JPS6244181A - 耐熱性アミノアシラ−ゼｓｋ−１及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、耐熱性アミノアシラーゼ及びその製造法に関
する。更に詳細には、７０℃、１０分処理においても全
く失活しない耐熱性アミノアシラーゼ及びバチルス・ス
テアロサーモフィラスを培養し、培養物中より該耐熱性
アミノアシラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ア
ミノアシラーゼの製造法に関する。

本発明の耐熱性アミノアシラーゼは、Ｄ、Ｌ−アミノ酸
を光学的に分割するのに好適に利用されうる。

「従来技術」 アミノアシラーゼは、動物、植物、微生物にわたって広
く分布していることが知られているが、アミノアシラー
ゼを工業的に使用するにあたっては、微生物起源のアミ
ノアシラーゼが好ましい。

微生物によるアミノアシラーゼ生産例としては、アスペ
ルギルス、ペニシリウム属等の糸状菌（特公昭３５−１
０６９２号）、ファカルタティブ・メタノール資化性細
菌（特公昭６０−１９９９６号）、シュードモナス・ク
ルジビニ（特公昭４３−２４４６２号）、放線菌（特公
昭４３−２４４５６号）等が知られている。

更に最近になって、工業的により有利な耐熱性アミノア
シラーゼ産生能を有するアスペルギルス属の報告もなさ
れている（特公昭５７−４３１０号）。

「発明が解決すべき問題点」 従来の微生物起源のアミノアシラーゼは、工業的に使用
する場合に耐熱性が弱いという欠点が有り、一方、特公
昭５７−４３１０号の耐熱性アミノアシラーゼは、従来
のものに比較してより有利に使用出来るというものの、
７０’Ｃ，５分の処理において３５％も失活するので必
ずしも安定性において十分ではなく、依然としてより耐
熱性にすぐれたアミノアシラーゼが望まれていた。

［問題点を解決すべき手段」 そこで本発明者らは、より耐熱性に富むアミノアシラー
ゼを生産する微生物を求め鋭意検討した。

その結果、中等度好熱性細菌の一種であるバチルス・ス
テアロサーモフィラスの１菌株を培養したところ該菌株
が菌体中に耐熱性アミノアシラーゼを著量産生すること
を見いだし、これを採取することにより本発明を完成し
た。

本発明で用いる耐熱性アミノアシラーゼ生産菌は、バチ
ルス・ステアロサーモフィラスＩＦ０１２９８３であり
、本菌株を用いた培養条件及び精製酵素標品の調製法を
以下にのべる。

本望の栄養源としては、グルコース、マルトース等の炭
素源、ペプトン、肉エキス等の窒素源、ＮａＣ１，Ｋ２
）ＩＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２　
。

ＭｎＣｌ２等の各種無機塩及び酵母エキスよりなる培地
を使用する。なおＮ−アセチル−アミノ酸の添加は、本
望の耐熱性アミノアシラーゼ生産を誘導する効果を有し
、そして又、無機塩、特にＣａイオン、Ｍｎイオンの添
加は本望の生育を促進する効果がある。

本望を接種後５０〜ｂ 養を行い、得られた菌体をダイノミルで破砕後、遠心分
離等の手段にて無細胞抽出液を調製し、粗酵素液を得る
。

粗酵素液は、ＤＥＡＥ−セルロース、ブチル−トヨパー
ル（東洋曹達工業社製、商品名）、ヒドロキシアパタイ
ト等の各種クロマトグラフィー等の手段、更には、ゲル
ろ過、高速液体クロマトグラフィー及び高性能イオン交
換クロマトグラフィー等の手段を駆使して精製し、結晶
化して、電気泳動的に単一な酵素標品とすることもでき
る。

こうして得られた精製アミノアシラーゼの酵素化学的性
質を以下に述べる。

１）作用二本酵素は、Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−アミノ酸
に作用し、■、−アミノ酸を遊離 させる。

２）基質特異性：本酵素は表１に示すとおり、アセチル
化アミノ酸のＬ体のみに作 用し、Ｄ体には、全く作用しない。

そしてアセチル化し一アミノ酸で は、Ｎ−アセチルＬ−メチオニン よりもＮ−アセチルＬ−フェニル アラニンに良く作用する。更に又 、クロロアセチル体の方がアセチ ル体よりもはるかに良く作用する 。

（以下余白） 表　　１ ３）至適ｐＨ：８．ｏ付近である。

４）ｐＨ安定性：５０℃、　１０分処理においてｐＨ５
，０〜１０．０まで安定である。

５）至適温度＝６０℃付近である。

６）温度安定性二本酵素は、ｐＨ７において７０°Ｃ１
１０分の処理では１００％安定であり、７０℃、３０分
の処理で９０％又、８０°Ｃ１１０分の処理でも８５％
の活性が残存 する。

しかし、８０℃、３０分処理すると、 完全に失活する。

７）活性測定法：　０．２５Ｍブリトンーロビンソン緩
衝液（ｐＨ８，０）　　０．２ｍｇ、１０−３ＭＧｏＣ
１２０，１−酵素溶液０．３−からなる混合液を５０℃
、５分インキュ ベートし、次いで０．２Ｍ　Ｎ−アセ チル−Ｄ、Ｌ−メチオニン０．４ｍｌ＋を°加え５０℃
、１０〜４０分反応後、２０％トリクロロ酢酸０．２ｍ
を加え、遠心 分離上清１．０艷にニンヒドリン− ヒドリダンチン１．Ｏｍｆ’を加え、１００℃、１５分
間加熱したものにアセト ン：　　０．ＩＭ　Ｎａ３ＰＯ４：水＝　４　：　２．
４：３．６からなる希釈液３．０−を加 えて吸光度Ａ　５７０ｎｍの波長を測定する。なお、上
記条件下で毎分１ μｍｏｌｅのＬ−メチオニンを生成す る酵素量を１単位とした。

８）阻害剤：ＳＨ阻害剤であるＰ−クロロメルクリ安息
香酸、５．５゛−ジチオビス （２−ニトロ安息香酸）　、２．２°−ジチオピリジン
及び２−ニトロ−５−チ オシアノ安息香酸により失活する。

９）金属塩の影響二本酵素の各種金属イオンによる影響
について表２に示した。即 ち本酵素はＣｏ”、Ｎｉｚ＋により 活性化され、Ｈｇ２＋及びＣｕ２＋に より阻害される。

（以下余白） 表　　２ １０）サブユニットの分子量：　　４２，０００　　（
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法に よる。） １１）分子量：約８５，０００　　（ゲルろ適法による
。）１２）電気泳動での移動度：　Ｒｍ　ＢＰａ　＝　
０．８５である。

１３）結晶形：無色の針状結晶である。

上記の酵素化学的性質を示す本発明の耐熱性アミノアシ
ラーゼと特公昭５７−４３１０記載の耐熱性アシラーゼ
の性質を表３に比較する。

表３ 表３より明らかのように、本発明の耐熱性アミノアシラ
ーゼは、特公昭５７−４３１０号の耐熱性アミノアシラ
ーゼに比較してより広いｐＨ安定範囲を有し、かつ温度
安定性も高い。更に又ＣｏＣｌ２での活性化も著しく相
違するので両者は明らかに酵素化学的性質を異にする。

従って本発明の耐熱性アミノアシラーゼは新規酵素であ
り、本発明者らは、これを耐熱性アミノアシラーゼＳＫ
−１と命名することにした。

以下に耐熱性アミノアシラーゼＳＫ−１の製造法につい
て実施例にて具体的に説明する。

実施例 グリセロール１％、ペプトン１．５％、　ＮａＣ１０，
２％、　　Ｋ２ＨＰＯ４０，２％、　ＫＨ２ＰＯ４０，
２％、　ＭｇＳＯ４０，０１％、　ＣａＣｌ２０．００
７％、　ＭｎＣｌ２０．０００２％、酵母エキス　０．
２％及び肉エキス０．１％からなる種培養培地（ｐ）１
７．２　）にバチルス・ステアロサーモフィラスＩ　Ｆ
　Ｏ１２９８３を接種し、５５°Ｃで２４時間培養を行
い、次いでこのものをあらかじめ　１１０℃。

１０分間殺菌したグルコース１％、Ｎ−アセチル−Ｄ、
Ｌ−メチオニン２％、ペプトン０．５％、　ＮａＣ１０
，２％、　　Ｋ２ＨＰＯ４０，２％、　にＨ２ＰＯ４０
，２％、　ＭｇＳＯ４０、旧％、　ＣａＣｌ２　０．０
０７％、　ＭｎＣｌ２　０．０００２％、酵母エキス０
，２％及び肉エキス０．１％からなる培地（ｐＨ７，２
）　　１５０Ａを含む２０ＯＡジャーファメンターに接
種し、５５°Ｃ，８時間通気攪拌培養した。培養終了後
、得られた菌体９４０ｇをダイノミルで破砕後、遠心分
離し、無細胞抽出液を調製し、耐熱性アミノアシラーゼ
ＳＫ−１粗酵素液　０．６５βを得た。本粗酵素液の総
活性は、１０２０ｕであった。

次いで本粗酵素液をＤＥＡＥ−セルロース、ブチルトヨ
バール（東洋曹達社製、商品名）、ヒドロキシアパタイ
トなどの各種クロマトグラフィーにて処理したのち、更
にセルロファインＧＣＬ−２０００ｓｆ　（生化学工業
社製、商品名）によるゲルろ過処理、Ｔｏｙｏ　５ｏｄ
ａ　ＴＳＫ　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ　（東洋曹達社製、
商品名）による高速液体クロマトグラフィー処理及びＦ
ＰＬＣＭｏｎｏＱ　　（ファルマシア社製、商標名）に
よる高性能イオン交換クロマトグラフィー処理を施すこ
とによって本酵素を単一化し結晶化することができた。

結晶化耐熱性アミノアシラーゼＳＫ−１１■の総活性は
８ｕで粗酵素液からの収率はＵ％であった。

「発明の効果」 本発明の耐熱性アミノアシラーゼＳＫ−１は、従来のい
ずれのアミノアシラーゼよりも耐熱性に優れており、Ｄ
、Ｌ−アミノ酸の光学分割に使用する場合特に有利であ
る。

そして又、バチルス・ステアロサーモフィラスを好気的
条件下で培養することによって容易に該酵素を取得する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は本発明の耐熱性アミノアシラーゼＳＫ
−１の酵素化学的性質を示すものであり、そのうち第１
図は至適ｐＨ曲線を、第２図はｐＨ安定曲線を、第３図
は温度安定曲線をそして第４図は至適温度曲線をそれぞ
れ示すものである。なお第３図における白丸は、各温度
で１０分処理した場合、黒丸は各温度で３０分処理した
場合をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　以下の酵素化学的性質を有する耐熱性アミノアシラ
   ーゼＳＫ−１ １）作用：Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に作用し、
   Ｌ−アミノ酸を遊離させる。 ２）基質特異性：アセチル化アミノ酸のＬ体のみに作用
   し、Ｄ体には全く作用しない。そしてアセチル化Ｌ−ア
   ミノ酸では、Ｎ−アセチルＬ−メチオニンよりもＮ−ア
   セチル−Ｌ−フェニルアラニンに良く作用する。 ３）至適ｐＨ：８．０付近 ４）ｐＨ安定性：５０℃、１０分処理においてｐＨ５．
   ０〜１０．０まで安定である。 ５）至適温度：６０℃付近 ６）温度安定性：７０℃、１０分処理において全く失活
   せず、７０℃、３０分処理においても９０％安定である
   。 ７）阻害剤：ＳＨ阻害剤であるパラクロロメルクリ安息
   香酸、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、
   ２−２−ジチオジピリジン及び ＮＴＣＢにより失活する。 ８）金属塩の影響：Ｃｏ＾２＾＋、Ｎｉ＾２＾＋によっ
   て活性化され、Ｈｇ＾２＾＋、Ｃｕ＾２＾＋によって失
   活する。 ９）本酵素の電気泳動による移動度は、Ｒｍ＿Ｂ＿Ｐ＿
   Ｂ＝０．８５である。 １０）結晶形：無色の針状である。 １１）サブユニットの分子量：４２，０００（ＳＤＳ−
   ポリアクリルアミド電気泳動法による。） １２）分子量：約８５，０００（ゲルろ適法による。）
   ２　バチルス属に属する耐熱性アミノアシラーゼＳＫ−
   １生産能を有する菌株を培養し、培養物中に耐熱性アミ
   ノアシラーゼＳＫ−１を生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とする耐熱性アミノアシラーゼＳＫ−１の製造
   法。 ３　バチルス属に属する耐熱性アミノアシラーゼＳＫ−
   １生産能を有する菌株がバチルス・ステアロサーモフイ
   ルスである特許請求の範囲第２項記載の耐熱性アミノア
   シラーゼＳＫ−１の製造法。