JPH07106150B2 - 新規なl−アミノアシラ−ゼ - Google Patents
新規なl−アミノアシラ−ゼInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は食品、医薬、飼料及びその他の工業原料として
有用な光学活性アミノ酸の製造に広く利用可能なL−ア
ミノアシラーゼに関するものである。
有用な光学活性アミノ酸の製造に広く利用可能なL−ア
ミノアシラーゼに関するものである。
従来の技術 N−アシル−L−アミノ酸よりL−アミノ酸を与える反
応を触媒する酵素として、動物由来のものでは豚腎アミ
ノアシラーゼ[メソッヅ・イン・エンザイモロジー(Me
thods in Enzymology)第2巻、第109頁(1955年)参
照]、また微生物由来のものとしてはラクトバシルス・
アラビノーサス(Lactobacillus arabinosus)[Park.
R.W.et al,:ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry)第235
巻、第3193頁(1960年)参照]、コリネバクテリウム
(Corynebacterium)[奥田等:特公昭49−13989号公報
参照]、アスペルギルス(Aspergillus)及びリゾープ
ス(Rhizopus)ファミリー[千畑等:ブレチン・オブ・
ジ・アグリカルチュラル・ケミカル・ソサエテイ・オブ
・ジャパン(Bulletin of the Agricultural Chemical
Society of Japan)21巻、第5号、第304〜第307頁)19
57年);Solodovnikora,N.I.et al:Inst.Biosin.Belkovy
kh Veshchesto第1巻、第145頁〜151頁(1972年)参
照]等の菌体内に広く分布することが知られている。し
かし主に工業的に利用されているのは、コスト上の問題
により、糸状菌由来のアミノアシラーゼに限られてい
る。現在市販されているアミノアシラーゼとしては、ア
シラーゼアマノ(天野製薬製)、アシラーゼ東京化成
(東京化成製)及びアシラーゼI(マイルス・ラボラト
リー製)が知られている。
応を触媒する酵素として、動物由来のものでは豚腎アミ
ノアシラーゼ[メソッヅ・イン・エンザイモロジー(Me
thods in Enzymology)第2巻、第109頁(1955年)参
照]、また微生物由来のものとしてはラクトバシルス・
アラビノーサス(Lactobacillus arabinosus)[Park.
R.W.et al,:ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー(Journal of Biological Chemistry)第235
巻、第3193頁(1960年)参照]、コリネバクテリウム
(Corynebacterium)[奥田等:特公昭49−13989号公報
参照]、アスペルギルス(Aspergillus)及びリゾープ
ス(Rhizopus)ファミリー[千畑等:ブレチン・オブ・
ジ・アグリカルチュラル・ケミカル・ソサエテイ・オブ
・ジャパン(Bulletin of the Agricultural Chemical
Society of Japan)21巻、第5号、第304〜第307頁)19
57年);Solodovnikora,N.I.et al:Inst.Biosin.Belkovy
kh Veshchesto第1巻、第145頁〜151頁(1972年)参
照]等の菌体内に広く分布することが知られている。し
かし主に工業的に利用されているのは、コスト上の問題
により、糸状菌由来のアミノアシラーゼに限られてい
る。現在市販されているアミノアシラーゼとしては、ア
シラーゼアマノ(天野製薬製)、アシラーゼ東京化成
(東京化成製)及びアシラーゼI(マイルス・ラボラト
リー製)が知られている。
発明が解決しようとする問題点 公知の糸状菌アミノアシラーゼ、例えばアシラーゼアマ
ノなどは、通常のアミノ酸、例えばL−メチオニン、L
−フェニルアラニンなどのN−アシル誘導体について広
く加水分解することが知られているが、特殊な合成アミ
ノ酸、例えばL−スレオ−N−アセチル−3−(3,4−
ジベンジルオキシフェニル)セリンなどには作用せず、
パーキンソン氏病の治療薬の合成中間体として有用なL
−スレオ−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セ
リンを得ることはできない。
ノなどは、通常のアミノ酸、例えばL−メチオニン、L
−フェニルアラニンなどのN−アシル誘導体について広
く加水分解することが知られているが、特殊な合成アミ
ノ酸、例えばL−スレオ−N−アセチル−3−(3,4−
ジベンジルオキシフェニル)セリンなどには作用せず、
パーキンソン氏病の治療薬の合成中間体として有用なL
−スレオ−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セ
リンを得ることはできない。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、公知のL−アミノアシラーゼよりも基質
特異性の広いL−アミノアシラーゼを得るべく公知の保
存菌株も含めて、鋭意探索を続けたところ、放線菌が、
従来のL−アミノアシラーゼよりも広い基質特異性を有
するL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノアシラーゼ
S2を産生することを見い出し本発明を完成した。
特異性の広いL−アミノアシラーゼを得るべく公知の保
存菌株も含めて、鋭意探索を続けたところ、放線菌が、
従来のL−アミノアシラーゼよりも広い基質特異性を有
するL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノアシラーゼ
S2を産生することを見い出し本発明を完成した。
作用 本発明は下記の理化学的性状即ち、 下記の理化学的性状、即ち、 (1)作用及び基質特異性 N−アシル−L−アミノ酸に作用してL−アミノ酸を与
えるL−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のL−アミノ酸のN−アシル体に加え、非天
然型のL−アミノ酸のN−アシル体に対しても作用す
る。一方、N−アシル−D−アミノ酸、DL−N−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びN−アセチル−D
−グルコサミンには作用しない。
えるL−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のL−アミノ酸のN−アシル体に加え、非天
然型のL−アミノ酸のN−アシル体に対しても作用す
る。一方、N−アシル−D−アミノ酸、DL−N−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びN−アセチル−D
−グルコサミンには作用しない。
(2)安定性 温度:50℃では殆んど活性が保持され、60℃でもなお僅
かに活性が残存する(pH7.0 1時間放置)。
かに活性が残存する(pH7.0 1時間放置)。
pH :pH7.0〜9.0で最も安定であり、pH10.0附近でも比
較的安定である。但し、pH4.0以下では失活する(5℃2
4時間放置)。
較的安定である。但し、pH4.0以下では失活する(5℃2
4時間放置)。
(3)反応性 温度:50℃までは直線的に活性が増加し、60℃以上では
急激に反応性が失われる。
急激に反応性が失われる。
pH :pH6.5〜9.5で反応性が高く、反応の至適pHは、pH
7.5〜8.5附近である。
7.5〜8.5附近である。
(4)分子量 50,000〜60,000(ゲル濾過法) (5)等電点 pI=7.00〜7.70 (6)ディスク電気泳動 RmBPB=0.125〜0.167 (7)金属イオンの影響 Fe++、Ni++、Ag+、Hg++及びCu++によって強く阻害され
る。また、Co++によって賦活化される。
る。また、Co++によって賦活化される。
(8)阻害剤 p−クロロ水銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード
酢酸では阻害されない。また、エチレンジアミン四酢酸
2ナトリウムにより、緩かに阻害される。
酢酸では阻害されない。また、エチレンジアミン四酢酸
2ナトリウムにより、緩かに阻害される。
を有する放線菌由来のL−アミノアシラーゼS1及び下記
の理化学的性状、即ち、 (1)作用及び基質特異性 N−アシル−L−アミノ酸に作用してL−アミノ酸を与
えるL−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のL−アミノ酸のN−アシル体に加え、非天
然型のL−アミノ酸のN−アシル体に対しても作用す
る。一方、N−アシル−D−アミノ酸、DL−N−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びN−アセチル−D
−グルコサミンには作用しない。
の理化学的性状、即ち、 (1)作用及び基質特異性 N−アシル−L−アミノ酸に作用してL−アミノ酸を与
えるL−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のL−アミノ酸のN−アシル体に加え、非天
然型のL−アミノ酸のN−アシル体に対しても作用す
る。一方、N−アシル−D−アミノ酸、DL−N−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びN−アセチル−D
−グルコサミンには作用しない。
(2)安定性 温度:50℃まで失活しないが、60℃では80%の活性が保
持され、さらに70℃においても20%以上の活性が残存す
る(pH7.0 10分間放置)。
持され、さらに70℃においても20%以上の活性が残存す
る(pH7.0 10分間放置)。
pH :pH8.5〜10.0で最も安定であり、pH3.5及びpH11.0
附近でも50%の活性が残存する(5℃24時間放置)。
附近でも50%の活性が残存する(5℃24時間放置)。
(3)反応性 温度:60℃までは直線的に相対活性は増加し、70℃でも
なお70%以上の反応性が認められる。
なお70%以上の反応性が認められる。
pH :pH7.0〜10.0で反応性が高く、反応の至適pHは、pH
8.0〜9.0附近である。
8.0〜9.0附近である。
(4)分子量 50,000〜60,000(ゲル濾過法) (5)等電点 pI=6.38〜7.42 (6)ディスク電気泳動 RmBPB=0.180〜0.280 (7)金属イオンの影響 Cu++、Mn++、Co++、Hg++、Fe++、Ni++及びAg+によって
強く阻害される。
強く阻害される。
(8)阻害剤 p−クロロ水銀安息香酸、L−システイン及びモノヨー
ド酢酸により強く阻害を受けるが、エチレンジアミン四
酢酸2ナトリウムでは殆んど阻害されない。
ド酢酸により強く阻害を受けるが、エチレンジアミン四
酢酸2ナトリウムでは殆んど阻害されない。
を有する放線菌由来のL−アミノアシラーゼS2に関する
ものである。
ものである。
第1表より本発明のL−アミノアシラーゼS1は特殊な合
成アミノ酸を含む広い範囲のL−アミノ酸のN−アシル
誘導体に作用し、公知のL−アミノアシラーゼより基質
特異性が広いものである。通常、アシラーゼはアシル基
としてアセチル基、クロロアセチル基などが好ましくベ
ンゾイル基などは加水分解しない場合が多い。一部の細
菌の生産するアシラーゼはエンゾイル基に選択的に作用
するが、アセチル基などは加水分解されない。これに対
し、本発明のL−アミノアシラーゼS1はアシル基に対し
ても広い基質特異性を示し、アセチル基、クロロアセチ
ル基などが最も好ましいが、ベンゾイル基であっても簡
単に加水分解する。
成アミノ酸を含む広い範囲のL−アミノ酸のN−アシル
誘導体に作用し、公知のL−アミノアシラーゼより基質
特異性が広いものである。通常、アシラーゼはアシル基
としてアセチル基、クロロアセチル基などが好ましくベ
ンゾイル基などは加水分解しない場合が多い。一部の細
菌の生産するアシラーゼはエンゾイル基に選択的に作用
するが、アセチル基などは加水分解されない。これに対
し、本発明のL−アミノアシラーゼS1はアシル基に対し
ても広い基質特異性を示し、アセチル基、クロロアセチ
ル基などが最も好ましいが、ベンゾイル基であっても簡
単に加水分解する。
(2)熱安定性 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)のリン酸カリ
ウム緩衝溶液(pH7.0)を各温度で1時間処理した後、
残存活性を測定した。なお、基質としてL−スレオ−N
−アセチル−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)
セリン、(以下N−Ac−DB−DOPSと略す)を用い、37℃
にて1時間反応させ、ニンヒドリン法により遊離したL
−スレオ−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セ
リン(以下DB−DOPSと略す)を測定することにより酵素
活性を定めた。測定結果を第1図に示す様にpH7.0、60
℃の処理で95%以上が失活するが、50℃以下では全く安
定である。
ウム緩衝溶液(pH7.0)を各温度で1時間処理した後、
残存活性を測定した。なお、基質としてL−スレオ−N
−アセチル−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)
セリン、(以下N−Ac−DB−DOPSと略す)を用い、37℃
にて1時間反応させ、ニンヒドリン法により遊離したL
−スレオ−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セ
リン(以下DB−DOPSと略す)を測定することにより酵素
活性を定めた。測定結果を第1図に示す様にpH7.0、60
℃の処理で95%以上が失活するが、50℃以下では全く安
定である。
(3)反応温度 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)をリン酸カリ
ウム緩衝溶液(pH7.0)中で、基質であるN−Ac−DB−D
OPSと1時間各種の温度条件で反応させ、相対活性を上
記の方法より測定した。その結果を第2図に示す。アシ
ラーゼ同様、失活限界であるほぼ50℃まで反応性は直線
的の上昇するが、これ以上の温度では急激に失活する。
ウム緩衝溶液(pH7.0)中で、基質であるN−Ac−DB−D
OPSと1時間各種の温度条件で反応させ、相対活性を上
記の方法より測定した。その結果を第2図に示す。アシ
ラーゼ同様、失活限界であるほぼ50℃まで反応性は直線
的の上昇するが、これ以上の温度では急激に失活する。
(4)pH安定性 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)液を各pH条件
下で5℃,24時間放置した。ついで各々をpH7.0に調整し
た後、基質であるN−Ac−DB−DOPSと37℃、1時間反応
させ、上記の方法により残存活性を測定した。その結果
を第3図に示す。
下で5℃,24時間放置した。ついで各々をpH7.0に調整し
た後、基質であるN−Ac−DB−DOPSと37℃、1時間反応
させ、上記の方法により残存活性を測定した。その結果
を第3図に示す。
本発明のL−アミノアシラーゼS1は弱塩基性条件下すな
わちpH7.0〜9.0で最も安定であり、pH10.0附近において
も比較的安定である。
わちpH7.0〜9.0で最も安定であり、pH10.0附近において
も比較的安定である。
(5)反応pH 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)を37℃で種々
のpH条件下、基質であるN−Ac−DB−DOPSと1時間反応
させ、上記の方法により相対活性を測定した。その結果
を第4図に示す。本発明のL−アミノアシラーゼS1はpH
7.0〜10.0で反応性が高く、至適pHは7.5〜8.5附近であ
る。
のpH条件下、基質であるN−Ac−DB−DOPSと1時間反応
させ、上記の方法により相対活性を測定した。その結果
を第4図に示す。本発明のL−アミノアシラーゼS1はpH
7.0〜10.0で反応性が高く、至適pHは7.5〜8.5附近であ
る。
(6)分子量 セファデックスG−100(ファルマシア社製)のゲル濾
過法により、本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)
の分子量を測定した。本酵素のL−アミノアシラーゼS1
の分子量は50,000〜60,000ダルトンの範囲内にある。
過法により、本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)
の分子量を測定した。本酵素のL−アミノアシラーゼS1
の分子量は50,000〜60,000ダルトンの範囲内にある。
なお、標準タンパク標品としてはチトクロームC(分子
量12,500)、カーボニックアンヒドラーゼ(分子量29,0
00)、鶏卵アルブミン(分子量45,000)、及び牛血清ア
ルブミン(分子量67,000)を使用した。
量12,500)、カーボニックアンヒドラーゼ(分子量29,0
00)、鶏卵アルブミン(分子量45,000)、及び牛血清ア
ルブミン(分子量67,000)を使用した。
(7)等電点 アンフォラインPAGプレート(LKB社製)を用いて4℃、
2時間800Vを通電し、本発明のL−アミノアシラーゼS1
の等電点を測定した。一般に公知のアミノアシラーゼが
酸性タンパクであることに対し本酵素(Lアミノアシラ
ーゼS1)の等電点(pI)は7.00〜7.70の範囲内にあり、
L−アミノアシラーゼS1が塩基性タンパクであることを
示す。
2時間800Vを通電し、本発明のL−アミノアシラーゼS1
の等電点を測定した。一般に公知のアミノアシラーゼが
酸性タンパクであることに対し本酵素(Lアミノアシラ
ーゼS1)の等電点(pI)は7.00〜7.70の範囲内にあり、
L−アミノアシラーゼS1が塩基性タンパクであることを
示す。
(8)ディスク電気泳動 7.5%ポリアクリルアミドゲル(pH8.9)のディスク電気
泳動測定を行い、本酵素(L−アミノアシラーゼS1)の
ブロモフェノールブルー(以下BPBと略す)に対する相
対移動度を測定した。L−アミノアシラーゼS1のBPBに
対する相対移動度(Rm BPB)は0.125〜0.167である。
泳動測定を行い、本酵素(L−アミノアシラーゼS1)の
ブロモフェノールブルー(以下BPBと略す)に対する相
対移動度を測定した。L−アミノアシラーゼS1のBPBに
対する相対移動度(Rm BPB)は0.125〜0.167である。
(9)金属イオンの影響 種々の金属塩を終濃度1mMを含む0.1Mベロナール緩衝液
中に本発明のL−アミノアシラーゼS1を添加し、37℃、
時間反応させた。その後、基質であるN−Ac−DB−DOPS
と37℃、1時間反応させ、上記の方法により相対活性を
測定した。
中に本発明のL−アミノアシラーゼS1を添加し、37℃、
時間反応させた。その後、基質であるN−Ac−DB−DOPS
と37℃、1時間反応させ、上記の方法により相対活性を
測定した。
なお、金属無添加のものの活性を100%とした。その測
定結果を第2表に示す。
定結果を第2表に示す。
本発明のL−アミノアシラーゼS1は、公知のアミノアシ
ラーゼの多くと同様にCo++添加により賦活され、Ni++、
Fe++、Ag+、Hg++、及びCu++添加により強く活性が阻害
される。
ラーゼの多くと同様にCo++添加により賦活され、Ni++、
Fe++、Ag+、Hg++、及びCu++添加により強く活性が阻害
される。
(10)阻害剤の影響 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS1)を各種阻害剤
とともに37℃、1時間放置し、その後基質であるN−Ac
−DB−DOPSと37℃、1時間反応させ、上記の方法により
その残存活性を測定した。その結果を第3表に示す。
とともに37℃、1時間放置し、その後基質であるN−Ac
−DB−DOPSと37℃、1時間反応させ、上記の方法により
その残存活性を測定した。その結果を第3表に示す。
本発明のL−アミノアシラーゼS1はSH阻害剤であるp−
クロル水銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード酢酸
では阻害されない。またキレート剤であるエチレンジア
ミン四酢酸2ナトリウムにより緩和な阻害を受ける。
クロル水銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード酢酸
では阻害されない。またキレート剤であるエチレンジア
ミン四酢酸2ナトリウムにより緩和な阻害を受ける。
次に、L−アミノアシラーゼS2の理化学的性状を以下に
記載する。
記載する。
(1)基質特異性 各種アミノ酸のN−アシル誘導体を基質としてL−アミ
ノアシラーゼS2の酵素活性を測定した。L−N−アセチ
ル−メチオニンを100とした相対活性を第4表に示す。
ノアシラーゼS2の酵素活性を測定した。L−N−アセチ
ル−メチオニンを100とした相対活性を第4表に示す。
第4表より、本発明のL−アミノアシラーゼS2は特殊な
合成アミノ酸を含む広い範囲のL−アミノ酸のN−アシ
ル誘導体に作用する。一方、通常、アシラーゼはL−N
−アシル−アミノ酸のアシル基としてアセチル基、クロ
ロアセチル基などが好ましくベンゾイル基などは加水分
解しない場合が多い。一部の細菌の生産するアシラーゼ
はベンゾイル基に選択的に作用するが、アセチル基など
は加水分解されない。これに対し、本発明のL−アミノ
アシラーゼS2はアシル基に対しても広い基質特異性を示
し、アセチル基、クロロアセチル基などが最も好ましい
が、ベンゾイル基であっても簡単に加水分解する。
合成アミノ酸を含む広い範囲のL−アミノ酸のN−アシ
ル誘導体に作用する。一方、通常、アシラーゼはL−N
−アシル−アミノ酸のアシル基としてアセチル基、クロ
ロアセチル基などが好ましくベンゾイル基などは加水分
解しない場合が多い。一部の細菌の生産するアシラーゼ
はベンゾイル基に選択的に作用するが、アセチル基など
は加水分解されない。これに対し、本発明のL−アミノ
アシラーゼS2はアシル基に対しても広い基質特異性を示
し、アセチル基、クロロアセチル基などが最も好ましい
が、ベンゾイル基であっても簡単に加水分解する。
(B)熱安定性 本発明の酵素の(L−アミノアシラーゼS2)のリン酸カ
リウム緩衝溶液(pH7.0)を各温度で10分間処理した
後、残存活性を測定した。
リウム緩衝溶液(pH7.0)を各温度で10分間処理した
後、残存活性を測定した。
なお、基質としてN−Ac−DB−DOPSを用い、37℃にて1
時間反応させ、ニンヒドリン法により遊離したDB−DOPS
を測定することにより酵素活性を定めた。測定結果を第
5図に示す様に60℃での処理で20%、70℃で70%以上が
失活するが、50℃ではまったく安定である。
時間反応させ、ニンヒドリン法により遊離したDB−DOPS
を測定することにより酵素活性を定めた。測定結果を第
5図に示す様に60℃での処理で20%、70℃で70%以上が
失活するが、50℃ではまったく安定である。
(3)反応温度 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS2)をリン酸カリ
ウム緩衝液(pH7.0)の中で、基質であるN−Ac−DB−D
OPSと10分間各種の温度条件下で反応させ、相対活性を
上記方法により測定した。その結果を第6図に示す。こ
の結果によれば反応性はほぼ60℃までほぼ直線的に上昇
し、70℃でも急激には失活することはない。
ウム緩衝液(pH7.0)の中で、基質であるN−Ac−DB−D
OPSと10分間各種の温度条件下で反応させ、相対活性を
上記方法により測定した。その結果を第6図に示す。こ
の結果によれば反応性はほぼ60℃までほぼ直線的に上昇
し、70℃でも急激には失活することはない。
(4)pH安定性 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS2)液を各種pH条
件下で5℃、24時間放置した。ついで各々をpH7.0に調
整した後、基質であるN−Ac−DB−DOPSと37℃、1時間
反応させ、上記方法により残存活性を測定した。その結
果を第7図に示す。
件下で5℃、24時間放置した。ついで各々をpH7.0に調
整した後、基質であるN−Ac−DB−DOPSと37℃、1時間
反応させ、上記方法により残存活性を測定した。その結
果を第7図に示す。
本発明のL−アミノアシラーゼS2は弱塩基性条件下すな
わちpH8.0〜10.0で最も安定である。
わちpH8.0〜10.0で最も安定である。
(5)反応pH 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS2)を37℃で種々
のpH条件下、基質であるN−Ac−DB−DOPSと1時間反応
させ、上記の方法により相対活性を測定した。その結果
を第8図に示す。本発明のL−アミノアシラーゼS2はpH
7.0〜10.0で反応性が高く、至適pHは8.0〜9.0附近であ
る。
のpH条件下、基質であるN−Ac−DB−DOPSと1時間反応
させ、上記の方法により相対活性を測定した。その結果
を第8図に示す。本発明のL−アミノアシラーゼS2はpH
7.0〜10.0で反応性が高く、至適pHは8.0〜9.0附近であ
る。
(6)分子量 セファデックスG−100(ファルマシア社製)のゲル濾
過法により、本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS2)
の分子量を測定した。その結果、本発明のL−アミノア
シラーゼS2の分子量は50,000〜60,000ダルトンの範囲内
にある。
過法により、本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS2)
の分子量を測定した。その結果、本発明のL−アミノア
シラーゼS2の分子量は50,000〜60,000ダルトンの範囲内
にある。
なお、標準タンパク標品としてはチトクロームC(分子
量12,500)、カーボニックアンヒドラーゼ(分子量29,0
00)、鶏卵アルブミン(分子量45,000)及び牛血清アル
ブミン(分子量67,000)を使用した。
量12,500)、カーボニックアンヒドラーゼ(分子量29,0
00)、鶏卵アルブミン(分子量45,000)及び牛血清アル
ブミン(分子量67,000)を使用した。
(7)等電点 アンフォラインPAGプレート(LKB社製)を用いて、4
℃、2時間800Vを通電し、本発明のL−アミノアシラー
ゼS2の等電点を測定した。
℃、2時間800Vを通電し、本発明のL−アミノアシラー
ゼS2の等電点を測定した。
本酵素(L−アミノアシラーゼS2)の等電点(pI)は6.
38〜7.42の範囲にある。
38〜7.42の範囲にある。
(8)ディスク電気泳動 7.5%ポリアクリルアミドゲル(pH8.9)のディスク電気
泳動を行い、本酵素(L−アミノアシラーゼS2)のBPB
に対する相対移動度を測定した。L−アミノアシラーゼ
S2のBPBに対する相対移動度(Rm BPB)は0.180〜0.280
である。
泳動を行い、本酵素(L−アミノアシラーゼS2)のBPB
に対する相対移動度を測定した。L−アミノアシラーゼ
S2のBPBに対する相対移動度(Rm BPB)は0.180〜0.280
である。
(9)金属イオンの影響 種々の金属塩を終濃度1mMを含む0.1Mベロナール緩衝液
中に本発明のL−アミノアシラーゼS2を添加し、37℃、
1時間反応させた。その後、基質であるN−Ac−DB−DO
PSと37℃、1時間反応させ、上記の方法により相対活性
を測定した。なお、金属塩無添加のものの活性を100%
とした。その測定結果を第5表に示す。
中に本発明のL−アミノアシラーゼS2を添加し、37℃、
1時間反応させた。その後、基質であるN−Ac−DB−DO
PSと37℃、1時間反応させ、上記の方法により相対活性
を測定した。なお、金属塩無添加のものの活性を100%
とした。その測定結果を第5表に示す。
本発明のL−アミノアシラーゼS2は、Co++、Ni++、M
n++、Hg++、Fe++、Cu++及びAg+の金属イオンにより阻害
される。
n++、Hg++、Fe++、Cu++及びAg+の金属イオンにより阻害
される。
(10)阻害剤の影響 本発明の酵素(L−アミノアシラーゼS2)を各種阻害剤
とともに37℃、1時間放置し、その後基質であるN−Ac
−DB−DOPSと37℃、1時間反応させ、上記の方法により
その残存活性を測定した。その結果を第6表に示す。
とともに37℃、1時間放置し、その後基質であるN−Ac
−DB−DOPSと37℃、1時間反応させ、上記の方法により
その残存活性を測定した。その結果を第6表に示す。
本発明のL−アミノアシラーゼS2はSH阻害剤であるp−
クロル水銀安息香酸及びモノヨード酢酸により強く阻害
されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸2
ナトリウムでは殆ど阻害されない。また、SH基を有する
アミノ酸であるシステインによっても、本発明のL−ア
ミノアシラーゼS2は阻害される。
クロル水銀安息香酸及びモノヨード酢酸により強く阻害
されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸2
ナトリウムでは殆ど阻害されない。また、SH基を有する
アミノ酸であるシステインによっても、本発明のL−ア
ミノアシラーゼS2は阻害される。
更に公知のL−アミノアシラーゼ及び本発明のL−アミ
ノアシラーゼ類の基質特異性及び熱安定性に関して比較
した。
ノアシラーゼ類の基質特異性及び熱安定性に関して比較
した。
(A)基質特異性 本発明のL−アミノアシラーゼS1、L−アミノアシラー
ゼS2及び公知のL−アミノアシラーゼの基質特異性につ
いて測定し、その結果を第7表に示した。
ゼS2及び公知のL−アミノアシラーゼの基質特異性につ
いて測定し、その結果を第7表に示した。
本発明のL−アミノアシラーゼS1、L−アミノアシラー
ゼS2と市販のL−アミノアシラーゼの作用をL−N−ア
セチル−メチオニン、D−N−アセチル−メチオニン及
びL−スレオ−N−アセチル−3−(3,4−ジベンジル
オキシフェニル)セリンを基質として比較した。用いた
L−アミノアシラーゼはL−体にのみ作用するが、特殊
な基質、すなわち、L−スレオ−N−アセチル−3−
(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セリンに対して
は、本発明の酵素のみしか作用しなかった。
ゼS2と市販のL−アミノアシラーゼの作用をL−N−ア
セチル−メチオニン、D−N−アセチル−メチオニン及
びL−スレオ−N−アセチル−3−(3,4−ジベンジル
オキシフェニル)セリンを基質として比較した。用いた
L−アミノアシラーゼはL−体にのみ作用するが、特殊
な基質、すなわち、L−スレオ−N−アセチル−3−
(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セリンに対して
は、本発明の酵素のみしか作用しなかった。
(B)熱安定性 本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノアシラ
ーゼS2の熱安定性の比較検討を行った。
ーゼS2の熱安定性の比較検討を行った。
測定法 各酵素溶液(pH7.0)0.5mlを60℃で各所定時間加熱処理
し、ついで氷冷後基質である0.02MのN−Ac−DB−DOPS
溶液0.5mlを加え、37℃で1時間放置した。その後ニン
ヒドリン法によりDB−DOPSを測定することによりその活
性を定めた。その結果を第9図に示す。
し、ついで氷冷後基質である0.02MのN−Ac−DB−DOPS
溶液0.5mlを加え、37℃で1時間放置した。その後ニン
ヒドリン法によりDB−DOPSを測定することによりその活
性を定めた。その結果を第9図に示す。
以上の結果より、本発明のL−アミノアシラーゼS2はL
−アミノアシラーゼS1以外の公知のアシラーゼ類よりも
広い基質特異性を備えている。一方、本発明のL−アミ
ノアシラーゼS2は基質特異性の点でL−アミノアシラー
ゼS1とほぼ同等であるが、熱安定性の面で本発明のL−
アミノアシラーゼS2はL−アミノアシラーゼS1よりもす
ぐれている。
−アミノアシラーゼS1以外の公知のアシラーゼ類よりも
広い基質特異性を備えている。一方、本発明のL−アミ
ノアシラーゼS2は基質特異性の点でL−アミノアシラー
ゼS1とほぼ同等であるが、熱安定性の面で本発明のL−
アミノアシラーゼS2はL−アミノアシラーゼS1よりもす
ぐれている。
本発明において使用するL−アミノアシラーゼ産生微生
物としては、本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−
アミノアシラーゼS2を生産することができる放線菌に属
する微生物であれば、野生株、変異株、または細胞融合
法、遺伝子操作法、若しくは、その他の遺伝的手法で誘
導される組換え株等いずれも用いることができ、例えば
L−アミノアシラーゼS1を生産する能力を有する微生物
の具体例としては、アクチノミセス・アウレオバーテイ
シラーツス(Actinomyces aureoverticillatus)IMC S
−0234(ISP 5080(FERM P−7216);アクチノミセス・
ビカラー(Actinomyces bicolor)IMC S−0276(ISP 51
40);ストレプトミセス・ブラストマイセティクス(St
reptomyses blastmycetics)IMC S−0189(ISP 5029)
(FERM P−7217);ストレプトミセス・チャルトリウシ
ス(Streptomyces chartreusis)IMC S−0226(ISP 508
5);ストレプトミセス・フラボペルシクス(Streptomy
ces flavopersicus)IMC S−0204(ISP 5093);アクチ
ノミセス・フラボトリシニ(Actinomyces flavotricin
i)IMC S−0219(ISP 5152);ストレプトバーテイシリ
ウム・グリゼオカルネウム(Streptoverticillium gris
eocareum)IMC S−0237(ISP 5004);ストレプトミセ
ス・ハチジョーエンシス(Streptomyces hachijoensi
s)IMC S−0244(ISP 5114)(FERM P−7218);ストレ
プトミセス・ハルステデイ(Streptomyces halstedii)
IMC S−0194(ISP 5068);ストレプトバーテイシリウ
ム・ヒロシメンセ(Streptoverticillium hiroshimens
e)IMC S−0179(ISP 5037)(FERM P−7252);ストレ
プトミセス・テンダエ(Streptomyces tendae)IMC S−
0168(ISP 5101);ストレプトミセス・トヨカエンシス
(Streptomyces toyocaensis)IMC S−0163(ISP 503
0)(FERM P−7253)などが好適に使用される。これら
の菌株はすべて文献記載の公知の保存菌である。また、
前記の菌株のうち、微工研寄託番号としてFERM P−721
6、FERM P−7217、FERM P−7218を付した菌株は昭和58
年9月5日以来、またFERM P−7252、FERM P−7253を付
した菌株は昭和58年9月20日以来、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。また、新規な本発明の
L−アミノアシラーゼS2産生能を有する菌の具体例とし
て、例えばストレプトバーチシリウム・リモファシエン
シス(Streptoverticillium rimofaciens)MH240−CPF7
が挙げられる。上記のストレプトバーチシリウム・リモ
ファシエンスMH240−CPF7は本発明らにより茨城県大宮
町の土壌より分離された菌株で、その菌学的性状は、以
下に示す通りである。
物としては、本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−
アミノアシラーゼS2を生産することができる放線菌に属
する微生物であれば、野生株、変異株、または細胞融合
法、遺伝子操作法、若しくは、その他の遺伝的手法で誘
導される組換え株等いずれも用いることができ、例えば
L−アミノアシラーゼS1を生産する能力を有する微生物
の具体例としては、アクチノミセス・アウレオバーテイ
シラーツス(Actinomyces aureoverticillatus)IMC S
−0234(ISP 5080(FERM P−7216);アクチノミセス・
ビカラー(Actinomyces bicolor)IMC S−0276(ISP 51
40);ストレプトミセス・ブラストマイセティクス(St
reptomyses blastmycetics)IMC S−0189(ISP 5029)
(FERM P−7217);ストレプトミセス・チャルトリウシ
ス(Streptomyces chartreusis)IMC S−0226(ISP 508
5);ストレプトミセス・フラボペルシクス(Streptomy
ces flavopersicus)IMC S−0204(ISP 5093);アクチ
ノミセス・フラボトリシニ(Actinomyces flavotricin
i)IMC S−0219(ISP 5152);ストレプトバーテイシリ
ウム・グリゼオカルネウム(Streptoverticillium gris
eocareum)IMC S−0237(ISP 5004);ストレプトミセ
ス・ハチジョーエンシス(Streptomyces hachijoensi
s)IMC S−0244(ISP 5114)(FERM P−7218);ストレ
プトミセス・ハルステデイ(Streptomyces halstedii)
IMC S−0194(ISP 5068);ストレプトバーテイシリウ
ム・ヒロシメンセ(Streptoverticillium hiroshimens
e)IMC S−0179(ISP 5037)(FERM P−7252);ストレ
プトミセス・テンダエ(Streptomyces tendae)IMC S−
0168(ISP 5101);ストレプトミセス・トヨカエンシス
(Streptomyces toyocaensis)IMC S−0163(ISP 503
0)(FERM P−7253)などが好適に使用される。これら
の菌株はすべて文献記載の公知の保存菌である。また、
前記の菌株のうち、微工研寄託番号としてFERM P−721
6、FERM P−7217、FERM P−7218を付した菌株は昭和58
年9月5日以来、またFERM P−7252、FERM P−7253を付
した菌株は昭和58年9月20日以来、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。また、新規な本発明の
L−アミノアシラーゼS2産生能を有する菌の具体例とし
て、例えばストレプトバーチシリウム・リモファシエン
シス(Streptoverticillium rimofaciens)MH240−CPF7
が挙げられる。上記のストレプトバーチシリウム・リモ
ファシエンスMH240−CPF7は本発明らにより茨城県大宮
町の土壌より分離された菌株で、その菌学的性状は、以
下に示す通りである。
ストレプトバーチシリウム・リモファシエンスMH240−C
PF7の菌学的性質 1.形態 MH240−CPF7株は、顕微鏡下で、分枝した基中菌糸より
輪生枝を有する気菌糸を伸長する。また気菌糸の先端に
10個以上の胞子の連鎖が認められるが、らせん形成は認
められない。この胞子の大きさは、0.6×0.8〜1.4ミク
ロン位であり、胞子の表面は平滑である。
PF7の菌学的性質 1.形態 MH240−CPF7株は、顕微鏡下で、分枝した基中菌糸より
輪生枝を有する気菌糸を伸長する。また気菌糸の先端に
10個以上の胞子の連鎖が認められるが、らせん形成は認
められない。この胞子の大きさは、0.6×0.8〜1.4ミク
ロン位であり、胞子の表面は平滑である。
2.各種培地における生育状態 (1)シュクロース・硝酸塩寒天培地(27℃培養) 無色の発育上にうっすらと白色の気菌糸を着生し、溶解
性色素は認められない。
性色素は認められない。
(2)グルコース・アスパラギン寒天培地(27℃培養) うす黄茶色[2gc,Bamboo]の発育上に、うっすらと白色
の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
(3)グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP−培地
5,27℃培養) うす黄茶色[2le,Mustard]の発育上に、うっすらと白
色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
5,27℃培養) うす黄茶色[2le,Mustard]の発育上に、うっすらと白
色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
(4)スターチ・無機塩寒天培地(ISP−培地4,27℃培
養) うす黄茶色[2le,Mustard]の発育上、わずかに白色の
気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
養) うす黄茶色[2le,Mustard]の発育上、わずかに白色の
気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
(5)チロシン寒天培地(ISP−培地7,27℃培養) うす黄茶色[2le,Mustard]の発育上に、白ないし茶白
色の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる程
度である。
色の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる程
度である。
(6)栄養寒天培地(27℃培養) 発育はうす黄茶色[2ng,Dull Gold]であり、気菌糸を
着生せず、溶解性色素はわずかに茶色味を帯びる程度で
ある。
着生せず、溶解性色素はわずかに茶色味を帯びる程度で
ある。
(7)イースト・麦芽寒天培地(ISP−培地2,27℃培
養) 黄茶色[3le Cinnamon]の発育上に、黄白色ないし茶白
色の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる程
度である。
養) 黄茶色[3le Cinnamon]の発育上に、黄白色ないし茶白
色の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる程
度である。
(8)オートミール寒天培地(ISP−培地3,27℃培養) うす黄茶色[2le,Mustard]の発育上に茶白[3ba,Pear
l]の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる程
度である。
l]の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる程
度である。
(9)グリセリン・硝酸塩寒天培地(27℃培養)無色の
発育上に、うっすらと白色の気菌糸を着生し、溶解性色
素は認められない。
発育上に、うっすらと白色の気菌糸を着生し、溶解性色
素は認められない。
(10)スターチ寒天培地(27℃培養) うす黄茶色[2gc,Bamboo]の発育上に、白色の気菌糸を
着生し、溶解性色素は認められない。
着生し、溶解性色素は認められない。
(11)リンゴ酸石灰寒天培地(27℃培養) 無色の発育上に、わずかに白色の気菌糸を着生し、溶解
性色素は認められない。
性色素は認められない。
(12)セルロース培地(濾紙片添加合成液、27℃培養) 無色の発育上に、うっすらと白色の気菌糸を着生し、溶
解性色素は認められない。
解性色素は認められない。
(13)ゼラチン穿刺培養 15%の単純ゼラチン培地(20℃培養)では、発育はうす
黄茶色であり、気菌糸は着生せず、茶色の溶解性色素は
生産する。
黄茶色であり、気菌糸は着生せず、茶色の溶解性色素は
生産する。
また、グルコース、ペプトン、ゼラチン培地(27℃培
養)では、発育はうす茶色であり、気菌糸は着生せず、
茶色の溶解性色素を生産する。
養)では、発育はうす茶色であり、気菌糸は着生せず、
茶色の溶解性色素を生産する。
(14)脱脂牛乳(37℃培養) 発育は無色ないしうす茶色であり、気菌糸は着生せず、
溶解性色素はわずかに茶色味を帯びる程度である。
溶解性色素はわずかに茶色味を帯びる程度である。
なお、色調の記載について[ ]内に示す標準はコンテ
イナー・コーポレーション・オブ・アメリカ(Containe
r Corporation of America)のカラー・ハーモニイ・マ
ニュアル(Color harmony mannual)を用いた。
イナー・コーポレーション・オブ・アメリカ(Containe
r Corporation of America)のカラー・ハーモニイ・マ
ニュアル(Color harmony mannual)を用いた。
3.生理学的性質 (1)生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地(グルコース1%、
アスパラギン0.5%、K2HPO40.5%、ひも寒天3.0%pH7.
0)を用い、20℃、24℃、27℃、30℃、50℃の各温度で
試験の結果、50℃を除いてそのいずれの温度でも発育し
たが、最適生育温度は27℃〜37℃附近と思われる。
アスパラギン0.5%、K2HPO40.5%、ひも寒天3.0%pH7.
0)を用い、20℃、24℃、27℃、30℃、50℃の各温度で
試験の結果、50℃を除いてそのいずれの温度でも発育し
たが、最適生育温度は27℃〜37℃附近と思われる。
(2)ゼラチンの液化(15%単純ゼラチン培地、20℃培
養;グルコース・ペプトン・ゼラチン培地27℃培養) 単純ゼラチン培地では液化が認められず、グルコース・
ペプトン・ゼラチン培地の場合に、極めて弱い液化が培
養後14日目頃より始まる。
養;グルコース・ペプトン・ゼラチン培地27℃培養) 単純ゼラチン培地では液化が認められず、グルコース・
ペプトン・ゼラチン培地の場合に、極めて弱い液化が培
養後14日目頃より始まる。
(3)スターチの加水分解(スターチ・無機塩寒天培地
及びスターチ寒天培地、いずれも27℃培養) スターチ・無機塩寒天培地、スターチ寒天培地ともに培
養後、7日目頃よりスターチの水解性が認められ、その
作用は弱い方である。
及びスターチ寒天培地、いずれも27℃培養) スターチ・無機塩寒天培地、スターチ寒天培地ともに培
養後、7日目頃よりスターチの水解性が認められ、その
作用は弱い方である。
(4)脱脂牛乳の凝固及びペプトン化(脱脂牛乳、37℃
培養) 培養後、5日目頃より凝固が始まり、約2週間で凝固が
完了し、直ちにペプトン化が始まる。その作用は弱い方
である。
培養) 培養後、5日目頃より凝固が始まり、約2週間で凝固が
完了し、直ちにペプトン化が始まる。その作用は弱い方
である。
(5)メラニン様色素の生成(トリプトン・イースト・
ブロス、ISP−培地1;ペプシン・イースト・鉄・寒天、I
SP−培地6;チロシン、ISP−培地7、いずれも27℃培
養)トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イー
スト・ブロス、ペプトン・イースト・鉄・寒天培地では
陽性であり、チロシン寒天培地では陰性である。
ブロス、ISP−培地1;ペプシン・イースト・鉄・寒天、I
SP−培地6;チロシン、ISP−培地7、いずれも27℃培
養)トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イー
スト・ブロス、ペプトン・イースト・鉄・寒天培地では
陽性であり、チロシン寒天培地では陰性である。
(6)炭素源の利用性(プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地、ISP−培地9,27℃培養) D−グルコース、D−フラクトース、イノシトール及び
D−マンニトールを利用して発育し、L−アラビノー
ス、D−キシロース、シュクロース、L−ラムノース及
びラフィノースは利用されない。
地、ISP−培地9,27℃培養) D−グルコース、D−フラクトース、イノシトール及び
D−マンニトールを利用して発育し、L−アラビノー
ス、D−キシロース、シュクロース、L−ラムノース及
びラフィノースは利用されない。
(7)リンゴ酸石灰の溶解(リンゴ酸石灰寒天培地、27
℃培養) 陰性である。
℃培養) 陰性である。
(8)硝酸塩の還元反応(0.1%硝酸カリ含有ペプトン
水、ISP−培地8,27℃培養) 陰性である。
水、ISP−培地8,27℃培養) 陰性である。
以上の性状を要約すると、以下の如くである。すなわ
ち、MH240−CPF7株の気菌糸は輪生枝を有し、らせん形
成は認められず、胞子の表面は平滑であり、種々の培地
でうす黄茶色の発育上に、白色ないし茶白色の気菌糸を
着生し、溶解性色素は認められないか又は茶色味を帯び
る程度である。またメラニン様色素の生成はトリプトン
・イースト・ブロス及びペプトン・イースト・鉄寒天培
地で陽性、チロシン寒天培地では陰性である。蛋白分解
力、スターチの水解性はともに弱い方である。なお、細
胞壁に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸はLL−型であ
る。
ち、MH240−CPF7株の気菌糸は輪生枝を有し、らせん形
成は認められず、胞子の表面は平滑であり、種々の培地
でうす黄茶色の発育上に、白色ないし茶白色の気菌糸を
着生し、溶解性色素は認められないか又は茶色味を帯び
る程度である。またメラニン様色素の生成はトリプトン
・イースト・ブロス及びペプトン・イースト・鉄寒天培
地で陽性、チロシン寒天培地では陰性である。蛋白分解
力、スターチの水解性はともに弱い方である。なお、細
胞壁に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸はLL−型であ
る。
これらの性状より、MH240−CPF7株はストレプトバーチ
シリウム(Strepotoverticillium)属に属するものと考
えられる。更に近縁の既知菌種を検索するとストレプト
ミセス・リモファシエンス(Streptomyces rimofacien
s)(特公昭42−7598号公報参照)が挙げられる。
シリウム(Strepotoverticillium)属に属するものと考
えられる。更に近縁の既知菌種を検索するとストレプト
ミセス・リモファシエンス(Streptomyces rimofacien
s)(特公昭42−7598号公報参照)が挙げられる。
次に理化学研究所微生物系統保存施設(JCM)よりスト
レプトミセス・リモファシエンスを入手し、MH240−CPF
7株と比較検討した。
レプトミセス・リモファシエンスを入手し、MH240−CPF
7株と比較検討した。
その結果を第8表に示す。
第8表から明らかなように、MH240−CPF7株とストレプ
トミセス・リモファシエンスの性状は全く合致してい
る。なお、特公昭42−7598号公報におけるストレプトミ
セス・リモファシエンスの菌学的性質に関する記載によ
れば、炭素源の利用試験に、プリドハム・ゴトリーブの
培地に発育しないため、ツアペック培地を使用している
が、この比較試験では両者ともプリドハム・ゴトリーブ
培地に生育し、糖利用能の判定は容易であった。加うる
に、両者とも抗生物質デストマイシンを生産すること
は、同種であることを否めない。したがって、MH240−C
PF7株をストレプトバーチシリウム・リモファシエンス
(Streptoverticillum rimofaciens)MH240−CPF7株と
同定した。なお、MH240−CPF7株は工業技術院微生物工
業技研研究所に微工研菌寄第8599号(FERM P−8599)と
して寄託されている。
トミセス・リモファシエンスの性状は全く合致してい
る。なお、特公昭42−7598号公報におけるストレプトミ
セス・リモファシエンスの菌学的性質に関する記載によ
れば、炭素源の利用試験に、プリドハム・ゴトリーブの
培地に発育しないため、ツアペック培地を使用している
が、この比較試験では両者ともプリドハム・ゴトリーブ
培地に生育し、糖利用能の判定は容易であった。加うる
に、両者とも抗生物質デストマイシンを生産すること
は、同種であることを否めない。したがって、MH240−C
PF7株をストレプトバーチシリウム・リモファシエンス
(Streptoverticillum rimofaciens)MH240−CPF7株と
同定した。なお、MH240−CPF7株は工業技術院微生物工
業技研研究所に微工研菌寄第8599号(FERM P−8599)と
して寄託されている。
本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノアシラ
ーゼS2は次のように製造することができる。
ーゼS2は次のように製造することができる。
本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノアシラ
ーゼS2はL−アミノアシラーゼ生産菌である任意の放線
菌を栄養源含有培地に接種して好気的に発育させること
によって得られる。栄養源としては、細菌、放線菌など
の栄養源として公知のものが使用できる。例えば、炭素
源としては市販されているグリセリン、グルコース、ラ
クトース、ショ糖、デンプン、マルトース、糖蜜などの
炭水化物、大豆油、綿実油など植物油、及び動物脂肪な
どが、窒素源としては市販されているペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー、コーングルーテンミール
、ファルマメディア 、大豆粉、落花生粉、酵母エキ
ス、N−Z−アミン、カゼイン、硝酸ソーダ、及び硫酸
アンモニウムなどが、無機塩としては食塩、リン酸塩、
炭酸カルシウム、及び硫酸マグネシウムなどが挙げられ
る。その他、必要に応じて微量の金属塩を添加すること
もできる。これらのものは本発明のL−アミノアシラー
ゼS1及びL−アミノアシラーゼS2の生産に役立つもので
あればよい。
ーゼS2はL−アミノアシラーゼ生産菌である任意の放線
菌を栄養源含有培地に接種して好気的に発育させること
によって得られる。栄養源としては、細菌、放線菌など
の栄養源として公知のものが使用できる。例えば、炭素
源としては市販されているグリセリン、グルコース、ラ
クトース、ショ糖、デンプン、マルトース、糖蜜などの
炭水化物、大豆油、綿実油など植物油、及び動物脂肪な
どが、窒素源としては市販されているペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー、コーングルーテンミール
、ファルマメディア 、大豆粉、落花生粉、酵母エキ
ス、N−Z−アミン、カゼイン、硝酸ソーダ、及び硫酸
アンモニウムなどが、無機塩としては食塩、リン酸塩、
炭酸カルシウム、及び硫酸マグネシウムなどが挙げられ
る。その他、必要に応じて微量の金属塩を添加すること
もできる。これらのものは本発明のL−アミノアシラー
ゼS1及びL−アミノアシラーゼS2の生産に役立つもので
あればよい。
培養温度に関しては、本発明のL−アミノアシラーゼS1
及びL−アミノアシラーゼS2を生産する範囲であればい
ずれでもよく、好ましくは20℃〜30℃である。また、培
養時間は通常1日ないし10日間、好気的に培養すること
が望ましい。
及びL−アミノアシラーゼS2を生産する範囲であればい
ずれでもよく、好ましくは20℃〜30℃である。また、培
養時間は通常1日ないし10日間、好気的に培養すること
が望ましい。
培養時のpH値は、L−アミノアシラーゼS1及びL−アミ
ノアシラーゼ2が生産される値であれば、特に限定はさ
れないが、好ましくは、pH7.0〜8.0が望ましい。
ノアシラーゼ2が生産される値であれば、特に限定はさ
れないが、好ましくは、pH7.0〜8.0が望ましい。
本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノアシラ
ーゼS2は菌体外に放出されやすく、主として培養濾液中
に存在する。
ーゼS2は菌体外に放出されやすく、主として培養濾液中
に存在する。
よって、本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−アミ
ノアシラーゼS2は、他の一般の糸状菌由来のL−アミノ
アシラーゼの調製法とは異なり、菌体を破壊し、酵素を
抽出することなく、培養濾液そのままを酵素液として利
用することができる。また必要に応じて、通常の生化学
的手段により精製することができる。すなわち、硫安分
別沈澱法、メンブラン濃縮法、カラムライト (富士化
学社製)クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルクロマトグラフィー及び電気泳動法等を適
宜組み合せて純化することもできる。
ノアシラーゼS2は、他の一般の糸状菌由来のL−アミノ
アシラーゼの調製法とは異なり、菌体を破壊し、酵素を
抽出することなく、培養濾液そのままを酵素液として利
用することができる。また必要に応じて、通常の生化学
的手段により精製することができる。すなわち、硫安分
別沈澱法、メンブラン濃縮法、カラムライト (富士化
学社製)クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルクロマトグラフィー及び電気泳動法等を適
宜組み合せて純化することもできる。
実施例 以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、これ
らの実施例によって本発明は限定されるものではない。
らの実施例によって本発明は限定されるものではない。
実施例1 スターチ1.0%、グルコース1.0%、肉エキス0.75%、ポ
リペプトン0.75%、塩化ナトリウム0.3%、硫酸マグネ
シウム0.1%、硫酸銅0.0007%、硫酸第一鉄0.001%、塩
化マンガン0.0008%、及び硫酸亜鉛0.0002%を含む滅菌
した培地100mlを含む500ml容エルレンマイヤーフラスコ
に本発明のL−アミノアシラーゼS1の生産菌の1つであ
るストレプトミセス・ハチジョーエンシス(Streptomyc
es hachijoensis IMC S−0244(ISP−5114)(FERM P
−7218))を無菌的に植菌し27℃にて4日間振とう培養
し、これを種母とした。同様の培地組成、操作で、500m
l容エルレンマイヤーフラスコ100本を作製し、上記種母
フラスコより2ml当り種母をそれぞれに添加した。添加
後フラスコを28℃、4日間振とう培養した。フラスコの
内容物を集め吸引濾過により菌体を除去し、瀘液7.5
を得た。培養瀘液は、限外濾過モジュール(旭化成社AC
L−1010)により400mlまで濃縮した。さらに濃縮液に0.
02Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)200mlを加え、再び
上記限外濾過モジュールにより300mlまで濃縮する操作
を2回くり返した後、内液を上記緩衝液で押し出し粗調
製酵素溶液630mlを得た。L−アミノアシラーゼ活性
は、L−スレオ−N−アセチル−3−(3,4−ジベンジ
ルオキシフェニル)セリンを基質として37℃1時間反応
させ、生成するL−スレオ−3−(3,4−ジベンジルオ
キシフェニル)セリンをニンヒドリン法にて測定するこ
とにより決定した。即ち、反応はN塩酸を系内に加え酵
素を変性させることにより終了させ、生成するL−スレ
オ−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セリンを
系内よりブタノールに転溶させた。ブタノール抽出液
は、ニンヒドリン法にて発色させ、570nmの吸光度で比
色定量した。脱アセチル体100μg/mlの濃度を与えるL
−アミノアシラーゼ活性を1単位と定義する上記粗調製
酵素溶液の単位は5.92×104単位であった。また一連の
操作の回収率は98%以上であった。
リペプトン0.75%、塩化ナトリウム0.3%、硫酸マグネ
シウム0.1%、硫酸銅0.0007%、硫酸第一鉄0.001%、塩
化マンガン0.0008%、及び硫酸亜鉛0.0002%を含む滅菌
した培地100mlを含む500ml容エルレンマイヤーフラスコ
に本発明のL−アミノアシラーゼS1の生産菌の1つであ
るストレプトミセス・ハチジョーエンシス(Streptomyc
es hachijoensis IMC S−0244(ISP−5114)(FERM P
−7218))を無菌的に植菌し27℃にて4日間振とう培養
し、これを種母とした。同様の培地組成、操作で、500m
l容エルレンマイヤーフラスコ100本を作製し、上記種母
フラスコより2ml当り種母をそれぞれに添加した。添加
後フラスコを28℃、4日間振とう培養した。フラスコの
内容物を集め吸引濾過により菌体を除去し、瀘液7.5
を得た。培養瀘液は、限外濾過モジュール(旭化成社AC
L−1010)により400mlまで濃縮した。さらに濃縮液に0.
02Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)200mlを加え、再び
上記限外濾過モジュールにより300mlまで濃縮する操作
を2回くり返した後、内液を上記緩衝液で押し出し粗調
製酵素溶液630mlを得た。L−アミノアシラーゼ活性
は、L−スレオ−N−アセチル−3−(3,4−ジベンジ
ルオキシフェニル)セリンを基質として37℃1時間反応
させ、生成するL−スレオ−3−(3,4−ジベンジルオ
キシフェニル)セリンをニンヒドリン法にて測定するこ
とにより決定した。即ち、反応はN塩酸を系内に加え酵
素を変性させることにより終了させ、生成するL−スレ
オ−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セリンを
系内よりブタノールに転溶させた。ブタノール抽出液
は、ニンヒドリン法にて発色させ、570nmの吸光度で比
色定量した。脱アセチル体100μg/mlの濃度を与えるL
−アミノアシラーゼ活性を1単位と定義する上記粗調製
酵素溶液の単位は5.92×104単位であった。また一連の
操作の回収率は98%以上であった。
実施例2 実施例1により調製された粗調製酵素溶液400ml(3.76
×104単位)をあらかじめ5mMのリン酸カリウム緩衝液
(pH7.0)にて平衡化させたカラムライト (富士化学
工業社)の塔(内径3.7cm×高さ30cm)に通し、L−ア
ミノアシラーゼS1を吸着させた。上記緩衝液200mlを流
し、塔を同緩衝液で洗浄後、緩衝液濃度を0.5Mまで直線
的に増加させる方法によりL−アミノアシラーゼS1を溶
離せしめた。
×104単位)をあらかじめ5mMのリン酸カリウム緩衝液
(pH7.0)にて平衡化させたカラムライト (富士化学
工業社)の塔(内径3.7cm×高さ30cm)に通し、L−ア
ミノアシラーゼS1を吸着させた。上記緩衝液200mlを流
し、塔を同緩衝液で洗浄後、緩衝液濃度を0.5Mまで直線
的に増加させる方法によりL−アミノアシラーゼS1を溶
離せしめた。
本発明のL−アミノアシラーゼS1は、0.2〜0.3Mのリン
酸カリウム緩衝液(pH7.0)で溶離され、活性画分を集
め5mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0,5℃)に対して透析
を行い、200mlの精製酵素液を得た。一連の操作の回収
率は80%であり、比活性は約11倍上昇した。
酸カリウム緩衝液(pH7.0)で溶離され、活性画分を集
め5mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0,5℃)に対して透析
を行い、200mlの精製酵素液を得た。一連の操作の回収
率は80%であり、比活性は約11倍上昇した。
実施例3 実施例2により調製した酵素溶液はさらにイオン交換セ
ファディクス等により精製することができる。即ち予め
5mMのリン酸カリウム緩衝液にて平衡化したCM−セファ
ディクスC−50 (ファルマシア社)の塔(内径3.0cm
×高さ25.0cm)に通し、L−アミノアシラーゼS1を吸着
させる。
ファディクス等により精製することができる。即ち予め
5mMのリン酸カリウム緩衝液にて平衡化したCM−セファ
ディクスC−50 (ファルマシア社)の塔(内径3.0cm
×高さ25.0cm)に通し、L−アミノアシラーゼS1を吸着
させる。
上記緩衝液800mlを流して塔を洗浄した後直線的に緩衝
液濃度を増加させることにより酵素活性画分を溶出せし
める。
液濃度を増加させることにより酵素活性画分を溶出せし
める。
本発明のL−アミノアシラーゼS1は、0.08〜0.12Mのリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて溶出された。一連の
操作の回収率は90%であり、比活性は、実施例1、及び
実施例2の酵素溶液に比較して、それぞれ85倍及び7.3
倍に上昇した。
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて溶出された。一連の
操作の回収率は90%であり、比活性は、実施例1、及び
実施例2の酵素溶液に比較して、それぞれ85倍及び7.3
倍に上昇した。
実施例4 実施例3により調製された酵素溶液はさらにDEAE−セフ
ァデックスA−50 (ファルマシア社)によって精製さ
れる。即ち、1200単位の酵素を含む酵素液を予め5mMリ
ン酸緩衝液にて平衡化させておいたDEAE−セファデック
スA−50 カラム(内径1.6cm×高さ11.0cm)に通し100
mlの上記緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を直線的
に増加させることによって酵素活性画分を溶出せしめ
た。
ァデックスA−50 (ファルマシア社)によって精製さ
れる。即ち、1200単位の酵素を含む酵素液を予め5mMリ
ン酸緩衝液にて平衡化させておいたDEAE−セファデック
スA−50 カラム(内径1.6cm×高さ11.0cm)に通し100
mlの上記緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を直線的
に増加させることによって酵素活性画分を溶出せしめ
た。
本発明のL−アミノアシラーゼS1は、0.2〜0.25Mのリン
酸緩衝液(pH7.0)で溶離した。一連の操作の回収率は8
5%であった。また比活性は実施例3のものに比べ1.7倍
上昇した。
酸緩衝液(pH7.0)で溶離した。一連の操作の回収率は8
5%であった。また比活性は実施例3のものに比べ1.7倍
上昇した。
実施例5 実施例4にて調製した精製酵素について、セファデック
スG−100 (ファルマシア社)を用いたゲル濾過を行
った。予め50mMのリン酸カリウム緩衝液で平衡化された
セファデックスG−100 カラム(内径1.7cm×高さ81.5
cm)に実施例4にて調製した精製酵素0.2mgアルブミン
換算量及びそれぞれ0.5〜1mgの各種タンパク標品を含む
0.5%グリセリン溶液1.0mlを通した。溶出液は上記緩衝
液を3.6ml/時の流速で流し、溶出液と2.0mlずつフラク
ションコレクターにて分取した。酵素活性は280nmの吸
光度、Lowry法によるタンパク定量及び酵素活性等によ
り検出した。ゲルクロマトグラフィーの結果、精製酵素
が単一タンパクバンドであり、かつ排除体積の1.4倍附
近に溶出されることにより分子量が50,000〜60,000であ
ることが証明された。
スG−100 (ファルマシア社)を用いたゲル濾過を行
った。予め50mMのリン酸カリウム緩衝液で平衡化された
セファデックスG−100 カラム(内径1.7cm×高さ81.5
cm)に実施例4にて調製した精製酵素0.2mgアルブミン
換算量及びそれぞれ0.5〜1mgの各種タンパク標品を含む
0.5%グリセリン溶液1.0mlを通した。溶出液は上記緩衝
液を3.6ml/時の流速で流し、溶出液と2.0mlずつフラク
ションコレクターにて分取した。酵素活性は280nmの吸
光度、Lowry法によるタンパク定量及び酵素活性等によ
り検出した。ゲルクロマトグラフィーの結果、精製酵素
が単一タンパクバンドであり、かつ排除体積の1.4倍附
近に溶出されることにより分子量が50,000〜60,000であ
ることが証明された。
実施例6 グルコース3%、ファルマメディア 1.5%、塩化ナト
リウム0.3%、硫酸マウネシウム0.1%、硫酸銅0.0007
%、硫酸第一鉄0.0001%、塩化マンガン0.0008%及び硫
酸亜鉛0.0002%を含む滅菌した培地100mlを含む500ml容
エルレンマイヤーフラスコに本発明のL−アミノアシラ
ーゼS2生産菌であるストレプトバーチシリウム・リモフ
ァシエンスMH240−CPF7株を無菌的に植菌し、27℃にて
3日間振盪培養し、これらを種母とした。前記と同様の
培地1.5ずつを5容エルレンマイヤーフラスコ18本
に分注し、滅菌後前記種母10mlずつを各フラスコに添加
し、27℃で4日間振盪培養した。ついで各フラスコの培
養物を集め、吸引濾過により菌体を除去し、濾液19.6
を得た。
リウム0.3%、硫酸マウネシウム0.1%、硫酸銅0.0007
%、硫酸第一鉄0.0001%、塩化マンガン0.0008%及び硫
酸亜鉛0.0002%を含む滅菌した培地100mlを含む500ml容
エルレンマイヤーフラスコに本発明のL−アミノアシラ
ーゼS2生産菌であるストレプトバーチシリウム・リモフ
ァシエンスMH240−CPF7株を無菌的に植菌し、27℃にて
3日間振盪培養し、これらを種母とした。前記と同様の
培地1.5ずつを5容エルレンマイヤーフラスコ18本
に分注し、滅菌後前記種母10mlずつを各フラスコに添加
し、27℃で4日間振盪培養した。ついで各フラスコの培
養物を集め、吸引濾過により菌体を除去し、濾液19.6
を得た。
こうして得られた培養濾液を、予め5mMのリン酸カリウ
ム緩衝液(pH7.0)にて平衡化させたカラムライト
(富士化学社製)2を充填したカラムに通し、L−
アミノアシラーゼS2を吸着させた。水7で該カラムを
洗浄後、0.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)5によ
りL−アミノアシラーゼS2を溶出し、活性画分を集め、
粗製酵素溶液1.95を得た。実施例1と同様にしてL−
アミノアシラーゼ活性を測定したところ、この粗製酵素
溶液の活性単位は1.69×105単位であり、また一連の操
作の回収率は95%以上であった。
ム緩衝液(pH7.0)にて平衡化させたカラムライト
(富士化学社製)2を充填したカラムに通し、L−
アミノアシラーゼS2を吸着させた。水7で該カラムを
洗浄後、0.5Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)5によ
りL−アミノアシラーゼS2を溶出し、活性画分を集め、
粗製酵素溶液1.95を得た。実施例1と同様にしてL−
アミノアシラーゼ活性を測定したところ、この粗製酵素
溶液の活性単位は1.69×105単位であり、また一連の操
作の回収率は95%以上であった。
実施例7 実施例6により調製された粗酵素溶液1.95(1.69×10
5単位)に硫酸アンモニウム540gを加え、45%飽和溶液
とし、予め45%飽和硫酸アンモニウム溶液で平衡化され
たトヨパールHW−65 (東洋曹達社製)を充填したカラ
ム(内径2.5cm×高さ25cm)に通し、L−アミノアシラ
ーゼS2を吸着させた。
5単位)に硫酸アンモニウム540gを加え、45%飽和溶液
とし、予め45%飽和硫酸アンモニウム溶液で平衡化され
たトヨパールHW−65 (東洋曹達社製)を充填したカラ
ム(内径2.5cm×高さ25cm)に通し、L−アミノアシラ
ーゼS2を吸着させた。
ついで45%飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄後、35%飽
和硫酸アンモニウム溶液を流し、さらに25%飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を流してL−アミノアシラーゼS2を溶出
した。活性画分を集め、2mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.
2)に対して透析を行い、精製酵素液440ml(収率95%以
上)を得た。
和硫酸アンモニウム溶液を流し、さらに25%飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を流してL−アミノアシラーゼS2を溶出
した。活性画分を集め、2mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.
2)に対して透析を行い、精製酵素液440ml(収率95%以
上)を得た。
実施例8 実施例7で得られた酵素液を予め2mMトリス−塩酸緩衝
液(pH8.2)で平衡化させたDEAE−トヨパール650M
(東洋曹達社製)のカラム(内径2cm×高さ21.5cm)
通し、L−アミノアシラーゼS2を吸着させた。ついでト
リス−塩酸緩衝液(pH8.2)の濃度を5mMから200mMに直
線的に増加させることにより、L−アミノアシラーゼS2
を溶出し、活性画分を集め、精製酵素液84ml(7.7×104
単位)(収率59%)を得た。
液(pH8.2)で平衡化させたDEAE−トヨパール650M
(東洋曹達社製)のカラム(内径2cm×高さ21.5cm)
通し、L−アミノアシラーゼS2を吸着させた。ついでト
リス−塩酸緩衝液(pH8.2)の濃度を5mMから200mMに直
線的に増加させることにより、L−アミノアシラーゼS2
を溶出し、活性画分を集め、精製酵素液84ml(7.7×104
単位)(収率59%)を得た。
実施例9 実施例8で得られた精製酵素液84ml(比活性7.7×104単
位)を水に対して透析し、予め5mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.0)で平衡化させたCM−トヨパール650M (東
洋曹達社製)のカラム(内径2cm×高さ28cm)通した。
こうして得られたCM−トヨパール650Mカラム通過液215m
lに硫酸アンモニウム60.9gを加え、予め45%飽和硫酸ア
ンモニウム溶液で平衡化させたトヨパールHW−65 (東
洋曹達社製)のカラム(内径2cm×高さ45cm)に通し、
L−アミノアシラーゼS2を吸着させた。ついで硫酸アン
モニウム溶液の濃度を直線的に減少させることにより、
L−アミノアシラーゼS2を溶出した。活性画分を集め、
5mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.2)に対して透析を行い、
精製酵素液105ml(比活性2323単位/280nm吸光度)(収
率46%)を得た。
位)を水に対して透析し、予め5mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.0)で平衡化させたCM−トヨパール650M (東
洋曹達社製)のカラム(内径2cm×高さ28cm)通した。
こうして得られたCM−トヨパール650Mカラム通過液215m
lに硫酸アンモニウム60.9gを加え、予め45%飽和硫酸ア
ンモニウム溶液で平衡化させたトヨパールHW−65 (東
洋曹達社製)のカラム(内径2cm×高さ45cm)に通し、
L−アミノアシラーゼS2を吸着させた。ついで硫酸アン
モニウム溶液の濃度を直線的に減少させることにより、
L−アミノアシラーゼS2を溶出した。活性画分を集め、
5mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.2)に対して透析を行い、
精製酵素液105ml(比活性2323単位/280nm吸光度)(収
率46%)を得た。
発明の効果 本発明のL−アミノアシラーゼS2及びL−アミノアシラ
ーゼS2は安価な培地中で産生菌により多量に産生され、
しかも菌体外へ放出されることから、特別な抽出操作を
施すことなく、培養濾液をそのまま酵素溶液として利用
することができる。さらに特にL−アミノアシラーゼS2
の基質特異性の広いこと及び耐熱性にすぐれていること
から、天然のアミノ酸はもとより、非天然型アミノ酸の
光学分割を行うことができ、加えてその際に微生物によ
る汚染に対し特別の操作をすることなく、また基質濃度
をより高くすることが可能である。
ーゼS2は安価な培地中で産生菌により多量に産生され、
しかも菌体外へ放出されることから、特別な抽出操作を
施すことなく、培養濾液をそのまま酵素溶液として利用
することができる。さらに特にL−アミノアシラーゼS2
の基質特異性の広いこと及び耐熱性にすぐれていること
から、天然のアミノ酸はもとより、非天然型アミノ酸の
光学分割を行うことができ、加えてその際に微生物によ
る汚染に対し特別の操作をすることなく、また基質濃度
をより高くすることが可能である。
また本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−アミノア
シラーゼS2は、公知のL−アミノアシラーゼよりも広い
基質特異性を有する。たとえば、公知のアシラーゼであ
るアシラーゼアマノが作用しないDL−スレオ−N−アセ
チル−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セリン
に本発明のL−アミノアシラーゼを作用させると、該化
合物のL体のアセチルアミノ基のみを特異的に加水分解
して、パーキンソン氏病の治療薬として有用なL−スレ
オ−3−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−N−メチル
セリンの合成中間体であるL−スレオ−3−(3,4−ジ
ベンジルオキシフェニル)セリンを得ることができる。
シラーゼS2は、公知のL−アミノアシラーゼよりも広い
基質特異性を有する。たとえば、公知のアシラーゼであ
るアシラーゼアマノが作用しないDL−スレオ−N−アセ
チル−3−(3,4−ジベンジルオキシフェニル)セリン
に本発明のL−アミノアシラーゼを作用させると、該化
合物のL体のアセチルアミノ基のみを特異的に加水分解
して、パーキンソン氏病の治療薬として有用なL−スレ
オ−3−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−N−メチル
セリンの合成中間体であるL−スレオ−3−(3,4−ジ
ベンジルオキシフェニル)セリンを得ることができる。
したがって、本発明のL−アミノアシラーゼS1及びL−
アミノアシラーゼS2を利用することにより、光学活性ア
ミノ酸の工業的製法の簡略化及び効率化が可能である。
アミノアシラーゼS2を利用することにより、光学活性ア
ミノ酸の工業的製法の簡略化及び効率化が可能である。
第1図は本発明のL−アミノアシラーゼS1の熱安定性
を、第2図はその反応温度(至適温度)を、第3図はそ
のpH安定性を、第4図は反応pH(至適pH)をそれぞれ示
す。 第5図は本発明のL−アミノアシラーゼS2の熱安定性
を、第6図はその反応温度(至適温度)を、第7図はそ
のpH安定性を、第8図は反応pH(至適pH)をそれぞれ示
す。また第9図は本発明のL−アミノアシラーゼS1(●
−●)とL−アミノアシラーゼS2(○−○)との熱安定
性に関する比較を示す。
を、第2図はその反応温度(至適温度)を、第3図はそ
のpH安定性を、第4図は反応pH(至適pH)をそれぞれ示
す。 第5図は本発明のL−アミノアシラーゼS2の熱安定性
を、第6図はその反応温度(至適温度)を、第7図はそ
のpH安定性を、第8図は反応pH(至適pH)をそれぞれ示
す。また第9図は本発明のL−アミノアシラーゼS1(●
−●)とL−アミノアシラーゼS2(○−○)との熱安定
性に関する比較を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 FERM P−8599 (72)発明者 松本 郁男 東京都杉並区高井戸西1丁目23番地14号 (72)発明者 森島 甫 東京都目黒区中目黒1丁目1番32−301号 審査官 冨永 みどり (56)参考文献 特公 昭43−24456(JP,B2)
Claims (1)
- 【請求項1】下記の理化学的性状、即ち、 (1)作用及び基質特異性 N−アシル−L−アミノ酸に作用してL−アミノ酸を与
えるL−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のL−アミノ酸のN−アシル体に加え、非天
然型のL−アミノ酸のN−アシル体に対しても作用す
る。一方、N−アシル−D−アミノ酸、DL−N−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びN−アセチル−D
−グルコサミンには作用しない。 (2)安定性 温度:50℃では殆んど活性が保持され、60℃でもなお僅
かに活性が残存する(pH7.0 1時間放置)。 pH :pH7.0〜9.0で最も安定であり、pH10.0附近でも比
較的安定である。但し、pH4.0以下では失活する(5℃2
4時間放置)。 (3)反応性 温度:50℃までは直線的に活性が増加し、60℃以上では
急激に反応性が失われる。 pH :pH6.5〜9.5で反応性が高く、反応の至適pHは、pH
7.5〜8.5附近である。 (4)分子量 50,000〜60,000(ゲル濾過法) (5)等電点 pI=7.00〜7.70 (6)ディスク電気泳動 RmBPB=0.125〜0.167 (7)金属イオンの影響 Fe++、Ni++、Ag+、Hg++及びCu++によって強く阻害され
る。また、Co++によって賦活化される。 (8)阻害剤 p−クロロ水銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード
酢酸では阻害されない。また、エチレンジアミン四酢酸
2ナトリウムにより、緩かに阻害される。 を有する放線菌由来のL−アミノアシラーゼS1及び下記
の理化学的性状、即ち、 (1)作用及び基質特異性 N−アシル−L−アミノ酸に作用してL−アミノ酸を与
えるL−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のL−アミノ酸のN−アシル体に加え、非天
然型のL−アミノ酸のN−アシル体に対しても作用す
る。一方、N−アシル−D−アミノ酸、DL−N−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びN−アセチル−D
−グルコサミンには作用しない。 (2)安定性 温度:50℃まで失活しないが、60℃では80%の活性が保
持され、さらに70℃においても20%以上の活性が残存す
る(pH7.0 10分間放置)。 pH :pH8.5〜10.0で最も安定であり、pH3.5及びpH11.0
附近でも50%の活性が残存する(5℃24時間放置)。 (3)反応性 温度:60℃までは直線的に相対活性は増加し、70℃でも
なお70%以上の反応性が認められる。 pH :pH7.0〜10.0で反応性が高く、反応の至適pHは、pH
8.0〜9.0附近である。 (4)分子量 50,000〜60,000(ゲル濾過法) (5)等電点 pI=6.38〜7.42 (6)ディスク電気泳動 RmBPB=0.180〜0.280 (7)金属イオンの影響 Cu++、Mn++、Co++、Hg++、Fe++、Ni++及びAg+によって
強く阻害される。 (8)阻害剤 p−クロロ水銀安息香酸、L−システイン及びモノヨー
ド酢酸により強く阻害を受けるが、エチレンジアミン四
酢酸2ナトリウムでは殆んど阻害されない。 を有する放線菌由来のL−アミノアシラーゼS2。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9376985 | 1985-05-02 | ||
JP60-93769 | 1985-05-02 | ||
JP5819286 | 1986-03-18 | ||
JP61-58192 | 1986-03-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6322188A JPS6322188A (ja) | 1988-01-29 |
JPH07106150B2 true JPH07106150B2 (ja) | 1995-11-15 |
Family
ID=26399258
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61101042A Expired - Lifetime JPH07106150B2 (ja) | 1985-05-02 | 1986-05-02 | 新規なl−アミノアシラ−ゼ |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4745067A (ja) |
EP (1) | EP0201039B1 (ja) |
JP (1) | JPH07106150B2 (ja) |
DE (1) | DE3680574D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3903324A1 (de) * | 1989-02-04 | 1990-08-09 | Degussa | Mikrobiologisch hergestellte n-acetyl-2,3-didehydroleucin-acylase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
AU2697297A (en) * | 1996-04-25 | 1997-11-19 | Novartis Ag | Biocatalysts with amine acylase activity |
EP1013769A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-28 | Dsm N.V. | Process for the enzymatic preparation of amino acid derivatives with enhanced optical purity |
WO2000037486A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Synthesis and recovery of aspartame involving enzymatic deformylation step |
US6617127B2 (en) | 1998-12-22 | 2003-09-09 | Holland Sweetener Company, V.O.F. | Synthesis and recovery of aspartame involving enzymatic deformylation step |
EP1013663A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-28 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Synthesis and recovery of aspartame involving enzymatic deformylation step |
EP1258531A1 (en) * | 2001-05-14 | 2002-11-20 | Givaudan SA | Compounds and methods for inhibiting axillary malodour |
JP2008307006A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Toyobo Co Ltd | L−アミノ酸の製造方法 |
EP3168208A1 (en) | 2015-11-11 | 2017-05-17 | Quimica Sintetica, S.A. | Processes for the preparation of diastereomerically and enantiomerically enriched oxazolines |
ES2975412T3 (es) | 2018-06-21 | 2024-07-05 | Fis Fabbrica Italiana Sintetici Spa | Proceso enzimático para la preparación de droxidopa |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT313224B (de) * | 1970-01-19 | 1974-01-15 | Astra Laekemedel Ab | Verfahren zur herstellung von l(-)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin undl (-)-3-(3-hydroxyphenyl)-alanin und den entsprechenden veraetherten derivaten |
JPS60160895A (ja) * | 1984-01-31 | 1985-08-22 | Sumitomo Chem Co Ltd | 光学活性−スレオ−3−(3,4−ジヒドロキシフエニル)セリンの製造方法 |
-
1986
- 1986-04-29 US US06/857,941 patent/US4745067A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-30 EP EP86105958A patent/EP0201039B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-30 DE DE8686105958T patent/DE3680574D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-02 JP JP61101042A patent/JPH07106150B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0201039A2 (en) | 1986-11-12 |
DE3680574D1 (de) | 1991-09-05 |
JPS6322188A (ja) | 1988-01-29 |
US4745067A (en) | 1988-05-17 |
EP0201039A3 (en) | 1988-12-07 |
EP0201039B1 (en) | 1991-07-31 |
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