JP4381132B2 - アミノヒドロキシ芳香族カルボン酸の生産に関与する遺伝子およびアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の遺伝子は、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類生合成に関与する遺伝子である。換言すると、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類(以下、「Ac-AHBA類」と略すことがある)の生合成を回復、付与、促進又は調節する機能を有する遺伝子である。
ここでいう、グリキサゾンは
また、配列番号1または配列番号3に記載の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や、又は配列番号1または配列番号3に記載の塩基配列に基づいて作製したプローブを用いたサザンもしくはノーザンハイブリダイゼーションなどを利用して、放線菌などの生物から取得することもできる。
本発明のタンパク質は、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の生合成に関与するタンパク質であって、換言すると、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の生合成を回復、付与、促進又は調節する活性を有するタンパク質である。
組換えベクター
本発明の遺伝子を、発現ベクターであるプラスミドに導入することによって、本発明の組換えベクターを得ることができる。
具体的には、配列番号1で表される塩基配列又はその相補配列又はこれらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子、又は、配列番号3で表される塩基配列又はその相補配列又はこれらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を、適当なプラスミドに導入する。
又は、配列番号1で表される塩基配列又はその相補配列又はこれらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子と、配列番号3で表される塩基配列又はその相補配列又はこれらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子とを共に適当なプラスミドに導入する。
本発明の組換えベクターを適当な宿主細胞に導入して、該宿主細胞の形質転換を行うことによって、本発明の形質転換体を得ることができる。
本発明の遺伝子を適切な発現ベクターに組み込んで組換えベクターとし、該組換えベクターで適切な宿主細胞を形質転換し、次いで該形質転換体を培養し、培地中で生産される3−アミノ−4−ヒドロキシ芳香族カルボン酸類を回収することによって、3−アミノ−4−ヒドロキシ芳香族カルボン酸類を製造することができる。
実施例1
(1)グリキサゾン非生産のUV変異株の取得
約3x106のストレプトマイセス・グリセウスの胞子を10 mlの10%グリセロールに懸濁し、直径9 cmの滅菌したガラスシャーレに入れた。長さ5 cmの細い鉄線をスターラーバーとし、マグネチックスターラーにより撹拌しつつ30 cm上空よりUVランプを50秒照射し、生存率0.5%で変異処理を行った。変異処理した胞子をYMPD寒天培地(酵母エキス0.2%、肉エキス0.2%、ペプトン0.4%、食塩0.5%、MgSO4・7H2O 0.2%、ブドウ糖1%、寒天2% pH7.2)にプレーティングし、28℃で5-7日培養した。
(2)ショットガンクローニングによるグリキサゾン生合成遺伝子群の取得
ストレプトマイセス・グリセウス野生株(IFO13350株)の染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化し、6-10 kbの断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。このDNA断片群と制限酵素BglIIで消化後アルカリフォスファターゼ処理により5'末端の脱リン酸を行った放線菌ベクターpIJ702とをライゲーションした。この染色体DNAライブラリーをM31株に導入して約6000個の形質転換株を得た。
(3)griHおよびgriIの遺伝子解析
取得したグリキサゾン生合成遺伝子群を含むDNA断片の塩基配列をダイデオキシ法(Messing,Methods in Enzynol.,101、20−78、1983)により決定した。配列解析および転写解析等によって、グリキサゾン生合成に関与すると推定される12種の遺伝子が同定され、そのうちの2つの遺伝子をgriHとgriIと命名した。
(4)griHおよびgriIの発現ベクターの構築および形質転換
griIとgriHを含むBglII-SphI3.4 kb 断片を放線菌高コピーベクターpIJ702上のmelCプロモーターの下流のBglII-SphI間に挿入したプラスミドpAYP25を構築した。すなわちgriIとgriHを含むBglII-SphI3.4 kb 断片とBglIIとSphIで消化したpIJ702をライゲーションし、M31株にプロトプラスト法により導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを回収し、制限酵素処理によりプラスミド構築が正しいことを確認した。pAYP25においてはmelCプロモーターによってgriIおよびgriHの転写が引き起こされる。
(5)アセチルアミノヒドロキシ安息香酸類の単離・粗精製
上記、SMM液体培地(100ml)による培養を10本行い合計1000mlの培養液を得た。この培養液を遠心分離し、菌体を沈殿させることによって培養液上清を得た。これに濃塩酸を加えpHを2.5に調整した後、生じた不溶物を遠心分離によって取り除いた。この遠心上清を5gの活性炭粒子(カラムクロマト用)を詰めたカラムに平均速度15ml/分の速度で通した。pH2.5の水溶液で該活性炭カラムを洗浄したのち、500mlの酢酸エチル/メタノール(=1:1)混合溶媒を該活性炭カラムに通し、活性炭に吸着した3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を脱着・溶離させた。この溶出液をロータリーエバポレーターによって濃縮、乾固し、0.41gの乾固物を得た。次いでこの乾固物に水1mlを加えて分散したのち、水不溶性物を遠心分離によって回収した。この水溶性物質を取り除く操作を数回繰り返した後、水不溶性物を減圧乾燥することによって3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の粗精製物を0.23g得た。
実施例1(4)で述べたpAYP25を保持するM31株の培養液を8 umのメンブレンフィルターで濾過し培養上清を得た。培養上清2 lを中性条件で酢酸エチル2 lと混合し、酢酸エチル層と水層を分離した。次に、この水層に塩酸を加えpH2.5にしてから再び酢酸エチル2 lと混合し、酢酸エチル層と水層を分離した(1))。酢酸エチル層には3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸が、水層には3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸が含まれる。
混和している酢酸エチルをロータリーエバポレーターにより除去した1)の水層を凍結乾燥した。得られた固形物を200 mlの水に溶かし、Sep-Pak Vac35cc C18 Cartridgeカラムに供し、非吸着画分および水溶出画分を計900 mlを得た。これを凍結乾燥し得られる固形物約5 gのうち約1 gを水に溶かし、Capcell Pak C18カラムを用いたHPLCにより3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を分取した。溶出には0-12%アセトニトリル(0.1% TFA)のリニアグラジエント(流速4 ml / min, 時間15分)を用いた。溶出画分を凍結乾燥し、3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の白色粉末8.0 mgを得た。
1)の酢酸エチル層をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固した。得られた固形物約3 gのうち約200 mgを20 mlのDMSOに溶解した。水180 mlを加えて10倍に希釈した後、Sep-Pak Vac35cc C18 Cartridgeカラムに吸着させ、20%アセトニトリル溶出画分200 mlを得た。混和しているアセトニトリルをロータリーエバポレーターにより除去したのち凍結乾燥して得られる固形物を3 mlのDMSOに溶かし、Capcell Pak C18カラムを用いたHPLCにより3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を分取した。溶出には10-100%アセトニトリル(0.1% TFA)のリニアグラジエント(流速4 ml / min, 時間20分)を用いた。溶出画分を凍結乾燥し、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の白色粉末40 mgを得た。
(3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸)
実施例2の方法に従い精製した3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸について低分解能ESI-MS測定を行い、m/z 154の(M+H)+イオンが検出された。さらに高分解能ESI-MS測定を行い、m/z 154.0510の(M+H)+イオンが検出され、分子式C7H8NO3が誤差0.6 mDaで算出された。また、プロトンおよびカーボンNMRにより以下の結果が得られ、本化合物が3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸であることが確認された。H-NMR (D2O):( 7.83 (1H, d, J2,6=2Hz, H-2), 6.98(1H, d, J5,6=9Hz, H-5), 7.83 (1H, dd, J2,6=2Hz, J5,6=9Hz, H-6), 13C-NMR (D2O):( 126.45 (C1), 119.11 (C2), 132.83 (C3), 155.42 (C4), 116.80 (C5), 122.78 (C6), 170.21 (-COOH).
(3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸)
実施例2の方法に従い精製した3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸について低分解能ESI-MS測定を行い、m/z 196の(M+H)+イオンが検出された。さらに高分解能ESI-MS測定を行い、m/z 196.0596の(M+H)+イオンが検出され、分子式C9H10NO4が誤差1.4 mDaで算出された。また、プロトンおよびカーボンNMRにより以下の結果が得られ、本化合物が3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸であることが確認された。H-NMR (DMSO-d6):( 8.43 (1H, d, J2,6=2Hz, H-2), 6.92(1H, d, J5,6=8.5Hz, H-5), 7.56 (1H, dd, J2,6=2Hz, J5,6=8.5Hz, H-6), 12.46 (1H, br, -COOH), 2.10(3H, s, -COCH 3), 10.69(1H,s, -NH-), 9.30(1H, s, -OH), 13C-NMR (DMSO-d6): ( 121.37 (C1), 123.75 (C2), 126.24 (C3), 151.99 (C4), 115.12 (C5), 126.47 (C6), 167.25 (-COOH), 169.11(-COCH3), 23.76 (-COCH3)。
実施例1(4)で作製したプラスミドpAYP25をストレプトマイセス・リビダンス野生株にプロトプラスト法により導入した。pAYP25を保持するストレプトマイセス・リビダンス株を100 mlのYMPD液体培地(プラスミド保持のため10 μg / mlのチオストレプトンを含む)で30度2日間前培養し、遠心により集めた菌体をSMM液体培地(ブドウ糖0.9%、L-アスパラギン0.9%、硫安0.2%、食塩0.01%、KH2PO4 0.034%、K2SO4 0.005%、MgSO4・7H2O 0.002%、CaCl2・2H2O 0.001%、微量金属塩溶液1%[40 mg ZnCl2, 200 mg FeCl3・6H2O, 10 mg CuCl2・2H2O, 10 mg MnCl2・4H2O, 10 mg Na2B4O7・10H2O, 10 mg (NH4)6Mo7O24・2H2O / l]、10 mM Trizma base、pH7.2)を用いて2-3回洗浄したのち、100 mlのSMM液体培地に懸濁した。すりガラス製のホモゲナイザーにより菌糸を十分に裁断したのち、1ml分の菌体を新たな100 mlのSMM液体培地に植菌し、30度で3-5日間振とう培養した。
実施例5
攪拌器、温度計および冷却管を装備した反応フラスコに実施例1(5)で得られた0.20gの3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の粗精製物と1規定の塩酸を3.0ml入れ、98℃加熱還流下、2時間撹拌した。反応終了後、反応処理液は薄い褐色を示していた。反応液を室温まで冷却したのち該反応液に活性炭粉末0.15gを入れた。室温で30分間、活性炭粉末を撹拌した後、該活性炭粉末をフィルター濾過することによって無色の上清を回収した。回収した上清をロータリーエバポレーターによって約半分量まで濃縮したのち、10mlのアセトニトリルを加えて晶析させた。この晶析した化合物を遠心分離によって回収し、減圧乾燥を行って白色結晶の3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の塩酸塩を得た。収量0.13g(収率65%)。
実施例6
実施例5において、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸粗精製物を塩酸で脱アセチル化した反応処理液に活性炭粉末0.15gを接触させた後、該活性炭粉末をフィルター濾過することによって得られた該活性炭粉末を数回水洗した。次いで遠心によって水分を除去し、該活性炭粉末にアセトニトリル10mlを加えて十分に撹拌した。その後フィルター濾過することによって活性炭に吸着していた3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を含む溶出液を得た。次いでこの溶出液をロータリーエバポレーターによって濃縮し、着色不純物をわずかに含有する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の塩酸塩を析出させた。収量0.065g(収率32.5%)。
実施例7
攪拌器、温度計および冷却管を装備した反応フラスコに実施例1(5)と同様にして得られた0.21gの3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の粗精製物と2規定の水酸化ナトリウムを2.0ml入れ、98℃加熱還流下、3時間撹拌した。反応終了後、反応処理液は薄い黒褐色を示していた。反応液を室温まで冷却したのち該反応液に活性炭粉末0.2gを入れた。室温で30分間、活性炭粉末を撹拌した後、該活性炭をフィルター濾過することよって無色の上清を回収した。回収した上清をロータリーエバポレーターによって約1/3量まで濃縮したのち、10mlのアセトニトリルを加えて晶析させた。この晶析した化合物を遠心分離によって回収し、減圧乾燥を行って白色粉末の3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を得た。収量0.09g(収率42.8%)。
実施例8
攪拌器、温度計および冷却管を装備した反応フラスコに実施例1(5)と同様にして得られた0.20gの3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の粗精製物と2規定の水酸化ナトリウムを2.0ml入れ、98℃加熱還流下、3時間撹拌した。反応終了後、反応処理液は薄い黒褐色を示していた。反応液を室温まで冷却したのち1規定の塩酸を4.0mlを加えた。次いで該反応液に活性炭粉末0.2gを入れた。室温で30分間、活性炭粉末を撹拌した後、該活性炭粉末をフィルター濾過することによって得られた該活性炭粉末を数回水洗した。次いで遠心によって水分を除去し、該活性炭粉末にアセトニトリル10mlを加えて十分に撹拌した。その後フィルター濾過することによって活性炭に吸着していた3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を含む溶出液を得た。この溶出液をロータリーエバポレーターによって約1/3量まで濃縮したのち、10mlのアセトニトリルを加えて晶析させた。この晶析した化合物を遠心分離によって回収し、減圧乾燥を行って白色結晶の3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の塩酸塩を得た。収量0.08g(収率40.0%)。
Claims (21)
- 配列番号1で表される塩基配列、又は配列番号1で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを含む3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類生合成遺伝子。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類生合成関連タンパク質。
- 請求項1記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項3記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
- 配列番号3で表される塩基配列、又は配列番号3で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを含む3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類生合成遺伝子。
- 配列番号4で表されるアミノ酸配列、又は配列番号4で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類生合成関連タンパク質。
- 請求項5記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
- 請求項3に記載の組換えベクター又は請求項7に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体を適当な培地中で培養して、該形質転換体が生産する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を回収することを含む3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の生産方法。
- 請求項3に記載の組換えベクター及び請求項7に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体を適当な培地中で培養して、該形質転換体が生産する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を回収することを含む3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の生産方法。
- 請求項1に記載の遺伝子及び請求項5に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項11に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
- 請求項11に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体を適当な培地中で培養して、該形質転換体が生産する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を回収することを含む3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の生産方法。
- 請求項11に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体を適当な培地中で培養して3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を得、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化処理することを特徴とする3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
- 請求項11に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体を適当な培地中で培養して3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を得、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化処理する工程と、該反応処理液を多孔性吸着剤に接触させる工程と、該多孔性吸着剤によって不純物が除去された溶液を晶析または沈殿させる工程からなることを特徴とする3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
- 請求項11に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体を適当な培地中で培養して3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸を得、3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化処理する工程と、該反応処理液を多孔性吸着剤に接触させた後、該多孔性吸着剤に極性有機溶媒を接触させて3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を優先的に溶離させ、該溶離液を晶析または沈殿させることを特徴とする3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の製造方法。
- 多孔性吸着剤が活性炭、芳香族系合成吸着剤から選ばれる少なくとも1種以上の疎水性の多孔性吸着剤であることを特徴とする請求項15ないし16記載の方法。
- 3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化処理した後、該処理液に酸類を加える工程を含むことを特徴とする請求項14ないし16記載の方法。
- 脱アセチル化処理が酸類を含む水溶液中で加熱処理することを特徴とする請求項14ないし16記載の方法。
- 酸類が塩酸、リン酸、硫酸、硝酸から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項18ないし19記載の方法。
- 3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸類がアミノヒドロキシ安息香酸の塩化合物であることを特徴とする請求項18ないし20記載の方法。
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