JPH02234678A - アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、新規なアミノ酸アミド加水分解酵素、その
製造方法、該酵素を生産する微生物、及び該酵素を使用
するＤ−アミノ酸の製造法に関する。Ｄ−アミノ酸は、
医薬、農薬、食品の合成原料として有用である。

〔従来の技術〕

アミノ酸アミド加水分解酵素は、通常、Ｌ−アミノ酸ア
ミドに作用してＬ−アミノ酸を遊離する。

ロビンソンら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｎ＋ｉｓｔｒｙ＋２０２．　１　（１９
５３））、ホプスら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，
　１１４，　　５６７−５７５　（１９６６））、ミナ
ミウラら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＰｅｒｍｅｎｔａＬ
ｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏ］ｏｇｙ，　３３，　６５３　（
１９６９））　、プランスコットら（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　７５，　１８５　
（１９７４））は、各種生物由来のアミノベプチダーゼ
が、Ｌ−アミノ酸からなるペプチドに作用するのみなら
ず、Ｄアミノ酸をＮ末端とするペプチドに対してもわず
かに作用することを報告しているが、これらは、Ｄ−ア
ミノ酸からなるペプチドにのみ特異的に作用するアミノ
酸アミド加水分解酵素ではない。

マエストラッチら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｆｔｌｒ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３８，　３１５　（１９８４
））は、プレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｆｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属細菌の産生ずるアシルアミド・アミドヒドロ
ラーゼ（ＥＣ　３．５．１．４）が直鎖あるいは芳香族
カルボン酸アミドのみならずＤ−アラニンアミドにも作
用することを報告しているがＤ一立体特異的な加水分解
については全く記載されていない。

又、本酵素はアミノ酸アミド加水分解酵素ではない。

特開昭５７−１３０００　，特開昭５９−１５９７８　
、特開昭６０−３６４４６　、特開昭６２−５５０９７
　、及び特開昭６２−２５３３９７には、各種微生物に
よるＤＬ−アミノ酸アミド又は、Ｌ−アミノ酸アミドの
、対応するＬアミノ酸への酵素的加水分解法が記載され
ているが、酵素化学的見地から、いかなる酵素が関与し
ているのかについて記載．されていない。又、Ｄアミノ
酸アミド含有物のＤ立体特異的な加水分解については全
く記載されていない。

特開昭６０−１８４３９２にはアク口モハクタ−（Ａｃ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ｍμ上
１肋並）属、及びクルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属細菌菌
体によるＤ−アミノ酸アミドの、対応するＤ−アミノ酸
への酵素的加水分解法が記載されているが、酵素化学的
見地から、いかなる酵素が関与しているのかについて記
載されていない。又、記載されている加水分解反応はＤ
−アミノ酸，アミドを原料とするものであり、Ｄ−アミ
ノ酸アミド含有物のＤ立体特異的な加水分解については
確認されていない。

特開昭６１−９６９８９にはロドコッカス・エリスロポ
リス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒ　ｔｈｒｏ　ｏｌ
ｉｓ）菌体によるＤーアミノ酸アミドの、対応するＤ−
アミノ酸への酵素的加水分解法が記載されているが、酵
素化学的見地から、いかなる酵素が関与しているのかに
ついて記載されていない。又、Ｄ−アミノ酸アミド含有
物のＤ立体特異的な加水分解については全く記載されて
いない。

特開昭６１−　２７４６９０には、シュードモナス（ｂ
！とｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属、及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
細菌菌体によるＤ−アミノ酸アミドの、対応するＤ−ア
ミノ酸への酵素的加水分解法が記載されているが、酵素
化学的見地からいかなる酵素が関与しているのかについ
て記載されていない。又、記載されている加水分解反応
はＤ−アミノ酸アミドを原料とするものであり、Ｄ−ア
ミノ酸アミド含有物のＤ立体特異的な加水分解について
は全く記載されていない。

特開昭６３−８７９９８　、および銅谷ら、昭和６３年
度日本醗酵工学会大会講演要旨集Ｐ　３４には、ロドコ
ッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌菌体によるＤ
Ｌアミノ酸アミドの、対応するＤ−アミノ酸への酵素的
加水分解法が記載されているが、酵素化学的見地からい
かなる酵素が関与しているのかについて記載されていな
い。又、記載されている加水分解反応はアク口モバクタ
ー（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌によるもので
はない。

尾崎ら、昭和６３年度日本醗酵工学会大会講演要旨集Ｐ
　３４には、アルスロバクタ−（＾ｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ）属細菌菌体によるＤＬ−アラニンアミドの、対応
するＤ−アラニンへの酵素的加水分解法が記載されてい
るが、酵素化学的見地からいかなる酵素が関与している
のかについて記載されていない。又、記載されている加
水分解反応はアク口モバクター（＾ｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒ）属細菌によるものではない。

浅野ら、昭和６３年度日本日本農芸化学会大会講演要旨
集Ｐ　５Ｂ８　；浅野、昭和６３年度有機合成夏１υ１
セミナー「活きた有機合成の新手法と新概念Ｊ要旨集１
１２８．浅野、ベトロテック１２．　４２　（１９８８
）には、未同定細菌より精製したＤ−アミノ酸アミ１゛
加水分解酵素によるＤ　Ｉ．−アミノ酸アミドの、対応
するＤ−アミノ酸への酵素的加水分解法が記載されてい
るが、記載されている加水分解酵素の分子量は１２２，
０００であり、本発明の酵素とは、分子量の点で異なる
。また、該酵素が作用する基質としてはＤ−アラニンア
ミト、Ｄ−２−アミノ酪酸アミ１゛、Ｄ−セリンアミド
、Ｄ−スレオニンアミト、Ｄ−メチオニンアミド、及び
Ｄ−ノルハリンアミドのアミノ酸アミト、並びにＤ−ア
ラニルグリシン、Ｄ−アラニルーＤ−アラニル−Ｄ−ア
ラニン、Ｄ−アラニルーし−アラニルーし−アラニン、
Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニルーＤ−アラニル−Ｄ−アラ
ニン、Ｄ−アラニンパラニト口アニリド等のＤ−アラニ
ン誘導体が言及されているにすぎず、他のアミノ酸誘導
体に作用する旨の記載はない。

特公昭６１−６８には、Ｄ−アミノ酸を含むオリゴベプ
チドに作用する放線菌由来のＤ−アミノ酸ペブチダーゼ
の製造法が記されているが、本酵素はベブチドのＣ末端
に作用するカルボキシペプチダーゼ様酵素であって、Ｄ
−アミノ酸アミドに特異的な加水分解酵素ではない。

従って、アクロモバクター属細菌の菌体処理物によるＤ
　Ｌ−アミノ酸アミドの、対応するＤ−アミノ酸へのＤ
立体選択的な加水分解法については、Ｄ−アラニンアミ
ド、Ｄ−２−アミノ酪酸アミト、Ｄ−セリンアミド、Ｄ
−スレオニンアミド、Ｄメチオニンアミド、及びＤ−ノ
ルハリンアミド以外、全く知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、今まで存在することが知られていなか
った基質特異性および分子量を有するＤアミノ酸アミド
に特異的な加水分解酵素、該酵素の新規な製造方法、該
酵素を生産する微生物、及び該酵素を利用するＤ−アミ
ノ酸の新規な製造法を提供しようとするものである。

〔課題を解決するだめの手段〕 本発明者等は、該酵素を生産する新規な微生物及び該酵
素の新規な製造方法を開発するために、Ｄ−アミノ酸誘
導体に特異的に作用するアミノ酸アミド加水分解酵素活
性を有する菌株を広範囲にスクリーニングしたところ、
アク口モハククー属細菌が新規なＤ−アミノ酸アミノ酸
アミド加水分解酵素を生産することを見出した。

前記の目的は、Ｄ−アミノ酸誘導体に特異的に作用する
ことを特徴とするアミノ酸アミド加水分解酵素；アミノ
酸アミド加水分解酵素を生産する細菌を培養し、この培
養物から前記酵素を採取することを特徴とする前記酵素
の製造方法；前記酵素又は該酵素の含有物の存在下でＤ
−アミノ酸アミド含有物を反応せしめ、該Ｄ−アミノ酸
を採取することを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法；
を提供することにより解決される。

翼下余白 〔具体的な説明〕 （１）微生粗 本発明において使用する微生物としてばＤ−アミノ酸誘
導体に特異的なアミノ酸アミト加水分解酵素を生産でき
るアク口モハククー（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属
に属する微生物であればよく、このような微生物は保存
菌のなかから選択することができる場合もあり、また自
然界から分離することができる。

このような微生物としては、例えば本発明者により分離
された新菌株アク口モバクターｓｐ．　ＳＣＲＣＳＶ３
を挙げることができる。この菌株アク口モハクタ−ｓｐ
．　ＳＣＲＣ−ＳＶ３は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第／ｔ＞ｔ６９　号（ＦＥＲＭ　Ｐ／０
〆Ｏｆ　　）として寄託されている。

この菌株の分離源は神奈川県相模原市である。

前記の新規な菌株は第１表に示すような菌学的性質を有
する。

以下余白 ？■」一一表 １」」糺ＩＪＬｊト戸 ａ）形態 ■　細胞の型 大きさ ２　多形性の有無 ３　運動性の有無 ４　胞子の有無 ５　グラム染色 ６　抗酸性 ｂ）各培地における生育状態 １　肉汁寒天平板培養 （３０゜Ｃ，３日間） イ）コロニー形状（直径） 口）コロニーの形 ハ）コロニー表面の形状 二）コロニーの隆起状態 ホ）コロニーの周縁 へ）コロニーの色調 ト）コロニーの透明度 桿菌 ０．６厠Ｘ１．２！ｌｍ ＋ １ｍｍ 円形 平滑 球面 全縁 淡ベージュ 不透明 観察項目 チ）コロニーの光沢 り）可溶性色素の生成 ２　肉汁寒天斜面培養 （３０゜Ｃ，３日間） イ）生育の良否 口）コロニーの光沢 ３　肉汁液体培養 （３０゜Ｃ，７日間） イ）表面の生育 口）濁度 ハ）沈殿 二）ガス発生 ４　肉汁ゼラチン （３０゜Ｃ，７日間） ゼラチン液化 ５　リトマスミルク （３０゜Ｃ，７日間） ＳＣＲＣ−ＳＶ３の観察結果 あ　　り な　　し 良好 あ　　り 良好 濁 な　　し な　　し 第Ｕ戸 第１Ｊし０先１戸 Ｃ）生理学的性質 １　硝酸塩の還元 ２脱窒 ３ＭＲ ４ＶＰ ５　インドール生成 ６　硫化水素の生成 ７　デンプンの加水分解 ８　クエン酸利用（Ｓｉｍｍｏｎｓ） ９　色素生成 イ）　Ｋｉｎｇ　Ａ培地 口）　Ｋｉｎｇ　Ｂ培地 １０　　ウレアーゼ １１　　オキシダーゼ １２　　カタラーゼ １３　　生育の範囲 イ）ｐＨ ＋ 十 ＋ 十 ＋ ６〜１０ ロ）温度 ３０゜Ｃ ３７゜Ｃ ４１゜Ｃ １４　　酸素に対する態度 １５　　０−Ｆテスト （グルコース） １６Ｉ！類からの酸および ガスの生成 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクース 麦芽糖 シヨ糖 酸化的 ガス 第１−　　　８斤 男」」礼ユ實１１斤 酸 ガス ９．乳糖 １０．１〜レハロース １１．Ｄ−ソルビット １２．Ｄ−マンニット １３．グリセリン １４．デンプン １５．ラフィノース １６．イヌリン １７，Ｄ−リボース １８，ソルホース １９．カルホキシメチルセルロース ２０．グリコーゲン １７　　ヒタミン要求性；あり。

ｅ）その他の諸性質 ＤＮａｓｅ アルギニンの分解 ゼラチンの分解性 ＋ 耐塩性　　５％　　　　　　　　＋ ７％士 １０％ 上記の菌学的性質に基づきチェスクーとクーパ−　（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，　９，　４２５（１９７９）　：］及び
、Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ４ｔｈ　ｅｄ．，　Ｐ　３３０，　（１
９８５）の記述に従って、前記ＳＣＲＣ　ＳＶ３の菌株
を次のように同定した。すなわち、ダラム陰性、胞子の
生成無し、短桿菌、運動性、好気的、オキシダーゼ陽性
、及びグルコースから酸が生成する。このような性質か
らアク口モパクター属に属する細菌であることが明らか
である。

なお、これらの菌株に変異を生じさせて一層生産性の高
い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の細胞
中に存在するアミノ酸アミト加水分解酵素の生産に関与
する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばブ
ラスミドに挿入し、このヘクターを用いて適当な宿主、
例えばエッジェリッヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）や酵母のごとき異種宿主もしくはアク
口モバクター属細菌のごとき同種宿主を形質転換するこ
とにより、本発明のアミノ酸アミト加水分解酵素生産株
を人為的に創製することもできる。

（２）■案勿製造方迭 前記の微生物を培養して本発明のアミノ酸アミド加水分
解酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地として、
この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれを使
用してもよい。この培地は、窒素源として例えば硫安、
酵母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種
類を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源
としてグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることが
できる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましル１。また、酵素の誘導物質となりうる少量の
Ｄ−アミノ酸アミドを添加することも好ましい。Ｄ−ア
ミノ酸アミドの添加量は基礎培地の組成、培養する菌株
の性質により異なるが、およそ０．０１〜５％である。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、アミノ酸
アミド加水分解酵素が生産される温度範囲内であればい
ずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜４５゜Ｃであ
る。ｐｌ＋は５〜１１、好ましくは６〜１０の範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好まし《は６〜７２時間である。

次に得られた培養物から本発明のアミノ酸アミド加水分
解酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精製法
を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を集め
、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって菌体
を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などによっ
て除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は
硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行ない、塩析、
有機溶媒沈殿、吸着クロマＩ・グラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ア
フィニティーク口マトグラフィー等を行ない、さらに硫
酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の添
加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵素
標品を単離することが出来る。

この方法において使用されるアミノ酸アミド加水分解酵
素の使用形態は特に限定されない。例えば、精製された
酵素を使用することができるのは無論のこと、細胞を含
有する培養液、培養生菌体、アセ１・ン等によって脱水
処理された風乾菌体、菌体破砕物、種々の段階まで精製
された部分精製物を使用することが出来る。さらにこれ
らの酵素または酵素含有物をポリアクリルアミド、光架
橋性樹脂、ポリウレタン樹脂、カッパ力ラギーナン、ア
ルギン酸ナトリウム、イオン交換樹脂、半透膜、高分子
酵素修飾剤等により固定化したものを使用することが出
来る。

（３）方囁災撒足抜 本発明においては次の方法により力価を測定した。トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５０μｍｏｎ、Ｄフェニ
ルアラニンアミド５μｌ！ｌｏｆ！．、及び適当量の酵
素サンプルを０．５ｍｌになるように混合し、３０゜Ｃ
において１０分間反応せしめた後、沸騰水中に３分間浸
して反応を停止し、生成したＤ−フェニルアラニンを以
下の方法によって定量した。すなわち、上記反応液０．
　５　ｍｌに、フェノール１０．６ｐｍｏｎ，４−アミ
ノアンチピリン０．　７９　ｐ　ｍｏ　ｐ．、パーオキ
シダーゼ５単位を加えて、１．５威とし、３０゛Ｃにお
いて５分間保温した後、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを０
．１４単位加えて１．　６　ｍｌとし、３７゜Ｃにおい
て６０分間振盪した。これを沸騰水中に３分間浸して反
応を停止し、５００ｎｍにおける吸収を測定して、検量
線より反応液中のＤ−フェニルアラニン量を求めた。ま
た、他のＤ一及びＬ−アミノ酸アミドに対する本酵素の
活性は、生成するアンモニアを定量キット（協和メデッ
クス社製）を用いて測定して求めた。１分間当り１μｍ
ｏｌのＤ−フエニルアラニンを生成する酵素量を１単位
とした。

（４）酢１１回１貫 本発明のアミノ酸アミド加水分解酵素は次の性質を有す
る。

（１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｄ−アミノ酸アミド十Ｈ２０→Ｄ−アミノ酸十ＮＨ３（
２）基質特異性：本酵素は、Ｄ−トリプトファンアミド
、Ｄ−フエニルアラニンアミド、，Ｄ−チロシンアミド
等の芳香族Ｄ〜アミノ酸アミド、及びその他の比較的疎
水性の高いＤ−アミノ酸アミドを良好な基質とする。具
体的には第２表の通りである。

翼下余ε 算一」Ｌ一表 Ｄ−フェニルアラニンアミド Ｄ−トリプトファンアミド Ｄ−チロシンアミド Ｄ一ロイシンアミド Ｄ−アラニンアミド Ｄ−メチオニンアミド Ｄ−ノルロイシンアミド Ｄ−ノルハリンアミド Ｄ−フェニルグリシンアミド Ｄ−パラヒドロギシフェニル グリシンアミド Ｄ−プロリンアミド Ｄ−リジンアミド Ｄ−ヒスチジンアミド Ｄ−アスパラギン酸アミド Ｄ−グルタミンアミド Ｄ−スレオニンアミド グリシンアミド ９．７ ２．５ １．５ １．４ １，１ ０．６４ ０．５７ 第フ−１１”ａ戸 Ｄ−グルタミン酸アミド　　　　　　　　　０．２７Ｄ
−アスパラギンアミド　　　　　　　　０．２６Ｄ−α
−アミノ酪酸アミド　　　　　　　　０．１８Ｄ−イソ
グルタミン酸アミト　　　　　　　０．１００−アルギ
ニンアミド　　　　　　　　　　０．０９Ｄ−ハリンア
ミド　　　　　　　　　　　　０．１５Ｄ−イソロイシ
ンアミド　　　　　　　　　０．１１Ｄ−フェニルアラ
ニンメチル　　　　１９２エステル これらに対応するＬ−アミノ酸アミドには作用しない。

（３）至適ｐｔ｛：ｐｌｌ８付近が至適である。

（４）ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０．０５Ｍ）中、
３０゜Ｃにて１時間保温した後の残存活性を測定した場
合、ｐＨ７．０〜１０．０付近が安定である。

（５）至適温度：４０゜Ｃ付近における活性が最大であ
る。

（６）温度安定性：　０．　Ｉ　Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ
＋８．０）中、各温度において１０分間処理した後の残
存活性を測定したところ、３５゜Ｃで８５％の活性が残
存していた。

（７）吸収スペクトル：　　２７８ｎｍに極大吸収を有
する。

（８）金属イオン、阻害剤の影響：亜鉛、水銀等の金属
イオン及びＰＭＳＦ等の阻害剤によって活性が阻害され
る。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合、約５．３である。

（１０）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ
３０００　３誉）により約３８，０００と算出される。

（１１）均一性：高速液体クロマトグラフィ−（ＴＳＫ
ＤＥＡＲ　５ＰＷ）により第１図Ａに示す如く単一のピ
ークをリえる。また、ポリアクリルアミトゲル電気泳動
により第１図Ｂに示す如く単一のハンドを与える。

Ｄ−アミノ酸アミド含有物からＤ−アミノ酸を合成する
方法は、以下のごとくに行われる。本発明に用いられる
Ｄ−アミノ酸アミ「含有物は、例えば、公知の方法に従
ってそれぞれのＤ−アミノ酸メチルエステル含有物を合
成し、続いて、アンモニアガスと反応せしめるか、ある
いは、ストレッカー法により合成したα−アミノニトリ
ルを化学的あるいは酵素的に永和して得ることができる
。

また、ＤＬ−アミノ酸アミドの酵素による光学分割の際
に副生ずるＤ−アミノ酸アミドを用いることもできる。

本発明に用いる酵素としては、アミノ酸アミド加水分解
酵素、アミダーゼ、アミノペブチダーゼ、アシラーゼ等
いずれの通称名で呼ばれるものでも良いが、Ｎ末端が遊
離のＤ−アミノ酸アミドに対してＤ立体特異的に作用し
てＤ−アミノ酸を生成する加水分解酵素であれば良い。

具体的には、本発明のアミノ酸アミド加水分解酵素を挙
げることができる。

アミノ酸アミド加水分解酵素反応によるＤ−アミノ酸の
製造の様態については、特に制限はないが、通常は前記
の酵素を含む反応液に基質としてのＤ−アミノ酸アミド
、及び水が含まれていれば反応が進行する。

酵素の様態としては、特に制限はないが、細胞を含有す
る培養液、培養菌体、酵素源を含む処理物、培養上清液
、又は培養液から分離した菌体の処理物、これから得た
酵素剤、さらに、これらの酵素又は、酵素含有物を常法
によって固定化したもの等、酵素反応手段として実施さ
れる方法であれば反応に供することができる。工業的な
実施にあたっては、生菌体、固定化菌体等を用いるのが
有利である。反応液中のアミノ酸アミド加水分解酵素の
量は基質であるＤ−アミノ酸アミドの量等によって異な
り、特に限定されないが、通常１〜１００，０００単位
とするのが便利である。

原料のＤ−アミノ酸アミドの濃度は反応を阻害しない程
度であれば良く、反応液中の前記酵素の濃度等により異
なり特に限定されなこ・が、１〜５００　ｇ　／　ｆｆ
ｉとするのが便利である。低濃度で使用する場合には遊
離塩基の形で使用することができるが、比較的高濃度で
使用する場合には例えば、塩酸塩やトシル酸塩等の形で
使用するのがｐＨｇＪＩ整の観点から好ましい。Ｄ−ア
ミノ酸アミド含有物又はその塩はバッチ式反応において
は反応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進
行と共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加する
こともできる。

反応媒体としては、水、又はアセトン、アセトニ！・リ
ル、ＤＭＳＯもしくはＤＭＦ等を含む緩衝作用を有する
水溶液を用いることができる。緩衝液としては、例えば
、トリスーＨｌ緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾールー
ＨＣｆｆｉ緩衝液、ＨＥＰＥＳ　−　Ｎａ０１１緩衝液
、ＴＲＩＣＩＮＥ−ＮａＯＨ緩衝液、炭酸ナトリウム炭
酸水素ナｌ−　ＩＪウム緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝
液等を使用することができる。また、ケトン、エーテル
、炭化水素、芳香族オレフィン、ハロゲン化炭化水素、
有機酸エステル、アルコール、二トリル等水と混合しな
い有機溶媒をも用いることもできる。例えば、メチルブ
チルケトン、イソプロビルエーテル、石油エーテル、ヘ
キサン、ヘプタン、シクロヘキサン、四塩化炭素、クロ
ロフォルム、二塩化メチレン、トリクロ口エタン、ヘン
ゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、酢酸ブチル、
ブタノール、ヘキサノール、オクタノール等を水と共存
させて使用することができる。また、それらの有機溶媒
の混合物を使うこともできるし、水を飽和させた有機溶
媒、水性緩衝液との二層系あるいは、ミセル、逆ミセル
、エマルジョンとして反応させることもできる。

反応のｐＨとしては、ｐＨ５〜１１、好ましくばｐｌ＋
６〜１０とする。

反応の温度も反応のｐＨと同様に考えることができるが
、通常は２０〜６０゜Ｃ、好ましくは２５〜５０゛Ｃで
ある。

反応時間は、特に限定されないが、反応混合物の基質濃
度、酵素力価等、に依存して基質Ｄ−アミノ酸アミド含
有物が充分な収率でＤ−アミノ酸に転換されるまで反応
を維持する。

生成したＤ−アミノ酸は任意に常法によって精製採取す
ることができる。例えば、反応終了後に、トリクロロ酢
酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する場合に
は）と共に濾過し、濾液をイオン交換樹脂等により精製
し、結晶化する。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

グルコース０．　１％、トリプトン０。５％、酵母エキ
ス０．　５％、及びＫ２！｛Ｐ０．　０．１％を含有し
、ｐｌ｛７．０に調整した培地１０ｆを１２０゜Ｃ，１
５分間加熱殺菌した後、アク口モバクターｓｐ．　ＳＣ
ＲＣ−ＳＶ３　（微工研菌寄第　／ｏ６ｏｆ号）を接種
して２４時間培養の後、菌体を得た。

菌体を生理的食塩水で洗浄した後、０．　１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ及び５ｍＭ　　２−メルカプトエタノールを含む
リン酸緩衝液（ｐＨ　７．　０　）３００ｍｆに懸濁し
、９　ＫＨｚにおける超音波処理を約２０分（計約２．
５時間）行ない菌体を破砕した。破砕菌体は１４，ＯＯ
Ｏｘ　ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、Ｄ−アミノ酸
アミダーゼを含む素抽出液を得た。この無細胞抽出液に
プロタミン硫酸を３．８ｇ加えて、３０分撹拌した後、
１４，ＯＯＯＸ　ｇ、２０分間の遠心分離で沈澱を除去
した。この上清に固形硫酸アンモニうムを加え６０％硫
酸アンモニウムと飽和した。３０分撹拌の後、１４，０
００ｘ　ｇで２０分間の遠心分離で得られる、酵素活性
を有する沈殿を少量の０．ＯＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
．　０　）で溶解し、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び
５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ｝１７．０）で透析した。この酵素液を
あらかじめＯ．ｌｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メル
カブ１・エタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｌ＋　７．　０　）で平衡化したＤＥＡＩ　｝ヨバール
６５０Ｍのカラムに通過させ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
５ｍＭの２−メノレカフ゜トエタノール、及び０．　１
　ＭのＮａＣ　１を含む０．ＯＩＭリン酸緩衝液（ｐ＋
１７．０）で溶出した。

活性区分を集め、ＤＨＡＥ　−　｝ヨパール６５０Ｍの
カラムクロマトグラフィーのステップを繰り返した。

活性区分を集め、０．　１　ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭ
の２一メルカブトエタノールを含む０．ＯＩＭリン酸緩
衝液（ｐ｝１７．　０　）で透析後、あらかじめ同じ緩
衝液で平衡化したヒドロキシアバタイ１・のカラムに通
過させ、０．］ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカ
ブトエタノールを含む０．０１．Ｍから０．　５　Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ１１７．０）の直線的な濃度勾配で酵素
を溶出させた。

この活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭ
の２メルカブ１・エタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐ｝１７．０）で透析後、濃縮し、０．Ｉｎ＋Ｍ
のＥＤＴＡ及び５ｍＭの２一メルカプトエタノール及ヒ
ｏ．ｉＭＮａＣ　ｊ２を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐｌ１７．０）で平衡化したセファデソクスＧ−２００
によるゲル濾過クＩ：Ｊマトグラフィーを行なった。次
に、同上の緩衝液を用いて、１’ＳＫ　Ｇ３０００　Ｓ
−ゲル濾過力ラムを用いる高速液体クロマトグラフィー
を行なった。さらに、活性区分をＴＳＫ　ＤＥＡＥ−　
１−ヨパールイオン交換力ラムを用いる高速液体クロマ
トグラフィーにかけ、０．２〜０．３Ｍのトリスー塩酸
緩衝液（ｐｌ１８．０）の濃度勾配で溶出させた。こう
して、アミノベプチダーゼを約５，ＯＯＱ倍に精製した
。この精製］二程における比活性及び回収率を第３表に
示す。

−策一良一表 ２．　１ロタミン処理及び 硫安分画（０−６０％） ３．　　１］ＩＥＡＥ−　１−ヨバーノレ（１回目） ＤＨＡＥ−　１へヨバール （２回目） ■４４ ５．　ヒドロキシアパタイト ６．　セファデックスＧ−２００ ７．　　ＴＳＫ　Ｇ　　３００３Ｗ ９６．２ ３８．５ １６．１ ４．０ ごの酵素はＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ力ラムクロマ１へグラ
フィーＣこより単一のピークを与え（第１図）、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動において均一であることが証
明された（第２図）。

０．０９６０ ２．７１ ５．２３ １４．９ １８．２ ２４．１ ２．　アクロモハクク−ｓ　．　ＳＣＲＣ−ＳＶ３（７
）元素分析値 ＤＬ７エニルアラニンアミド塩酸１１．５０ｇ（０．０
０７５ｍｏ　Ｑ　）を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１５ｍｌに溶解し、Ｑ．０１．Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｔｌ７．　０　）で透析したアミノベプチダーゼ２１０
単位（実施例１において部分精製した比活性１４．９単
位／ｍｇの酵素）を加えて、３７゜Ｃで１時間保温した
。反応液中に生成したＤ−フェニルアラニンをアンバー
ライトＩＲＡｉ００　（ＣＩ！．−　）カラムに吸着さ
せ、水洗後、ＩＮ塩酸で溶出させた。この溶液を減圧下
濃縮し、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗ　Ｘ　８　（Ｈ４）カラム
に吸着させ、水洗後、ＩＮアンモニア水で溶出させた。

減圧下濃縮し、Ｄ−フェニルアラニンを５８１■（４７
．０％）得た。

得られたＤ−フェニルアラニンは水−メタノールイソプ
ロビルアルコールーエーテルで再結晶シ、市販のＤ−フ
エニルアラニンとスペクトルデータを比較した。融点二
　２７０゜Ｃ０ Ｃ　　　　６５．４３ Ｈ　　　　　６．７１ Ｎ　　　　　８．４８ ６５．３２ ６，７１ ８．４８ Ｃｃｘ〕ｇｏ＋３５．５゜　（　ｃ　＝０．４８　，　
ｌｌｚｏ）　Ｔ：光学的に純粋なＤ体であった。マスス
ペクトル、核磁気共鳴スベクｌ・ル、および赤外吸収ス
ペク１・ルによる分析結果はいずれも、生成物がＤ−フ
ェニルアラニンであることを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の精製酵素のＰｈｅｎｙｌ　−　５Ｐ
Ｗカラムクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示し
、本発明の酵素が均一であることを示す。 第２図は本発明の精製酵素のポリアクリルアミト′ゲル
電気泳動の結果をスケッチしたものであり、本発明の酵
素が均一であることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の物性： （イ）Ｄ−フェニルアラニンアミド及び水からＤ−フェ
   ニルアラニン及びアンモニアを生成する反応を触媒する
   ； （ロ）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
   約３８，０００の分子量を有する；及び（ハ）Ｄ体の芳
   香族アミノ酸アミドを良好な基質とする； を有するアミノ酸アミド加水分解酵素。 ２、請求項１記載のアミノ酸アミド加水分解酵素の製造
   方法において、該アミノ酸アミド加水分解酵素を生産す
   ることができるアクロモバクター（￥Ａｃｈｒｏｍｏｂ
   ａｃｔｅｒ￥）属細菌を培養し、この培養物から該アミ
   ノ酸アミド加水分解酵素を採取することを特徴とする方
   法。 ３、請求項１記載のアミノ酸アミド加水分解酵素を生産
   することができるアクロモバクターｓｐ．ＳＣＲＣ−Ｓ
   Ｖ３。 ４、アクロモバクター属細菌の培養物、菌体又は、菌体
   処理物をＤ−アミノ酸アミドまたはＤ−アミノ酸アミド
   含有物に作用させ、Ｄ−アミノ酸を生成せしめることを
   特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。 ５、請求項１記載のアミノ酸アミド加水分解酵素をＤ−
   アミノ酸アミドまたはＤ−アミノ酸アミド含有物に作用
   させ、Ｄ−アミノ酸を生成せしめることを特徴とするＤ
   −アミノ酸の製造方法。