JP5232247B2 - L−サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたl−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子;
(c)配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(i)分子量:43kDa(SDS−PAGE);
(ii)基質特異性:N−サクシニルターシャリーロイシン、N−サクシニルビフェニルアラニン、N−サクシニルシクロヘキシルグリシン、N−サクシニルジクロロフェニルアラニン、N−サクシニルブロモフェニルアラニンに作用する;
(iii)温度安定性:30分間熱処理した場合、70℃では安定であり75℃以上では失活する;
(iv)至適温度:pH7〜8で反応させる場合、温度55〜60℃において作用が至適である;および
(v)至適pH:60℃で30分間反応させる場合、pH7において作用が至適である。
反応液中のN−サクシニル−DL−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に1重量%〜30重量%である。
(1)N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンの合成
D−ターシャリーロイシン(東京化成工業製)とL−ターシャリーロイシン(東京化成工業製)の等モル混合物10gを水50mlと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)15gに溶解し、無水コハク酸8gと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)15gを加え、20℃〜40℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンの白色粉末を14g得た。
(2)N−サクシニル−DL−バリンの合成
D−バリン(ナカライテスク製)とL−バリン(ナカライテスク製)の等モル混合物10gを水50mlと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)17gに溶解し、無水コハク酸(ナカライテスク製)8.8gと20%水酸化ナトリウム溶液(ナカライテスク製)17gを加え、20℃〜40℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸(ナカライテスク製)で中和後、酢酸エチル(ナカライテスク製)で抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、N−サクシニル−DL−バリンの白色粉末を15g得た。
(3)N−サクシニル−DL−フェニルアラニン、N−サクシニル−DL−トリプトファン、N−サクシニル−DL−アスパラギン、N−サクシニル−DL−セリン、N−サクシニル−DL−チロシン、N−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシン、N−サクシニル−DL−4−ブロモフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−ビフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−3,4−ジクロロフェニルアラニンの合成
これらのN−サクシニル−DL−アミノ酸は、(2)のN−サクシニル−DL−バリンの合成方法に準じた方法で合成した。
(1)特開2008−61642号公報に記載のN−サクシニルラセマーゼの調製
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503の染色体DNAを次の方法で分離した。該菌株をLB液体培地(5ml仕込み/30ml容試験管;1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%NaCl、pH7.4)に1白金耳植菌し、50℃にて一晩振とう培養した。この菌体1ml分から遠心分離(12000rpm、10分間、4℃)により菌体を回収した。回収した菌体よりMagExtractor−genome−キット(東洋紡製)を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体DNAを抽出した。1mlの菌体より約20μgの染色体DNAを取得した。
次に、得られた染色体DNAを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503株由来のN−サクシニルラセマーゼ遺伝子(配列番号3)を、PCRで増幅した。PCRプライマーは、5’プライマー(5’−AAG GAG GTA AAA TGG CGA TCA ACA TCG AGT AC−3’(配列番号:4))および3’プライマー(5’−TCT AGA TTA TGC CGT CGC CGT ACG ATG AAA−3’(配列番号:5))を用いた。これらのPCRプライマーおよびKOD Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡製)を用いて、上記の染色体DNAを鋳型としてPCR(94℃・15秒、55℃・30秒、68℃・90秒を30サイクル)を行った。
次に、クローニングキットTarget Clone−Plus(東洋紡製)を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターpBluescriptにクローニングし、組換え発現プラスミドpBSNAR1を取得した。このpBSNAR1を用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)JM109株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーJM109(pBSNAR1)と命名した。
TB培地(500ml)を2L容坂口フラスコ2個に分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が100μg/mlと0.1mMになるように添加した。この培地に、アンピシリン(100μg/ml)を含むLB培地で予め30℃、16時間培養したエシェリヒア・コリーJM109(pBSNAR1)の培養液を5ml接種し、37℃で24時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、50℃、1時間の熱処理後、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で透析を行った。更にDEAEセファロースCL−6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)、およびオクチルセファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス製)の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
クロロフレクサス・オーランティアカス由来のN−サクシニルラセマーゼ(以下、NAAAR)遺伝子(配列番号6)を、この配列の上流と下流にそれぞれNdeI、BamHIサイトを付加し、細胞工学別冊「植物のPCR実験プロトコール」(p84−89,秀潤社刊)に記載の方法で人工的に合成した。ベクターpBluescriptII KSN+にクローニングし、組換え発現プラスミドpCFNARを取得した。このpCFNARを用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)DH5α株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーDH5α(pCFNAR)と命名した。
TB培地(500ml)を2L容坂口フラスコ2個に分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が100μg/mlと0.1mMになるように添加した。この培地にアンピシリン(100μg/ml)を含むLB培地で予め30℃、16時間培養したエシェリヒア・コリーDH5α(pCFNAR)の培養液を5ml接種し、37℃で24時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で透析を行った。更にDEAEセファロースCL−6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)のカラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスIFO12983の染色体DNAを次の方法で分離した。該菌株をLB液体培地(5ml仕込み/30ml容試験管;1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%NaCl、pH7.4)に1白金耳植菌し、50℃にて一晩振とう培養した。この菌体1ml分から遠心分離(12000rpm、10分間、4℃)により菌体を回収した。回収した菌体よりMagExtractor−genome−キット(東洋紡製)を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体DNAを抽出した。1mlの菌体より約20μgの染色体DNAを取得した。
次に、得られた染色体DNAを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスIFO12983株由来のL−サクシニルアミノアシラーゼ遺伝子(配列番号1)を、PCRで増幅した。PCRプライマーは、5’プライマー(5’−AAG GAG GTA AAA TGA AAG AAA TTA TTC AGC AGA TGA AAG C−3’(配列番号:7))および3’プライマー(5’−TCT AGA TCA ATG ATT TGC AGC GAT AGA GAC ACG−3’(配列番号:8))を用いた。これらのPCRプライマー、およびKOD Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡製)を用いて、上記の染色体DNAを鋳型としてPCR(94℃・15秒、55℃・30秒、68℃・90秒を30サイクル)を行った。
次に、クローニングキット(Target Clone(登録商標)−Plus−、東洋紡製)を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られたベクターをベクターpBluescriptにクローニングし、組換え発現プラスミドpLSA2を取得した。このpLSA2を用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)JM109株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーJM109(pLSA2)と命名した。
TB培地(500ml)を2L容坂口フラスコ2個に分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が100μg/mlと0.1mMになるように添加した。この培地に、アンピシリン(100μg/ml)を含むLB培地で予め30℃、16時間培養したエシェリヒア・コリーJM109(pLSA2)の培養液を5ml接種し、37℃で24時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、50℃、1時間の熱処理後、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で透析を行った。さらにDEAEセファロースCL−6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)、およびオクチルセファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス製)の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。得られた標品は、SDS−PAGEにより、単一であることが確認された。
上記の(1)で合成したN−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、0.1Nの水酸化ナトリウム(ナカライテスク製)で、pH調整を行い、5重量% N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン溶液(pH7〜8)を調製した。この溶液10mlに、0.5mM(終濃度)CoCl2と5.8mg/mlの実施例1で調製したL−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を0.5ml添加し、反応液(pH 7〜8)を調製した。この反応液を撹拌しながら57℃で144時間保持した。反応開始の24時間後、48時間後、72時間後、および144時間後にサンプルを採取し、以下の条件でHPLC測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンからのL−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
カラム:Inertsil ODS−2(粒径5μm、内4.6mm×長さ250mm)GLサイエンス(株)製
溶離液:pH2.3リン酸水溶液/HPLC用アセトニトリル=80:20
流速:0.8ml/min カラム温度:40℃ 検出器:210nm
N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンの代わりに上記の(2)および(3)で合成したN−サクシニル−DL−バリン、N−サクシニル−DL−フェニルアラニン、N−サクシニル−DL−トリプトファン、N−サクシニル−DL−アスパラギン、N−サクシニル−DL−セリン、N−サクシニル−DL−チロシン、N−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシンを使用して、実施例2と同様の条件で反応を96時間行った。ただし、各N−サクシニル−DL−アミノ酸の濃度は10重量%にした。反応終了後、サンプルを採取して実施例2と同様の条件でHPLC測定を行い、N−サクシニル−DL−バリン、N−サクシニル−DL−フェニルアラニン、N−サクシニル−DL−トリプトファン、N−サクシニル−DL−アスパラギン、N−サクシニル−DL−セリン、N−サクシニル−DL−チロシン、N−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシンに対応する各L−アミノ酸への変換率を算出した。
N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン溶液の濃度を1重量%にし、上記の(1)で調製した9.6mg/mlのN−サクシニルラセマーゼ0.1mlを反応液に添加しておいたことを除いては、実施例2と同様の条件で反応を90時間行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例2と同様の条件でHPLC測定を行い、L−ターシャリーロイシンの収率を算出したところ、収率は90%以上であり、理論上の最高収率である100%に近い値が得られた。
N−サクシニルラセマーゼとして上記の(2)で調製したものを使用したことを除いては、実施例4と同様にして反応を120時間行い、反応開始の24時間後、48時間後、および120時間後にサンプルを採取して実施例2と同様の条件でHPLC測定を行い、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンからのL−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
上記の(1)で合成したN−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、0.1Nの水酸化ナトリウム(ナカライテスク製)で、pH調整を行い、5重量% N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン溶液(pH7〜8)を調製した。この溶液10mlに、0.5mM(終濃度)CoCl2と、10mg/mlに調製した上記の(2)のN−サクシニルラセマーゼ0.1mlを添加した。得られた溶液に、2.5mg/mlに調製した特許文献3の実施例1に記載のL−サクシニルアミノアシラーゼ、または2.5mg/mlに調製した上記実施例1で得られた本発明のL−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を0.1ml添加した。得られた反応液を撹拌しながら50℃で144時間保持した。反応開始の24時間後、48時間後、72時間後、および144時間後にサンプルを採取し、HPLC測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンからのL−ターシャリーロイシンの合成を確認した。
上記の(3)で合成したN−サクシニル−DL−4−ブロモフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−ビフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−3,4−ジクロロフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシン、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンを使用し、それぞれ10重量%のアミノ酸溶液(pH7.5)を調製した。0.1M HEPES−NaOH(pH7.5)緩衝液0.25ml、0.1M酢酸コバルト溶液0.025ml、各アミノ酸溶液0.5ml、蒸留水4.2mlを混合物した溶液に、5mg/mlに調製した特許文献3の実施例1に記載のL−サクシニルアミノアシラーゼ、または5mg/mlに調製した上記実施例1で得られた本発明のL−サクシニルアミノアシラーゼの溶液を0.025ml添加した。得られた反応液を、50℃で撹拌しながら4時間反応を行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例2と同様の条件でHPLC測定を行い、N−サクシニル−DL−4−ブロモフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−ビフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−3,4−ジクロロフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシン、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシンに対応する各L−アミノ酸への変換率を算出した。
配列番号6は、大腸菌株K−12中で効率的に発現されるように設計されたNAAARをコードするDNAの配列である。
Claims (5)
- 下記(a)〜(d)のいずれか1つで表されるタンパク質を用いてN−サクシニル−DL−アミノ酸中のN−サクシニル−L−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするL−アミノ酸の製造方法:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1に記載の塩基配列に対して90%以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。 - N−サクシニルラセマーゼを用いてN−サクシニル−D−アミノ酸をラセミ化してN−サクシニル−L−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 下記(a)〜(d)のいずれか1つで表されるタンパク質を用いてN−サクシニル−DL−アミノ酸中のN−サクシニル−L−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、およびN−サクシニルラセマーゼを用いてN−サクシニル−D−アミノ酸をラセミ化してN−サクシニル−L−アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項2に記載の方法:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1に記載の塩基配列に対して90%以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、L−サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。 - N−サクシニル−DL−アミノ酸が、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン、N−サクシニル−DL−ビフェニルアラニン、N−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシン、N−サクシニル−DL−ジクロロフェニルアラニン、またはN−サクシニル−DL−ブロモフェニルアラニンであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- N−サクシニル−DL−アミノ酸が、N−サクシニル−DL−ターシャリーロイシン、N−サクシニル−DL−ビフェニルアラニン、またはN−サクシニル−DL−シクロヘキシルグリシンであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
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