquence de la technique de purification utilisée. La séquence signal proposée de 30 acides aminés fait apparaître une glutamine (position 31) comme premier acide aminé de la séquence mature, facilement convertie en acide pyroglutamique rendant impossible le séquençage amino-terminal de la protéine par la technique d' Edman. Cette protéine PS2 possède les caractéristiques des protéines de paroi, comme son caractère très acide (pl=4,1), son absence de résidus cystéine et son très faible contenu en résidus méthionine (Sleytr, U. B. (1978) Regular arrays of macromolecules on bacterial cell walls: structure, chemistry, assembly, and function. Int Rev. Cytol. 53: 1-64.) (Sleytr, U. B. and P. Messner (1983) Crystalline surface layers on bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 37: 311-339.). Les analyses de microscopie électronique confirme que PS2 est bien une protéine de paroi capable de s' arranger en structure hexagonale ordonnée à la surface cellulaire.
Un site putatif de terminateur de type rho indépendant est trouvé dans la région 3' du gène à 76 nucléotides du codon stop.
Les caractéristiques de la séquence sont les suivants: de 562 à 567: site de fixation aux ribosomes
de 579 à 2108: séquence codante
de 579 à 668: séquence signal de protéine sécrétée
de 2188 à 2233: structure en épingle à cheveux, signal putatif de terminaison de transcription de type rho indépendant (présent à 76 nucléotides du codon stop).
Exemple 10. Obtention de souche de Corynebacterium glutamicum ne synthétisant plus PS2. dite PS2-. (Figure 14). L'interruption du gène csp2 a été réalisée chez C. glutamicum dite B . lactofermentum 15 à l'aide du vecteur pCGL830 (Figure 14), vecteur non réplicatif chez les corynébactéries, et portant une copie du gène csp2 inactivé par l'insertion du gène aphlll (clonage du gène aphlll au site unique Nru I de cspl porté par le piasmide pCGL811). Aucun signal de PS2 n'a été mis en évidence par détection immunologique avec des anticorps polyclonaux anti-PS2, sur des extraits cellulaires issus de la souche E. coli TG1 portant le piasmide pCGL830. Par électroporation de la souche B. lactofermentum 15 et sélection sur Km, des clones intégrés ont été sélectionnés. Parmi ces intégrants, les clones Têts ont été obtenus indiquant un événement de double crossing-over conduisant à la substitution du gène sauvage par le gène interrompu.
L'analyse par southem blot de l'ADN chromosomique digéré par Xho I et Sac I des clones Km r Têts en utilisant la sonde pCGL811 montre respectivement un fragment à 4,2kb et 2,2kb au lieu de 2,7kb pour Xho I et de 0,7kb Sac I obtenu pour la souche sauvage, indiquant une augmentation de taille liée à la présence du gène aphlll .
L'absence de détection de PS2 par Western blotting, avec des anticorps polyclonaux anti-PS2, dans les différentes fractions confirme l' interruption du gène csp2 dans B. lactofermentum. Cette souche PS2- est tout à fait viable et n' est affectée en rien dans sa croissance. De même que la région du chromosome de C. glutamicum portant le gène cspl, cette région d' ADN portant le gène csp2 , peut être également utilisée comme cible d' intégration d' ADN étranger sans affecter la croissance de la bactérie. Restauration du phénotype PS2+ dans la souche B. lactofermentum 15 PS2-.
Le fragment Scal-Fspl de 23 kb contenant l' intégralité du gène cspl ainsi que la région d' ADN en amont, a été soϋs-cloné dans le piasmide pCGL824 et réintroduit dans la souche B. lactofermentum 15 PS2-, permettant la restauration du phénotype PS2 +. II est à noter qu' une plus grande quantité de PS2 est obtenue lorsque le gène est en multicopies. Ces résultats montrent que la quantité de produit sécrété issu du gène cspl de C. glutamicum peut être modifiée en fonction du nombre de copies du gène.
Une analyse en microscopie électronique d' un échantillon des souches PS2+ et PS2- (obtenue par la technique énoncée ci-dessus) par cryofracture montre très clairement que la protéine PS2 est effectivement une protéine de paroi capable de s' arranger en structure hexagonale ordonnée à la surface cellulaire. Exemple 11. Effet de la température sur la sécrétion de PS1. (Figure
15 ).
Les bactéries en phase exponentielle de croissance (34°C) ont été marquées par la méthionine 35S durant 1 mn. Du chloramphénicol (100μg/ml) et un excès de méthionine froide (32S) sont alors ajoutés (temps 0). La température de la suspension cellulaire est alors rapidement portée à la température désirée et l' incubation est continuée à la dite température pendant 30 mn. La translocation de PS 1 est déterminée par SDS-PAGE, autoradiographie et quantifiée par densitométrie (Figure 15). La translocation de PS1 est clairement dépendante de la température. Aucune translocation n' a lieu au-dessous de 10°C, elle augmente rapidement au-dessus de cette température pour atteindre un maximum autour de 30°C. La translocation est corrélée à une transition de phase des lipides (figure 15).
Exemple 12. Construction d'une banque d'ADN chromosomique de Corynebacterium melassecola ATCC 17965 et clonage du gène gdhA L'ADN chromosomique de la souche de C. melassecola ATCC 17965 a été préparé suivant la méthode décrite par Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (Eds) (( 1987) Current protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York). Une digestion ménagée par l'endonucléase de restriction Mbo I ( Boehringer ) a été réalisée sur 10 μg de cet ADN en suivant le protocole décrit par Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (( 1982) Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Les fragments d'ADN ont été séparés en fonction de leur taille surgradient de sucrose comme décrit par Ausubel et al. ( 1987). Les fragments d'une taille comprise entre 6 et 15 kb ont été retenus pour la construction de la banque.
Le piasmide de clonage pUN121 (Nilsson B, Uhlen M, Josephson S, Gatenberg S, Philipson L ( 1983) An improved positive sélection plasmid vector constructed by oligonucleotide mediated mutagenesis. Nucleic Acids Res 11 : 8019-8030) a été préparé par la méthode de Birnboim HC, Doly J ((1979) A rapid alkaline extraction procédure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7 : 1513-1523), à partir de la souche de E. coli GM 2929 disponible librement auprès du Dr. B. Bachmann. Le piasmide a été linéarisé par l'endonucléase de restriction Bcl I ( Boehringer ).
La banque a été construite par ligation avec la T4 DNA ligase
(Boehringer) dans les conditions décrites par Ausubel et al. ( 1987), de 1 μg de piasmide pUN121 linéarisé par Bel I et de 2 μg des fragments d'ADN de 6 à 15 kb décrits ci-dessus. Le mélange de ligation a été introduit dans la souche de E. coli DH5 par électroporation en suivant le protocole décrit par Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW ( (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage électroporation. Nucleic Acids Res 16 : 6127-6145). Les clones de E. coli portant les plasmides recombinants ont été sélectionnés directement par leur capacité à croître sur milieu LB contenant 10 μg/ml de tétracycline. Les plasmides de la totalité des clones résistants à la tétracycline ont été préparés par la méthode de Birnboim et Doly ( 1979 ). L'ensemble de ces plasmides correspond à la banque d'ADN. La souche de E. coli CLR207 recA (Mattaj IW, McPherson MJ, Wooton JC (1982) Localization of a strongly conserved section of coding séquence in glutamate dehydrogenase gènes. FEBS Letters 147 : 21-25), déficiente pour l'activité glutamate dehydrogenase a été transformée avec la banque d'ADN de C. melassecola ATCC 17965. Un clone transformant de E. coli CLR 207 recA capable de croître sur milieu minimum de sélection contenant 100 μg/ml d'ampicilline a été sélectionné. Ce clone est porteur d'un piasmide recombinant, pCGL310. L'activité glutamate deshydrogénase mesurée suivant la méthode de Meers JL, Tempest DW, Brown CM ((1970) Glutamine (amide) : 2-oxoglutarate amino transferase oxido-reductase (NADP), an enzyme involved in the synthesis of glutamate by some bacteria. J Gen Microbiol 64 : 187-194), est restorée dans la souche de E. coli CLR207 recA porteuse du piasmide pCGL310. Différents sous-clonages- ont permis dans un premier temps de raccourcir le fragment d'ADN de C. melassecola portant le gène gdhA complet à un fragment d'ADN de 3,8 kb délimité par les sites de restriction Eco RI et Xho I. Une carte de restriction précise de ce fragment Eco RI - Xho I est présentée Fig 16. Des sousclonages supplémentaires ont permis de délimiter plus précisément le gène gdh A à un fragment Nhe I - Bel I de 2,2 kb. Une hybridation ADN- ADN par la méthode de Southern EM ((1975) Détection of spécifie séquences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98 : 503-517), a montré que le fragment d'ADN clone est bien issu de la souche de C. melassecola ATCC 17965. Détermination de la séquence nucléotidique du gène gdh A.
Afin de procéder à la détermination de la séquence nucléotidique du fragment d'ADN Eco RI - Xho I mentionné ci-devant, les sous-clonages suivants ont été effectués :(1) Eco RI - Bgl II dans le vecteur M13 mp18 (Norrander J, Kempe T, Messing J (1983) Construction of improved M13 vectors using oligodeoxy-nucleotide directed mutagenesis. Nucleic Acids Res 26 : 101-106) coupé par Eco RI - Bam HI, (2) Xba. I - Pst I dans le vecteur M13 mp18 coupé par Xba I - Pst 1 , (3) Xho I - Bgl II dans le vecteur M13 mp18 coupé par Sal I - Bam HI, (4) Eco RI - Pst I dans le vecteur M13 mp19 (Norrander et al. , 1983) coupé par Eco RI - Pst I. De la sorte, la séquence nucléotidique complète du fragment Eco RI - Xba I contenu dans le fragment Eco RI - Xho I a pu être déterminée sur les deux brins par la méthode de Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (( 1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463-5467). La séquence complète du fragment Nhe I - Bgl I contenant le gène gdh A est présentée Fig 17 (séquence ID n° 3).
Analyse de la séquence nucléotidique du gène gdh A
L'analyse de la séquence nucléotidique du fragment Nhe I - Bgl I permet de mettre en évidence les éléments suivants :
a) promoteur ( nucléotides 1 à 572 )
Le promoteur du gène gdh A peut être caractérisé en ce qu'il comprend les éléments structurels suivants :
_ nucléotides 251 à 266
signal TGGTCATATCTGTGCG présentant une similitude avec la séquenceTGG(Py)A(Pu)NNNNTTGCA caractéristique des promoteurs reconnus par le facteur σ60 (Merriek MJ (1983) Nitrogen eontrol of the nif regulon in Klebsieila pneumoniae : involvement of the ntr A gène and analogies between ntr C and nif A. EMBO J 2 : 39-44) et régulés par l'ammonium.
_ nucléotides 437 à 442
signal TTCACA présentant une similitude avec la séquence TTGAC(Pu) caractéristique de la zone -35 des promoteurs de Streptomyces sp. (Strohl
WR (( 1992) Compilation and analysis of DNA séquences associated with apparent streptomycete promoters. Nucleic Acids Res 20 : 961-974)
_ nucléotides 466 à 471
signal TAGGAT présentant une similitude avec la séquence TAG(Pu)(Pu)T caractéristique de la zone -10 des promoteurs de Streptomyces sp. ( Strohl,
1992 )
_ nucléotides 558 à 572
signal GGGAACGAGGAAATC présentant une similitude avec la séquence AAAGGAGGTGATC de fixation du ribosome chez Streptomyces sp. ( Strohl,
1992 )
b) séquence codante ( nucléotides 573 à 1913 )
La phase de lecture s'étendant de la position 573 à 1913 correspond à celle de la glutamate deshydrogénase en raison des données suivantes : _ La protéine déduite de cette phase de lecture comporte 447 acides aminés, avec un poids moléculaire prédit de 48957 Daltons. Ce poids moléculaire est très proche de celui du polypeptide ( 48300 D) observé après électrophorèse en gel dénaturant d'une préparation de glutamate deshydrogénase de la souche de C. melassecola ATCC 17965.
_ La structure primaire de la glutamate deshydrogénase déduite de la séquence nucléotidique du gène gdh A de C. melassecola présente de fortes similarités avec les structures primaires de glutamate deshydrogénases d'autres organismes (Teller JK, Smith RJ, McPherson MJ, Engel PC, Guest JR (( 1992) The glutamate dehydrogenase gène of Clostridium symbiosum : cloning by polymerase chain reaction, séquence analysis and over-expression in Escherichia coli. Eur J Biochem 206 : 151- 159).
_ Les acides aminés mentionnés par Baker PJ, Britton KL, Engel PC, Farrants GW, Lilley KS, Rice DW, Stillman TJ ((1992) Subunit assembly and active site location in the structure of glutamate dehydrogenase. Proteins 12 : 75-86) comme étant indispensables à l'activité glutamate deshydrogénase sont présents dans la glutamate deshydrogénase de C. melassecola , et ce à des positions équivalentes à celles décrites par Baker et al. (1992).
_ La structure secondaire de la glutamate deshydrogénase de C. melassecola. déduite de la séquence primaire mentionnée ci-dessus, présente de fortes similarités avec les structures secondaires de glutamate deshydrogénases d'autres organismes ( Teller et al. , 1992 ).
c) teπninateur ( nucléotides 1937 à 1977 )
Le teπninateur du gène gdh A peut être caractérisé en ce qu'il comprend l' élément structurel suivant :
_ séquence CCCTGATCCGCGTTAAGGATCAGGG pouvant former une structure en épingle à cheveux riche en appartements GC avec un ΔG = - 13,6 kcal / mole, suivie de la séquence TTATTTGATTTCTT riche en T. Une telle structure est caractéristique des terminateurs rho-indépendants (Rosenberg M, Court D (1979) Regulatory séquences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Ann Rev Genêt 13 : 319- 353). Régulation de l'expression du gène gdh A de C. melassecola
La régulation de l'expression du gène gdh A de C. melassecola ATCC 17965 a été étudiée par mesure des variations de l'activité spécifique glutamate deshydrogénase en fonction de la nature du milieu dans lequel cette souche a été cultivée. L'activité glutamate deshydrogénase a été mesurée par la méthode de Meers et al. ( 1970) à partir d'extraits acellulaires de C. melassecola obtenus par ultrasonication.
Les milieux de culture utilisés pour cette étude sont des milieux synthétiques dont la base est celle décrite par Liebl W, Klamer R, Schleifer KH ( 1989) (Requirement of chelating eompounds for the growth of
Corynebacterium glutamicum in synthetic média. Appl Microbiol
Biotechnol 32 : 205-210). Les modifications suivantes ont été apportées :
_ La source de carbone est soit du glucose à 11 g/l final ( milieux 1 , 2 et 4 ) soit du fructose à 10 g/l (milieu 3 ).
_ La concentration en ions NH4+ est de 125 mM dans les milieux 1 , 3 et 4. Elle est de 1,25 mM dans le milieu 2 ( limitation en NH4+ ).
_ Le milieu 4 contient 50 g/l final de L-glutamate.
Les activités spécifiques mesurées pour la glutamate deshydrogénase de la souche C. melassecola ATCC 17965 cultivée dans les différents milieux décrits ci-dessus sont données dans le tableau ci- dessous. Les activités sont exprimées en micromoles de NADPH2 transformées par minute et par milligramme de protéines. milieu milieu 1 milieu 2 milieu 3 milieu 4 Act. spécifique GdhA 4,4 +/- 0,3 23,2 +/- 1,1 18,2 +/- 1,8 2,8 +/- 0,2
Ce tableau permet de mettre en évidence les trois types suivants de régulation de l'expression du gène gdh A de C. melassecola ATCC 17965.
_ répression de l'expression par le glutamate ( facteur 1,57 )
_ répression de l'expression par l'excès d'ammonium ( facteur 5,27 )
_ répression catabolique par le glucose ( facteur 4,13 entre fructose et glucose ). Il faut noter que dans le cas de la répression catabolique, les activités enzymatiques isocitrate deshydrogénase, aconitase, citrate synthase sont également touchées. Construction d'un vecteur de fusion gdh A - lac Z
Afin de contrôler chez C. melassecola le caractère transcriptionnel de la régulation du gène gdh A par le glutamate, l'excès d'ammonium et le glucose, et de disposer d'un outil permettant une sélection simple de mutants de C. melassecola non soumis à ces régulations, une construction a été réalisée entre le promoteur et le codon ATG d'initiation de la traduction du gène gdh A et l'opéron lac d' E. coli délété au niveau du gène lacZ de ses cinq premiers acides aminés. Cette fusion a été réalisée comme suit :
_ Isolement d'un fragment Eco RI - Bsp HI contenant le promoteur du gène gdh A.
_ Conversion de l'extrémité Bsp HI en extrémité franche.
_ Clonage du fragment ainsi obtenu dans le vecteur pMC 1403 (Casadaban MJ, Chou J, Cohen SN ( 1980) In vitro gène fusions that join an. enzymatically actice β-galactosidase segment to amino-terminal fragments of exogenous proteins : Escherichia coli plasmid vectors for the détection and cloning of translational initiation signais. J Bacteriol 143 : 971-980) linéarisé par Eco RI et Sma I. donnant naissance au piasmide pCGL 133.
_ Isolement du fragment Nhe I - Sal I de pCGL 133 contenant la fusion promoteur gdh A - opéron lac décrite ci-dessus et clonage dans le vecteur pCGL 241 (Reyes O, Guyonvarch A, Bonamy C, Salti V, David F, Leblon G (1991) "Integron" bearing vectors : a method suitable for stable chromosomal intégration in highly restrictive Corynebacteria. Gène 107 : 61-68) linéarisé par Spe I et Sal I, donnant ainsi naissance au piasmide pCGL 140 (figure 18).
_ Transfert de l'intégron isolé de pCGL 140, contenant la fusion gdhA - lac ainsi que le gène aph III conférant la résistance à la kanamycine, dans le vecteur pCGL 125, donnant naissance à pCGL 141 et pCGL 142 ( Fig. 18 ). Les plasmides pCGL 141 et pCGL 142 ont été introduits dans la souche C. melassecola ATCC 17965 par transformation.
La fonctionalité de la fusion gdh A - lac a été montrée par mise en évidence d'une activité β-galactosidase dans les souches de C. melassecola ATCC 17965 transformées par pCGL 141 et pCGL142, activité absente de la même souche transformée par pCGL 125. L'activité β-galactosidase est mise en évidence par culture des bactéries sur milieu complet solidifié (BHI, Difco ) contenant le substrat chromogène X-gal ( 5-bromo-4-chloro-3- indolyl β-D-galactopyranoside ). Les colonies issues de bactéries possédant l'activité β-galactosidase deviennent bleues sur un tel milieu. Par culture des bactéries transformées par pCGL 141 et pCGL 142 sur les milieux 1, 2, 3 et 4 décrits ci-dessus, solidifiés par adjonction d'agar à 15 g/l final, et supplémentés par de la kanamycine à 25 mg/1 final et du X-Gal à 100 mg/l final, nous avons pu montrer que la régulation du gène gdh A est bien de type transcriptionnel puisque les colonies bactériennes obtenues sur ces différents milieux présentent un gradient de coloration compatible avec la régulation montrée par mesure enzymatique. En effet, les colonies obtenues sur milieu 4, sont d'un bleu plus clair que celles obtenues , dans l'ordre d'intensité croissante, sur les milieux 1, 3 et 2.
Nous avons montré que cette différence se reflétait au niveau de la mesure enzymatique de l'activité β-galactosidase pour des cultures de C . melassecola transformée par pCGL 141 en milieu 1 et milieu 4 ( répression par le glutamate ). milieu milieu 1 milieu 4
Act sp. β-gal. 0,118 0,052 Les activités β-galactosidase ont été mesurées comme décrit par
Miller JH ( 1972) (Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), à partir d'extraits acellulaires de C. melassecola. Sélection de mutants déficients en répression catabolique
Une mutagénèse NTG d'une souche dérivée de C. melassecola ATCC 17965 a été réalisée. A partir de cette mutagénèse, une première sélection a été appliquée sur le critère de résistance à un analogue du glutamate, le 4-fluoroglutamate. Les mutants résistants à cet analogue peuvent appartenir à différentes classes dont la classe de non répression catabolique. En effet, dans de tels mutants, on peut s'attendre à ce que l'élévation d'activité spécifique de la glutamate deshydrogénase conduise à une surproduction de glutamate intracellulaire, et ainsi à une dilution de l'analogue toxique, d'où le phénomène de résistance. Les mutants de résistance au 4-fIuoroglutamate ont été rassemblés et l'ensemble des cellules a été soumis à transformation par pCGL 141. Les bactéries transformées ont été étalées sur milieu 1 solidifié contenant du X-Gal et de la kanamycine. Les colonies bactériennes présentant la couleur bleue la plus intense ont été isolées, et mises en culture en milieu 1 liquide contenant de la kanamycine. L' activité glutamate deshydrogénase a été mesurée à partir d'un extrait acellulaire, l'activité β-galactosidase à partir de cellules entières toluènisées ( Miller, 1972 ). Les résultats obtenus pour l'un des mutants sélectionnés sont présentés ci-dessous. activité glutamate deshydrogénase β-galactosidase
témoin 6,3 10,79
mutant 90 12,1 23,66 Les résultats obtenus montrent donc bien qu'il est possible de sélectionner par crible phénotypique des mutants de régulation du gène gdh A avec l'outil construit. Il faut noter qu'il est très aisé d'éliminer pCGL 141 et pCGL 142 des cellules après sélection, simplement par culture en absence de pression de sélection kanamycine.
Exemple 13. Construction d'un piasmide permettant le clonage de peptides
Pour cette construction, une étape de sous-clonage de celA a été réalisée. Le gène celA disponible sous forme d'un fragment HindIII de 3,5kb contenant la région promotrice, le gène et le début d'un autre gène non identifié, a été sous-cloné sous forme d'un fragment HindlII-EcoRI de 2,6kb délété du morceau de gène inconnu, dans un vecteur réplicatif d'E. coli, le pMTL23 (Chambers, S. P., Prior, S.E., Barstow, D.A. and Minton N.P. (1988) The pMTL nie - cloning vectors. I. Improved pUC polylinker régions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. Gène. 68: 139-149.)
Le site Eco RI a été introduit par mutagénèse dirigée immédiatement derrière le terminateur de transcription du gène. Ce sous-clonage intermédiaire, compte tenu des sites de restriction introduits est nécessaire à l'étape suivante de clonage ; en particulier le clonage dans le polylinker de pMTL23 permet l'introduction d'un site de restriction Ncol juste derrière le site Eco RI, ce qui permet de sortir le fragment contenant la région codante de celA sous forme d'un fragment Nael-Ncol. Cette étape permet également de disposer d'un gène celA dépourvu de séquences non identifiées en 3'.
Le clonage de cel A sous forme d'un fragment HindlII-EcoRI a été réalisé dans le piasmide pMTL23 en utilisant la souche réceptrice d'E. coli TGl. La souche d'E. coli possédant ce piasmide est bien dotée du phénotype CMC+ associé à l'expression de l'EGA ; l'analyse des fragments de restriction obtenus est conforme à ce qui est attendu.
La construction de pPROK-celA (figure 20) est la suivante :
On utilise le piasmide pPROK-1 de 4,6kb disponible chez Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA).
Ce piasmide réplicatif chez E. coli contenant le promoteur tac (Brossius et coll. Gène 27:161, 1984) est hydrolyse par EcoRI-NcoI.
On introduit ensuite dans cette restriction les adaptateurs
DGF1/DGF2 de la figure 19 sous forme EcoRI-Blunt, ces adaptateurs créent le site BstXl. Puis on introduit celA sous forme NaeI(blunt)-NcoI à partir de la construction précédente.
Le piasmide ainsi obtenu est dénommé pPROK-celA. Il comporte le gène celA sous le contrôle du promoteur tac séparé par un site BstXl introduit grâce aux adaptateurs DGF1/DGF2. Exemple 14. Construction d'un piasmide permettant l'expression de séquences AQ multiples
Pour réaliser l'insertion d'une séquence codant pour 20 unités Ala-Gln (AQ) on utilise un deuxième couple d'oligonuciéotides de synthèse dénommés DGF5/DGF6 (figure 1.9) qui correspondent au gène synthétique :
5' CAG[AQ]20CAGGCA 3'
3' CCGTGTC[AQ]20GT 5'
[AQ] représentant la séquence codant pour Ala-Gln.
Les extrémités des séquences de DGF5 et DGF6 sont compatibles avec le site BstXl et la séquence peut donc être clonée dans ce site.
Les séquences d'extrémités de DGF5 et DGF6 sont telles que, d'une part, elles orientent la direction du clonage, et, d'autre part, elles détruisent le site BstXI à la suite du clonage.
L'utilisation d'adaptateurs non phosphorylés évite d'introduire plusieurs gènes synthétiques en tandem.
Après digestion du pPROK-celA (figure 20) par BstXl et ligation du gène synthétique, on obtient : pPROK(AQ)20celA ayant la structure représentée figure 20.
La figure 21 détaille plus particulièrement la structure du site de fusion AQ/EGA et montre l'intérêt du site BstXl utilisé. Ce site est de structure :
CCATGGCAATGG
On constate qu'il comporte un codon de départ ATG ainsi que le codon codant pour l'alanine, GCA et un 2ème codon ATG pour l'insertion d'une méthionine après la séquence codante déterminée.
L'insertion de l'adaptateur DGF5/DGF6 ne peut se faire que dans un sens et n'introduit aucune base étrangère à l'objet visé.
Ce piasmide est traité par BamHI et traité par ligation avec le produit de restriction du piasmide pCGL125 traité par la même enzyme.
Le piasmide pCGL125 (figure 22) est un piasmide fonctionnel de
Brevibacterium lactofermentum 15 comportant une origine de réplication pBLl. Par transformation de ladite souche par , le piasmide (pCGL 125-(AQ)20-celA) (pCGL 1002 figure 1 1) et sélection des souches transformées on obtient une souche selon la présente invention.
Dans toutes les fusions qui sont réalisées, la traduction commence par une méthionine immédiatement suivie par (AQ)20 ; on a également pris la précaution de border (AQ)20 par une méthionine en COOH-terminal ; la détection du polypeptide AQ fusionné ou non à la protéine celA peut se faire grâce à des anticorps spécifiques ou par détection analytique après purification sommaire de la protéine de fusion et hydrolyse au bromure de cyanogène ou inversement. Les propriétés particulières des peptides répétés permettent une séparation aisée.
Les souches citées ont les origines suivantes :
Escherichia coli
. CLR207 recA B. Bachman
. DH5alpha Gibco BRL
. GM2929 B. Bachman
. TG1 Institut Pasteur
Brevibacterium flavum
. ATCC 14067 ATCC
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum)
. 15 S. Bonassie
. ATCC 21086 ATCC
Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium melassecola)
. ATCC 17965 ATCC
La souche DH5alpha est disponible dans le catalogue de
Clontech laboratories n° C 1021-1 (Palo Alto, CA, USA).
Les souches ATCC sont disponibles à American Type Culture Collection c/o Sales and Marketing Département, 12301 Parkiawn Drive, Rockville, MD 20852 USA.
Une souche a été déposée dans la Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris) le 23 juillet 1991 :
. Brevibacterium lactofermentum 15 (CGL2005(B115) sous le n° 1-1126. SEQ ID NO: 1
TYPE DE SEQUENCE: Nucleotide et sa protéine correspondante
LONGEUR DE LA SEQUENCE:2547 paires de bases
NOMBRE DE BRINS: double brin avec une représentation simple brin dans le sens 5'-3'
CONFIGURATION: linéaire
TYPE DE MOLECULE: ADN génomique
ORIGINE
ORGANISME : Corynebacterium melassecola
SOUCHE: ATCC17965
SOURCE EXPERIMENTALE IMMEDIATE: clone pCSPlG
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
de 239 à 244 TACATA (signal -35) (S)
de 269 à 274 TAAGAT (signal -10) (S)
de 405 à 415 GAGAAGGAAAA site de fixation du ribosome (S)
de 420 à 2390 séquence codante (S)
de 420 à 548 peptide signal de protéine sécrétée (S)
de 2455 à.2506 structure en épingle à cheveux signal de terminateur rho dépendant (S)
ACTIVITE BIOLOGIQUE ASSOCIEE : précurseur de la protéine
extracellulaire PS1 de Corynebacterium melassecola et de
Brevibacterium lactofermentum
Homologue du précurseur des protéines du complexe antigénique
extracellulaire 85 de Mycobacterium
AAGCTTCAAGGGGAAAACAAGGGCCTl ATCCGAAGTG
52
ATCCGCGCACTGGGGT GAAGCGGAGGGGCGG 104
TΓTCAGCGAAATGCGAAAAGGTGGAGGGGAAATGCTGCGAGTCTTGCGG 156
ATTCCCGGCGTGGCA AGTCTAAAGTTGAACTTAAGATTGAGGTC 208
ATTCTGAAGTTGTGACCTGCATCAGAAGAGTTACATACCCACATATGTAACC 260 TTCTGGACTAAGATC^CGACΛGACTGAAAATSAACTGAAGACTCTCAAGGCAT 312
AGCCCACGTGTGTTTGTCGGGCCGGAAGCGGGGAACTTTCGGGACGGATCTA 364
ACTCATTGCGGGCCTGTGCGC^GTATCCAAAAATCAAAATGAGAAGGAAAAC 416
TTC ATG CGC GAC ACC GCA TTT CGT TCC ATC AAG GCT AAA 455 Met Arg Asp Thr Ala Phe Arg Ser Ile Lys Ala Lys
GCT CAG GCT AAG CGC CGT TCC CTC TGG ATT GCA GCA GGC 494 Ala Gln Ala Lys Arg Arg Ser Leu Trp Ile Ala Ala Gly
GCT GTC CCA ACC GCA ATT GCG TTG ACT ATG TCC CTG GCA 533 Ala Val Pro Thr Ala Ile Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala
CCT ATG GCT TCG GCT CAG TCC AGC AAC CTT TCC TCT GAT 572 Pro Met Ala Ser Ala Gln Ser Ser Asn Leu Ser Ser Asp
GCC GTA GTT GGC AGC ATC GCG CAG GGC GTC ACC GAT GGC 611 Ala Val Val Gly Ser Ile Ala Gln Gly Val Thr Asp Gly
CTG ACT GAC TAC CTG AAG CCT CGC GTC GAA GAG CTT CCT 650 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Pro Arg Val Glu Glu Leu Pro
GCT GGT GAA GTC ACC TAC CCA GAG ATC GCC GGG CTG CCT 689 Ala Gly Glu Val Thr Tyr Pro Glu Ile Ala Gly Leu Pro
GAT GGT GTG CGC GTG ATC AGC GCT GAG TGG GCA ACC TCC 728 Asp Gly Val Arg Val Ile Ser Ala Glu Trp Ala Thr Ser
AAG CAT GTC ATT TTG ACT ATT CAG TCT GCA GCA ATG CCA 767 Lys His Val Ile Leu Thr Ile Gln Ser Ala Ala Met Pro
GAG CGC CCA ATC AAG GTG CAG CTG CTG CTT CCG CGT GAC 806 Glu Arg Pro Ile Lys Val Gln Leu Leu Leu Pro Arg Asp
TGG TAC TCT TCC CCG AAC CGT GAG TTC CCT GAA ATC TGG 845 Trp Tyr Ser Ser Pro Asn Arg Glu Phe Pro Glu Ile Trp
GCA CTT GAC GGT CTG CGC GCG ATT GAA GAG CAG AGT GGT 884 Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Ile Glu Glu Gln Ser Gly TGG ACC ATT GAG ACC AAC ATT GAG CAG TAC TAC GCC GAT 923 Trp Thr Ile Glu Thr Asn Ile Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp
AAG AAC GCC ATT GTT GTG CTC CCA ATC GGT GGC GAG AGC 962 Lys Asn Ala Ile Val Val Leu Pro Ile Gly Gly Glu Ser
TCC TTC TAC TCT GAC TGG GAA GAG CCA AAC AAC GGC AAG 1001 Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Glu Glu Pro Asn Asn Gly Lys
AAC TAC CAG TGG GAG ACC TTC CTG ACT CAG GAG CTC GCA 1040 Asn Tyr Gln Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu Leu Ala
CCG ATC CTG GAC AAG GGC TTC CGT TCC AAC ACC GAT CGC 1079 Pro Ile Leu Asp Lys Gly Phe Arg Ser Asn Thr Asp Arg
GCC ATC ACC GGT ATC TCC ATG GGC GGT ACC GCT GCG GTT 1118 Ala Ile Thr Gly Ile Ser Met Gly Gly Thr Ala Ala Val
AAC ATC GCA ACC CAC CAC CCA GAC ATG TTT AAG TTC GTC 1157 Asn Ile Ala Thr His His Pro Asp Met Phe Lys Phe Val
GGT TCC TTC TCC GGC TAT CTG GAC ACC ACC TCC GCT GGC 1196 Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Leu Asp Thr Thr Ser Ala Gly
ATG CCA ATC GCT ATT TCC GCA GCC CTG GCA GAC GCC GGC 1235 Met Pro Ile Ala Ile Ser Ala Ala Leu Ala Asp Ala Gly
GGA TAC GAT GCC AAC GCA ATG TGG GGA CCA GTC GGT TCT 1274 Gly Tyr Asp Ala Asn Ala Met Trp Gly Pro Val Gly Ser
GAG CGC TGG CAG GAA AAC GAT CCA AAG AGC AAC GTA GAC 1313 Glu Arg Trp Gln Glu Asn Asp Pro Lys Ser Asn Val Asp
AAG CTC AAG GGC AAG ACC ATC TAC GTT TCC TCT GGT AAC 1352 Lys Leu Lys Gly Lys Thr Ile Tyr Val Ser Ser Gly Asn
GGT GCA GAT GAC TTC GGT AAG GAA GAC TCT GTA GCT ATT 1391 Gly Ala Asp Asp Phe Gly Lys Glu Asp Ser Val Ala Ile
GGA CCT GCA AAC GCG ACA GGT GTC GGT CTG GAA GTT ATC 1430 Gly Pro Ala Asn Ala Thr Gly Val Gly Leu Glu Val Ile
TCC CGT ATG ACT TCC CAG ACC TTC GTC GAT CGT GCA AAC 1469 Ser Arg Met Thr Ser Gln Thr Phe Val Asp Arg Ala Asn
CAG GCT GGC GTG GAA GTT GTT GCT AGC TTC CGT CCA TCC 1508 Gln Ala Gly Val Glu Val Val Ala Ser Phe Arg Pro Ser
GGC GTG CAC TCA TGG GAA TAC TGG CAG TTC GAG ATG ACT 1547 Gly Val His Ser Trp Glu Tyr Trp Gln Phe Glu Met Thr CAG GCG TTC CCT CAC ATC GCT AAC GCT CTT GGC ATG TCC 1586 Gln Ala Phe Pro His Ile Ala Asn Ala Leu Gly Met Ser
ACT GAG GAC CGT GGC GTT GAG TGT GCA CCT GTC GGC GCA 1625 Thr Glu Asp Arg Gly Val Glu Cys Ala Pro Val Gly Ala
ATC GCT GAC GCT GTT GCC GAC GGC GCG ATG GGC ACC TGC 1664 Ile Ala Asp Ala Val Ala Asp Gly Ala Met Gly Thr Cys
CTG ACC AAC GAA TAC GAT GTT ACC GGC GGT AAG GCC CAG 1703 Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Val Thr Gly Gly Lys Ala Gln
GAC TTC GCT AAC GGT CGC GCA TAC TGG TCT GCA AAC ACT 1742 Asp Phe Ala Asn Gly Arg Ala Tyr Trp Ser Ala Asn Thr
GGC GCT TTC GGC CTG GTT GGA CGC ATC AAC GCT CGT TAC 1781 Gly Ala Phe Gly Leu Val Gly Arg Ile Asn Ala Arg Tyr
TCT GAG CTG GGT GGA CCT GAC TCC TGG TTG GGC TAC CCA 1820 Ser Glu Leu Gly Gly Pro Asp Ser Trp Leu Gly Tyr Pro
ACC TCT TCT GAG TTG AAG ACA CCA GAC GGA CGT GGC CGC 1859 Thr Ser Ser Glu Leu Lys Thr Pro Asp Gly Arg Gly Arg
TTC GTC ACC TTC GAG CAC GGC TCC ATC TAC TGG ACC GCC 1898 Phe Val Thr Phe Glu His Gly Ser Ile Tyr Trp Thr Ala
ACC ACT GGT CCT TGG GAA ATC CCA GGC GAT ATG CTC GCC 1937 Thr Thr Gly Pro Trp Glu Ile Pro Gly Asp Met Leu Ala
GCA TGG GGC ACC CAG GAC TAT GAG AAG GGC AGC CTC GGC 1976 Ala Trp Gly Thr Gln Asp Tyr Glu Lys Gly Ser Leu Gly
TAC CCA ACC GGC GCC GCA GTT GAA TAC AAC GGT GGC CTG 2015 Tyr Pro Thr Gly Ala Ala Val Glu Tyr Asn Gly Gly Leu
CGC CAG CAG TTC GAA GGT GGC TAC GTA TTC CGT ACC TCC 2054 Arg Gln Gln Phe Glu Gly Gly Tyr Val Phe Arg Thr Ser
AAT AAC CAG TCT TAC TGG GTT CGC GGA GAA ATC TCC AAG 2093 Asn Asn Gln Ser Tyr Trp Val Arg Gly Glu Ile Ser Lys
AAG TAC GCC GAT GAC GGA ATC TTC GCT CAG CTT GGT TTC 2132 Lys Tyr Ala Asp Asp Gly Ile Phe Ala Gln Leu Gly Phe
CCA ACC GGC AAT GAG AAG TTG ATC AAC GGT GGC GCT TTC 2171 Pro Thr Gly Asn Glu Lys Leu Ile Asn Gly Gly Ala Phe
CAG GAA TTC GAA AAG GGC AAC ATC TAC TGG TCC GTG TCC 2210 Gln Glu Phe Glu Lys Gly Asn Ile Tyr Trp Ser Val Ser ACT GGC GCG CAC GTG ATT CTG CAC GGC GAC ATC TTC GAC 2249 Thr Gly Ala His Val Ile Leu His Gly Asp Ile Phe Asp
GCA TGG GGT GCT AAG GGC TGG GAG CAG GGC GAA TAC GGC 2288 Ala Trp Gly Ala Lys Gly Trp Glu Gln Gly Glu Tyr Gly
TTC CCA ACC TCT GAC CAG ACC GCA ATC ACC GCG GGT GGA 2327 Phe Pro Thr Ser Asp Gln Thr Ala Ile Thr Ala Gly- Gly
CAG ACC ATT GAT TTC CAG AAC GGC ACC ATC CGT CAG GTC 2366 Gln Thr Ile Asp Phe Gln Asn Gly Thr Ile Arg Gln Val
AAT GGC CGA ATT GAG GAG TCT CGC TAATAGTGA AGCGCATCTA 2409 Asn Gly Arg Ile Glu Glu Ser Arg
CGCAACTCTCGCTTCCGGACTTTTGTGCCTGAGCCTTGCTGCTTGTGGGGGA 2461
TGAT ACAGAAA 2513
GCAGCGCTGGGTCAAGCAGCACCGCAAGGTCGAC 2547
SEQ ID NO: 2
TYPE DE SEQUENCE: Nucleotide et sa protéine correspondante
LONGEUR DE LA SEQUENCE : 2702 paires de bases
NOMBRE DE BRINS: double brin avec une représentation simple brin dans le sens 5'-3'
CONFIGURATION: linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADN génomique
ORIGINE
ORGANISME: Corynebacterium melassecola
SOUCHE: ATCC17965
SOURCE EXPERIMENTALE IMMEDIATE: clone pCGL815, pCGL824
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
de 562 à 567 AAGGAG site de fixation du ribosome (S)
de 579 à 2108 séquence codante (S)
de 579 à 668 peptide signal de protéine sécrétée (S)
de 2188 à 2333 structure en épingle à cheveux signal de terminateur de transcription (S)
ACTIVITE BIOLOGIQUE ASSOCIEE :précurseur de la protéine constituant la couche de surface externe de la paroi et de l' antigène
extracellulaire PS2 de Corynebacterium melassecola et de
Brevibacterium lactofermentum.
GAATTCCTGTGAATTAGCCGGTTTAGTACTTTTCAGGGGTGTCTATTCTTAC 52
OIGATCGTCAAGTTGTGGGTAGAGTCACCTGAATATTAATTGCACCGCACGG 104
GTGATATATGCTTATTTGCTCAAGTAGTTCGAGGTTAAGTGTATTTTAGGTG 156
AACAAATTTCAGCTTCGGGTAGAAGACTTTCTATGCGCTTCAGAGCTTCTAT 208
TAGGAAATCTGACACCACTTGATTAAATAGCCTACCCCCGAATTGGGGGATG 260
GGTCATTTTTTGCTGTGAAGGTAGTTTTGATGCATATGACCTGCGTTTATAA 312
AGAAATGTAAACGTGATCAGATCGATATAAAAGAAACAGTTTGTACTCAGGT 364
TTGAAGCATTTTCTCCGATTCGCCTGGC^AAAATCTCAATTGTCGCTTACAG 416
TTTTTCTCAACGACAGGCTGCTAAGCTGCTAGTTCGGTGGCCTAGTGAGTGG 468
CGTTTACTTGGATAAAAGTAATCCCATGTCGTGATCAGCCATTTTGGGTTGT 520
TTCÇATAGCAATCCAAAGGTTTCGTCTTTCGATACCTATTCAAGGAGCCTTC 572
GCCTCT ATG TTT AAC AAC CGT ATC CGC ACT GCA GCT CTT 611
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu
GCT GGT GCA ATC GCA ATC TCC ACC GCA GCT TCC GGC GTT 650 Ala Gly Ala Ile Ala Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val
GCT ATC CCA GCA TTC GCT CAG GAG ACC AAC CCA ACT TTC 689 Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe
AAC ATC ACC AAC GGC TTC AAC GAT GCT GAT GGA TCC ACC 728 Asn Ile Thr Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly Ser Thr
ATC CAG CCA GTT GGC CCT GTT AAC CAC ACC GAG GAA ACC 767 Ile Gln Pro Val Gly Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr
CTC CGC GAC CTG ACT GAC TCC ACC GGC GCT TAC CTG GAA 806 Leu Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu
GAG TTC CAG AAC GGC ACC GTT GAG GAA ATC GTT GAA GCA 845 Glu Phe Gln Asn Gly Thr Val Glu Glu Ile Val Glu Ala
TAC CTG CAG GTT CAG GCT TCC GCA GAC GGA TTC GAT CCT 884 Tyr Leu Gln Val Gln Ala Ser Ala Asp Gly Phe Asp Pro
TCT GAG CAG GCT GCT TAC GAG GCT TTC GAG GCT GCT CGC 923 Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Phe Glu Ala Ala Arg
GTC CGT GCA TCC CAG GAG CTC GCA GCT TCC GCT GAG ACC 962 Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala Glu Thr ATC ACC AAG ACC CGC GAG TCC GTT GCT TAC GCA CTC AAG 1001 Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys
GTT GAC CAG GAA GCT ACC GCT GCT TTC GAG GCA TAC CGC 1040 Val Asp Gln Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Arg
AAC GCA CTT CGC GAT GCA GCT ATC TCT ATC AAC CCA GAT 1079 Asn Ala Leu Arg Asp Ala Ala Ile Ser Ile Asn Pro Asp
GGC TCT ATC AAC CCA GAT ACC TCT ATC AAC CTA CTG ATC 1118 Gly Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Ile Asn Leu Leu Ile
GAT GCT GCT AAC GCT GCT AAC CGC ACC GAT CGT GCA GAG 1157 Asp Ala Ala Asn Ala Ala Asn Arg Thr Asp Arg Ala Glu
ATC GAG GAT TAC GCT CAC CTT TAC ACC CAG ACC GAT ATT 1196 Ile Glu Asp Tyr Ala His Leu Tyr Thr Gln Thr Asp Ile
GCT CTT GAA ACT CCA CAG CTT GCA TAC GCT TTC CAG GAC 1235 Ala Leu Glu Thr Pro Gln Leu Ala Tyr Ala Phe Gln Asp
CTG AAG GCT CTT CAG GCT GAG GTC GAC GCA GAC TTC GAG 1274 Leu Lys Ala Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu
TGG TTG GGC GAG TTC GGA ATC GAC CAG GAA GAC GGT AAC 1313 Trp Leu Gly Glu Phe Gly Ile Asp Gln Glu Asp Gly Asn
TAC GTT CAG CGC TAC CAC CTC CCT GCT GTA GAG GCA CTC 1352 Tyr Val Gln Arg Tyr His Leu Pro Ala Val Glu Ala Leu
AAG GCT GAG GTC GAC GCT CGC GTC GCA GCA ATT GAG CCA 1391 Lys Ala Glu Val Asp Ala Arg Val Ala Ala Ile Glu Pro
CTT CGT GCA GAC TCC ATC GCT AAG AAC CTT GAG GCG CAG 1430 Leu Arg Ala Asp Ser Ile Ala Lys Asn Leu Glu Ala Gln
AAG TCT GAC GTT CTG GTT CGC CAG CTC TTC CTC GAG CGT 1469 Lys Ser Asp Val Leu Val Arg Gln Leu Phe Leu Glu Arg
GCA ACC GCA CAG CGC GAC ACC CTG CGT GTT GTA GAG GCG 1508 Ala Thr Ala Gln Arg Asp Thr Leu Arg Val Val Glu Ala
ATC TTC TCT ACC TCT GCT CGT TAC GTT GAA CTC TAC GAG 1547 Ile Phe Ser Thr Ser Ala Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Glu
AAC GTC GAG AAC GTT AAC GTT GAG AAC AAG ACC CTT CGC 1586 Asn Val Glu Asn Val Asn Val Glu Asn Lys Thr Leu Arg CAG CAC TAC TCT GCG CTG ATC CCT AAC CTC TTC ATC GCA 1625 Gln His Tyr Ser Ala Leu Ile Pro Asn Leu Phe Ile Ala
GCA GTT GCA AAC ATC AGC GAG CTC AAC GCT GCA GAT GCT 1664 Ala Val Ala Asn Ile Ser Glu Leu Asn Ala Ala Asp Ala
GAA GCA GCA GCT TAC TAC CTC CAC TGG GAC ACC GAC CTC 1703 Glu Ala Ala Ala Tyr Tyr Leu His Trp Asp Thr Asp Leu
GCA ACC AAC GAT GAG GAC GAA GCT TAC TAC AAG GCT AAG 1742 Ala Thr Asn Asp Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Lys Ala Lys
CTC GAC TTC GCT ATC GAG ACC TAC GCA AAG ATC CTG TTC 1781 Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr Tyr Ala Lys Ile Leu Phe
AAC GGT GAA GTT TGG CAG GAG CCA CTG GCT TAC GTC CAG 1820 Asn Gly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala Tyr Val Gln
AAC CTG GAT GCA GGC GCA CGT CAG GAA GCA GCT GAC CGT 1859 Asn Leu Asp Ala Gly Ala Arg Gln Glu Ala Ala Asp Arg
GAG GCA GCT CGC GCA GCT GAC GAA GCT TAC CGC GCT GAG 1898 Glu Ala Ala Arg Ala Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Ala Glu
CAG CTC CGC ATC GCT CAG GAA GCA GCT GAC GCT CAG AAG 1937 Gln Leu Arg Ile Ala Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys
GCT ATC GCT GAG GCG CTT GCT AAG GAA GCA GAA GGC AAC 1976 Ala Ile Ala Glu Ala Leu Ala Lys Glu Ala Glu Gly Asn
AAC GAC AAC TCC TCC GAC AAC ACG GAG ACC GGT TCT TCT 2015 Asn Asp Asn Ser Ser Asp Asn Thr Glu Thr Gly Ser Ser
GAC ATC GGA TCC TGG GGA CCT TTC GCA GCA ATT GCA GCT 2054 Asp Ile Gly Ser Trp Gly Pro Phe Ala Ala Ile Ala Ala
ATC ATC GCA GCA ATC GCA GCT ATC TTC CCA TTC CTC TCC 2093 Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser
GGT ATC GTT AAG TTC TAA TTTCGAACCGAGATAGCTAAAAGTTAAA 2139 Gly Ile Val Lys Phe
CCACCTCCTTTCTTGCGGGAGGTGGTTTTTCCCTTGGCTAACAGCACCAAAA 2191
TCT ATTTACTGGG 2243
GAGCCGGAGGTTGGCGTCGATAAGCAAAAATCTTTTGCTTTTAAGGGAACGT 2295 GATAATCGGCTTAATGACTCGCCACTGGCGGAATCCGCAAAGGCATCATTGA 2347 TTTGTTCCAGCGGGTAAGTGCGCACGAGCTTCTCGATCGGGAACTTGCCCTG 2399 GCGCCACAAATGAACCAGGCGAGGGATGAAATCCTGAGGGACGGCGTCGCCC 2451 TCAATGATGGTCTGGAACTTCCAACCACGGACCAGTGACGCGCCAACCTCGA 2503 AGGTAGCTTCCGTGCCAGGGGCAGGGGCGCCGACGAGACCGACGGTACCGTT 2555 GATCGCO^GGAATCGGCTGCTTGCCTGGTCIACGGCCACGACACCAGTTGTA 2607 TCGAGAGCGAATTGCACACCATCGCCGGTCAGTTCCTTGATTTTCTCCGCAG 2659 GATCCTCATCCTTGGAGTTGATCGTGTGGGTAGCTCCGAGCTC 2702
SEQ ID NO: 3
TYPE DE SEQUENCE: Nucleotide et sa protéine correspondante
LONGEUR DE LA SEQUENCE : 2160 paires de bases
NOMBRE DE BRINS: double brin avec une représentation simple brin dans le sens 5' -3'
CONFIGURATION: linéaire
TYPE DE MOLECULE: ADN génomique
ORIGINE
ORGANISME: Corynebacterium melassecola
SOUCHE: ATCC17965
SOURCE EXPERIMENTALE IMMEDIATE: pCGL315, pCGL313,pCGL310
CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
de 251 à 266 TGGTCATATCTGTGCG site de promoteur reconnu par le facteur sigma 60 et régulé par l'ammonium (S)
de 437 à 442 TTCACA signal de promoteur région -35 (S)
de 466 à 471 TAGGAT signal de promoteur région -10 (S)
de 558 à 572 GGGAACGAGGAAATC site de fixation du ribosome (S) de 573 à 1913 séquence codante (S)
de 1937 à 1977 structure en épingle à cheveux signal de terminateur de transcription rho-indépendant (S)
ACTIVITE BIOLOGIQUE ASSOCIEE :activité glutamate deshydrogénase
NADPH dépendante migrant en gel dénaturant comme un polypeptide de
48300d.
GCTAGCCTCGGGAGCTCTAGGAGATTGTGAAAAACGGGTCAAATTTCTCCGA 52
TGCΛGCGCCTATAAAAGTCGTACCAATTCCATTTGAGGGTGCTCAAGTGTGG 104
CCAGGTTATATAACCAGTCAGTCAACTGGTCTCATTCGCTGGTCGGATGAAT 156
TTAATTAAAGAAGAGACTTCATGCAGTTACCGCGCGTTTTGGCGATACACAA 208
TTGATAAACCTAAAGAAATTTTCAAACAATTTTAATTCTTTGTGGTCATATC 260
TGTGCGACACTGCCATAATTGAACGTGAGCATTTACCAGCCTAAATGCCCGC 312
AGTGAGTTAAGTCTCAAAGCAAGAAGTTGCTCTTTAGGGCATCCGTAGTTTA 364
AAACTATTAACCGTTAGGTATGACAAGCCGGTTGATGTGAACGCAGTTTTTA 416
AAAGTTTCΛGGATCΛGATTTTTCACAGGCATTTTGCTCCAGCAAACGCCTAG 468
GATGTACATGGTGCCCTCAATGGGAACCACCAACATCACTAAATGGCCCAGA 520
TACACACTTTAAAATCGTGCGCGCATGCAGCCGAGATGGGAACGAGGAAATC 572
ATG ACA GTT GAT GAG CAG GTC TCT AAC TAT TAC GAC ATG 611 met thr val asp glu gln val ser asn tyr tyr asp met
CTT CTG AAG CGC AAT GCT GGC GAG CCT GAA TTT CAC CAG 650 leu leu lys arg asn ala gly glu pro glu phe his gln
GCA GTG GCA GAG GTT TTG GAA TCT TTG AAG ATC GTC CTG 689 ala val ala glu val leu glu ser leu lys ile val leu
GAA AAG GAC CCT CAT TAC GCT GAT TAC GGT CTC ATC CAG 728 glu lys asp pro his tyr ala asp tyr gly leu ile gln
CGC CTG TGC GAG CCT GAG CGT CAG CTC ATC TTC CGT GTG 767 arg leu cys glu pro glu arg gln leu ile phe arg val
CCT TGG GTT GAT GAC CAG GGC CAG GTC CAC GTC AAC CGT 806 pro trp val asp asp gln gly gln val his val asn arg
GGT TTC CGC GTG CAG TTC AAC TCT GCA CTT GGA CCA TAC 845 gly phe arg val gln phe asn ser ala leu gly pro tyr
AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCA TCT GTA AAC CTG GGC 884 lys gly gly leu arg phe his pro ser val asn leu gly
ATT GTG AAG TTC CTG GGC TTT GAG CAG ATC TTT AAA AAC 923 ile val lys phe leu gly phe glu gln ile phe lys asn
TCC CTA ACC GGC CTG CCA ATC GGT GGT GGC AAG GGT GGA 962 ser leu thr gly leu pro ile gly gly gly lys gly gly TCC GAC TTC GAC CCT AAG GGC AAG TCC GAT CTG GAA ATC 1001 ser asp phe asp pro lys gly lys ser asp leu glu ile
ATG CGT TTC TGC CAG TCC TTC ATG ACC GAG CTG CAC CGC 1040 met arg phe cys gln ser phe met thr glu leu his arg
CAC ATC GGT GAG TAC CGC GAC GTT CCT GCA GGT GAC ATC 1079 his ile gly glu tyr arg asp val pro ala gly asp ile
GGA GTT GGT GGC CGC GAG ATC GGT TAC CTG TTT GGC CAC 1118 gly val gly gly arg glu ile gly tyr leu phe gly his
TAC CGT CGC ATG GCC AAC CAG CAC GAG TCC GGC GTT TTG 1157 tyr arg arg met ala asn gln his glu ser gly val leu
ACC GGT AAG GGC CTG ACC TGG GGT GGA TCC CTG GTC CGC 1196 thr gly lys gly leu thr trp gly gly ser leu val arg
ACC GAG GCA ACT GGC TAC GGC TGC GTT TAC TTC GTG AGT 1235 thr glu ala thr gly tyr gly cys val tyr phe val ser
GAA ATG ATC AAG GCT AAG GGC GAG AGC ATC AGC GGC CAG 1274 glu met ile lys ala lys gly glu ser ile ser gly gln
AAG ATC ATC GTT TCC GGT TCC GGC AAC GTA GCA ACC TAC 1313 lys ile ile val ser gly ser gly asn val ala thr tyr
GCG ATT GAA AAG GCT CAG GAA CTC GGC GCA ACC GTT ATT 1352 ala ile glu lys ala gln glu leu gly ala thr val ile
GGT TTC TCC GAT TCC AGC GGT TGG GTT CAT ACC CCT AAT 1391 gly phe ser asp ser ser gly trp val his thr pro asn
GGC GTT GAC GTG GCT AAG CTC CGC GAA ATC AAG GAA GTT 1430 gly val asp val ala lys leu arg glu ile lys glu val
CGC CGC GCA CGC GTA TCC GTG TAC GCC GAC GAA GTT GAA 1469 arg arg ala arg val ser val tyr ala asp glu val glu
GGC GCA ACC TAC CAC ACC GAC GGG TCC ATC TGG GAT CTC 1508 gly ala thr tyr his thr asp gly ser ile trp asp leu
AAG TGC GAT ATC GCT CTT CCT TGT GCA ACT CAG AAC GAG 1547 lys cys asp ile ala leu pro cys ala thr gln asn glu
CTC AAC GGT GAG AAC GCT AAG ACT CTT GCA GAC AAC GGC 1586 leu asn gly glu asn ala lys thr leu ala asp asn gly
TGC CGT TTC GTT GCT GAA GGC GCG AAC ATG CCT TCC ACC 1625 cys arg phe val ala glu gly ala asn met pro ser thr CCA GAG GCT GTT GAG GTC TTC CGT GAG CGC GAC ATC CGC 1664 pro glu ala val glu val phe arg glu arg asp ile arg
TTC GGA CCA GGC AAG GCA GCT AAC GCT GGT GGC GTT GCA 1703 phe gly pro gly lys ala ala asn ala gly gly val ala
ACC TCC GCT CTG GAG ATG CAG CAG AAC GCT TCG CGC GAT 1742 thr ser ala leu glu met gln gln asn ala ser arg asp
TCC TGG AGC TTC GAG TAC ACC GAC GAG CGC CTC CAG GTG 1781 ser trp ser phe glu tyr thr asp glu arg leu gln val
ATC ATG AAG AAC ATC TTC AAG ACC TGT GCA GAG ACC GCA 1820 ile met lys asn ile phe lys thr cys ala glu thr ala
GCA GAG TAT GGA CAC GAG AAC GAT TAC GTT GTC GGC GCT 1859 ala glu tyr gly his glu asn asp tyr val val gly ala
AAC ATT GCT GGC TTC AAG AAG GTA GCT GAC GCG ATG CTG 1898 asn ile ala gly phe lys lys val ala asp ala met leu
GCA CAG GGC GTC ATC TAA GACCCCTGCACTTTACTTAAACCCCTGA 1944 ala gln gly val ile OCH
TCCGCGTTAAGGATCAGGGATTTTTGATTTCTTCCAGGTCAATTATCCGATC 1996
CACATGGGTTAATGCAGCTGTGCGGTGCGCAATGATGATCACCGTGGTGTCT 2048
TTAAGCGTGGCCAGAGTCTGGGAAAGATCCGCTTGATTGAGCGCATCTTGGT 2100
GGCTGGTGGCTTCATCGACAATCAGTACCTGAGGGGTGCGTGCCAAAGCACG 2152
CGCCAGGCAGAGCCGTTGTTGCTGTCCGCCAGATAGGC 2190
LEGENDES DES FIGURES
FIGURE 8 :
A = p : promoteur de csp 1
s : séquence signal
putative de cspl
m :30 premiers acides
aminés de PS1 mature
FIGURE 9 :
A = p : promoteur de csp1
s : séquence signal putative de csp1
m : 30 premiers acides aminés de PS1 mature
Détail de séquence de 5' en 3'
ACACCGCATTTCGTTCCATCAAGGCTAAAGCTCAGGCTAAGCGCCGTTCCC
TCTGGATTGCAGCAGGCGCTGTCCCAACCGCAATTGCGTTGACTATGTCCC
TGGCACCTATGGCTTCGGCTCAGTCCAGCAACCTTTCCTCTGATGCCGTAG
TTGGCAGCATCGCGCAGGGCGTCACCGATGGCCTGACTGACTACCTGAAG
CCTCGCGTCGAAGACCTGCAGCCCAATTCCATGGCAATGGCCGGCCTGTCG
ACCCCGGCAAACACTGTGTCAGCGGCAGGTGTGCCTTTTAACACAAAATAC
CCCTATGGTCCTACTTCTATTGCCGATAATCAGTCGGAAGTAACTGCAATG
CTCAAAGCAGAATGGGAAGACTGGAAGAGCAAGAGAATTACCTCGAACGGT
GCAGGAGGATA
FIGURE 1 0 :
A = p : promoteur de csp1
s : séquence signal putative de csp1
m : 30 premiers acides aminés de PS1 mature
Détail de séquence de 5' en 3'
CCTΓTCCTCTGATGCCGTAGTTGGCAGCATCGCGCAGGGCGTCACCGATGG
CCTGACTGACTACCTGAAGCCTCGCGTCGAAGACCTGCAGCCCAATTCCAT
GGCACAGAAGGCACAGAAGGCACAGAAGGCACAGAAGGCACAGAAGGCACA
GAAGGCACAGAAGGCACAGAAGGCACAGAAGGCACAGAAGGCAATGGCCGG
CCTGTCGACCCCGGCAAACACTGTGTCAGCGGCAGGTGTG FIGURE 1 1 :
A = p : promoteur de cspl
s : séquence signal putative de cspl
m : 30 premiers acides aminés de PS1 mature
Détail de séquence de 5' en 3'
CCTTTCCTCTGATGCCGTAGTTGGCAGCATCGCGCAGGGCGTCACCGATG
CCTGACTGACTACCTGAAGCCTCGCGTCGAAGACCTGCAGCCCAATTCCA
GGCACAGGCACAGGCTCAGGCCCAGGCACAGGCCCAGGCGCAGGCCCA
CCAGGCTCAGGCACAGGCGCAGGCGCAGGCACAGGCACAGGCTCAGGCG
GGCTCAGGCTCAGGCAATGGCCGGCCTGTCGACCCCGGCAAACACTGTG
AGCGGCAGGT
FIGURE 22 :
Polylinker1: 0.001/Sacll.BstXI.Notl.Xbal.
Polylinker2: 1.531/Clal.Sall.Aatl.Mlul.Ncol.Bglll.Xhol.Stul.Pstl.
Smal.BamHI.Spel.
Polylinker3: 1.561/Xbal.Notl.Sacll.BstXI.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système d'expression et de sécrétion d'un amino-acide, polypeptide ou protéine déterminé par une souche de corynébacterie, caractérisé en ce que la séquence qui code pour ledit amino-acide, polypeptide ou ladite protéine est située dans une région d'ADN chromosomique ou plasmidique où ladite séquence est transcrite avec vers l'extrémité 5' au moins une partie de la séquence codant pour la séquence signal de la protéine PS 1 ou PS2, ladite partie assurant la sécrétion de ladite protéine après traduction lorsque le système est incorporé dans ladite souche de corynébacterie.
2. Système d'expression et de sécrétion dans une corynébacterie comprenant :
- une souche de corynébacterie,
- une cassette de sécrétion contenant une première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression dans ladite souche de corynébacterie, une seconde séquence d'ADN qui code pour un aminoacide, un polypeptide et/ou une protéine, et une troisième séquence d'ADN insérée entre lesdites première et seconde séquences d'ADN qui codent pour des éléments d'une protéine choisie parmi PS 1 ou PS2, qui assurent la- sécrétion desdits amino-acides, polypeptides et/ou protéines de ladite souche de corynébacterie.
3. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la souche de corynébacterie est du genre Brevibacterium.
n. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression comporte un promoteur et un site de fixation- des ribosomes.
5. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la cassette de sécrétion est portée par un piasmide autoréplicatif comportant une origine de réplication fonctionnelle dans la souche de corynébacterie.
6. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la cassette de sécrétion comporte des éléments d'ADN assurant son intégration dans le chromosome de la souche de corynébacterie.
7. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendicatons 1 à 6, caractérisé en ce que la troisième séquence d'ADN comporte tout ou partie de la séquence signal de PS 1 ou PS2.
8. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, une séquence d'arrêt de la traduction, une séquence d'arrêt de la transcription à la fin de la séquence codante et un gène marqueur.
9. Système selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la séquence qui code pour un amino-acide, polypeptide ou protéine déterminé est insérée dans le gène csp1 ou csp2 en phase.
10. Système selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la séquence de PS 1 ou PS2 est tronquée.
11. Système selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'expression et sécrétion de l'amino-acide, polypeptide ou protéine déterminé est régulée par la température, le milieu de culture et la nature des sucres.
12. Système selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la séquence codante est une séquence codante pour un polymère d'un ou plusieurs amino acides répétés.
13. Système selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'unité répétée dans la séquence répétitive contient en position COOH terminale un acide aminé chargé positivement ou négativement.
14. Système selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le caractère ionique du polypeptide permet son isolement.
15. Système selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé ert ce que l'acide aminé chargé permet le clivage par une protease spécifique du polypeptide à son niveau.
16. Système selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'acide aminé chargé peut être enlevé par une carboxypeptidase spécifique.
17. Système selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène celA.
18. Système selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la séquence codante comporte tout ou partie du gène gdhA correspondant à la figure 17.
19. Système selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les séquences d'ADN fonctionnelles pour l'expression sont choisies parmi les éléments d'expression de csp1, csp2 ou gdhA.
20. Système selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'expression dépend de la concentration en sels, métabohtes et sucres.
21. Système selon l'une des revendications 1 à 20, dans lequel le promoteur, avant l'expression de la séquence codante, est choisi parmi les promoteurs de csp1, csp2 ou gdhA.
22. Système selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène lacZ.
23. Souche bactérienne obtenue par la mise en oeuvre du système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 22.
24. Souche selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une corynébacterie.
25. Souche de corynébacterie selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'il s'agit de Brevibacterium.
26. Souche de corynébacterie selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Brevibacterium lactofermentum.
27. Souche de corynébacterie selon l'une des revendications 23 à 26, caractérisée en ce que la protéine déterminée est ancrée sur la paroi par la partie de PS 1 ou PS2 ayant cette fonction d'ancrage.
28. Souche de corynébacterie selon l'une des revendications 23 à 26, caractérisée en ce qu'elle présente les épitopes antigeniques de PS 1 ou PS2 ancrés sur sa paroi.
29V Procédé d'obtention d'un amino-acide, d'un polypeptide, d'une protéine caractérisé en ce que l'on cultive en un milieu de culture une souche de corynébacterie selon l'une des revendications 23 à 28, dans laquelle la seconde séquence d'ADN code pour ledit amino-acide, ledit polypeptide, ladite protéine et en ce que l'on sépare éventuellement après culture ledit produit du milieu de culture et/ou du concentrât bactérien.
30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'on sépare la protéine déterminée fusionnée ou non avec PS 1 ou PS2 des cellules bactériennes par utilisation d'un agent tensio-actif.
31. Protéine comportant tout ou partie de la séquence de PS 1 ou PS2.
32. Protéine comportant les sites antigeniques de PS 1 ou PS2.
33. A titre d'élément antigenique, une protéine selon l'une des revendications 31 et 32.
34. Anticorps dirigés contre PS 1 ou PS2.
EP92917803A 1991-07-30 1992-07-29 Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries Withdrawn EP0551506A1 (fr)

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