JPH07100034B2 - 耐熱性アミノアシラ−ゼｓｋ−２及びその製造法 - Google Patents
耐熱性アミノアシラ−ゼｓｋ−２及びその製造法Info
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- JPH07100034B2 JPH07100034B2 JP62052732A JP5273287A JPH07100034B2 JP H07100034 B2 JPH07100034 B2 JP H07100034B2 JP 62052732 A JP62052732 A JP 62052732A JP 5273287 A JP5273287 A JP 5273287A JP H07100034 B2 JPH07100034 B2 JP H07100034B2
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Description
【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、耐熱性アミノアシラーゼ及びその製造法に関
する。更に詳細には、80℃,10分処理において90％安定
でＮ−アセチル−Ｌメチオニン及びＮ−アセチル−Ｌ−
アラニンに同等に作用する耐熱性アミノアシラーゼ及び
バチルス・サーモグルコシダスを培養し、培養物中より
該耐熱性アミノアシラーゼを採取することを特徴とする
耐熱性アミノアシラーゼの製造法に関する。
する。更に詳細には、80℃,10分処理において90％安定
でＮ−アセチル−Ｌメチオニン及びＮ−アセチル−Ｌ−
アラニンに同等に作用する耐熱性アミノアシラーゼ及び
バチルス・サーモグルコシダスを培養し、培養物中より
該耐熱性アミノアシラーゼを採取することを特徴とする
耐熱性アミノアシラーゼの製造法に関する。
本発明の耐熱性アミノアシラーゼは、D,L−アミノ酸を
光学的に分割するのに好適に利用されうる。
光学的に分割するのに好適に利用されうる。
「従来技術」 アミノアシラーゼは、動物、植物、微生物にわたって広
く分布していることが知られているが、アイノアシラー
ゼを工業的に使用するにあたっては、微生物起源のアミ
ノアシラーゼが好ましい。微生物によるアミノアシラー
ゼ生産例としては、アスペルギルス、ペニシリウム属等
の糸状菌（特公昭35−10692号）、フアカルタティブ・
メタノール資化性細菌（特公昭60−19996号）、シユー
ドモナス・クルシビエ（特公昭43−24462号）、放線菌
（特公昭4324456号）等が知られている。
く分布していることが知られているが、アイノアシラー
ゼを工業的に使用するにあたっては、微生物起源のアミ
ノアシラーゼが好ましい。微生物によるアミノアシラー
ゼ生産例としては、アスペルギルス、ペニシリウム属等
の糸状菌（特公昭35−10692号）、フアカルタティブ・
メタノール資化性細菌（特公昭60−19996号）、シユー
ドモナス・クルシビエ（特公昭43−24462号）、放線菌
（特公昭4324456号）等が知られている。
更に最近になって、工業的により有利な耐熱性アミノア
シラーゼ産生能を有するアスペルギルス属の報告もなさ
れている（特公昭57−4310号）。
シラーゼ産生能を有するアスペルギルス属の報告もなさ
れている（特公昭57−4310号）。
又、本出願人が出願しているバチルス・ステアロサーモ
フイルスによる耐熱性アミノアシラーゼの報告（特開昭
62−44181号）がある。
フイルスによる耐熱性アミノアシラーゼの報告（特開昭
62−44181号）がある。
「発明が解決すべき問題点」 従来の微生物起源のアミノアシラーゼは、工業的に使用
する場合に耐熱性が弱いという欠点が有り、特開昭62−
44181号の耐熱性アミノアシラーゼは、従来のものに比
較してより有利に使用出来るというものの、より耐熱性
にすぐれたアミノアシラーゼが望まれていた。
する場合に耐熱性が弱いという欠点が有り、特開昭62−
44181号の耐熱性アミノアシラーゼは、従来のものに比
較してより有利に使用出来るというものの、より耐熱性
にすぐれたアミノアシラーゼが望まれていた。
「問題点を解決すべき手段」 そこで本発明者らは、より耐熱性に富むアミノアシラー
ゼを生産する微生物を求め鋭意検討した。
ゼを生産する微生物を求め鋭意検討した。
その結果、中等度好熱性細菌の一種であるバチルス・サ
ーモグルコシダスの１菌株を培養したところ該菌株が菌
体中に耐熱性アミノアシラーゼを著量産生することを見
いだし、これを採取することにより本発明を完成した。
ーモグルコシダスの１菌株を培養したところ該菌株が菌
体中に耐熱性アミノアシラーゼを著量産生することを見
いだし、これを採取することにより本発明を完成した。
本発明で用いる耐熱性アミノアシラーゼ生産菌は、バチ
ルス・サーモグルコシダスDSM2542であり、本菌株を用
いた培養条件及び精製酵素標品の調製法を以下にのべ
る。
ルス・サーモグルコシダスDSM2542であり、本菌株を用
いた培養条件及び精製酵素標品の調製法を以下にのべ
る。
本菌の栄養源としては、グルコース，マルトース等の炭
素源，ペプトン，肉エキス等の窒素源、NaCl,K2HPO4,KH
2PO4,MgSO4,CaCl2,MnCl2等の各種無機塩及び酵母エキス
よりなる培地を使用する。なおＮ−アセチル−アミノ酸
の添加は、本菌の耐熱性アミノアシラーゼ生産を誘導す
る効果を有する。
素源，ペプトン，肉エキス等の窒素源、NaCl,K2HPO4,KH
2PO4,MgSO4,CaCl2,MnCl2等の各種無機塩及び酵母エキス
よりなる培地を使用する。なおＮ−アセチル−アミノ酸
の添加は、本菌の耐熱性アミノアシラーゼ生産を誘導す
る効果を有する。
本菌を接種後55℃,6〜７時間通気撹拌培養を行い、得ら
れた菌体をダイノミルで破砕後、遠心分離等の手段にて
無細胞抽出液を調製し、粗酵素液を得る。
れた菌体をダイノミルで破砕後、遠心分離等の手段にて
無細胞抽出液を調製し、粗酵素液を得る。
粗酵素液は、DEAE−セルロース、ブチルートヨパール
（東洋曹達工業社製、商品名）、ヒドロキシアパタイト
等の各種クロマトグラフイー等の手段、更には、ゲルろ
過、高速液体クロマトグラフイー及び高性能イオン交換
クロマトグラフイー等の手段を駆使して精製し、電気泳
動的に単一な酵素標品とすることもできる。
（東洋曹達工業社製、商品名）、ヒドロキシアパタイト
等の各種クロマトグラフイー等の手段、更には、ゲルろ
過、高速液体クロマトグラフイー及び高性能イオン交換
クロマトグラフイー等の手段を駆使して精製し、電気泳
動的に単一な酵素標品とすることもできる。
こうして得られた精製アミノアシラーゼの酵素化学的性
質を以下に述べる。
質を以下に述べる。
１）作用：本酵素は、Ｎ−アセチル−D,L−アミノ酸に
作用し、Ｌ−アミノ酸を遊離させる。
作用し、Ｌ−アミノ酸を遊離させる。
２）基質特異性：本酵素は表１に示すとおり、アセチル
化アミノ酸のＬ体のみに作用し、Ｄ体には、作用しな
い。そしてアセチル化Ｌ−アミノ酸では、Ｎ−アセチル
−Ｌ−メチオニン及びＮ−アセチル−Ｌ−アラニンに
は、ほぼ同程度に作用する。更に又、クロロアセチル体
の方がアセチル体よりもはるかに良く作用する。
化アミノ酸のＬ体のみに作用し、Ｄ体には、作用しな
い。そしてアセチル化Ｌ−アミノ酸では、Ｎ−アセチル
−Ｌ−メチオニン及びＮ−アセチル−Ｌ−アラニンに
は、ほぼ同程度に作用する。更に又、クロロアセチル体
の方がアセチル体よりもはるかに良く作用する。
３）至適pH:8.3付近である。
４）pH安定性:37℃、60分処理においてpH6.0〜11.5まで
安定である。
安定である。
５）至適温度:70℃付近である。
６）温度安定性：本酵素は、pH8.0において80℃,10分の
処理では90％安定である。
処理では90％安定である。
７）活性測定方:0.25Mブリトン−ロビンソン緩衝液（pH
8.0）0.2ml、10-3M CoCl20.1ml酵素溶液0.3mlからなる
混合液を50℃,5分インキユベートし、次いで0.2M N−ア
セチル−D,L−メチオニン0.4mlを加え50℃,10〜40分反
応後、20％トリクロロ酢酸0.2mlを加え、遠心分離上清
1.0mlにニンヒドリン−ヒドリダンチン1.0mlを加え、10
0℃,15分間加熱したものにアセトン:0.1M Na3PO4:水＝
4:2.4:3.6からなる希釈液3.0mlを加えて吸光度A570nmの
波長を測定する。なお、上記条件下で毎分１μmoleのＬ
−メチオニンを生成する酵素量を１単位とした。
8.0）0.2ml、10-3M CoCl20.1ml酵素溶液0.3mlからなる
混合液を50℃,5分インキユベートし、次いで0.2M N−ア
セチル−D,L−メチオニン0.4mlを加え50℃,10〜40分反
応後、20％トリクロロ酢酸0.2mlを加え、遠心分離上清
1.0mlにニンヒドリン−ヒドリダンチン1.0mlを加え、10
0℃,15分間加熱したものにアセトン:0.1M Na3PO4:水＝
4:2.4:3.6からなる希釈液3.0mlを加えて吸光度A570nmの
波長を測定する。なお、上記条件下で毎分１μmoleのＬ
−メチオニンを生成する酵素量を１単位とした。
８）阻害剤:1mMのSH試薬で80％阻害され、0.1mMのHgCl2
及びAgCl2で100％阻害される。
及びAgCl2で100％阻害される。
９）金属塩の影響：本酵素の各種金属イオンによる影響
について表２に示した。即ち本酵素はCo2+、Mn2+により
活性化され、Hg2+、Ag2+により阻害される。
について表２に示した。即ち本酵素はCo2+、Mn2+により
活性化され、Hg2+、Ag2+により阻害される。
10）サブユニツトの分子量:43,000（SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動方による。） 11）分子量：約175,000（ゲルろ過法による。） 12）電気泳動での移動度:RmBPS＝31である。
アミド電気泳動方による。） 11）分子量：約175,000（ゲルろ過法による。） 12）電気泳動での移動度:RmBPS＝31である。
上記の酵素化学的性質を示す本発明の耐熱性アミノアシ
ラーゼSK−２と特公昭57−4310号の耐熱性アシラーゼの
性質比較を表３に示し、本出願人による特開昭62−4418
1号との比較を表４及び基質特異性の相対活性比較を表
５に示す。
ラーゼSK−２と特公昭57−4310号の耐熱性アシラーゼの
性質比較を表３に示し、本出願人による特開昭62−4418
1号との比較を表４及び基質特異性の相対活性比較を表
５に示す。
表３より明らかのように、本発明の耐熱性アミノアシラ
ーゼSK−２は、特公昭57−4310号の耐熱性アミノアシラ
ーゼと比較してより広いpH安定範囲を有し、かつ温度安
定性も高い。更に分子量も著しく相違するので両者は明
らかに酵素化学的性質を異にする。また本出願人の出願
になる特開昭62−44181号と比較しても表４及び表５の
ように、分子量、至適温度及び基質特異性が明らかに相
違する。従って本発明の耐熱性アミノアシラーゼは新規
酵素であり、本発明者らは、これを耐熱性アミノアシラ
ーゼSK−２と命名することにした。
ーゼSK−２は、特公昭57−4310号の耐熱性アミノアシラ
ーゼと比較してより広いpH安定範囲を有し、かつ温度安
定性も高い。更に分子量も著しく相違するので両者は明
らかに酵素化学的性質を異にする。また本出願人の出願
になる特開昭62−44181号と比較しても表４及び表５の
ように、分子量、至適温度及び基質特異性が明らかに相
違する。従って本発明の耐熱性アミノアシラーゼは新規
酵素であり、本発明者らは、これを耐熱性アミノアシラ
ーゼSK−２と命名することにした。
以下に耐熱性アミノアシラーゼSK−２の製造法について
実施例にて具体的に説明する。
実施例にて具体的に説明する。
実施例 グリセロール１％,N−アセチル−D,L−メチオニン２％,
NaCl0.2％,K2HPO40.2％,KH2PO40.2％,MgSO4・7H2O0.01
％,CaCl2・2H2O0.007％,MnCl2・4H2O0.0002％，酵母エ
キス0.2％及び肉エキス0.1％からなる種培養培地（pH7.
2）にバチルス・サーモグルコシダスDSM2540を接種し、
55℃で培養を行い、次いでこのものをあらかじめ110℃,
10分間殺菌したグルコース１％,N−アセチル−D,L−メ
チオニン２％,NaCl0.2％,K2HPO40.2％,KH2PO40.2％,MgS
O4・7H2O0.01％,CaCl2・2H2O0.007％,MnCl2・4H2O0.000
2％，酵母エキス0.2％及び肉エキス0.1％からなる培地
（pH7.2）48を含む50ジヤーフアメンターに接種
し、55℃,7時間通気撹拌培養した。培養終了後、得られ
た菌体150gをダイノミルで破砕後、遠心分離し、無細胞
抽出液を調製し、耐熱性アミノアシラーゼSK−２の酵素
液500を得た。本粗酵素液の総活性は、4300uであっ
た。次いで本粗酵素液をDEAE−セルロース、ブチルトヨ
パール（東洋曹達社製、商品名）、ヒドロキシアパタイ
トなどの各種クロマトグラフイーにて処理したのち、更
にセルロフアインGCL−2000sf（チッソ社製、商品名）
によるゲルろ過処理、Toyo Soda TSK Pheny1−5PW（東
洋曹達社製、商品名）による高速液体クロマトグラフイ
ー処理及びFPLC MonoQ（フアルマシア社製、商標名）に
よる高性能イオン交換クロマトグラフイー処理を施すこ
とによって本酵素を単一化した。均一精製した耐熱性ア
ミノアシラーゼSK−２ 1mgの総活性は3500uで粗酵素液
からの収率は35％であった。
NaCl0.2％,K2HPO40.2％,KH2PO40.2％,MgSO4・7H2O0.01
％,CaCl2・2H2O0.007％,MnCl2・4H2O0.0002％，酵母エ
キス0.2％及び肉エキス0.1％からなる種培養培地（pH7.
2）にバチルス・サーモグルコシダスDSM2540を接種し、
55℃で培養を行い、次いでこのものをあらかじめ110℃,
10分間殺菌したグルコース１％,N−アセチル−D,L−メ
チオニン２％,NaCl0.2％,K2HPO40.2％,KH2PO40.2％,MgS
O4・7H2O0.01％,CaCl2・2H2O0.007％,MnCl2・4H2O0.000
2％，酵母エキス0.2％及び肉エキス0.1％からなる培地
（pH7.2）48を含む50ジヤーフアメンターに接種
し、55℃,7時間通気撹拌培養した。培養終了後、得られ
た菌体150gをダイノミルで破砕後、遠心分離し、無細胞
抽出液を調製し、耐熱性アミノアシラーゼSK−２の酵素
液500を得た。本粗酵素液の総活性は、4300uであっ
た。次いで本粗酵素液をDEAE−セルロース、ブチルトヨ
パール（東洋曹達社製、商品名）、ヒドロキシアパタイ
トなどの各種クロマトグラフイーにて処理したのち、更
にセルロフアインGCL−2000sf（チッソ社製、商品名）
によるゲルろ過処理、Toyo Soda TSK Pheny1−5PW（東
洋曹達社製、商品名）による高速液体クロマトグラフイ
ー処理及びFPLC MonoQ（フアルマシア社製、商標名）に
よる高性能イオン交換クロマトグラフイー処理を施すこ
とによって本酵素を単一化した。均一精製した耐熱性ア
ミノアシラーゼSK−２ 1mgの総活性は3500uで粗酵素液
からの収率は35％であった。
「発明の効果」 本発明の耐熱性アミノアシラーゼSK−２は、従来のアミ
ノアシラーゼよりも耐熱性に優れており、D,L−アミノ
酸の光学分割に使用する場合特に有利である。
ノアシラーゼよりも耐熱性に優れており、D,L−アミノ
酸の光学分割に使用する場合特に有利である。
そして又、バチルス・サーモグルコシダスを好気的条件
下で培養することによって容易に該酵素を取得すること
ができる。
下で培養することによって容易に該酵素を取得すること
ができる。
第１図〜第４図は本発明の耐熱性アミノアシラーゼSK−
２の酵素化学的性質を示すものであり、そのうち第１図
は至適pH曲線を、第２図はpH安定曲線を、第３図は温度
安定曲線をそして第４図は至適温度曲線をそれぞれ示す
ものである。なお第３図における白丸は、各温度で10分
処理した場合、黒丸は各温度で30分処理した場合をそれ
ぞれ示す。
２の酵素化学的性質を示すものであり、そのうち第１図
は至適pH曲線を、第２図はpH安定曲線を、第３図は温度
安定曲線をそして第４図は至適温度曲線をそれぞれ示す
ものである。なお第３図における白丸は、各温度で10分
処理した場合、黒丸は各温度で30分処理した場合をそれ
ぞれ示す。
Claims (3)
- 【請求項１】以下の酵素化学的性質を有する耐熱性アミ
ノアシラーゼSK−２。 １）作用:N−アセチル−D,L−アミノ酸に作用し、Ｌ−
アミノ酸を遊離させる。 ２）基質特異性：アセチル化アミノ酸のＬ体のみに作用
し、Ｄ体には作用しない。そしてアセチル化Ｌ−アミノ
酸では、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン及びＮ−アセチ
ル−Ｌ−アラニンには、ほぼ同定度に作用する。 ３）至適pH:8.3付近 ４）pH安定性:37℃、60分処理においてpH6.0〜11.5まで
安定である。 ５）至適温度:70℃付近 ６）温度安定性:80℃,10分処理においても90％安定であ
る。 ７）分子量：約175,000（ゲルろ過法による。） - 【請求項２】バチルス属に属する耐熱性アミノアシラー
ゼSK−２生産能を有する菌株を培養し、培養物中に耐熱
性アミノアシラーゼSK−２を生成せしめ、これを採取す
ることを特徴とする耐熱性アミノアシラーゼSK−２の製
造法。 - 【請求項３】バチルス属に属する耐熱性アミノアシラー
ゼSK−２生産能を有する菌株が、バチルス・サーモグル
コシダスである特許請求の範囲第２項記載の耐熱性アミ
ノアシラーゼSK−２の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62052732A JPH07100034B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | 耐熱性アミノアシラ−ゼｓｋ−２及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62052732A JPH07100034B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | 耐熱性アミノアシラ−ゼｓｋ−２及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63219379A JPS63219379A (ja) | 1988-09-13 |
| JPH07100034B2 true JPH07100034B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=12923099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62052732A Expired - Fee Related JPH07100034B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | 耐熱性アミノアシラ−ゼｓｋ−２及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100034B2 (ja) |
-
1987
- 1987-03-06 JP JP62052732A patent/JPH07100034B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63219379A (ja) | 1988-09-13 |
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