JP6183358B2 - 3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の製造方法 - Google Patents
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Description
特許文献1には、3,4−AcAHBAの製造において、副生成物として生じた3,4−AHBAが培養液中において経時的にAPOCに変換されることが記載されている。特許文献1はまた、3,4−AcAHBAを脱アセチル化処理して3,4−AHBAを生成することを開示している。
特許文献2には、griIおよびgriHを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を用いることにより3,4−AHBAが生成されることが開示されている。
非特許文献1には、griIおよびgriHのエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)への導入により3,4−AHBAおよび3,4−AcAHBAが生成されることが開示されている。
非特許文献2には、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてアリールアミン N−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(natA)を欠失させると、培養中に3,4−AcAHBAが生成されなくなることが開示されている。
非特許文献3には、エシェリヒア・コリ由来のN−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(nhoA)の機能として、芳香族アミノ基に対するアセチル化を触媒することが開示されている。一方、非特許文献4には、E.coli BAP1株が3,5−AHBA(3,4−AHBAの構造異性体)の副生物としてN−アセチル化体(3,5−AcAHBA)を生成すること、ならびにE.coli BAP1のnhoA遺伝子欠損株(MAR1株)においても、3,5−AcAHBAが副生するため、NhoAが3,5−AHBAのN−アセチル化の主要な要因ではないと考えられることが開示されている。
〔1〕ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する微生物であって、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)活性が増大するように改変された微生物。
〔2〕前記N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性の増大が、NhoAをコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔1〕の微生物。
〔3〕前記NhoAが、下記(I)〜(III)のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔2〕の微生物:
(I)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(II)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;あるいは
(III)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
〔4〕前記NhoAをコードするDNAが、下記(i)〜(iii)のいずれか一つに記載のDNAである、〔2〕の微生物:
(i)配列番号3に示す塩基配列を含むDNA;
(ii)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;あるいは
(iii)配列番号3に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
〔5〕微生物がエシェリヒア属、パントエア属、またはコリネバクテリウム属に属する、〔1〕〜〔4〕のいずれかの微生物。
〔6〕微生物が、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、またはコリネバクテリウム・グルタミカムに属する、〔1〕〜〔5〕のいずれかの微生物。
〔7〕前記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔1〕〜〔6〕のいずれかの微生物。
〔8〕前記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、GriIおよびGriHである、〔7〕の微生物。
〔9〕前記GriIが、下記(A)〜(C)のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記GriHが、下記(D)〜(F)のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔8〕の微生物:
(A)配列番号9または配列番号18に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)上記(A)に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)上記(A)に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号11または配列番号20に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)上記(D)に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質;
(F)上記(D)に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
〔10〕前記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAが、下記(a)〜(c)のいずれか一つに記載のDNAであり、かつ、griH遺伝子が、下記(d)〜(f)のいずれか一つに記載のDNAである、〔7〕の微生物:
(a)配列番号10または配列番号19の塩基配列を含むDNA;
(b)上記(a)に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c)上記(a)に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するDNA;
(d)配列番号12または配列番号21の塩基配列を含むDNA;
(e)上記(d)に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(f)上記(d)に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するDNA。
〔11〕〔1〕〜〔10〕のいずれかの微生物を培養して、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成することを含む、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
〔12〕以下(1)および(2)を含む、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法:
(1)〔11〕の方法により3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること;および
(2)3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化して、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること。
〔13〕以下(1’)および(2’)を含む、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法:
(1’)〔12〕の方法により3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること;および
(2’)3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化して、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーを得ること。
〔14〕前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、〔13〕の方法。
本発明の微生物は、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)活性を増大させるように改変することにより、3,4−AcAHBAの生成を促進し、その結果、培養液中において3,4−AHBAの蓄積が抑制され得る。NhoA活性とは、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性であり、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸(3,4−AHBA)との関係では、3,4−AHBAから3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸(3,4−AcAHBA)を生成する活性をいう。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
本発明の微生物は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)とアスパラギン酸セミアルデヒド(ASA)から3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸(3,4−AHBA)を生成する活性が増大するように改変されたものであってもよい。このような改変は、例えば、DHAPとASAから3,4−AHBAを生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで所望の微生物を形質転換することにより達成できる。DHAPとASAから3,4−AHBAを生成する活性を有するタンパク質は、DHAPおよびASAからの3,4−AHBAの生成に資するものである限り特に限定されず、例えば、DHAPとASAの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性(以下、アルドラーゼ活性と略することがある)を有するタンパク質、およびDHAPとASAの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたC7化合物の環化を触媒する酵素活性(以下、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性と略することがある)を有するタンパク質が含まれる。以下、両活性を併せて、3,4−AHBA生合成能ということがある。
所望の遺伝子を発現ベクターに導入することによって、本発明に用いられ得る組換えベクターを得ることができる。例えば、nhoA、griIおよびgriHのすべてが用いられる場合、それぞれ発現可能な状態で形質転換体に含まれる限り、それぞれ別の組換えベクターに搭載して形質転換に用いても良いし、nhoA、griIおよびgriHを適当なスペーサーにより連結して、同一の組換えベクターに搭載し、形質転換に用いても良い。また、griIとgriHは同一の微生物に由来する遺伝子であってもよいし、異種微生物に由来する遺伝子であってもよい。同一の微生物に由来する遺伝子であり、griIおよびgriHは染色体上の近接した位置に存在する場合は、griIおよびgriHの双方を含む部位においてDNAを切り出し、ベクターに搭載しても良い。
本発明の微生物は、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸産生能を有し、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)の活性が増大するように改変されている微生物である限り特に限定されないが、好ましくは形質転換体である。本発明の形質転換体は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることが好ましい。
<5−1>3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法
本発明は、本発明の微生物を培養して、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成することを含む、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類は、ジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナー(例、アセチルCoA)から生合成され得る。したがって、微生物は、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナー(例、アセチルCoA)を効率的に供給できる微生物であることが好ましい。また、ジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナーを多量に含有する培地中で、微生物を培養してもよい。
塩としては、カルボン酸のアルカリ金属(例、ナトリウム、カリウム、リチウム)塩、アルカリ土類金属(例、カルシウム、マグネシウム)塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。
本発明はまた、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。本方法は、以下(1)および(2)を含む:
(1)上述した方法より3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること;および
(2)3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化して、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること。
塩としては、カルボン酸のアルカリ金属(例、ナトリウム、カリウム、リチウム)塩、アルカリ土類金属(例、カルシウム、マグネシウム)塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。
本発明はまた、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法を提供する。本方法は、以下(1’)および(2’)を含む:
(1’)上述した方法により3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること;および
(2’)3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化して、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーを得ること。
(1)エシェリヒア・コリのゲノム情報をもとにした3,4−AHBAのN−アセチル化を触媒する酵素の探索
ストレプトマイセス・グリセウスIFO13350株において、アリールアミン N−アセチルトランスフェラーゼ(同意語:NatA;NCBI accession ID:BAF46971.1)が3,4−AHBAのN−アセチル化反応を触媒することが報告されている[Suzuki et. al.,(2007) J.Bacteriol.,189,2155−2159]。NatAのアミノ酸配列を配列番号1に示す。NatAと同様の機能を有する酵素を探索するため、エシェリヒア・コリK−12株のゲノム情報から、NatAと相同性を示す配列を検索した。公開されているデータベース(EcoCyc,http://ecocyc.org/,Keseler et al.,(2005) Nucleic Acids Res.,33,334−337)を利用し、blastpを用いて検索を行った結果、エシェリヒア・コリK−12株のN−ヒドロキシアリルアミン O−アセチルトランスフェラーゼ(同意語:NhoA,EC:2.3.1.118,NCBI accession ID:NP_415980.1)が、ストレプトマイセス・グリセウスIFO13350株由来NatAと49%の相同性を示すことを見出した。NhoAのアミノ酸配列を配列番号2に、NhoAをコードする遺伝子(同意語:nhoA,GenBank accession No.:NC_000913.2、ヌクレオチド1532048〜1532893、GI:947251)の塩基配列を配列番号3に示す。
エシェリヒア・コリでnhoA遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。エシェリヒア・コリBW25113株のゲノムを鋳型として、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付与した配列番号4に示す合成オリゴヌクレオチド、更には3’末端にEcoRIの制限酵素認識配列を付与した配列番号5に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて60秒の反応を30サイクル行った。その結果、nhoA遺伝子のネイティブプロモーターおよびnhoA遺伝子を含む、約1.1kbpのPCR産物を取得した。この断片をEcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpUC19(Takara社製)にクローニングした。得られたベクターをpUC19−NhoAと名付けた。pUC19−NhoAの全長配列を配列番号6に示す。
エシェリヒア・コリに3,4−AHBAの生産能を付与する為の発現用プラスミドpSTV28−Ptac−Ttrpを構築した。始めに、tacプロモーター(同意語:Ptac)領域(deBoer, et al.,(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,21−25)およびエシェリヒア・コリ由来トリプトファンオペロンのターミネーター(同意語Ttrp)領域(Wu et al.,(1978) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,5442−5446)を含み、5’末端にKpnIサイト、3’末端にBamHIサイトを有するDNA断片を化学合成した(塩基配列を配列番号7に示す)。得られたDNA断片をKpnIおよびBamHIにて消化処理し、PtacおよびTtrpを含むDNA断片を得た。精製したDNA断片と、KpnIおよびBamHIで消化処理したpSTV28(タカラバイオ社製)とを、DNA Ligaseによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをpSTV28−Ptac−Ttrpと名付けた(塩基配列を配列番号8に示す)。本プラスミドのPtac下流に目的遺伝子をクローニングすることで、目的遺伝子の発現増幅が可能となる。
ストレプトマイセス・グリセウスIFO13350株において、3,4−AHBAの合成はアルドラーゼ(同意語:SGR_4249,GriI)および3,4−AHBAシンターゼ(同意語:SGR_4248, GriH)からなる3,4−AHBA合成酵素群によって触媒される事が既に知られている(Suzuki et. al.,(2006) J.Biol.Chem.,281,36944−36951)。GriIは、griI遺伝子(GenBank accession no.AB259663.1、ヌクレオチド13956〜14780;GI:117676060)によりコードされている。GriIタンパク質のアミノ酸配列およびgriI遺伝子の塩基配列を、配列番号9および配列番号10にそれぞれ示す。また、GriHは、griH遺伝子(GenBank accession no.AB259663.1、ヌクレオチド12690〜13880; GI:117676059)によりコードされている。GriHタンパク質のアミノ酸配列およびgriH遺伝子の塩基配列を配列番号11および配列番号12にそれぞれ示す。
griI遺伝子およびgriH遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにgriI遺伝子およびgriH遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをEcGriIHと名付けた。EcGriIHの5’末端にEcoRI、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った(配列番号13に示す)。両末端に制限酵素認識配列が付与されたEcGriIHは、EcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpUC57(Genscript社製)にクローニングした。得られたベクターをpUC57−EcGriと名付けた。pUC57−EcGriの全長配列を配列番号14に示す。
エシェリヒア・コリでgriI遺伝子およびgriH遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。pUC57−EcGriを鋳型として、配列番号15に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号16に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて150秒の反応を30サイクル行った。その結果、EcGriIH遺伝子断片を含む、約2.1kbpのPCR産物を取得した。その後、精製されたEcGriIH遺伝子断片と、SmaIで消化処理されたpSTV28−Ptac−Ttrpを、In−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。得られたgriIH遺伝子発現用プラスミドをpSTV28−EcGriと名付けた。pSTV28−EcGriの全長配列を配列番号17に示す。
エシェリヒア・コリBW25113株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpSTV28−EcGriを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて18時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。エシェリヒア・コリBW25113株にpSTV28−EcGriが導入された株をBW25113/pSTV28−EcGri株と名付けた。つぎに、BW25113/pSTV28−EcGri株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpUC19またはpUC19−NhoAを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび100(mg/L)のアンピシリンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて18時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性およびアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。BW25113/pSTV28−EcGri株にpUC19が導入された株をBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株と名付け、BW25113/pSTV28−EcGri株にpUC19−NhoAが導入された株をBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株と名付けた。
BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株、およびBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株を、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび100(mg/L)のアンピシリンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて18時間培養した。得られたプレートから1白金耳分の菌体を、試験管中の、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび100(mg/L)のアンピシリンを含むMSグルコース/Asp培地4mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃にて48時間培養した。MSグルコース/Asp培地の組成は以下の表1に記載のとおりである。
実施例1(7)に記載の、BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株、およびBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株の培養上清液、3,4−AHBA標準品(東京化成工業株式会社製,Cat.No.:A0859)に対する逆相カラムクロマトグラフィーのチャートを図1に示した(分析条件はSuzuki et. al.,(2006) J.Biol.Chem.,281,36944−36951に記載)。BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株の培養上清液中からは3,4−AHBAが検出されず、溶出時間(R.T.) 9.5min.に検出されるピークの高さが、対照であるBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株と比較して増加した。これにより、過剰発現したNhoAによって、3,4−AHBAがR.T.9.5min.に検出される化合物に変換されていることが示唆された。
BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株を培養後の培養上清液中に含まれる3,4−AHBA変換物(R.T.9.5min.)の分子量を、LC/MSで分析した。分析条件は以下のとおりである。
移動相:A=0.1% ギ酸/H2O
B=0.1% ギ酸/アセトニトリル
グラジェントプログラム 0 min. A/B=100/0
3 min. A/B=100/0
23 min. A/B=20/80
25 min. A/B=20/80
流速: 0.2(mL/min.)
カラム温度:室温(25℃)
検出波長: 254nm(PDA)
MSイオン化モード:ESI
分析機種: Agilent Infinity1290(LC)
Agilent Quadrupole LC/MS 6130(MS)
実施例1(7)に記載の、BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株、およびBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株の培養液の600nmでのOptical density(OD)値を、分光光度計(HITACHI U−2900)によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した3,4−AHBA、および3,4−AcAHBAを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した(Suzuki et. al.,(2006) J.Biol.Chem.,281,36944−36951)。培養液の600nmでのOD値、培養上清液中の3,4−AHBA蓄積量および3,4−AcAHBA蓄積量を表2に示した。BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株の培養上清液からは3,4−AHBAが検出されず、対照のBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株の培養上清液と比べて3,4−AcAHBAの蓄積量が増加した。また、BW25113/pSTV28−EcGri/pUC19−NhoA株の培養上清中の3,4−AHBA濃度と3,4−AcAHBA濃度の和は、対照のBW25113/pSTV28−EcGri/pUC19株に対して1.67倍となった。
(1)エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したnspI遺伝子およびnspH遺伝子の化学合成
ストレプトマイセス・ムラヤマエンシスにおいて、3,4−AHBAの合成はアルドラーゼ(同意語:NspI;NCBI accession ID:BAJ08171.1)および3,4−AHBAシンターゼ(同意語:NspH;NCBI accession ID:BAJ08172.1)からなる3,4−AHBA合成酵素群によって触媒される事が既に知られている(Noguchi et. al.,(2010) Nat.Chem.Biol.,6,641−643)。NspIは、nspI遺伝子(GenBank accession no.AB530136、ヌクレオチド8730〜9584;GI:296784943)によりコードされている。NspIタンパク質のアミノ酸配列およびnspI遺伝子の塩基配列を配列番号18および配列番号19にそれぞれ示す。また、NspHは、nspH遺伝子(GenBank accession no.AB530136、ヌクレオチド9599〜10702;GI:296784944)によりコードされている。NspHタンパク質のアミノ酸配列およびnspH遺伝子の塩基配列を配列番号20および配列番号21にそれぞれ示す。
nspI遺伝子およびnspH遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにnspI遺伝子およびnspH遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをEcNspIHと名付けた。EcNspIHの5’末端にEcoRI、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った。両末端に制限酵素認識配列が付与されたEcNspIHは、EcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpUC57(Genscript社製)にクローニングした。
エシェリヒア・コリでnspI遺伝子およびnspH遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。pUC57−EcNspを鋳型として、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて150秒の反応を30サイクル行った。その結果、EcNspIH遺伝子断片を含む、約2.1kbpのPCR産物を取得した。その後、精製されたEcNspIH遺伝子断片と、SmaIで消化処理されたpSTV28−Ptac−Ttrp[実施例1(3)に記載]を、In−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。得られたnspIH遺伝子発現用プラスミドをpSTV28−EcNspと名付けた。
エシェリヒア・コリBW25113株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpSTV28−EcNspを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて18時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。エシェリヒア・コリBW25113株にpSTV28−EcNspが導入された株をBW25113/pSTV28−EcNsp株と名付けた。つぎに、BW25113/pSTV28−EcNsp株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpUC19またはpUC19−NhoA[実施例1(2)に記載]を導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび100(mg/L)のアンピシリンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて18時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性およびアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。BW25113/pSTV28−EcNsp株にpUC19が導入された株をBW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19株と名付け、BW25113/pSTV28−EcNsp株にpUC19−NhoAが導入された株をBW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19−NhoA株と名付けた。
BW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19株、およびBW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19−NhoA株を、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび100(mg/L)のアンピシリンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて18時間培養した。得られたプレートから、1白金耳分の菌体を、試験管中の30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび100(mg/L)のアンピシリンを含むMSグルコース/Asp培地4mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃にて48時間培養した。MSグルコース/Asp培地の組成は表1に記載のとおりである。
培養後、培養液の600nmでのOD値を分光光度計(HITACHI U−2900)によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した3,4−AHBAおよび3,4−AcAHBAを、実施例1と同様に逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した。培養液の600nmでのOD値、培養上清液中の3,4−AHBA蓄積量および3,4−AcAHBA蓄積量を表3に示した。BW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19−NhoA株の培養上清液からは3,4−AHBAが検出されず、対照のBW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19株と比べて3,4−AcAHBAの蓄積量が増加した。また、BW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19−NhoA株の培養上清中の3,4−AHBA濃度と3,4−AcAHBA濃度の和は、対照のBW25113/pSTV28−EcNsp/pUC19株に対して1.69倍となった。
(1)nhoA遺伝子発現用プラスミドの構築
パントエア・アナナティスでnhoA遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。エシェリヒア・コリBW25113株のゲノムを鋳型として、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付与した配列番号4に示す合成オリゴヌクレオチド、更には3’末端にEcoRIの制限酵素認識配列を付与した配列番号5に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて60秒の反応を30サイクル行った。その結果、nhoA遺伝子のネイティブプロモーターおよびnhoA遺伝子断片を含む、約1.1kbpのPCR産物を取得した。この断片をEcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpMW219(Takara社製)にクローニングした。得られたベクターをpMW219−NhoAと名付けた。pMW219−NhoAの全長配列を配列番号22に示す。
パントエア・アナナティスSC17株(特開2006−230202号公報に記載)のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpSTV28−EcGriを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、30℃にて24時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。パントエア・アナナティスSC17株にpSTV28−EcGriが導入された株をSC17/pSTV28−EcGri株と名付けた。つぎに、SC17/pSTV28−EcGri株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpMW219またはpMW219−NhoAを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび50(mg/L)のカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、30℃にて24時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性を示す形質転換体を取得した。SC17/pSTV28−EcGri株にpMW219が導入された株をSC17/pSTV28−EcGri/pMW219株と名付け、SC17/pSTV28−EcGri株にpMW219−NhoAが導入された株をSC17/pSTV28−EcGri/pMW219−NhoA株と名付けた。
SC17/pSTV28−EcGri/pMW219株、およびSC17/pSTV28−EcGri/pMW219−NhoA株を、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび50(mg/L)のカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、30℃にて24時間培養した。得られたプレートから1白金耳分の菌体を、試験管中の、30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび50(mg/L)のカナマイシンを含むMSグルコース/Asp培地4mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃にて32時間培養した。MSグルコース/Asp培地の組成は表1に記載のとおりである。
培養後、培養液の600nmでのOD値を分光光度計(HITACHI U−2900)によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した3,4−AHBAおよび3,4−AcAHBAを、実施例1(9)と同様に逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した。培養液の600nmでのOD値、培養上清液中の3,4−AHBA蓄積量および3,4−AcAHBA蓄積量を表4に示した。SC17/pSTV28−EcGri/pMW219−NhoA株の培養上清液中からは3,4−AHBAは検出されず、対照のSC17/pSTV28−EcGri/pMW219株と比べ3,4−AcAHBAの蓄積量が増加した。また、SC17/pSTV28−EcGri/pMW219−NhoA株の培養上清中の3,4−AHBA濃度と3,4−AcAHBA濃度の和は、対照のSC17/pSTV28−EcGri/pMW219株に対して2.46倍となった。
(1)nhoA遺伝子発現用プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムでnhoA遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。エシェリヒア・コリBW25113株のゲノムを鋳型として、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付与した配列番号4に示す合成オリゴヌクレオチド、更には3’末端にEcoRIの制限酵素認識配列を付与した配列番号5に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて60秒の反応を30サイクル行った。その結果、nhoA遺伝子のネイティブプロモーターおよびnhoA遺伝子断片を含む、約1.1kbpのPCR産物を取得した。この断片をEcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpVC7(特開平9−070291号公報に記載)にクローニングした。得られたベクターをpVC7−NhoAと名付けた。pVC7−NhoAの全長配列を配列番号23に示す。
コリネバクテリウム・グルタミカムでgriI遺伝子およびgriH遺伝子を発現させるために、特開2010−005099号公報に記載のプラスミドpPK4griIHを用いた。pPK4griIHは、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株由来細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーター配列(Peyret et al.,(1993) Mol.Microbiol.,9,97−109)の下流にgriI遺伝子およびgriH遺伝子を接続した配列を含んでおり、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてgriI遺伝子およびgriH遺伝子を効果的に発現可能なプラスミドである。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりpPK4griIHを導入し、25(mg/L)のカナマイシンを含むCMDexプレートに均一に塗布し、30℃にて24時間培養した。CMDexプレートの組成を以下の表5に示す。
ATCC13869/pPK4griIH/pVC7株、およびATCC13869/pPK4griIH/pVC7−NhoA株を、20(mg/L)のカナマイシンおよび5(mg/L)のクロラムフェニコールを含むCMDexプレートに均一に塗布し、30℃にて24時間培養した。得られたプレートから1白金耳分の菌体を、試験管中の、20(mg/L)のカナマイシンおよび5(mg/L)のクロラムフェニコールを含む3,4−AcAHBA生産用培地4mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃にて56時間培養した。3,4−AcAHBA生産用培地の組成は以下の表6に記載のとおりである。
Claims (13)
- ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が非改変株と比較して増大するように改変された3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する微生物であって、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)活性が非改変株と比較して増大するように改変された微生物を培養して、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成することを含む、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
- 前記N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性の増大が、NhoAをコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、請求項1に記載の方法。
- 前記NhoAが、下記(I)〜(III)のいずれか一つに記載のタンパク質である、請求項2に記載の方法:
(I)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(II)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;あるいは
(III)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記NhoAをコードするDNAが、下記(i)または(ii)に記載のDNAである、請求項2に記載の方法:
(i)配列番号3に示す塩基配列を含むDNA;あるいは
(ii)配列番号3に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、N−ヒドロキシアリールアミン O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 微生物がエシェリヒア属、パントエア属、またはコリネバクテリウム属に属する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物が、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、またはコリネバクテリウム・グルタミカムに属する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、GriIおよびGriHである、請求項7に記載の方法。
- 前記GriIが、下記(A)〜(C)のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記GriHが、下記(D)〜(F)のいずれか一つに記載のタンパク質である、請求項8に記載の方法:
(A)配列番号9に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)上記(A)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)上記(A)に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号11に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)上記(D)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質;
(F)上記(D)に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。 - 前記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAがgriI遺伝子およびgriH遺伝子であり、griI遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAであり、かつ、griH遺伝子が、下記(c)または(d)に記載のDNAである、請求項7に記載の方法:
(a)配列番号10の塩基配列を含むDNA;
(b)上記(a)に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するDNA;
(c)配列番号12の塩基配列を含むDNA;
(d)上記(c)に示す塩基配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するDNA。 - 以下(1)および(2)を含む、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法:
(1)請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法により3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること;および
(2)3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化して、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること。 - 以下(1’)および(2’)を含む、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法:
(1’)請求項11に記載の方法により3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること;および
(2’)3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化して、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーを得ること。 - 前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、請求項12に記載の方法。
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