KR102118898B1 - 신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법 - Google Patents

신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102118898B1
KR102118898B1 KR1020180120620A KR20180120620A KR102118898B1 KR 102118898 B1 KR102118898 B1 KR 102118898B1 KR 1020180120620 A KR1020180120620 A KR 1020180120620A KR 20180120620 A KR20180120620 A KR 20180120620A KR 102118898 B1 KR102118898 B1 KR 102118898B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
seq
leu
ala
stereospecific
Prior art date
Application number
KR1020180120620A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190047602A (ko
Inventor
염수진
이승구
권길광
나유진
박성현
최민정
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20190047602A publication Critical patent/KR20190047602A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102118898B1 publication Critical patent/KR102118898B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01004—Amidase (3.5.1.4)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 관한 것으로서, 바실러스(Bacillus) 속 미생물로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제, 및 이를 암호화 하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 아미노산 아미드를 입체특이적으로 D-아미노산으로 변환시킬 수 있어서, 별도의 분리공정 없이도 D-아미노산을 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 D-아미노산 생산 방법{Novel D-stereospecific amino acid amidase and mutants thereof, and method for preparing D-amino acid using the same}
본 발명은 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 바실러스(Bacillus) 속 미생물 유래의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그의 돌연변이체에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 아미노산들은 대부분 광학활성을 나타내는 알파탄소를 가지고 있으며 입체특이성에 따라 L-아미노산과 D-아미노산으로 나뉜다. 자연계에 존재하는 대부분의 단백질은 L-아미노산으로 구성되어 있으나, 예외적으로 미생물의 펩티도글리칸이나 펩티드계 항생물질의 구성성분 및 고등식물의 생리활성물질의 구성성분 등은 D-아미노산으로 구성되어 있다.
현재까지의 연구에 의하면, D-아미노산은 신경전달물질, 백신, 합성감미료, 항생제 및 호르몬 등의 생리활성물질을 합성하는 중간물질로서 식품과 의약분야에서 널리 이용되고 있으며, 이에 D-아미노산을 생산하는 방법들이 개발되어 왔다.
D-아미노산을 생산하는 방법은 크게 화학 합성법과 생물촉매로 사용하여 생산하는 방법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 의한 아미노산의 생산은 D- 또는 L-아미노산이 혼합된 상태(racemic mixture)로 생성물이 얻어지기 때문에, 순수한 D-아미노산을 얻기 위해서는 또 다른 복잡한 광학적 순수화 과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 이에 비해 미생물 생물촉매를 이용한 D-아미노산 생산방법은 광학적으로 순수한 D-아미노산만을 한 단계로 직접 생산할 수 있기 때문에 환경오염의 문제점을 가지고 있는 다단계 화학합성법을 대체할 수 있는 저공해 청정생산기술로서 주목 받고 있다.
생물촉매를 이용한 D-아미노산 생산법으로는 D,L-아미노산 혼합물로부터 D-아미노산만을 순수하게 분리하여 생산하는 방법이 연구되었는데, 상기 방법은 D,L-아미노산 혼합물을 D,L-아미노산 아미드로 만든 후, 여기에 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 작용시켜 D,L-아미노산 아미드에서 D-아미노산 아미드만을 선택적으로 가수분해하여 D-아미노산을 제조할 수 있고, 남아있는 L-아미노산 아미드는 라세마아제(racemase)를 이용해서 다시 D-아미노산 아미드로 전환한 다음 이를 다시 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 D-아미노산을 제조할 수 있는 것이다. 따라서 D-아미노산 생산에 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 사용하면 비교적 저렴한 D,L-아미노산 혼합물(racemic mixture)로부터 산업적으로 유용한 다양한 D-아미노산을 생산할 수 있다는 장점이 있다.
이에, 상기와 같은 생물전환공정으로 D-아미노산을 생산하는데 생물촉매로 이용될 수 있는 효소에 관한 연구, 개발이 더욱 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 바실러스(Bacillus) 속 미생물인 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 신규한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용한 D-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다른 측면은 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또 다른 측면은 상기 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 포함하는 상기 D-아미노산 생산용 조성물, 및 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 아미노산 아미드와 반응시키는 단계를 포함하는 D-아미노산의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 아미노산 아미드를 입체특이적으로 D-아미노산으로 변환시킬 수 있어서, 별도의 분리공정 없이도 D-아미노산을 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PGAE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 시간에 따른 D-아미노산 전환 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 금속 양이온의 종류(A)와 금속 양이온의 농도(B)를 확인한 그래프이다.
도 4는 온도가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 5는 pH가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 'D-입체특이적 아미노산 아미다아제'는 하기 반응식과 같이 아미노산 아미드(amino acid amide)을 D-아미노산으로 변환시키는 활성을 가진 효소를 의미한다.
[반응식]
Figure 112018099712685-pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 그 유전자
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자를 제공한다.
본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 바실러스(Bacillus) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
특히, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 119번째 페닐알라닌(phenylalanine)에 변이가 발생한 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 상기 119번째 페닐알라닌이 알라닌(alanine), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있고, 보다 구체적으로 상기 119번째 페닐알라닌이 알라닌, 발린, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있으며, 예컨대 상기 119번째 페닐알라닌이 알라닌, 티로신 및 페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 119번째 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 서열번호 7의 아미노산 서열, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 119번째 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 119번째 페닐알라닌이 트립토판으로 치환된 서열번호 11의 아미노산 서열일 수 있다.
상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-입체특이적 아미노산 아미다아제로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(표 1 및 도 2 참고).
2. D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질 전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.
3. D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 생산 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 생산 방법은 1) 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 D-입체특이적 아미노산 아미다아제 유전자의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 분리하는 단계;를 포함한다.
상기 단계 1)의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 정제 또는 원래 형태의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 수득이 가능할 수 있다.
상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.
상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 D-입체특이적 아미노산 아미다아제는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.
본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
4. D-아미노산의 생산 방법 및 D-아미노산 생산용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 아미노산 아미드로부터 D-아미노산을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 D-아미노산의 생산에 이용되는 D-아미노산 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 D-아미노산 생산용 조성물은 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 포함한다.
또한, 본 발명의 D-아미노산의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 아미노산 아미드와 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 D-아미노산을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 D-아미노산의 생산 방법 및 D-아미노산 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 이용하여 그 기질인 아미노산 아미드로부터 D-아미노산을 생성하는 것이다.
상기 단계 1)의 반응은 40℃ 내지 70℃의 온도 범위, 바람직하게는 45℃ 내지 65℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 50℃ 내지 65℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 7 내지 12의 pH 범위, 바람직하게는 8 내지 11의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 9 내지 10의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성을 향상시키기 위해 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 함께 금속 양이온이 함께 포함될 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온 또는 코발트 양이온 등일 수 있고, 코발트 양이온인 것이 바람직하다.
상기 단계 1)의 반응에서, 상기 아미노산 아미드는 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 아미노산 아미드는 목적하는 D-아미노산의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 또한, 상기 아미노산 아미드의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 아미노산 아미드가 연속적으로 주입되는 경우, 상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 의하여 D-아미노산을 지속적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 D-입체특이적 아미노산 아미다아제에 의하여 아미노산 아미드로부터 D-아미노산이 생산됨을 확인하였고(도 2 참조), 이러한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 효소 활성이, 코발트 양이온의 첨가에 의해, 55℃에 가까운 온도에서 반응을 수행할수록, 9.5에 가까운 pH에서 반응을 수행할수록 더욱 향상됨을 확인하였다(도 3 내지 도 5 참고).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 D-아미노산을 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 D-아미노산의 인 비보(in vivo) 생산 방법은 1) 상기 형질전환체를 아미노산 아미드가 공급되는 환경 하에서 배양하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 배양물로부터 D-아미노산을 회수하는 단계;를 포함한다.
상기 아미노산 아미드가 공급되는 환경은 외부에서 인위적으로 아미노산 아미드를 공급해 주거나 배양에 이용되는 배지 내에 아미노산 아미드를 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 아미노산 아미드가 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 아미노산 아미드가 생성되는 환경은 상기 아미노산 아미드의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 50℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 D-아미노산의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.
또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 8에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 7에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.3 내지 pH 6.7에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장하기 어렵기 때문에 D-아미노산의 발현이 용이하지 않아 D-아미노산의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리
[1-1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환
바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 다음 표 1과 같이 서열번호 3 내지 6의 프라이머를 각각 설계하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5'->3 ')
3 정방향 프라이머 5'-tggtgccgcgcggcagccatatgaaactatatctgtcggt-3'
4 역방향 프라이머 5'-tggtggtggtggtgctcgagctaacagaatgttgtgcgcg-3'
5 정방향 프라이머 5'-cgcgcacaacattctgttagctcgagcaccaccaccacca-3'
6 역방향 프라이머 5'-accgacagatatagtttcatatggctgccgcgcggcacca-3'
㈜바이오니아에 의뢰하여 서열번호 2의 염기 서열의 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. Gibson assembly (New England Biolabs, 미국)를 이용하여 상기와 같이 증폭된 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을, 서열번호 5, 6의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 플라스미드 벡터 pET28a(+) (Novagen, 미국)와 깁슨 어셈블리 (Gibson assemably, NEB)기법을 이용하여 클로닝을 진행하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
[1-2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 5㎖의 LB 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액을 500㎖의 LB 배지가 포함된 2000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 16℃로 조정하여 16시간 동안 배양하였다.
또한, 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 4℃에서 4000rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상등액을 분리해 낸 펠렛에 50mM의 제1인산나트륨(NaHPO4), 300mM의 NaCl, 10mM의 이미다졸(immidazole) 및 0.1mM의 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, 단백질분해효소 저해제)를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4℃에서 14000rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kit His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그라피(Fast Protein Liquid Chromatography)(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag이 붙어 있는 65 kDa의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인
본 발명자들은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 하기 반응식과 같은 'D-입체특이적 아미노산 아미다아제'로서의 활성을 가질 것으로 예상하고, 이를 확인하였다.
[반응식]
Figure 112018099712685-pat00002
구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 2㎎/㎖와 10mM의 트레오닌 아미드를 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 첨가하고, 55℃에서 반응시키면서 시간별로 샘플링하여 생성된 D-트레오닌의 양을 측정하였다.
상기 생성된 D-아미노산은 OPA/NAC 전처리(OPA/NAC derivatization)한 후 HPLC를 통해 분석하였다. 상기 전처리 과정은 8㎎의 OPA(o-phthalaldelhyde)와 10㎎의 NAC(N-acetylcysteine)를 1㎖의 메탄올에 녹여 OPA/NAC 용액을 만들고, 25㎕의 분석할 샘플을 50㎕의 OPA/NAC 용액 및 0.4M의 붕산나트륨 완충용액(sodium borate buffer)(pH10.4)에 넣고 0.2㎛ 필터로 필터링하여 전처리된 샘플을 준비하였다. 이때 상기 D-아미노산 농도의 측정은 LC-UV 검출기 및 Eclipse XDB-C18 column (Agilent) 칼럼이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 실시하였으며, 상기 Eclipse XDB-C18 column (Agilent) 칼럼은 25℃에서 0.5 ㎖/분 속도로 methanol/50mM sodium acetate (pH5.9) (30:70 v/v)을 3분동안 흘려주고, methanol 을 70%까지 6분동안 순차적으로 통과시키도록 하였다. 생성된 D-트레오닌을 정량화하기 위해 시판되는 D-트레오닌(Sigma-Aldrich, 미국)을 스탠다드로 사용하였다.
그 결과, 10mM의 트레오닌 아미드가 160분 시점에 D-트레오닌으로 100% 전환됨을 확인하였고(도 2 참고), 반응액에 존재하지 않았던 D-트레오닌이 위 반응 결과 생성된 결과로부터 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 아미노산 아미드를 D-아미노산으로 변환시키는, D-입체특이적 아미노산 아미다아제로서의 활성을 가짐을 확인하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건에 관한 연구
본 발명자들은, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-입체특이적 아미노산 아미다아제로서 작용함에 그 활성에 영향을 미치는 조건들에 대하여 연구를 진행하였고, 그로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 활성 조건을 도출하였다.
[3-1] 금속 양이온의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.005㎎/㎖와 트레오닌 아미드 1mM을 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 10mM의 EDTA 또는 금속 양이온(Mn2 +, Mg2 +, Co2+, Zn2 +)과 함께 첨가하여 55℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 트레오닌 아미드와 D-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 여러 종류의 금속 양이온 중 코발트 양이온과 망간 양이온이 첨가된 경우에 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성이 향상되었고, 그 중에서도 코발트 양이온을 이용한 경우에 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 3의 (A)).
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.005㎎/㎖와 트레오닌 아미드 1mM을 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 코발트 양이온을 0mM, 0.1mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM, 2.5mM 및 5mM의 함량으로 각각 첨가하여 55 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 트레오닌 아미드와 D-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 0.5mM의 코발트 양이온을 첨가할 때까지는 첨가되는 코발트 양이온의 양이 증가할수록 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성도 함께 증가하다가, 0.5mM의 코발트 양이온을 첨가한 경우에 가장 우수한 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 활성을 나타내었으나, 그 이상이 첨가된 경우에는 특별한 활성의 향상은 없는 것으로 확인되었다(도 3의 (B)).
[3-2] 온도의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.005㎎/㎖, 아미노산 아미드 15mM 및 코발트 양이온 50mM을 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 첨가한 다음, 35℃ 내지 75℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 트레오닌 아미드와 D-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 55℃에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 4).
[3-3] pH의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.005㎎/㎖, 아미노산 아미드 1mM 및 코발트 양이온 0.5mM을 50 mM의 각각 pH 6.5 내지 7.5의 MOPS 완충용액, pH 7.5 내지 8.0의 HEPES 완충 용액, pH 8.0 내지 8.5의 EPPS 완충 용액 및 pH 8.5 내지 10의 CHES 완충 용액에 각각 첨가하여, pH 6.5 내지 10의 범위에서 각각 반응시켰다. 상기 효소 반응은 55℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 트레오닌 아미드와 D-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 pH가 9.5에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 5).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기질 특이성 확인
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.005㎎/㎖와, 2.5mM의 트레오닌 아미드, 알라닌 아미드, 메티오닌 아미드, 발린 아미드 및 글루타민 아미드 각각을 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 첨가한 다음, 55℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌, D-알라닌, D-메티오닌, D-발린 및 D-글루타민의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 아래 표 2에 기재된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 알라닌 아미드와 메티오닌 아미드에 대해서 가장 우수한 효소 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
기질 비활성(specific activity, U/㎎)
알라닌 아미드 21.57±0.12
메티오닌 아미드 21.03±0.30
발린 아미드 3.90±0.44
글루타민 아미드 3.01±0.05
트레오닌 아미드 0.14±0.00
서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인
상기와 같이 D-입체특이적 아미노산 아미다아제로서의 활성이 확인된 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 하기와 같이 그 활성을 확인하였다.
[5-1] 서열번호 7, 9, 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리 및 정제
서열번호 1의 아미노산 서열과 99% 이상의 상동성을 갖는 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 각각 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 다음 표 3과 같이 서열번호 14 내지 19의 프라이머를 각각 설계하였고, 서열번호 2의 염기를 주형으로 하여, 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 13, 14의 프라이머를, 서열번호 9의 아미노산 서열은 서열번호 15, 16의 프라이머를, 그리고 서열번호 11의 아미노산 서열은 서열번호 17, 18의 프라이머를 이용하여, PCR 증폭하였고 그 산물은 Kination & Ligation 방법을 통하여 클로닝하였다. 클로닝된 각각의 산물은 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열의 119번 위치의 페닐알라닌이 각각 알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 치환되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
상기 실시예 [1-2]에서와 동일한 방법으로 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5‘->3’)
13 정방향 프라이머 tcgatgatagctggtgctcgcaata
14 역방향 프라이머 atgagacatgacaccaggcatggat
15 정방향 프라이머 tcgatgatatatggtgctcgcaata
16 역방향 프라이머 atgagacatgacaccaggcatggat
17 정방향 프라이머 tcgatgatatggggtgctcgcaata
18 역방향 프라이머 2 atgagacatgacaccaggcatggat
[5-2] 단백질의 특이 활성도 분석
상기 실시예 [5-1] 에서 분리 및 정제한 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 대상으로, 상기 실시예 4에서와 동일한 방법으로 알라닌 아미드에 대한 비활성값 및 특이 활성도를 확인하여 아래 표 4에 나타내다. 상기 비활성도는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 특이 활성도를 100%로 하였을 때의 상대적인 값으로 환산하였다.
단백질 비활성(specific activity, U/㎎) 특이 활성도 ( % )
서열번호 1 21.6±0.8 100±3.8
서열번호 7 29.7±1.1 138±4
서열번호 9 24.2±1.9 112±8.7
서열번호 11 22.6±1.1 104.8±4.9
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> NOVEL D-STEREOSPECIFIC AMINO ACID AMIDASE AND MUTANTS THEREOF, AND METHOD FOR PREPARING D-AMINO ACID USING THE SAME <130> 2018-DPA-3011 <160> 18 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 1 Met Cys Ser Ala Ser Thr Gln Val Ser Asp Pro Gln Glu Gly Arg Arg 1 5 10 15 Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Ser Val Trp Thr Tyr Asn Tyr Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Val Ala Asp Glu Gly Arg Arg Ser His Arg Glu Val Glu Leu Gln 35 40 45 Arg Glu Lys Ala Gln Val Leu Glu Glu Glu Val Arg Gly Ala Leu Asn 50 55 60 Asp Glu Lys Ala Glu Pro Thr Thr Ile Phe Ala Leu Val Asp Asp Ile 65 70 75 80 Arg Arg Leu Gly Leu Gly His Gln Phe Glu Glu Asp Ile Ser Arg Ala 85 90 95 Leu Arg Arg Cys Leu Ser Pro Gly Ala Val Asn Lys Ser Leu Asp Lys 100 105 110 Ser Leu His Gly Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ile Leu Arg Gln His Gly 115 120 125 Phe Ala Val Ser Gln Asp Val Leu Lys Ile Phe Met Asp Glu Ser Gly 130 135 140 Ser Phe Met Lys Thr Leu Gly Gly Asp Val Gln Gly Met Leu Ser Leu 145 150 155 160 Tyr Glu Ala Ser His Leu Ala Phe Glu Glu Glu Asp Ile Leu His Gln 165 170 175 Ala Lys Thr Phe Ser Ile Glu His Leu Lys Ser Leu Ser Arg Asp Ile 180 185 190 Ser Lys Asp Leu Gln Asp Leu Val Asn His Glu Leu Glu Leu Pro Leu 195 200 205 His Arg Arg Met Pro Leu Leu Glu Ala Arg Arg Ser Ile Glu Ala Tyr 210 215 220 Ser Lys Arg Gly Tyr Met Asn Asp Arg Ile Leu Lys Leu Ala Ala Thr 225 230 235 240 Asn Phe Asn Thr Ser Gln Ser Ile Leu Gln Arg Asp Leu Gln Glu Met 245 250 255 Leu Gly Trp Trp Asn Asn Val Ser Leu Ala Lys Arg Leu Ser Phe Ala 260 265 270 Arg Asp Arg Leu Met Glu Cys Phe Phe Trp Ala Val Gly Ile Ala Asn 275 280 285 Glu Pro Leu Leu Ser Asn Cys Arg Lys Gly Val Thr Lys Ala Phe Ala 290 295 300 Leu Ile Leu Val Leu Asp Asp Val Tyr Asp Val Phe Gly Thr Leu Asp 305 310 315 320 Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Asn Ala 325 330 335 Val Glu Asp Leu Pro Ala Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Leu Ala Leu Tyr 340 345 350 Asn Asn Val Asn Glu Met Ala Tyr Asp Thr Leu Lys Glu Thr Gly Glu 355 360 365 Asn Val Ile Leu Tyr Leu Ala Lys Ala Trp Tyr Asp Leu Cys Lys Ala 370 375 380 Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Ser Tyr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Val 385 390 395 400 Glu Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Trp Met Ser Ser Ser Gly Gln Val Met 405 410 415 Leu Thr His Ala Tyr Phe Leu Ala Ser Pro Ser Met Arg Lys Glu Glu 420 425 430 Leu Glu Ser Leu Glu His Tyr His Asp Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu 435 440 445 Ile Phe Arg Leu Thr Asn Asp Leu Ala Ser Ser Ser Ala Glu Leu Glu 450 455 460 Arg Gly Glu Thr Thr Asn Ser Ile Gln Ser Tyr Met Gln Glu Asn Gly 465 470 475 480 Ile Ser Glu Ser Glu Ala Arg Glu Tyr Val Thr Glu Gln Ile Asp Thr 485 490 495 Ala Trp Lys Lys Met Asn Lys Tyr Leu Val Asp His Ser Thr Phe Asp 500 505 510 Gln Ser Phe Val Arg Met Ala Tyr Asn Leu Ala Arg Met Ala His Cys 515 520 525 Val Tyr Gln Asp Gly Asp Ala Ile Gly Ala Pro Asp Asp Gln Ser Trp 530 535 540 Asn Arg Val His Ser Leu Ile Ile Ser Pro Val Ser Leu Ala Pro Arg 545 550 555 560 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Bacillus megaterium <400> 2 atgtgtagtg cttccacaca agtcagtgac ccgcaggaag gacgccgcag cgctaactac 60 caaccctcag tgtggaccta caactactta caatcccttg ttgctgacga gggtcgtcgt 120 agccaccgcg aagtagagtt gcagcgtgag aaagcacaag tcttggagga ggaagttcgt 180 ggtgcgctta acgacgaaaa ggcggagcca accactattt ttgcactggt agacgatatc 240 cgccgcttgg gtcttggtca tcagttcgag gaggatatca gtcgtgcgct tcgtcgttgt 300 ctgagtccgg gtgccgtaaa caagagcttg gataagtcgc ttcatgggac tgccttaggc 360 ttccgtattc tgcgtcaaca cggattcgca gttagccagg atgttcttaa aattttcatg 420 gatgagagcg gcagttttat gaagaccttg ggtggtgatg tccagggaat gctgagttta 480 tatgaggcgt cacatctggc atttgaggaa gaggatatct tacatcaggc aaaaacgttt 540 tccatcgaac acctgaagtc cttgtcgcgt gacatcagta aagatttaca agacctggtc 600 aatcacgaac ttgagcttcc ccttcatcgt cgcatgccac tgttggaagc ccgccgctcg 660 attgaggctt actctaagcg tggctatatg aatgatcgca tcttgaagtt agcagcgacc 720 aatttcaaca cgtctcaatc aattcttcaa cgcgatctgc aagaaatgct gggttggtgg 780 aacaatgtct ctttagcgaa acgtttgagt ttcgcacgcg atcgcctgat ggaatgcttt 840 ttctgggcgg ttggaattgc taacgagcca ttgctttcaa actgccgcaa aggagtgact 900 aaggcattcg cgctgatttt agtgttggat gatgtatatg atgttttcgg aaccctggat 960 gaacttgaac ttttcacaga tgcagtgcgc cgttgggatt tgaacgctgt agaggatctg 1020 ccagcataca tgaaactttg ttatctggcc ttgtataaca atgttaatga aatggcctat 1080 gatacactta aagaaacggg agagaatgtt atcttgtacc ttgcaaaggc gtggtacgat 1140 ctgtgtaagg cattcttaca ggaagcgaag tggagctaca acaaaatcat ccctggcgta 1200 gaagagtact tgaataatgg gtggatgtct tcttctggcc aggtaatgtt aacgcacgct 1260 tactttttgg cttccccctc catgcgtaag gaggagcttg agtctttaga acactatcac 1320 gaccttcttc gccttccatc cttaattttt cgtttaacta acgacctggc ctcttcttct 1380 gctgaacttg agcgtggcga gacgactaat tccattcaga gctatatgca ggaaaacggt 1440 atcagtgagt ctgaagcccg cgagtacgtc accgagcaga ttgacaccgc gtggaaaaag 1500 atgaacaagt acctggtgga tcactccaca ttcgatcaat cattcgttcg tatggcatat 1560 aacttagcac gtatggccca ttgtgtgtat caagatgggg atgccattgg agcgccagac 1620 gatcaatctt ggaaccgcgt acacagtttg atcatttcac ccgtcagtct tgcgccgcgt 1680 taa 1683 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 2 <400> 3 tggtgccgcg cggcagccat atgtgtagtg cttccacaca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 2 <400> 4 tggtggtggt ggtgctcgag ttaacgcggc gcaagactga 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pET28a(+) <400> 5 tcagtcttgc gccgcgttaa ctcgagcacc accaccacca 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pET28a(+) <400> 6 tgtgtggaag cactacacat atggctgccg cgcggcacca 40 <210> 7 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of SEQ ID No. 1 <400> 7 Met Lys Leu Tyr Leu Ser Val Asp Met Glu Gly Ile Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Asp His Thr Asn Val Leu Arg Gln Lys Lys Asn Tyr Glu Arg Ser Arg 20 25 30 Lys Ile Met Thr Asp Glu Ala Asn Ala Val Ile Tyr Ala Gly Phe Arg 35 40 45 Glu Gln Cys Ser Glu Val Val Val Asn Asp Ser His Ser Ser Met Asn 50 55 60 Asn Leu Leu Val Glu Arg Leu His Pro Glu Thr Gln Leu Ile Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Lys Pro Tyr Ser Met Val Gln Gly Leu Asp Gln Thr Phe Asp 85 90 95 Gly Ala Met Phe Leu Gly Tyr His Ala Lys Ala Ser Met Pro Gly Val 100 105 110 Met Ser His Ser Met Ile Ala Gly Ala Arg Asn Met Tyr Ile Asp Asp 115 120 125 Thr Asn Ile Gly Glu Leu Gly Phe Asn Ala Tyr Val Ala Gly Tyr Tyr 130 135 140 Gly Val Pro Val Leu Met Val Val Gly Asp Asp Gln Thr Ala Leu Glu 145 150 155 160 Ala Gln Gln Leu Ile Pro Asn Val Thr Thr Ala Ile Val Lys Gln Ala 165 170 175 Ile Ser Arg Ser Ala Ala Lys Thr Leu Thr Pro Lys Lys Ala Glu Gln 180 185 190 Leu Leu Gln Glu Lys Thr Ala Ala Ala Ile Gln His Arg His Leu Val 195 200 205 Lys Pro Leu Leu Pro Pro Lys His Pro Thr Leu Arg Ile Glu Phe Ala 210 215 220 Asn Tyr Gly Gln Ala Glu Trp Ala His Leu Met Pro Gly Thr Glu Ile 225 230 235 240 Glu Pro Gly Thr Thr Thr Val Arg Phe Gln Ala Lys Asp Ile Leu Glu 245 250 255 Ala Tyr Gln Ala Met Leu Val Met Thr Glu Leu Ala Thr Arg Thr Thr 260 265 270 Phe Cys Glx 275 <210> 8 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SEQ ID No. 7 <400> 8 atgaaactat atctgtcggt tgatatggaa ggaattacgg gactcgtcga tcacacaaat 60 gttctgcggc agaaaaaaaa ttatgaaaga agccgcaaaa taatgacgga tgaagcaaat 120 gcagtaattt atgcaggatt tagagaacag tgctcagaag ttgtggtaaa tgacagtcat 180 tcgagtatga ataatctcct tgttgaacgg cttcatccag aaactcagct tatttcagga 240 agcgtaaaac catattcaat ggtacaggga ttagatcaga cttttgatgg tgctatgttt 300 ctaggatatc atgctaaagc atccatgcct ggtgtcatgt ctcattcgat gatagctggt 360 gctcgcaata tgtacataga cgatacgaat attggagagt taggcttcaa tgcatatgtc 420 gcaggctatt acggcgtgcc agttttaatg gtagtcggtg atgaccaaac ggcgttggaa 480 gcacagcagc ttattccaaa cgtgacgact gctatcgtca aacaggccat ttcacgttct 540 gcagccaaaa cattaacccc taagaaagca gaacaattac ttcaagaaaa aacagccgca 600 gctattcaac atagacacct tgttaaacct ttacttccac ctaaacatcc aaccttacga 660 atagagtttg caaattacgg tcaagcagag tgggcgcact taatgccggg cacagaaatt 720 gagcctggaa cgacgactgt tcggtttcaa gcaaaagata ttttagaagc ttatcaggcc 780 atgcttgtta tgactgaatt agcgacgcgc acaacattct gttag 825 <210> 9 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of SEQ ID No. 1 <400> 9 Met Lys Leu Tyr Leu Ser Val Asp Met Glu Gly Ile Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Asp His Thr Asn Val Leu Arg Gln Lys Lys Asn Tyr Glu Arg Ser Arg 20 25 30 Lys Ile Met Thr Asp Glu Ala Asn Ala Val Ile Tyr Ala Gly Phe Arg 35 40 45 Glu Gln Cys Ser Glu Val Val Val Asn Asp Ser His Ser Ser Met Asn 50 55 60 Asn Leu Leu Val Glu Arg Leu His Pro Glu Thr Gln Leu Ile Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Lys Pro Tyr Ser Met Val Gln Gly Leu Asp Gln Thr Phe Asp 85 90 95 Gly Ala Met Phe Leu Gly Tyr His Ala Lys Ala Ser Met Pro Gly Val 100 105 110 Met Ser His Ser Met Ile Tyr Gly Ala Arg Asn Met Tyr Ile Asp Asp 115 120 125 Thr Asn Ile Gly Glu Leu Gly Phe Asn Ala Tyr Val Ala Gly Tyr Tyr 130 135 140 Gly Val Pro Val Leu Met Val Val Gly Asp Asp Gln Thr Ala Leu Glu 145 150 155 160 Ala Gln Gln Leu Ile Pro Asn Val Thr Thr Ala Ile Val Lys Gln Ala 165 170 175 Ile Ser Arg Ser Ala Ala Lys Thr Leu Thr Pro Lys Lys Ala Glu Gln 180 185 190 Leu Leu Gln Glu Lys Thr Ala Ala Ala Ile Gln His Arg His Leu Val 195 200 205 Lys Pro Leu Leu Pro Pro Lys His Pro Thr Leu Arg Ile Glu Phe Ala 210 215 220 Asn Tyr Gly Gln Ala Glu Trp Ala His Leu Met Pro Gly Thr Glu Ile 225 230 235 240 Glu Pro Gly Thr Thr Thr Val Arg Phe Gln Ala Lys Asp Ile Leu Glu 245 250 255 Ala Tyr Gln Ala Met Leu Val Met Thr Glu Leu Ala Thr Arg Thr Thr 260 265 270 Phe Cys Glx 275 <210> 10 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SEQ ID No. 9 <400> 10 atgaaactat atctgtcggt tgatatggaa ggaattacgg gactcgtcga tcacacaaat 60 gttctgcggc agaaaaaaaa ttatgaaaga agccgcaaaa taatgacgga tgaagcaaat 120 gcagtaattt atgcaggatt tagagaacag tgctcagaag ttgtggtaaa tgacagtcat 180 tcgagtatga ataatctcct tgttgaacgg cttcatccag aaactcagct tatttcagga 240 agcgtaaaac catattcaat ggtacaggga ttagatcaga cttttgatgg tgctatgttt 300 ctaggatatc atgctaaagc atccatgcct ggtgtcatgt ctcattcgat gatatatggt 360 gctcgcaata tgtacataga cgatacgaat attggagagt taggcttcaa tgcatatgtc 420 gcaggctatt acggcgtgcc agttttaatg gtagtcggtg atgaccaaac ggcgttggaa 480 gcacagcagc ttattccaaa cgtgacgact gctatcgtca aacaggccat ttcacgttct 540 gcagccaaaa cattaacccc taagaaagca gaacaattac ttcaagaaaa aacagccgca 600 gctattcaac atagacacct tgttaaacct ttacttccac ctaaacatcc aaccttacga 660 atagagtttg caaattacgg tcaagcagag tgggcgcact taatgccggg cacagaaatt 720 gagcctggaa cgacgactgt tcggtttcaa gcaaaagata ttttagaagc ttatcaggcc 780 atgcttgtta tgactgaatt agcgacgcgc acaacattct gttag 825 <210> 11 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of SEQ ID No. 1 <400> 11 Met Lys Leu Tyr Leu Ser Val Asp Met Glu Gly Ile Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Asp His Thr Asn Val Leu Arg Gln Lys Lys Asn Tyr Glu Arg Ser Arg 20 25 30 Lys Ile Met Thr Asp Glu Ala Asn Ala Val Ile Tyr Ala Gly Phe Arg 35 40 45 Glu Gln Cys Ser Glu Val Val Val Asn Asp Ser His Ser Ser Met Asn 50 55 60 Asn Leu Leu Val Glu Arg Leu His Pro Glu Thr Gln Leu Ile Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Lys Pro Tyr Ser Met Val Gln Gly Leu Asp Gln Thr Phe Asp 85 90 95 Gly Ala Met Phe Leu Gly Tyr His Ala Lys Ala Ser Met Pro Gly Val 100 105 110 Met Ser His Ser Met Ile Trp Gly Ala Arg Asn Met Tyr Ile Asp Asp 115 120 125 Thr Asn Ile Gly Glu Leu Gly Phe Asn Ala Tyr Val Ala Gly Tyr Tyr 130 135 140 Gly Val Pro Val Leu Met Val Val Gly Asp Asp Gln Thr Ala Leu Glu 145 150 155 160 Ala Gln Gln Leu Ile Pro Asn Val Thr Thr Ala Ile Val Lys Gln Ala 165 170 175 Ile Ser Arg Ser Ala Ala Lys Thr Leu Thr Pro Lys Lys Ala Glu Gln 180 185 190 Leu Leu Gln Glu Lys Thr Ala Ala Ala Ile Gln His Arg His Leu Val 195 200 205 Lys Pro Leu Leu Pro Pro Lys His Pro Thr Leu Arg Ile Glu Phe Ala 210 215 220 Asn Tyr Gly Gln Ala Glu Trp Ala His Leu Met Pro Gly Thr Glu Ile 225 230 235 240 Glu Pro Gly Thr Thr Thr Val Arg Phe Gln Ala Lys Asp Ile Leu Glu 245 250 255 Ala Tyr Gln Ala Met Leu Val Met Thr Glu Leu Ala Thr Arg Thr Thr 260 265 270 Phe Cys Glx 275 <210> 12 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for SEQ ID No. 11 <400> 12 atgaaactat atctgtcggt tgatatggaa ggaattacgg gactcgtcga tcacacaaat 60 gttctgcggc agaaaaaaaa ttatgaaaga agccgcaaaa taatgacgga tgaagcaaat 120 gcagtaattt atgcaggatt tagagaacag tgctcagaag ttgtggtaaa tgacagtcat 180 tcgagtatga ataatctcct tgttgaacgg cttcatccag aaactcagct tatttcagga 240 agcgtaaaac catattcaat ggtacaggga ttagatcaga cttttgatgg tgctatgttt 300 ctaggatatc atgctaaagc atccatgcct ggtgtcatgt ctcattcgat gatatggggt 360 gctcgcaata tgtacataga cgatacgaat attggagagt taggcttcaa tgcatatgtc 420 gcaggctatt acggcgtgcc agttttaatg gtagtcggtg atgaccaaac ggcgttggaa 480 gcacagcagc ttattccaaa cgtgacgact gctatcgtca aacaggccat ttcacgttct 540 gcagccaaaa cattaacccc taagaaagca gaacaattac ttcaagaaaa aacagccgca 600 gctattcaac atagacacct tgttaaacct ttacttccac ctaaacatcc aaccttacga 660 atagagtttg caaattacgg tcaagcagag tgggcgcact taatgccggg cacagaaatt 720 gagcctggaa cgacgactgt tcggtttcaa gcaaaagata ttttagaagc ttatcaggcc 780 atgcttgtta tgactgaatt agcgacgcgc acaacattct gttag 825 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 8 <400> 13 tcgatgatag ctggtgctcg caata 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 8 <400> 14 atgagacatg acaccaggca tggat 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 10 <400> 15 tcgatgatat atggtgctcg caata 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 10 <400> 16 atgagacatg acaccaggca tggat 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 12 <400> 17 tcgatgatat ggggtgctcg caata 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 12 <400> 18 atgagacatg acaccaggca tggat 25

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, D-입체특이적 아미노산 아미다아제.
  2. 삭제
  3. 청구항 1의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 암호화하는 유전자.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  5. 청구항 3의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  6. 청구항 5의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 청구항 1의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 유효성분으로 포함하는 D-아미노산 생산용 조성물.
  9. 청구항 6의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    상기 형질전환체의 배양물로부터 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 분리하는 단계를 포함하는 D-입체특이적 아미노산 아미다아제의 생산 방법.
  10. 청구항 1의 D-입체특이적 아미노산 아미다아제를 아미노산 아미드와 반응시키는 단계;를 포함하는 D-아미노산 생산 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 D-입체특이적 아미노산 아미다아제와 아미노산 아미드의 반응 생성물로부터 D-아미노산을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 D-아미노산 생산 방법.
  12. 청구항 6의 형질전환체를 아미노산 아미드의 존재 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 D-아미노산 생산 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 형질전환체된 배양물로부터 D-아미노산을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 D-아미노산 생산 방법.
  14. 청구항 10 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 D-아미노산은 D-트레오닌인 것을 특징으로 하는 D-아미노산 생산 방법.
KR1020180120620A 2017-10-27 2018-10-10 신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법 KR102118898B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170141116 2017-10-27
KR1020170141116 2017-10-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190047602A KR20190047602A (ko) 2019-05-08
KR102118898B1 true KR102118898B1 (ko) 2020-06-05

Family

ID=66580531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180120620A KR102118898B1 (ko) 2017-10-27 2018-10-10 신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102118898B1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100352192B1 (ko) * 2000-02-03 2002-09-12 한국생명공학연구원 신규 고온성 미생물 브레비바실러스 보스테렌시스ｂｃｓ-1 및 그로부터 생산되는 내열성 ｄ-입체특이적아미노산 아미다아제
KR100449456B1 (ko) * 2001-07-14 2004-09-21 한국생명공학연구원 신규한 ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자, 그의 제조방법, 이를 이용한 ｄ-아미노산의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Eur J Biochem.,267(7):2028-2035(2000.4.)
J Ind Microbiol Biotechnol.,69(2):980-986(2003.2.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190047602A (ko) 2019-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5232247B2 (ja) Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法
JPH08333395A (ja) ヒトプロインスリン誘導体およびヒトインスリンの製造方法
JP4672815B2 (ja) Ｌ−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法
JP6638086B2 (ja) フルクトースからアロースを生産する菌株およびこれを用いたアロース生産方法
RU2669996C2 (ru) Новый мутантный белок орнитиндекарбоксилаза и его применение
KR102118898B1 (ko) 신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법
KR102212488B1 (ko) 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 입체특이적 생산 방법
JP6675520B2 (ja) Ｄ型アミノ酸脱水素酵素
CN109136209B (zh) 肠激酶轻链突变体及其应用
JP6675519B2 (ja) Ｄ型アミノ酸脱水素酵素
KR101708974B1 (ko) 신규한 수크로스이성화효소 및 이의 제조방법
KR100888513B1 (ko) 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법
KR102207688B1 (ko) 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 생산 방법
KR20200045978A (ko) 신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법
KR101965210B1 (ko) 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법
KR101725454B1 (ko) 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법
KR102424603B1 (ko) 알코올 탈수소효소 변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법
KR102675089B1 (ko) 디펩티드 합성 활성을 갖는 단백질 및 이를 이용한 디펩티드의 생산 방법
KR101617526B1 (ko) 활성이 개선된 대장균 유래의 돌연변이 당 이성질화 효소 및 그를 이용한 l-굴로스의 생산
TWI756604B (zh) 鳥胺酸脫羧酶變異體、使用其製造丁二胺之方法、聚核苷酸、微生物、聚醯胺的製備方法以及聚醯胺製備用組成物
KR20160144258A (ko) 숙신산 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법
KR102232839B1 (ko) 투라노스 생산 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 투라노스 제조방법
KR20230077068A (ko) CYP153A33 효소 변이체, 및 이를 이용한 α,ω-디올 화합물의 생산 방법
JP2011239686A (ja) ペプチド及びペプチド誘導体の製造方法
KR101715882B1 (ko) 신규 ε-카프로락탐 전환 효소 및 이를 이용한 ε-카프로락탐 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right