KR20200045978A - 신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 - Google Patents

신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 Download PDF

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이승구
이혜원
권길광
박성현
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이진영
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 신규한 알코올 탈수소효소에 관한 것으로서, 리시니바실러스(Lysinibacillus) 속 미생물로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소, 및 이를 암호화 하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 알코올 탈수소효소는 종래의 효소들에 비해 친환경적이면서도 높은 수율로 알데히드 화합물을 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법{A Novel Alcohol Dehydrogenase and Mutants thereof, and A Method for Preparing Aldehyde Compounds Using The Same}
본 발명은 신규한 알코올 탈수소효소 및 그 돌연변이체에 관한 것이다.
일반적으로 알데히드 화합물은 목표 물질을 합성하기 위한 중간 화합물로 주로 사용되는 물질이다. 주로, 합성하고자 하는 물질 내의 알코올기를 알데히드기로 선택적으로 치환하는 반응을 진행하여 목표 물질을 합성하게 된다. 이러한 선택적인 치환 반응을 일으킬 수 있는 합성 방법은 이미 공지되어 있고, 다양한 분야에서 실제로 적용 또는 응용하여 사용하고 있다.
알데히드 화합물을 생산하는 방법은 크게 화학적 합성법과 효소나 미생물을 이용하는 생물학적 합성법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 따른 알코올의 산화에 의한 알데히드 화합물의 제조 과정의 경우에는 산화가 과하게 진행됨에 따라 카르복시산이 생성되는 것을 방지하기 위해 생성된 알데히드 화합물을 즉시 반응계 외에 취출하거나, 알데히드를 즉시 안정적이고 재생하기 쉬운 유도체로 바꾸거나, 또는 불활성 용매 중에서 산화 반응을 수행하는 등의 과정이 필요하고, 위험한 시약이나 고가의 촉매를 이용하여야 할 뿐만 아니라, 반응 조건이 엄격하다는 등의 문제점이 있었다. 그에 비해, 생물학적인 합성 방법은 알데히드 화합물을 간단한 공정으로 직접 생산할 수 있기 때문에, 위와 같은 문제점을 가지고 있는 화학적 합성법을 대체할 수 있는 생산기술로서 주목 받고 있다.
상기와 같은 생물학적 합성 방법에는 관련 효소의 개발이 필수적이라고 할 것인데, 이에 관여하는 효소의 하나로 알코올을 산화시켜 알데히드 화합물로 전환시키는 활성을 갖는 촉매인 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)가 있다. 그런데, 위와 같은 알코올 탈수소효소는 알코올을 산화시켜 알데히드 화합물로 전환시키기도 하지만, 가역적으로 알데히드 화합물을 알코올로 다시 환원시키는 활성도 함께 가지고 있어서, 종래 알려진 알코올 탈수소효소는 그 활성이 충분하지 못하여 알데히드 화합물의 생산량이 매우 적고, 그래서 산업적으로 이용하기에는 불충분한 문제점이 있다.
이에, 보다 활성이 우수한 신규의 알코올 탈수소효소에 관한 연구·개발이 더욱 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 종래에 비해 우수한 효율로 알데히드 화합물을 생성해 낼 수 있는 신규의 효소와 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다른 측면은 상기 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또 다른 측면은 상기 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 알코올 탈수소효소를 포함하는 상기 알데히드 화합물 생산용 조성물, 및 상기 알코올 탈수소효소를 알코올과 함께 반응시키는 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 알데히드 화합물 생산 방법을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 알코올이 존재하는 환경에서 배양하는 단계를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 알코올 탈수소효소는 알코올을 기질로 알데히드 화합물을 생성함에 있어 독성 물질이나 환경오염을 유발하는 부산물이 발생하지 않을 뿐만 아니라, 비활성도(specific activity)가 종래 알려진 효소들에 비하여 현저하게 우수한바, 알데히드 화합물을 친환경적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PGAE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의한 알데히드 화합물의 전환 정도를, NADH/NAD의 산화/환원 정도로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 금속 양이온의 종류(A)와 금속 양이온의 농도(B)를 확인한 그래프이다.
도 4는 온도가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 5는 pH가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 6은 메탄올과 에탄올을 기질로 이용하는 경우에, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 동역학적 특성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소의 돌연변이체들의 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올에 대한 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 ‘알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)’는 하기 반응식과 같이 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 활성을 가진 효소를 의미한다.
[반응식]
Figure pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 알코올 탈수소효소 및 그 유전자
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 알코올 탈수소효소를 암호화하는 알코올 탈수소효소의 유전자를 제공한다.
본 발명의 알코올 탈수소효소는 리시니바실러스(Lysinibacillus) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 리시니바실러스 실라니리티쿠스(Lysinibacillus xylanilyticus)로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 발명의 알코올 탈수소효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 알코올 탈수소효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 알코올 탈수소효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
일 구현예에서, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열이나 서열번호 9의 아미노산 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 164번째 알라닌(alanine) 및 364번째 시스테인(cysteine) 중 적어도 하나에 변이가 발생한 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 상기 164번째 알라닌과 364번째 시스테인 중 적어도 하나는 각각 독립적으로 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 티로신(tyrosine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있고, 보다 구체적으로 상기 164번째 알라닌과 364번째 시스테인 중 적어도 하나는 각각 독립적으로 발린, 이소류신, 류신 및 페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있으며, 예컨대 상기 164번째 알라닌과 364번째 시스테인 중 적어도 하나는 각각 독립적으로 페닐알라닌으로 치환된 것일 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 164번째 알라닌이 페닐알라닌으로 치환된 서열번호 11의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 364번째 시스테인이 페닐알라닌으로 치환된 서열번호 13의 아미노산 서열일 수 있다.
상기 알코올 탈수소효소의 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 알코올 탈수소효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 알코올 탈수소효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 알코올 탈수소효소에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소는 상기 알코올 탈수소효소의 돌연변이체일 수 있다.
상기 알코올 탈수소효소의 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 특정 잔기가 변형된 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있고, 상기 돌연변이체는 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소의 101번째 세린(S), 141번째 트레오닌(T), 및 164번째 아스파라긴(N) 중 적어도 하나는 각각 독립적으로 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 알코올 탈수소효소의 돌연변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소의 101번째 아미노산 세린(S)을 각각 글리신(G), 발린(V) 또는 류신(L)으로 변환시킨 돌연변이체이거나, 141번째 아미노산 트레오닌(T)을 각각 세린(S), 알라닌(A), 이소류신(I) 또는 아스파라긴(N)으로 변환시킨 돌연변이체이거나, 164번째 아미노산 알라닌(A)을 류신(L), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 글루타민(Q) 또는 글루탐산(E)으로 치환된 것일 수 있다.
상기 알코올 탈수소효소는 알코올, 특히 저급 알코올을 기질로 하고, 상기 저급 알코올은 탄소수 1 내지 6, 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올일 수 있으며, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 리시니바실러스 실라니리티쿠스(Lysinibacillus xylanilyticus)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 알코올 탈수소효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였고(표 1 및 도 2 참고), 상기 서열번호 1 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 경우에도 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 마찬가지로 알코올 탈수소효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다.
2. 알코올 탈수소효소의 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 알코올 탈수소효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 알코올 탈수소효소의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 알코올 탈수소효소를 생산하고자하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 알코올 탈수소효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 알코올 탈수소효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 알코올 탈수소효소 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 알코올 탈수소효소 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질 전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 알코올 탈수소효소는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 알코올 탈수소효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.
3. 알코올 탈수소효소의 생산 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 알코올 탈수소효소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 알코올 탈수소효소 생산 방법은 1) 본 발명의 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 알코올 탈수소효소 유전자의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 알코올 탈수소효소를 분리하는 단계;를 포함한다.
상기 단계 1)의 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 알코올 탈수소효소의 정제 또는 원래 형태의 알코올 탈수소효소의 수득이 가능할 수 있다.
상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.
상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 알코올 탈수소효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 알코올 탈수소효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.
본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 알코올 탈수소효소의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 알코올 탈수소효소의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
4. 알데히드 화합물의 생산 방법 및 알데히드 화합물 생산용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 알코올 탈수소효소를 이용하여 알코올로부터 알데히드 화합물을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 알데히드 화합물의 생산에 이용되는 알데히드 화합물 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 알데히드 화합물 생산용 조성물은 본 발명의 알코올 탈수소효소를 포함한다.
또한, 본 발명의 알데히드 화합물의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 알코올 탈수소효소를 알코올과 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 알데히드 화합물의 생산 방법 및 알데히드 화합물 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 알코올 탈수소효소의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 알코올 탈수소효소를 이용하여 그 기질인 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 알코올의 종류에 따라 생성되는 알데히드 화합물의 종류 또한 달라지는 것이고, 저급 알코올을 기질로 이용하는 경우 저급 알데히드 화합물이 생성된다. 예컨대, 기질로 메탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 포름알데히드가 생성되고, 기질로 에탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 아세트알데히드가 생성되는 것이다.
상기 단계 1)의 반응은 20℃ 내지 55℃의 온도 범위, 바람직하게는 22℃ 내지 45℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 7 내지 10의 pH 범위, 바람직하게는 8 내지 9.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 8.5 내지 9의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 알코올 탈수소효소의 활성을 향상시키기 위해 상기 알코올 탈수소효소와 함께 금속 양이온이 함께 포함될 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 마그네슘 양이온일 수 있다.
상기 단계 1)의 반응에서, 기질인 상기 알코올은 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 알코올은 목적하는 알데히드 화합물의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 상기 알코올의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 알코올이 연속적으로 주입되는 경우, 상기 알코올 탈수소효소에 의하여 알데히드 화합물을 지속적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 알코올 탈수소효소에 의하여 알코올로부터 알데히드 화합물이 생산됨을 확인하였고(도 2 참조), 이러한 알코올 탈수소효소의 효소 활성이, 마그네슘 양이온의 첨가에 의해, 50~60℃에 가까운 온도에서 반응을 수행할수록, 그리고 9.0~10.0에 가까운 pH에서 반응을 수행할수록 더욱 향상됨을 확인하였다(도 3 내지 도 5 참고).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 알데히드 화합물을 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 알데히드 화합물의 인 비보(in vivo) 생산 방법은 1) 상기 형질전환체를 알코올이 공급되는 환경 하에서 배양하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 배양물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계;를 포함한다.
상기 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법은 형질전환체 내에서 발현되는 본 발명의 알코올 탈수소효소의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 알코올 탈수소효소를 이용하여 그 기질인 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 알코올의 종류에 따라 생성되는 알데히드 화합물의 종류 또한 달라지는 것이고, 저급 알코올을 기질로 이용하는 경우 저급 알데히드 화합물이 생성된다. 예컨대, 기질로 메탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 포름알데히드가 생성되고, 기질로 에탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 아세트알데히드가 생성되는 것이다.
상기 알코올이 공급되는 환경은 외부에서 인위적으로 알코올을 공급해 주거나 배양에 이용되는 배지 내에 알코올을 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 알코올이 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 알코올이 생산되는 환경은 상기 알코올의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 60℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 알데히드 화합물의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.
또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 10에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 8.5 내지 pH 10에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질 전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장하기 어렵기 때문에 알데히드 화합물의 발현이 용이하지 않아 알데히드 화합물의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리
[1-1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환
리시니바실러스 실라니리티쿠스(Lysinibacillus xylanilyticus)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 다음 표 1과 같이 서열번호 3 내지 6의 프라이머를 각각 설계하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5‘->3’)
3(Lxmdh-F) 정방향 프라이머 agcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgtcagacgttctaaagcaatttgtaa
4(Lxmdh-R) 역방향 프라이머 ctttcgggctttgttagcagccggatcctcgagttaagaaagtgcgacagcttcaagtgactctT
5(pET28a-F) 정방향 프라이머 aagagtcacttgaagctgtcgcactttcttaactcgaggatccggctgctaacaaagcccgaaag
6(pET28a-R) 역방향 프라이머 ttacaaattgctttagaacgtctgacatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgcT
㈜바이오니아에 의뢰하여 서열번호 2의 염기 서열의 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. Gibson assembly (New England Biolabs, 미국)를 이용하여 상기와 같이 증폭된 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을, 서열번호 5, 6의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 플라스미드 벡터 pET28a(+) (Novagen, 미국)의 다중 클로닝 자리에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
[1-2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 3㎖의 LK 고체 배지(LB 배지+25㎎/㎖ 카나마이신)에 선접종하고 37℃에서 10시간 이상 배양하였다. 고체 배지에 나타나는 하나의 콜로니를 단집락 분리 과정으로 3㎖의 LK 고체 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37℃의 진탕 배양기로 18시간 동안 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액 2㎖를 200㎖의 LK 배지가 포함된 1000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 18℃로 조정하여 20시간 동안 배양하였다.
또한, 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 50㎖의 코니칼 튜브(conical tube, SPL Life Sciences Co., Ltd., 한국)에 분주하고, 4℃에서 4000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리해 낸 펠렛에 프로피니아 1X 용해 완충용액(Profinia 1X Lysis buffer, Bio-Rad Laboratories, 미국) 10㎖를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4℃에서 14000rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kit® His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그라피(Fast Protein Liquid Chromatography)(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag이 붙어 있는 42.81kDa의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인
본 발명자들은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 하기 반응식과 같은 ‘알코올 탈수소효소’로서의 활성을 가질 것으로 예상하고, 이를 확인하였다.
[반응식]
Figure pat00002
구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1㎎/㎖를 500mM의 메탄올과 함께, 5mM의 NAD와 10mM의 MgCl2가 포함된 50mM의 CHES 완충 용액(pH 9.5)에 첨가하고, 55℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, NADH의 생성량을 형광플레이트 리더기를 통하여 확인하였다(fluorescent emission 445nm/340nm).
그 결과, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는, 알코올 탈수소효소로서의 활성을 가짐을 확인하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건에 관한 연구
본 발명자들은, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 알코올 탈수소효소로서 작용함에 그 활성에 영향을 미치는 조건들에 대하여 연구를 진행하였고, 그로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 활성 조건을 도출하였다.
[3-1] 금속 양이온의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, NAD 5 mM 및 메탄올 500mM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 10mM의 EDTA 또는 금속 양이온(Mg2+, Mn2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+, Co2+)과 함께 첨가하여 55℃에서 10분 동안 반응시키고, NADH 생성량을 측정하여, 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 여러 종류의 금속 양이온 중 마그네슘 양이온이 첨가된 경우에 알코올 탈수소효소의 활성이 향상되는 것으로 확인되었다(도 3의 (A)).
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1㎎/㎖, NAD 5 mM 및 메탄올 500mM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 마그네슘 양이온을 0mM, 0.5mM, 1.0mM, 2.5mM, 5mM, 7mM 또는 10mM의 함량으로 각각 첨가하여 55℃에서 10분 동안 반응시키고, NADH 생성량을 측정하여, 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 마그네슘 양이온의 농도가 증가할수록 더욱 우수한 알코올 탈수소효소 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3의 (B)).
[3-2] 온도의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1㎎/㎖, NAD 5mM, 메탄올 500mM 및 10 mM의 Mn2+가 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 첨가한 다음, 25℃ 내지 70℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응시키고, 10분 동안 반응시키고, NADH 생성량을 측정하여, 그 상대값을 비교하였다. 그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 55℃에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 4).
[3-3] pH의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0. 1㎎/㎖, NAD 5 mM, 메탄올 500mM 및 Mn2+ 10 mM와 함께, 각각 pH 7.5 내지 8.0의 HEPES 완충 용액, pH 8.0 내지 8.5의 EPPS 완충 용액 또는 pH 8.5 내지 10의 CHES 완충 용액에 각각 첨가하여, pH 7.5 내지 10의 범위에서 각각 반응시켰다. 상기 효소 반응은 NADH 생성량을 측정하여, 그 상대값을 비교하였다. 그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 pH가 9.0~10.0에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 5).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 비활성도 및 동역학적 특성 분석
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1㎎/㎖, NAD 5 mM 및 Mn2+ 10 mM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올을 각각 500mM의 함량으로 첨가하여 55℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 10분 동안 반응시키고, NADH 생성량을 측정하여, 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 기질인 알코올의 종류에 따라 약 100 내지 200 U/㎎의 비활성도(specific activity)를 갖는 것으로 확인되었다.
기질 비활성도(specific activity, U/㎎)
메탄올 103.1±2.4
에탄올 118.9±5.3
프로판올 146.3±2.6
부탄올 180.8±10.6
아울러, 기질로 메탄올과 에탄올을 이용하는 경우에, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 동역학적 특성을 분석하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.1㎎/㎖, NAD 5 mM 및 Mn2+ 10 mM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 메탄올, 에탄올, 각각 다양한 농도(0.1-500mM)의 함량으로 첨가하여 55℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 10분 동안 반응시키고, NADH 생성량을 측정하여 활성을 측정한 후, 마이켈리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten Equation)에 의하여 기질 친화도 및 효소 turnover number(kcat)를 계산하여, 그 결과를 아래 표 3 및 도 6에 나타내었다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 메탄올에 대한 기질 친화도는 약 2mM로써 기존에 보고된 메탄올 디하이드로게나아제 (최저 기질 친화도= 30mM) 중 가장 메탄올에 대한 친화도가 높은 것으로 확인되었다.
메탄올 에탄올
Km (mM) 1.9±0.2 0.7±0
Kcat (min -1 ) 17.3±0.2 23.2±1.8
Kcat/Km 9.2±0.8 33.1±2.7
서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인
상기와 같이 알코올 탈 수소효소로서의 활성이 확인된 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 하기와 같이 그 활성을 확인하였다.
[5-1] 서열번호 7, 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리 및 정제
서열번호 1의 아미노산 서열과 92%의 상동성을 갖는 서열번호 7의 아미노산 서열과 서열번호 1의 아미노산 서열과 91%의 상동성을 갖는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 각각 서열번호 8의 염기 서열과 서열번호 10의 염기 서열을 기초로, 다음 표 4와 같이 서열번호 15 내지 22의 프라이머를 각각 설계하였고, 상기 실시예 [1-1] 및 [1-2]에서와 동일한 방법으로 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상기 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 클로닝하고, 각각 분리 및 정제하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5‘->3’)
15(LCMDH-F) 정방향 프라이머 ggcctggtgccgcgcggcagccatatgtctgacgttctgaaacagttc
16(LCMDH-R) 역방향 프라이머 cagtggtggtggtggtggtgctcgagctaagaaacggtaacggtttcacgct
17(pET28a-LCMDH-F) 정방향 프라이머 agcgtgaaaccgttaccgtttcttagctcgagcaccaccaccaccaccactg
18(pET28a-LCMDH-R) 역방향 프라이머 gaactgtttcagaacgtcagacatatggctgccgcgcggcaccaggcc
19(BCLR-F) 정방향 프라이머 agcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgtctgacgttctgaaacagttcgttatg
20(BCLR-R) 역방향 프라이머 cagtggtggtggtggtggtgctcgagttaagaaacggtaaccgcttcgttct
21(pET28a-BCLR-F) 정방향 프라이머 agaacgaagcggttaccgtttcttaactcgagcaccaccaccaccaccactg
22(pET28a-BCLR-R) 역방향 프라이머 cataacgaactgtttcagaacgtcagacatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgct
[5-2] 서열번호 11, 13의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리 및 정제
서열번호 1의 아미노산 서열과 99% 이상의 상동성을 갖는 서열번호 11의 아미노산 서열과 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 각각 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 다음 표 5와 같이 서열번호 23 내지 26의 프라이머를 각각 설계하였고, 서열번호 2의 염기를 주형으로 하여, QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)을 이용하여 돌연변이를 유발하고 각각의 산물을 클로닝하였다. 상기와 같이 클로닝된 각각의 산물에 대하여 염기 서열 분석을 수행하여 돌연변이가 제대로 유발되었는지 여부를 확인하였으며, 상기 산물을 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
상기 실시예 [1-2]에서와 동일한 방법으로 상기 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상기 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5‘->3’)
23(LXMDHA164F-1) 정방향 프라이머 1 Gtaacatgtttgtccacgatgaacatcttcactttacgagctgt
24(LXMDHA164F-2) 정방향 프라이머 2 Acagctcgtaaagtgaagatgttcatcgtggacaaacatgttac
25(LXMDHC364F-1) 정방향 프라이머 1 ggtttgttgcagcaaatacatctaacattgcgtttttcgcta
26(LXMDHC364F-1) 정방향 프라이머 2 tagcgaaaaacgcaatgttagatgtatttgctgcaacaaacc
[5-3] 단백질의 특이 활성도 분석
상기 실시예 [5-1] 및 [5-2]에서 분리 및 정제한 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 대상으로, 상기 실시예 4에서와 동일한 방법으로 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올 각각에 대한 특이 활성도를 확인하여, 그 결과를 아래 표 6에 나타내었다.
기질 비활성도(specific activity, U/㎎)
서열번호 1 서열번호 7 서열번호 9 서열번호 11 서열번호 13
메탄올 453.1±3.3 117.9±8.2 89.3±3.2 899.8±6.6 360.2±2.5
에탄올 514.6±3.4 측정값 없음 측정값 없음 1177.1±9.0 449.8±0.9
프로판올 544.7±2.5 측정값 없음 측정값 없음 1043.3±14.7 474.6+3.0
부탄올 643.6±8.1 측정값 없음 측정값 없음 1298.4±16 589.3±1.5
알코올 탈수소효소의 돌연변이체 제조 및 돌연변이체의 효소 활성 확인
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소의 돌연변이체를 제작하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소와 그 효소 활성을 비교하는 실험을 수행하였다.
[6-1] 돌연변이체 제조
구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 돌연변이체들(S101G, S101V, S101A, S101L, T141S, T141A, T141I, T141N, A164V, A164L, A164Y, A164F, A164R, A164H, A164Q, A164E)을 얻기 위한 프라이머들을 각각 설계하였고, 서열번호 2의 염기를 주형으로 하여, QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)을 이용하여 돌연변이를 유발하고 각각의 산물을 클로닝하였다. 상기와 같이 클로닝된 각각의 산물에 대하여 염기 서열 분석을 수행하여 돌연변이가 제대로 유발되었는지 여부를 확인하였으며, 상기 산물을 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
상기 실시예 [1-2]에서와 동일한 방법으로 상기 돌연변이가 유발된 단백질들을 각각 분리 및 정제하였다.
[6-2] 알코올 탈수소효소 돌연변이체의 효소 활성 확인
상기 실시예 [6-1]에서 분리 및 정제한 돌연변이체들을 대상으로, 상기 실시예 4에서와 동일한 방법으로 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올 각각에 대한 특이 활성도를 확인하여, 그 결과를 도 8에 나타내었고, 메탄올을 기질로 하였을 때 활성을 표 7에 나타내었다.
그 결과, S101G, S101V, S101L, T141S, T141A, T141I, T141N, A164L, A164F, A164R, A164Q 및 A164E 돌연변이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 효소에 비해 메탄올을 기질로 하였을 때 활성이 1.1~1.9배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
효소 돌연변이체 종류 비활성도 (specific activity, U/㎎)
야생형(WT) - 411.9±20.7
Mutant 1 S101G 533.9±0
S101V 782.0±85.7
S101L 480.3±96.2
Mutant 2 T141S 603.4±43.5
T141A 634.6±62.3
T141I 483.2±126.2
T141N 693.9±167.5
Mutant 3 A164L 535.7±69.3
A164F 547.3±30.1
A164R 556.7±34.9
A164Q 433.1±58.0
A164E 576.7±0
[6-3] 알코올 탈수소효소 돌연변이체의 동역학적 특성 분석
기질로 메탄올과 에탄올을 이용하는 경우에, 본 발명의 알코올 탈수소효소 돌연변이체들의 동역학적 특성을 분석하기 위하여, 상기 실시예 [6-1]에서 정제 및 분리한 돌연변이체 0.1㎎/㎖, NAD 5 mM 및 Mn2+ 10 mM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 메탄올, 에탄올, 각각 다양한 농도(0.1-500mM)의 함량으로 첨가하여 55℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 10분 동안 반응시키고, NADH 생성량을 측정하여 활성을 측정한 후, 마이켈리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten Equation)에 의하여 기질 친화도 및 효소 turnover number(kcat)를 계산하여, 그 결과를 아래 표 8에 나타내었다.
그 결과, S101V, T141S 및 A164F 돌연변이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 효소보다 기질의 전환 정도를 나타내는 Kcat 값이 높은 것으로 확인되었다.
효소 메탄올 에탄올
Vmax
(mU/mg)		 Km
(mM)		 Kcat/Km
(M-1 s-1)		 Vmax
(mU/mg)		 Km
(mM)		 Kcat/Km
(M-1 s-1)
야생형(WT) 302.7
± 16.9		 3.23
± 1.05		 0.067 652.4
± 12.0		 0.25
± 0.03		 1.862
S101V 342.3± 21.6 10.35
± 3.88		 0.024 1511.0
± 60.3		 3.71
± 0.81		 0.291
T141S 462.9± 57.6 51.24
± 23.9		 0.006 864.9
± 90.6		 173.8
± 49.41		 0.004
A164F 475.3± 50.7 36.83
± 15.8		 0.009 872.5
± 30.7		 1.19
± 0.26		 0.523
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A Novel Alcohol Dehydrogenase and Mutants thereof, and A Method for Preparing Aldehyde Compounds Using The Same <130> 2019-DPA-3497 <150> KR 2018/0126953 <151> 2018-10-23 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 402 <212> PRT <213> Lysinibacillus xylanilyticus <400> 1 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser Glx <210> 2 <211> 1206 <212> DNA <213> Lysinibacillus xylanilyticus <400> 2 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacaaatt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacacat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Seq ID No. 2 <400> 3 agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgtcagacg ttctaaagca atttgtaa 58 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Seq ID No. 2 <400> 4 ctttcgggct ttgttagcag ccggatcctc gagttaagaa agtgcgacag cttcaagtga 60 ctctt 65 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for pET28a(+) <400> 5 aagagtcact tgaagctgtc gcactttctt aactcgagga tccggctgct aacaaagccc 60 gaaag 65 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for pET28a(+) <400> 6 ttacaaattg ctttagaacg tctgacatat ggctgccgcg cggcaccagg ccgctgct 58 <210> 7 <211> 401 <212> PRT <213> Lysinibacillus contaminans <400> 7 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Thr Ser Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Asn Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Glu Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Lys Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Val Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Ile Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Gln Thr 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Arg 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Val Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ala Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Gly Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Ile Pro Glu Phe Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Lys 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Ala Asn Val Glu Gly Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Ala Val Ile Glu Gly Leu Ser Lys Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Asp Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Val Ala Glu Ala Lys Gln Arg Glu Thr Val Thr Val 385 390 395 400 Ser <210> 8 <211> 1206 <212> DNA <213> Lysinibacillus contaminans <400> 8 atgtctgacg ttctgaaaca gttcgttatg ccgacctcta acctgttcgg tccgggtgcg 60 atccaggaag ttggtaaccg tctgaacgac ctggaagtta aaaaaaccct gatcgttacc 120 gacgaaggtc tgcacaaact gggtctgtct gaacagatcg cgaacatcat caccgcggcg 180 ggtatcgaag ttgcgatctt cccgaaagcg gaaccgaacc cgaccgacaa aaacatcgaa 240 gacggtatcg cggtttacca cgcggaaaac tgcgactcta tcgtttctgt tggtggtggt 300 tctgcgcacg acgcggcgaa aggtatcggt atcatcgcgt ctaacggtgg tcgtatccac 360 gactacgaag gtgttgacca gacccagaac ccgctggttc cgctgatcgc gatcaacacc 420 accgcgggta ccgcgtctga aatgacccgt ttcaccatca tcaccgacac cgcgcgtcgt 480 gttaaaatgg cgatcgttga caaacacgtt accccgctgg tttctatcaa cgacccggaa 540 ctgatgatcg gtctgccgcc ggcgctgacc gcggcgaccg gtctggacgc gctgacccac 600 gcgatcgaag cgttcgtttc taccaacgcg accccgatca ccgacgcgtg cggtgaaaaa 660 gttctgcagc tgatcccgga attcctgccg cgtgcgtacg cgaacggtgc ggacctggaa 720 gcgcgtgaac agatggttta cgcgcagttc ctggcgggta tggcgttcaa caacgcgtct 780 ctgggttacg ttcacgcgat cgcgcaccag ctgggtggtt tctacaacct gccgcacggt 840 gtttgcaacg cgatcctgct gccgcacgtt tgccgtttca acctgaccgc gcgtaccgaa 900 cgtttcgcga aaatcgcgga actgctgggt gcgaacgttg aaggtctgtc taaacgtgac 960 gcggcggaaa aagcgatcgc ggttatcgaa ggtctgtcta aagacctgaa catcccgtct 1020 ggtttccgtg aactgggtgc gaaagacgaa gacatcgaaa tcctggcgaa aaacgcgatg 1080 ctggacgttt gcgcggcgac caacccgcgt aaagcgaccc tggaagacat caaacagatc 1140 atcaccaacg cgatgggtcc ggttgttgcg gaagcgaaac agcgtgaaac cgttaccgtt 1200 tcttag 1206 <210> 9 <211> 402 <212> PRT <213> Bacillus cecembensis <400> 9 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Ser Val Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Asn Lys Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Gln Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Glu Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Lys Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr Ile Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Ile Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Gln Thr 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Val Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Val Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ala Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Gly Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Ile Pro Glu Phe Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Gly Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Lys 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Ala Asn Ile Glu Gly Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Ser Val Ile Glu Ala Leu Ala Lys Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Val Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Asp Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Val Val Thr Ala Asn Gln Asn Glu Ala Val Thr Val 385 390 395 400 Ser Glx <210> 10 <211> 1206 <212> DNA <213> Bacillus cecembensis <400> 10 atgtctgacg ttctgaaaca gttcgttatg ccgtctgtta acctgttcgg tccgggtgcg 60 atccaggaag ttggtaacaa actgaacgac ctggaagtta aaaaaaccct gatcgttacc 120 gacgaaggtc tgcacaaact gggtctgtct cagcagatcg cgaacatcat caccgcggcg 180 ggtatcgaag ttgcgatctt cccgaaagcg gaaccgaacc cgaccgacaa aaacatcgaa 240 gacggtatcg cggtttacat cgcggaaaac tgcgactcta tcgtttctct gggtggtggt 300 tctgcgcacg acgcggcgaa aggtatcggt atcatcgcgt ctaacggtgg tcgtatccac 360 gactacgaag gtgttgacca gacccagaac ccgctggttc cgctggttgc gatcaacacc 420 accgcgggta ccgcgtctga aatgacccgt ttcaccatca tcaccgacac cgcgcgtaaa 480 gttaaaatgg cgatcgttga caaacacgtt accccgctgg tttctatcaa cgacccggaa 540 ctgatgatcg gtctgccgcc ggcgctgacc gcggcgaccg gtctggacgc gctgacccac 600 gcgatcgaag cgttcgtttc taccaacgcg accccgatca ccgacgcgtg cggtgaaaaa 660 gttctgcagc tgatcccgga attcctgccg cgtgcgtacg cgaacggtgc ggacctggaa 720 gcgcgtgaac agatggttta cgcgcagttc ctgggtggta tggcgttcaa caacgcgtct 780 ctgggttacg ttcacgcgat cgcgcaccag ctgggtggtt tctacaacct gccgcacggt 840 gtttgcaacg cgatcctgct gccgcacgtt tgccgtttca acctgaccgc gcgtaccgaa 900 cgtttcgcga aaatcgcgga actgctgggt gcgaacatcg aaggtctgtc taaacgtgac 960 gcggcggaaa aagcgatctc tgttatcgaa gcgctggcga aagacctgaa catcccgtct 1020 ggtttccgtg aactgggtgt taaagacgaa gacatcgaaa tcctggcgaa aaacgcgatg 1080 ctggacgttt gcgcggcgac caacccgcgt aaagcgaccc tggaagacat caaacagatc 1140 atcaccaacg cgatgggtcc ggttgttgtt accgcgaacc agaacgaagc ggttaccgtt 1200 tcttaa 1206 <210> 11 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A164F <400> 11 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Phe Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser Glx <210> 12 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A164F <400> 12 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacaaatt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac 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215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Phe Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser Glx <210> 14 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C364F <400> 14 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa 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900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat ttgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Seq ID No. 8 <400> 15 ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatgtct gacgttctga aacagttc 48 <210> 16 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Seq ID No. 8 <400> 16 cagtggtggt ggtggtggtg ctcgagctaa gaaacggtaa cggtttcacg ct 52 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for pET28a(+) of LC-MDH <400> 17 agcgtgaaac cgttaccgtt tcttagctcg agcaccacca ccaccaccac tg 52 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for pET28a(+) of LC-MDH <400> 18 gaactgtttc 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Seq ID No. 12 <400> 24 acagctcgta aagtgaagat gttcatcgtg gacaaacatg ttac 44 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Seq ID No. 14 <400> 25 ggtttgttgc agcaaataca tctaacattg cgtttttcgc ta 42 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Seq ID No. 14 <400> 26 tagcgaaaaa cgcaatgtta gatgtatttg ctgcaacaaa cc 42

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 것인 알코올 탈수소효소.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 알코올 탈수소효소는
    서열번호 1의 아미노산 서열의 101번 아미노산 세린(S)을 각각 글리신(G), 발린(V) 또는 류신(L)으로 변환시킨 돌연변이체이거나,
    141번 아미노산 트레오닌(T)을 각각 세린(S), 알라닌(A), 이소류신(I) 또는 아스파라긴(N)으로 변환시킨 돌연변이체이거나,
    164번 아미노산 알라닌(A)을 류신(L), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 글루타민(Q) 또는 글루탐산(E)으로 변환시킨 돌연변이체인 것인 알코올 탈수소효소.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 알코올 탈수소효소는 저급 알코올을 기질로 하는 것인 알코올 탈수소효소.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 저급 알코올은 메탄올인 것인 알코올 탈수소효소.
  6. 청구항 1의 알코올 탈수소효소를 암호화하는 유전자.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  8. 청구항 7의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  9. 청구항 8의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  11. 청구항 1의 알코올 탈수소효소를 유효성분으로 포함하는 알데히드 화합물 생산용 조성물.
  12. 청구항 9의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    상기 형질전환체의 배양물로부터 알코올 탈수소효소를 분리하는 단계;를 포함하는 알코올 탈수소효소의 생산 방법.
  13. 청구항 1의 알코올 탈수소효소를 알코올과 함께 반응시키는 단계;를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 알코올 탈수소효소와 알코올의 반응 생성물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
  15. 청구항 9의 형질전환체를 알코올이 존재하는 환경 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 형질전환체의 배양물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
KR1020190131994A 2018-10-23 2019-10-23 신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 KR20200045978A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20220117742A (ko) 2021-02-17 2022-08-24 주식회사 피코엔텍 글루타치온과 알데히드탈수소효소를 함유하는 숙취해소제

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