JPS61239888A - Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法、該酵素を産生ずる微生物、並びに該酵素を使
用するＬ−フェニルアラニンの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するし一α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭５９−１９８９７２に記載されている。しか
しながらこの公開された明細書に記載されているＬ−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌により生産さ
れたものであり、この明細書にはスポロサルシナ（Ｓｐ
ｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細菌及びバシルス（Ｂａｃｉ
　ｌ　１ｕｓ）属細菌が同様の酵素を生産することは全
く示唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼは１３０．０００±ｉｏ、ｏｏｏの分子
量を有し、分子量６６．０００±５，０００のサブユニ
ットから成る点、及びフェニルピンピン酸のみならずｐ
−ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドールピルビン
酸等広範囲の基質に対して高い特異性を有する点等にお
いて、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とは全
く異なる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、今までＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素を生産することが知られていなかった微生物に由来す
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、該酵素を生
産する新規な微生物及び該酵素の新規な製造方法、並び
に該酵素を利用するＬ−フェニルアラニンの新規な製造
方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
”　及ヒ１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０　、０００の分子量を示し、沈降平衡法におい
て約３４０．０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ボリアク
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８．００
０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
に作用し、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対
する特異性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素；前記酵素を生産するこ
とができるバシルス属に属する細菌；これらの細菌を培
養し、この培養物から前記酵素を採取することを特徴と
する前記酵素の製造方法；並びに前記酵素又は該１　　
　　酵素の含有物の存在下でフェニルピルビン酸、ＮＡ
ＤＨ及びアンモニウムイオンを反応せしめてＬ−フェニ
ルアラニンを生成せしめ、該フェニルアラニンを採取す
ることを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造方法； を提供することにより解決される。

〔具体的な説明〕

（１）監生立 本発明において使用する微生物としてはスポロサルシナ
属又はバシルス属に属し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素を生産することができるものであればよく、このよ
うな微生物は保存菌の中から選択することができる場合
もあり、また自然界から新たに分離することができる。

スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエを挙げることができる。

この種に属する保存菌として例えばスポロサルシナ・ウ
レアエＩＰ０１２６９Ｂ、及びスポロサルシナ・ウレア
エＩＦＯ１２６９９（ＡＴＣＣ６４７３）を挙げること
ができ、また新菌株として本発明者等が分離したスポロ
サルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４を挙げることがで
きる。

前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもとにＩＦＯ又
はＡＴＣＣから自由に入手することができ、また新菌株
スポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８１７８号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−８１７８）として寄託されている。

バシルスに属する微生物としては、例えば本発明者等に
より分離された新菌株バシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ５３
ｂ、バシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ、バシルスｓｐ
、ＳＣＲＣ−１０１Ａ、及びバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−
１１４０を挙げることができる。これらの菌株の菌学的
性質は非常に近似しており、これらの代表株としてバシ
ルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第８１７９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−
８１７９）として寄託されている。

前記の新菌株は次のようにして分離した。次の第１表に
示す組成の培地を調製した。

第１表 Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　　１％ペプトン　　
　　　　　　　　　　　１％酵母エキス　　　　　　　
　　　　０．５％に２ＨＰＯ４０，２％ ＮａＣ１Ｏ，１％ Ｍ　ＳＯ＊　・１１ｈ０　　　　　　　　　　　　　　
０．０２％水道水　　　　　　　　　　　　ｐＨ７，０
この培地を試験管（φ１８ｆｉ）に５ｍＪずつ分注し、
１２０℃で１５分間滅菌した。この培地に各地より採取
した土壌サンプルを少量加え３０℃で３日間振とう培養
した。この培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種しさ
らに３０℃で３日間振とう培養した。表の培地に２％の
寒天を加えた平板培地に、培養液の一部を白金耳を用い
て画線塗布し、３０℃で数日保温した。出現したコロニ
ーを同じ培地組成の斜面培地に釣菌した。

このようにして各地より採取した土壌サンプルから多数
の菌株を分離した。次に、表の培地２００ｍｊ２を５０
０ｍｊ！の三角フラスコに分注し、同様に滅菌した。そ
れぞれの菌株をこの培地で３０℃、２４時間回転振とう
培養し、得られた菌体を洗浄後、超音波処理により破砕
した。遠心後得られた上清を０．１ｍＭのＥＤＴＡおよ
び５ｍＭの２−メルカプトエタノール 透析した。この上清に含まれるＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素活性を後記の方法により測定した。

このようにして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を顕
著に生産する下記の５株を得た。これらの菌株の分離源
は次表の通りであった。

第２表 菌　　　　　　　　　　　　　　　　　　集　１ＳＣＲ
Ｃ−ＲＯ４神奈川県相模原市 ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ　　　　　　　神奈川県相模原市Ｓ
ＣＲＣ−Ｒ７９ａ　　　　　　　神奈川県相模原市ＳＣ
ＲＣ−１０１Ａ　　　　　千葉県松戸市ＳＣＲＣ−１１
４０Ｍ　　ムー 前記の新規な５菌株はそれぞれ次のような菌学的性質を
有する。

以下余白 上記の菌学的性質に基づき、バーゼイズ・マニュアル・
オブ・ディターミネーティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７
４年の分類基準に従って、前記５菌株を次の様に同定し
た。

（ｉ　）　ＳＣＲＣ−Ｒ０ｄ株は、好気性で運動性及び
胞子形成能を有し、ダラム陽性の２連〜４連の球菌であ
ることからスポロサルシナ属に属する。スポロサルシナ
属には唯一の種としてスポロサルシナ・ウレアエが知ら
れており、前記性質が文献記載のそれとほぼ一致するの
で、ＳＣＲＣ−Ｒ０ｄ株はスポロサルシナ・ウレアエで
あると同定される。

（ｉｉ）　ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、　ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ
、　ＳＣＲＣ−１０１Ａ、及びＳＣＲＣ−１１４０株は
いずれもダラム陽性の桿菌で内生胞子を形成し、カタラ
ーゼの生成が認められることからバシルス属に属するこ
とが明らかである。

なお、菌株ＳＣＲＣ−ＲＯ４，ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、　
ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ。

ｉ　　　　　ＳＣＲＣ−１０１Ａ、及びＳＣＲＣ−１１
４０の電子顕微鏡写真をそれぞれ第１図〜第５図に示す
。

以上、主として自然界から分離した菌株について詳細に
記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性
の高い菌株を得ることもできる。

また、これらの菌株の細胞中に存在するＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の生産に関与する遺伝子を切り出し、
これを適切なベクター例えばプラスミドに挿入し、この
ベクターを用いて適当な宿主、例えばエンシエリッヒヤ
・コリ（Ｅｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）や酵母の
ごとき異種宿主、又はバシルス属菌株もしくはスポロサ
ルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転換することによ
り、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素生産株を
人為的に創成することもできる。

この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてはスポロ
サルシナ属又はバシルス属細菌の保存に常用されている
培地、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用する
ことができる。

また、凍結乾燥保存も常法に従って行うことができる。

（２）Ｍ１！」わＵ汰 前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複類種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。

Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当たっては前
記基礎培地に、誘導物質として少量のし−フェニルアラ
ニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニ
ンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等
により異なるがおよそ０．０１〜ｌＯｗ／ｖ％であり、
好ましくは０．１〜１　ｗ／ｖ％である。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振とう培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下
で培養を行うのが好ましい。

培養温度は菌が生育し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素が生産される温度範囲内であればいずれの温度でも良
いが、好ましくは２５〜４５℃である。

ｐｉは６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲である。

培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好
ましくは６〜４８時間である。

次に得られた培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を
集め、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって
菌体を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などに
よって除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン
又は硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行い、塩析
、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を
行い、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレング
リコール等の添加による結晶化等の公知の方法によって
均一の結晶酵素標品を単離することが出来る。なお、本
発明の酵素の製造方法の具体的な１例を実施例に記載す
る。

（３）力負■量定方迭 本発明においては次の方法により力価を測定した。

酸化的脱アミノ化反応ニゲリシン−ＫＣｌ−ＫＯＲ緩衝
液（ｐＨ１０，５）　１００μｍｏｊ２　、　　ＮＡＤ
”　２．５　ｐｍｏｉｔ　。

Ｌ−フェニルアラニン１０μｒａｏｌ　、、及び適当量
のサンプルを１ｍｌになるように混合して反応せしめ、
２５℃におけるＮＡＤＨの増加を３４０ｎｍの吸光度の
増加として計測し、１分間当り１マイクロモルのＮＡＤ
Ｈを増加せしめる酵素量を１単位とした。

還元的アミノ化反応：各種緩衝液１００μｍｏｌ、ＮＡ
ＤＨ０，ＩＪｚｍｏｌ、ＮＨ４Ｃｊｉ！　　２００μｍ
ｏｊ！　、フェニルピルビン酸ナトリウム１０μＩＩＩ
ｏＩ１．及び適当量のサンｊ　　　　　　プルを１ｍｆ
ｆ１になるように混合して反応せしめ、２５℃における
ＮＡＤＨの減少を３４Ｑｎｍの吸光度の減少として計測
し、１分間当り１マイクロモルのＮＡＤＨを減少せしめ
る酵素量を１単位とした。

フェニルピルビン酸の還元的アミノ化反応の速度は、至
適ｐＨにおいて上記酸化的脱アミノ化反応速度に比べて
約５．５倍速い。従って前記特開昭５９−１９８９７２
に記載されているように還元的アミン化反応速度を測定
し、上記のように力価を定義した場合、同量の酵素が約
５．５倍の単位数を示す。

（４）園素■性１ 本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。

Ａ。スポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４により
生産される酵素 （１）　　作用二次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン十ＮＡＤ”　＋Ｈ２０９−龜フェ
ニルピルビン酸十ＮＡＤＨ＋ＮＨ：Ｉ　＋Ｈ”（２）基
質特異性：本酵素は第３表に示すようにＬ−フェニルア
ラニン以外のし一アミノ酸には極めてわずかにしか反応
せず又は全く反応しない。

第３表 アミノ酸　　　　　　　　　相対活性（％）Ｌ−フェニ
ルアラニン　　　　　１００Ｌ−トリプトファン　　　
　　　　　６．８Ｌ−チロシン（１，４ｍＭ）　　　　
　５．４Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　４．ＩＬ−
エチオニン　　　　　　　　　７．ＯＬ−バリン　　　
　　　　　　　３．ＩＬ−ロイシン　　　　　　　　　
　２．３Ｌ−イソロイシン　　　　　　　　０．５４Ｌ
−α−アミノ−ｎ−酪酸　　　　１．６Ｌ−ノルバリン
　　　　　　　　　６．３Ｌ−ノルロイシン　　　　　
　　　　１５上記の表は酸化的脱アミノ化反応について
測定した結果を示す。基質濃度はＬ−チロシンを１．４
ｍＭとしたのを除き、１０ｍＭとした。

Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−
アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−７’ロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−
スレオニン、Ｌ−システィンおよびＤＬ−フェニルグリ
シンは基質とならない。

補酵素としてはＮＡＤ＋が必要であり、ＮＡ叶゛はＮＡ
Ｄ＋に対して約３．９％の活性を示すにすぎない。

（３）至適ｐＨ：酸化的脱アミノ化反応ではｐＨ１０，
５付近が至適であり、還元的アミノ化反応では９．０付
近が至適である（第６図）。

（４）　　ｐｉ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ）
中３０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱ア
ミノ化について測定した場合、第７図に示す（処理前の
活性を１００％とする）ごと（ｐＨ９付近において安定
である。

（５）至適温度：４０℃付近における活性が最大である
（第８図）。

（６）温度安定性：　０．　Ｉ　Ｍグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ９，０）中、各温度において１０分間処理
した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測定
したところ、第９図に示す（処理前の活性を１００％と
する）ごとく４２℃において活性の半分を失う。

（７）吸収スペクトル：２７８ｎｍに極大吸収、２８３
ｎｍ付近に肩を有する。可視部の吸収は認められない。

この様子を第１０図に示す。

（８）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン、およびＰＣＭＢ、　Ｎ−エチルマレイミド、５．
５′−ジチオ−ビス（２−二トロ安息香酸）等のＳＨ阻
害剤によって活性が阻害される（第４表）。

以下余白 第一ヨＬ−犬２ 金属イオン　　　　　　　相対活性 Ｌｉ”　　　　　　　　　　　　９６％Ｎａ”　　　　
　　　　　　　　ｇ　２Ａ　ｇ　＋　　　　　　　　　
　　　　。

Ｍｇ”　　　　　　　　　　　　９０ Ｃａ”　　　　　　　　　　　１００ Ｃｕ”　　　　　　　　　　　　ｇ　ＩＭｎ”　　　　
　　　　　　　１２９ Ｚｎ”　　　　　　　　　　　　ｇ　ｇＮｉハ　　　　
　　　　　　１００ Ｆｅ”　　　　　　　　　　　１２７ Ｂａ”　　　　　　　　　　　Ｉ　Ｏ６Ｃｄ”　　　　
　　　　　　　　７　Ｑｐｂ”・　　　　　　　　　　
　８１ Ｓｒ＋”（０，５ａ＋ｌ’ｌ）　　　　　　　　１２３
Ｈｇｚ′″（０，０１ｍＭ）　　　　　　　　　ＯＡｌ
”　　　　　　　　　　１５３ Ｆｅ’・　　　　　　　　　　１６１ 阻　害　剤　　　　　　　　相対活性 ＮａＮｘ　　　　　　　　　　　　１００％ヒドロキシ
ルアミン（１０ｍＭ）　　　１７３ＫＣＮ（０，５＋ｎ
Ｍ）　　　　　　　　　　１０２０−フェナンスロリン
　　　　１０３ α、α′−ジピリジル　　　　１２４ ８−オキシキノリン　　　　　１０１ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　１１９Ｐ　ＣＭ　Ｂ　
（０，２ｍＭ）　　　　　　　　　　０５．５′−ジチ
オビス （２−ニトロ安息香酸）　　　　　　　ＯＮ−エチルマ
レイミド　　　　　２１ ヨード酢酸　　　　　　　　　　９１ 金属イオンおよび阻害剤の濃度は特に記さない限り１ｍ
Ｍである。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合５．３〜５．４である。

α０）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ　
３０００　ＳＷ）　ニより約２９０，０００　と算出さ
れ、沈降平衡法により約３００，０００と算出される。

ａυ　サブユニットの分子量：　５Ｏ５−ポリアクリル
アミドゲルディスク電気泳動により約３８，０００〜３
９．０００と算出される。

（ロ）均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７，
５％、ｐＨ８，４）により第１１図Ａに示す如く単一の
バンドを与える。またＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（１０，０％、　ｐＪＩＸ７．２　）により第
１１図Ｂに示す如く単一のバンドを与える。

α争　結晶形：第１２図に拡大して示すように板状であ
る。

以上のごとく、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素は他の微生物起源のそれとは明らかに異なっており、
新規な酵素である。

Ｂ、バシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａにより生産され
る酵素 （１１作用二次式に余す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン＋ＮＡＤ”　＋Ｈ２０＝ａｅ＝−
必フエニｌレピルビン酸十ＮＡＤＨ＋　Ｎｌｌ：ｌ　＋
　Ｈ”（２）基質特異性二本酵素は第５表に示すように
Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン以外のし一アミ
ノ酸には極めてわずかにしか反応せず、又は全く反応し
ない。

第５表 アミノ酸　　　　　　　　　相対活性（％）Ｌ−フェニ
ルアラニン　　　　　１００Ｌ−チロシン（１，４ｍＭ
）　　　　　７２Ｌ−トリプトファン　　　　　　　　
１．６Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　３゜ＯＬ−エ
チオニン　　　　　　　　　３．１Ｌ−ノルバリン　　
　　　　　　　１．３Ｌ−ノルロイシン　　　　　　　
　　３６９上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測
定した結果を示す。基質濃度はＬ−チロシンを１．４ｍ
Ｍとしたのを除き、１０ｍＭとした。

Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−λ オルニチン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ
−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システィン、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−α−
アミノ−ｎ−酪酸は基質とならない。

なお、還元的アミノ化反応ではフェニルピルビン酸をＬ
−フェニルアラニンにする速度を１００％とすると、ｐ
−ヒドロキシフェニルピルビン酸をＬ−チロシンにする
相対速度は１３６％である。

Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化反応ではＮＡ
ＤＰ”はＮＡＤ“の２．９％の補酵素活性しか有さない
。

（３）至適ｐＨ二酸化的脱アミノ化反応ではｐＨ１０，
６〜１１６３付近が至適であり、還元的アミノ化反応で
はｐＨ９，８〜１０．８付近が至適である（第１３図）
。

（４）　　ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ）
中３０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱ア
ミノ化について測定した場合、第１４図に示す（処理す
る前の活性を１００％とする）ごとく、ｐＨ４〜１１゜
３の範囲で安定であり、特にｐＨ９〜１１の範囲で安定
であった。

（５）　　至適温度：５０℃付近における活性が最大で
ある（第１５図）。

（６）温度安定性：　０．１　Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ９，０；第１６図Ａ）、及び０．１　Ｍグリ
シ７−ＫＣｊ！−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ１１，０；第１６
図Ｂ）中、各温度において１０分間処理した後の残存活
性を酸化的脱アミノ化反応について測定する場合、ｐＨ
９，０においては５７℃で活性が半減し、ｐＨ１１，０
においては４８℃で活性が半減する。

（７）吸収スペクトル：　　２７８ｎｍに極大吸収、２
８３ｎｍ付近に肩を有する。可視部の吸収は認められな
い。この様子を第１７図に示す。

（８）　　金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金
属イオンおよびＰＣＭＢによって活性が阻害される（第
６表）。

以下余白 茅−」Ｌ−表 金属イオン　　　　　　　相対活性 Ｌｉ”　　　　　　　　　　　　　９５％Ｎａ’″　　
　　　　　　　　　　９３Ａｇ“　　　　　　　　　　
　　　Ｏ Ｍｇ”　　　　　　　　　　　　９９ Ｃａ”◆　　　　　　　　　　　９２ Ｃｕ”・　　　　　　　　　　　８５ Ｍ　ｎ　”・　　　　　　　　　　　９５Ｚｎ”・　　
　　　　　　　　　９６ Ｎｉ”　　　　　　　　　　　１００ Ｆｅ”　　　　　　　　　　　１１６ Ｂａ２・　　　　　　　　　　　９３ Ｃｄ”　　　　　　　　　　　１０２ Ｐｂ”　　　　　　　　　　　　５３ Ｓｎ２′″（０，５ｍＭ）　　　　　　　　１１０Ｈｇ
”（０，０１ｍＭ）　　　　　　　　３８Ａ［”　　　
　　　　　　　　９９ Ｆｅ”　　　　　　　　　　　１１７ 無添加　　　　　　　　　　１００ ヒドロキシルアミン（１０ｍＭ）　　　　９０ＫＣＮ（
０，５ｍＭ）　　　　　　　　　　　１１３０−フェナ
ンスロリン　　　　　９９ α、α′−ジピリジル　　　　１０４ ８−オキシキノリン　　　　　　９６ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　１２０Ｐ　ＣＭ　Ｂ　
（０，２ｎ＋Ｍ）　　　　　　　　　　０５．５′−ジ
チオビス （２−二トロ安息香酸）７４ Ｎ−エチルマレイミド　　　　１６２ ヨード酢酸　　　　　　　　　１２７ 限り１ｍＭである。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気、ｊ　　
　　　泳動により測定した場合４６３〜４．４である。

αψ　分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ　
３０００５Ｗ）により約２９０．０００と算出され、沈
降平衡法により約３４０．０００と算出される。

αυ　サブユニットの分子ｔ：５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲルディスク電気泳動により約３８．０００〜３９
．０００と算出される。

（２）均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７，
５％、ｐＨ８，４）により第１８図Ａに示す如く単一の
バンドを与える。また５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（１０，０％、ｐＨ７，２）により第１８図Ｂ
に示す如（単一のバンドを与える。

α濁　結晶形：第１９図に拡大して示すように針状であ
る。

（５）Ｌ−フェニルアラニンの製゛４　法本発明のＬ−
フェニルアラニンの製造方法においては、スポロサルシ
ナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産されるＬ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェニルピルビン
酸、ＮＡＤＨ及ヒアンモニウムイオンを反応せしめるこ
とによりＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、該フェニ
ルアラニンを採取する。

この方法において使用されるＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素の使用形態は特に限定されない。

例えば、この発明によって精製された酵素を使用するこ
とができるのは熱論のこと、細胞を含有する培養液、培
養生菌体、アセトン等によって脱水処理された乾燥菌体
、菌体破砕物、種々の段階まで精製された部分精製酵素
標品等の酵素含有物を使用することができる。さらにこ
れらの酵素又は酵素含有物を常法に従って固定化したも
のを使用することもできる。工業的な実施に当っては生
菌体、固定化菌体等を用いるのが有利である。反応液中
のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の量は基質であるフ
ェニルピルビン酸又はその塩の濃度等によって異なり特
に限定されないが、通常１０〜１０．０００単位／ｌと
するのが便利である。

基質としてフェニルピルビン酸又はその塩、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。フェニルピルビン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜５００ｇ／ｌとするのが便利
である。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用す
ることができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩
の形で使用するのがｐｎ調整の観点から好ましい。例え
ばフェニルピルビン酸ナトリウムは高濃度では完全には
溶解しないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が存在
していても差しつかえない、また、フェニルピルビン酸
アンモニウム又はフェニルピルビン酸をアンモニウムで
中和したものを使用することもでき、この場合このアン
モニウム塩はフェニルピルビン酸の給源であると同時に
後に記載するアンモニウムイオンの給源としても機能す
る。

フェニルピルビン酸又はその塩はバッチ式反応において
は反応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進
行と共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加する
こともできる。

アンモニウムイオンの給源としてはアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のｐＨを所定値に維持し
ながら反応の進行と共に連続的に導入することも可能で
ある。前記のようにフェニルピルビン酸アンモニウムを
使用する場合にはこの物質がアンモニウム塩の給源とし
ても機能する。アンモニウム塩の使用量はフェニルピル
ビン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。この量
は一般にフェニルピルビン酸の量に対して１〜２倍モル
量とするのが便利である。アンモニウム塩のモル量を多
くすることによって酵素反応の平衡をＬ−フェニルアラ
ニン側に傾け、フェニルピルビン酸に対するＬ−フェニ
ルアラニンの収率を上昇せしめることができる。

ＮＡＤＨは、フェニルピルビン酸と等モルを加えてもよ
いが、ＮＡＤＨは非常に高価であるから、工業的見地か
ら、前記の反応系のほかに、ＮＡＤＨ再生系再生−わち
前記反応により生成したＮＡＤ”をＮＡＤＨに還元する
系を共有させるのが好ましい。このような系としてＮＡ
Ｄ”をＮＡＤＨに変換する酵素とその基質との組合わせ
、例えば蟻酸脱水素酸素（ＥＣ１，２゜１．２）と蟻酸
、Ｌ−グルタミン酸脱水素酸素（ＥＣ１゜４．１．２）
とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素（ＥＣ１，１，
１，１）とエタノール、アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１
，２，１，３）とアセトアルデヒド、グルコース−６−
リン酸脱水素酵素（ＩＩＩＣ１，１，１，４９）とグル
コース−６−リン酸等を使用することができる。また、
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１８，３，１，）による分子
状水素を電子供与体とするＮＡＤ”のＮＡＤＨへの還元
反応や、電気化学的に還元されたメチルビオローゲンや
ジヒドロリポアミドのジアホラーゼ（ＥＣ１，６゜４．
３）による酸化に伴うＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元反応
をも使用することができる。蟻酸脱水素酵素と蟻酸を使
用する場合、ＮＡＤ”が還元されてＮＡＤＨとなると同
時に蟻酸が酸化されて二酸化炭素が生成し、これは反応
系から容易に除去され、反応が常に所望の方向に進行す
るため特に好ましい。蟻酸脱水素酵素は市販されており
容易に入手することができる。又、例えばカンジダ・ボ
イディニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）　ｋ　２
２０１　（ＡＫＵ　４７０５）や、ハンゼヌラ・ポリモ
ルファ　（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
）　（ＡＴＣＣ２６０１２）から公知の方法〔カトウら
、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　３ＥＬＬ
１１〜１１６　（１９７４））により精製して使用する
こともできる。ＮＡＤＨ再生系再生−濃度は、Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素濃度等に依存して異なり、一般
に基質フェニルピルビン酸の還元的アミノ化速度（従っ
てＮＡＤ”生成速度）に匹敵する速度でＮＡＤ”をＮＡ
ＤＨに還元するために必要な量である。例えば、前記の
ように１０〜１０．０００単位／ｉのＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素を使用し、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ再生系酵素と
して蟻酸脱水素酵素を使用する場合、この酵素の使用量
は１０〜１０，０００単位／Ｉｔ程度とするのが好まし
い。螺脱水素酵素の基質としては蟻酸の塩、例えば蟻酸
ナトリウム、蟻酸カリウム、蟻酸アンモニウム等を使用
するのが便利である。蟻酸塩の使用量はフェニルピルビ
ン酸又はその塩の量の１〜２倍モル量とするのが好まし
い。ＮＡＤＨ再生系再生−る場合は、ＮＡＤ′″又はＮ
ＡＤＨを通常の生理的濃度である０、　１〜１０ｍＭ加
えればよい。

反応媒体としては水、又は水性液、例えば水性緩衝液を
用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−Ｈ
Ｃβ緩衝液、グリシン−Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液等を使用す
ることができる。

反応液のｐＨとしては、前記のＮＡＤＨ再生系再生−な
い場合には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還
元的アミノ化に適するｐＨを用いることができ、例えば
スポロサルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはｐＨ
８〜１０、好ましくはｐＨ約９とし、バシルス属細菌由
来の酵素を用いる場合にはｐＨ９〜１１、好ましくはｐ
Ｈ約１０とする。フェニルピルビン酸酸の還元的アミノ
化系と共にＮＡＤＨ再生系再生−る場合には、これら両
者の反応が共に良好に進行するｐＨ範囲を選択する必要
がある。このようなｐＨは、例えば、スポロサルシナ属
細菌由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ
・ボディニ由来の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常
はｐＨ７，５〜９．５、好ましくはｐＨ８，０〜９．０
である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とカンジダ・ボディニ由来の蟻酸脱水素
酵素を用いる場合には通常はｐＨ８〜１０好ましくはｐ
ＨＢ、５〜９．５である。

反応温度も、反応ｐＨの場合と同様に考えることができ
るが酵素のいずれの組合わせにおいても通常は２０°Ｃ
〜５０℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。

反応時間は特に臨界的でなく、反応混合物の基質濃度、
酵素力価等に依存して、基質フェニルピルビン酸が十分
な収率でＬ−フェニルアラニンに転換されるまで反応を
維持する。

反応方式は回分式であっても連続式であってもよく、反
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。

生成したＬ−フェニルアラニンは任意の常法に従って精
製採取することができる。例えば、反応終了後にトリク
ロロ酢酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する
場合には）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等によ
り精製し、結晶化する。

ｆ　　　　　フェニルアラニンの定量は、例えばロイコ
ノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ
ｃ　ｍｅｓｅｎｔ−ｅｒｏｉｄｅｓ）　ＡＴＣＣ８０４
２を用いるバイオアッセイにより行うことができる。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

Ｌ−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５％、
ペプトン１．０％、）［ｚＨＰＯ＊　０．２％、ＮａＣ
ｌ　Ｑ、１％及び阿ｇｓＯ＊・７ｕｚｏ　Ｏ，０２％を
含有し、ｐＨ１，０に調整した培地３（ｌを１２０℃、
１５分間加熱殺菌した後、スポロサルシナ・ウレアエＳ
ＣＲＣ−ＲＯ４（ｍ工研菌寄第８１７８号）を接種し、
３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後、遠心分離
機で菌体を採取し湿重量約３８０ｇの菌体を得た。菌体
を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、０．１　ｍＭ
　ＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　１１に懸濁し、９
ＫＨｚにおける超音波処理を約１０時間行い菌体を破砕
した。

破砕菌体は１４，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離で除
去し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液
を得た。この無細胞抽出液に５％プロタミン硫酸水溶液
を１ｇ蛋白当り０．１ｇとなるように添加し、３０分間
攪拌した。生成した沈澱を１４．０００　ｘ　ｇ　。

２０分間遠心分離し、得られた粗酵素液を０．１ｍＭの
ＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含
む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析
した。透析後の酵素液（１９９０ｍｊ！　）に固体硫酸
アンモニウム（４１２ｇ）を加え３０％硫酸アンモニウ
ム飽和とした。３０分間攪拌の後、１４．ＯＯＯｘｇで
２０分間遠心して得られる上清（２１００ｍＡ　）にさ
らに固体硫酸アンモニウム（４１６ｇ）を加え６０％硫
酸アンモニウム飽和とした。ｔ４．ｏｏｏｘｇで２０分
間遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の０
．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、さらに
０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０
　）で透析した。この酵素液をあらかじめ、０．１ｍＭ
のＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
たＤＥＡε−トヨパール６５０Ｍのカラムに通過させ、
０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７、Ｏ）
で溶出した。

活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝
液で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、０．１ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０
．０１Ｍから０．１５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分
を集め０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプト
エタノールおよび０．１　Ｍ　ＮａＣ４を含む０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２００によるゲル減化クロマトグラフィーを行
なった。このようにして得られた酵素液を限外媒化によ
り濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行った。

こうして収率３１％で板状結晶Ｌ−フェニルアラニン脱
水素酵素が得られた。この結晶の拡大図を第１２図に示
す。

なお第７表に菌体抽出液から結晶化に至るまでの精製工
程における比活性および回収率を示す。

大践桝朱　バシルスｓ　、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａからのＬ
−フＬ−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５
％、ペプトン１．０％、ＫＪＰＯ４０，２％、ＮａＣｊ
！　０．１％、及びＭｇ５Ｏａ・７Ｈ，ＯＯ，０２％を
含有し、ｐｉ（７，０に調製した培地１０Ｉ！を１２０
℃、１５分間加熱殺菌した後、バシルスｓｐ、ＳＣＲＣ
−Ｒ７９ａ　（微工研菌寄第８１７９号）を接種し、３
０℃で２４時間好気的に培養した。培養後１ＯＮの培養
液から遠心分離機で菌体を採取し湿重量約１０８ｇの菌
体を得た。菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後
、０．１　ｍ　ＭＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）約０．
４ｊ２に懸濁し、９ｋＨｚにおける超音波処理を約６時
間行ない菌体を破砕した。破砕菌体は１４．０００ｘ　
ｇ、　２０分間の遠　分離で除去し、Ｌ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出
液に５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り０．１ｇ
となるように添加し、３０分間攪拌した。生成した沈澱
を１４，０００ｘ　ｇ、　２０分間遠心分離し、得られ
た粗酵素液を０゜１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−
メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に対して透析した。透析後の酵素液　（４
００ｍ　ｌ！　）に固体硫酸アンモニウム（７０，４ｇ
）を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。３０分攪
拌の後、１４．０００Ｘｇで２０分間遠心して得られる
、上滑（４３０ｍ　Ｉｌ　）にさらに固体硫酸アンモニ
ウム（８５，６ｇ）を加え６０％硫酸アンモニウム飽和
とした。１４．０００Ｘｇで２０分間遠心して得られる
、酵素活性を有する沈澱を少量の０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解し、さらに０．１ｍＭのＥＤＴ
Ａおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むｏ、
ｏｉＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵
素液を、あらかじめ０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭ
の２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｍのカラムに通過させ、０．１ｍＭのＥＤＴＡお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐｌ＋　７．０　’）で溶出した。

活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝
液で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、０．１ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０
．ＯＩＭから０．４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の
直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を
集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプト
エタノールおよび０．１　ＭＮａＣβを含む０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデック
スＧ−２００によるゲル減化クロマトグラフィーを行な
った。こうして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を約
６０％の収率で約１８００倍に精製した。この精製過程
における比活性および回収率を第８表に示す。この酵素
はポリアクリルアミドゲル電気泳動および５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動において均一であることが
証明された。

以下余白 犬施斑生　バシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−７９ａからのし一
フＬ−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５％
、ペプトン１．０％、Ｋ２ＨＰＯ４０，２％、ＮａＣ／
！　０．１％、及びＭｇ５Ｏｎ・７１（２００，０２％
を含有し、ｐｌ（８，０％に調製した培地１００１を１
２０℃、１５分間加熱殺菌した後、バシルスｓｐ、ＳＣ
ＲＣ−Ｒ７９ａ　微工研菌寄第８１７９号（ＦＥＲＭＰ
−８１７９）を接種し、３０℃で２２時間好気的に培養
した。培養後１００１の培養液から遠心分離機で菌体を
採取し湿重量約０．７　ｋｇの菌体を得た。菌体０．１
　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡおよび５ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，９）約４
７！に懸濁し、９ＫＨｚにおける超音波処理を約４１時
間行ない菌体を破砕した。破砕菌体は１４．０００ｘｇ
、２０分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液を
５０℃、１０分間熱処理を行ない、直ちに水冷した。処
理後の酵素液’　　　　　　　（３，８５０ｍｊ！　）
に固体硫酸アンモニウム（６７８ｇ）を加え３０％硫酸
アンモニウム飽和とした。３０分間攪拌の後、生成した
沈澱を１４，０００ｘｇ、２０分間の遠心により除去し
た。この上清（３，４００＋ｎｊ！　）に固体硫酸アン
モニウム（６７３ｇ　）を加え６０％硫酸アンモニウム
飽和とした。１４，０ＯＯＸ　ｇ、２０分間遠心して得
られる、酵素活性を有する沈澱を少量の０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，９）に溶解し、さらに０．１　ｍＭ
　ＥＤＴＡおよび５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，９）で透析した。

この酵素液を、あらかじめ０．１ｍＭＥＤＴＡおよび５
　ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，９）で平衡化したＤＥＡＥ−
トヨバール６５０Ｍのカラムに通過させ０．１ｍＭＥＤ
Ｔ八、５ｍＭ２−メルカプトエタノールよびＱ．　Ｉ　
Ｍ　ＮａＣβを含む０．　１　Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．９）で溶出した。

活性区分を集め、Ｏ．　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化した２番
目のＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍのカラムに通過させ
、前段階と同じ緩衝液で溶出した。この活性区分を集め
０．　１　ｍＭ　ＨＤＴＡ　５　ｍＭ　２−メルカプト
エタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液で透析後、あ
らかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト
のカラムに通過させ０．　１　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび５
　ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタノールを含む０．ＯＩＭ
から０．４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ　７．　９　）の直
線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性区分を集め濃
縮後０．　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　５　ｍＭ　２−メルカ
プトエタノールおよび０．　１　ｍ　Ｍ　Ｎａｉｌを含
む０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ　７．　９　）で平
衡化したセファデックスＧ−２００によるゲル濾過クロ
マトグラフィーを行なった。こうしてＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素を約５４％の収率で約１４００倍に精製
した。この精製過程における比活性および回収率を第９
表に示す。このようにして得られた酵素液を濃縮し、硫
酸アンモニウムを添加し結晶化を行なった。第１９図に
示すような針状結晶が得られた。

以下余白 実施例４．　スポロサルシナ・ウレアヱＳＣＲＣ−ＲＯ
４フェニルピルビン酸ナトリウム５　ｇ　（２２ｍｎ＋
ｏｆ　）、蟻酸アンモニウム３　ｇ　（４９ｍｍｏｊｉ
！　）　、ＮＡＤ”　０．２１ｇ　（０，２９ｍ＋ｎｏ
６　）　、）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）１８　
ｍｍｏ１２　、粗Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素４３
．２単位（実施例１、第５表の工程３の硫酸アンモニウ
ム分画まで部分精製した粗酵素画分に相当）および粗蟻
酸脱水素酵素４９．０単位（（ｐＨ８，５）　、カンジ
ダ・ポイディニ１ｋ２２０１より部分精製）を含む３０
０ｍＩ！の反応液を３０℃において２４時間反応させた
。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量をロイ
コノストック゛・メセンテロイデスを用いる微生物定量
法により定量したところ１．９１　ｇ（１１，６ｍｍｏ
ｌ、　５２．７％の転換率）のし−フェニルアラニンが
生成していた。この反応液に２０％トリクロロ酢酸３０
ｍ／！を加え除蛋白後、陽イオン交換樹脂アンバーライ
ト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）　ＩＲ−１２０ＣＨ”）カラ
ムに吸着させ、１Ｍアンモニア水で溶出させた。Ｌ−フ
ェニルアラニンを含む画分を集め、濃縮後陰イオン交換
樹脂アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉ　ｔｅ）ＩＲＡ−
４００（ＯＨ−）カラムに吸着させ、１Ｍ蟻酸で溶出さ
せた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を濃縮乾固した
。小量の温水に溶解し、エタノールを５０％となるよう
に加え、冷蔵すると結晶が析出した。この結晶を同様の
操作により再結晶化し、０．４５８ｇの無色固体を得た
。この標品の元素分析値は以下のとおりであった。

実測値（％）　　計算値（％） Ｃ６５，３３６５，４３ Ｈ６，６１６，７１ Ｎ　　　　　８．４８　　　　　　８．４８融点：２７
０℃で分解した。

気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルによ
る分析結果はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニン
であることを示した。

大■炭】　スポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４
フェニルピルビン酸ナトリウム　３．５７ｍｍｏＪ　。

ＮＡＤ”　　１００μａ＋ｏｆ　ＳＮＨ，、Ｃ１ｌ　５
　ｒｎｔａｏｌ　、　　）リス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ８
，５）　　２７２μｎ＋ｏＪ　、蟻酸ナトリウム７．８
４ｍｍｏｊ！　、Ｌ−フェニルアラニン脱水ｓ酵素３５
単位（実施例１、第５表の工程４のＤＥＡＲ−トヨパー
ルカラムを通過させた両分）および蟻酸脱水素酵素１０
．２単位（（ｐＨ８，５）　、カンジダ・ボイディニ１
１ｈ２２０１より部分精製）を５ｍｌ中に含む反応液を
３０℃で２４時間保温した。微生物定量法により定量し
たところ、５８０ｍ　ｇ　（３，５１ｍ５ｏｆ　、　９
８．５％の転換率）のし−フェニルアラニンが生成して
いた。

１　　　　　　　フェニルピルビン酸ナトリウム２００
μ＋＊ｏｊ２、ＮＡＩ）”２０μｍｏ１　％蟻酸ナトリ
ウム２００　ｐ　ｍｏｌ、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８，５）　６００１１ｍｏ１２　、蟻酸脱水素酵素１１
．９単位（（ｐＨ８，５）　、カンジダ・ポイディニ１
ｌｈ２２０１の無細胞抽出液）およびＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素１３．２単位（ＳＣＲＣ−ＲＯｄ株の培
養菌体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム３０〜６０％
飽和として沈澱した粗酵素画分；実施例１の第５表の工
程３に相当）を含む１３．０ｍβの反応液を３０℃で１
５時間反応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルア
ラニンの量を微生物定量法により測定したところ３２．
８ｍ　ｇ　（１９Ｂ、Ｌｃｒｍｏｆ　、　９８．４％の
転換率）のし−フェニルアラニンが生成していた。

フェニルピルビン酸ナトリウム４００μ５ｏｉｌ　−、
蟻酸アンモニウム８００μｍｏｌ　％　　ＮＡＤ”　５
　ｐｔａｏｌ　、　　トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，
５）　　２６０μｍｏｆ　、粗蟻酸脱水素酵素０．５単
位（ｐＨ８，５）、およびＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素０．２５単位（ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａの無細胞抽出液
よりプロタミン処理、硫安分画、　ＤＥＡＥ−トヨパー
ル、およびヒドロキシアパタイトの各カラムクロマグラ
フィーにより、約１８０倍に精製した酵素標品）を含む
５．０ｍｌ１の反応液を３０℃で２４時間反応させた。

微生物定量法により定量したところ６４．４ｍ　ｇ　（
３９０，０ｃｒｍｏＪ　、　９７．５％の転換率）のし
−フェニルアラニンが生成していた。

この反応液から、実施例３の方法に準じてＬ−フェニル
アラニンを得た。

フェニルピルビン酸ナトリウム０．９１ｇ（４＋ｎ　ｍ
ｏｌ　）、ギ酸アンモニウム０．７５ｇ（１１Ｊｍ　ｍ
ｏ／　）、ＮＡＤ”　３６ＩＩＩｇ（５０μｍｏｌ）、
トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ８，５）２．５ｍｍｏｊ＋
を含む５０ｍｆの反応液中に、セルロースチューブに入
れたＬ−フェニルアラニン脱水素酵素２０単位（Ｉ）Ｅ
ＡＥ−）ヨパールカラムを通過させた両分）および粗ギ
酸脱水素酵素１５単位（ｐＨ８，５、カンジダ・ボイデ
ィニｌｌｈ　２２０１より部分精製）を浸し、３０℃に
おいて２４時間反応させた。反応後、酵素の入ったチュ
ーブを取り出して新しい同反応液中に浸し、同様にして
反応させた。これをくり返して２８回の反応を行なった
。各反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量をロ
イコノストック・メセンテロイデスを用いる微生物定量
法により測定したところ全部で１０．７４ｇ　（６５ｍ
　ｍａｉｌ、５８％の転換率）のし−フェニルアラニン
が生成していた。この反応液の１部（４５０ｍｊ！　、
３．５８ｇのＬ−フェニルアラニンを含む）を陽イオン
交換樹脂アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲ−
１２０（Ｈ”　）カラムに吸着させ、ＩＭアンモニア水
で溶出させた。

Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を集め、濃縮後陰イオ
ン交換樹脂アンバーライト（Ａｎ＋ｂｅｒｌｉｔｅ）Ｉ
ＲＡ−４００（ＯＨ−）カラムに吸着させ、１Ｍギ酸で
溶出させた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を濃縮乾
固した。少量の温水に溶解し、冷蔵すると結晶が析出し
た。この結晶を同様の操作により再結晶化し、１．２３
５ｇの無色固体を得た。この標品の元素分析値は以下の
とおりであった。

実測値（％）　　計算値（％） Ｃ６５，４８６５゜４４ Ｈ６，６５６，７１ Ｎ　　　８．４７　　　　　　８．４８融点：２５２〜
２５４℃で分解した。

比旋光度（α）　　＝−３４，１°（ｃ＝１゜７２、Ｈ
２Ｏ）でＬ体であり、光学純度は９８％８．１１＋。で
ある。マススペクトル、核磁気共鳴吸収スペクトル、お
よび赤外吸収スペクトルによる分析結果はいずれも、生
成物がＬ−フェニルアラニンであることを示した。

フェニルピルビン酸ナトリウム１．８ｇ　（８ｍ　ＩＩ
Ｉｏβ）ギ酸アンモニウム０．９８ｇ　（１５，５４ｍ
　ｔａｏｌ２　）、ＭＡＤ”７２ｎ＋ｇ　（１００μｆ
ｆ１ｏ１）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）４　
　　　　５ｍｍａｌｌ、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素４０単位（ＤＥＡＥ−トヨパールカラムを通過させた
両分）およびギ酸脱水素酵素２０単位（ｐ）１８．５、
カンジダ・ボイディニ１ｌｈ２２０１より部分精製）を
１０ｍｌ１中に含む反応液を３０℃で２４時間保温した
。微生物定量法により定量したところ、１．１２ｇ（６
，７８ｍＩＩｏβ、８６％の転換率）のし−フェニルア
ラニンが生成していた。

底 フェニルピルビン酸ナトリウム４００μｌ１ａｌ　％　
塩化アンモニウム１２ｍ＋ｗｏ１、ＮＡＤＨ４８０μｒ
ａｏｌ、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）　２５０
μ５ｏｉｌ　、および粗Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素２．０単位（ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株の培養菌体の無細
胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なった後、硫
酸アンモニウム３０〜６０％飽和として沈澱した粗酵素
画分；実施例３の工程２に相当）を含む５ｍｇの反応液
を３０℃で２４時間反応させた。反応液中に生成したＬ
−フェニルアラニンの量を微生物定量法により測定した
ところ６３．５ｍ　ｇ　（３８４ｐ　ｔａｏｌ　、９６
．０％の転換率）のし−フェニルアラニンが生成してい
た。

実施例１１．バシルスｓｐ、５ｃＲｃ−Ｒ７９ａ由来の
粗酵素底 フェニルピルビン酸ナトリウム４００μｌｌｌ０ｌ、蟻
酸アンモニウム１．２ｍｍｏｊ！　、　　ＮＡＤ”　２
．５　ｐｒａｏｌｔ　、　　トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）　２５０μｍｏ１、蟻酸脱水素酵素１．５単
位（ｐＨ８，５、カンジダ・ポイディニＮ１１２２０１
より部分精製）および粗し−フェニルアラニン脱水素酵
素２．０単位（ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株の培養菌体の無細
胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なった後、硫
酸アンモニウム３０〜６０％飽和として沈澱した粗酵素
画分；実施例３の工程２に相当）を含む５ｍ／の反応液
を３０℃で２４時間反応させた。反応液中に生成したＬ
−フェニルアラニンの量を微生物定量法により測定した
ところ６２．８ｍｇ（３８０＃ｍｏｌ、　９５．０％の
転換率）のし−フェニルアラニンが生成していた。

実施例１２．バシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ由来の
粗酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの合 向 フェニルピルビン酸ナトリウム４００μｌ１ｌＯＩｔ、
ギ酸アンモニウム１．２ｍｍ＋ｏ１、ＮＡＩＬ”　２．
５　ｐｔｓｏｌ　、　　）リス−ＨＣｌ１緩衝液（ｐＨ
８，５）　２５０μｔａｏｌｌ　、蟻酸脱水素酵素１．
５単位（ｐＨ８，５、カンジダ・ポイディニ１１ｍ２２
０１より部分精製）および粗Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素２．０単位（ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ株の培養菌体の
無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なった後
、硫酸アンモニウム３０〜６０％飽和として沈澱した粗
酵素画分）を含む５ｍｇの反応液を３０℃で２０時間反
応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの
量を微生物定量法により測定したところ５７．３ｍｇ（
３４７μｍｏｊ！　、８６．８％の転換率）のし−フェ
ニルアラニンが生成していた。

底 フェニルピルビン酸ナトリウム４００μｍｏ１　％ギ酸
アンモニウム１．２ｍｍｏｆ　、　　ＮＡＤ”　２．５
　μｍｏｓｓ　　トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）
　２５０４ｍｏｊ？　、蟻酸脱水素酵素１．５単位（ｐ
Ｈ８，５、カンジダ・ポイディニ１１ｍ２２０１より部
分精製）および粗し−フェニルアラニン脱水素酵素２．
０単位（ＳＣＲＣ−１０１Ａ株の培養菌体の無細胞抽出
液に５０℃、１０分間の熱処理を行なった後、硫酸アン
モニウム３０〜６０％飽和として沈澱した粗酵素画分）
を含む５ｍｆの反応液を３０℃で２０時間反応させた。

反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量を微生物
定量法により測定したところ５８．３ｍｇ（３５３ｕｍ
ｏｌ、８８．３％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが
生成していた。

２成。

フェニルピルビン酸ナトリウム４００μｍａｉｌ　、　
Ｉｌｉ酸アンモニウム１．２ｍｍｏｆ、ＮＡＤ”　２．
５μｍａｉｌ、トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐｎ　８゜５）
　２５０μｍｏＡ　、蟻酸脱水素酵素１．５単位（ｐＨ
８，５、カンジダ・ボイディニ１１ｈ２２０１より部分
精製）および粗Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素２．０
単位（ＳＣＲＣ−１１４０株の培養菌ｊ　　　　体の無
細胞抽出液を硫酸アンモニウム３０〜６０％飽和として
沈澱した粗酵素画分）を含む５ｍＡの反液を３０℃で２
０時間反応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルア
ラニンの量を微生物定量法により測定したところ５２゜
５＋ｍｇ（３１８μｍａｉｌ　、７９．５％の転換率）
のし−フェニルアラニンが生成していた。

交考炭 本発明のバシルス由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素は、Ｌ−フェニルアラニンに対するのと同様Ｌ−チロ
シンに対しても強く作用し、１モルのし一チロシン、１
モルのＮＡＤ”及び１モルの水から１モルのｐ−ヒドロ
キシフェニルピルビン酸、１モルのＮＡＤＨ及び１モル
のアンモニウムイオンを生成する反応、並びにこの逆反
応を触媒する。

従って、Ｌ−フェニルアラニンの製造方法について記載
したのと同様の方法を用い、但し基質としてフェニルピ
ルビン酸の代りにｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を
使用することにより、Ｌ−チロシンを製造することがで
きる。次に参考のためし一チロシンの製造例を記載する
。

バシルスｓ　、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ由来の部　事製酵素
を用ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸１．１ｇ（６ｗ
　ｍｏｌ）ギ酸アンモニウム４．５ｇ（７１，３ｔａ　
ｍｏｌ　）　、ＮＡＤ”２１６ｍｇ（３００，ｃｚｍｏ
Ｊ　）　、）リスーＨＣ１１緩衝液（ｐＨ８，５）１５
ｍｍｏβ、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素２４単位（
ＤＥＡＥ−）ヨパールカラムを通過させた両分）および
粗ギ酸脱水素酵素３０単位（ｐＨ８，５、カンジダ・ボ
インディニ１１ｋＬ２２０１より部分精製）を含む３０
０ｍ１の反応液を３０℃において４５時間反応させたと
ころ、結晶が析出した。この結晶をろ取し、再結晶化し
て０．６４８ｇの無色固体を得た。この標品の元素分析
値は以下のとおりであった。

実測値（％）　　計算値（％） Ｃ５９，４５５９，６６ Ｈ６，１１６，１２ Ｎ　　　７．６９　　　　　　７．７３比旋光度〔α）
　　＝−７，３３°（ｃ＝４．６ＮＨｔＪりで５体であ
り、光学純度は１００％ｅ、　ｅ、である。マススペク
トル、核磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペ
クトルによる分析結果はいずれも、生成物がＬ−チロシ
ンであることを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はスポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４の
電子顕微鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代
る写真であり； 第２図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂの電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり； 第３図はバシルスｓｐ、　ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａの電子顕
微鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真
であり； 第４図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−１０１Ａの電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり； 第５図はバシルスｓｐ、ｓｃＩ’１ｃ−１１４Ｄの電子
顕微鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写
真であり； 第６図はスポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４が
生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐＨと反応
速度の関係を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミ
ノ化反応について、Ｂは還元的アミノ化反応についての
結果を示し； 第７図はスポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４が
生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐＨ安定性
を示すグラフであり； 第８図はスポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４が
生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応
速度との関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ
化反応についての結果を示し；第９図はスポロサルシナ
・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４が生産するＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであり； 第１０図はスポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４
が生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸
収スペクトラムであり； 第１１図はスポロサルシナ・ウレアエＳＣＲＣ−ＲＯ４
が生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を
示す電気泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気
泳動（７，５％ゲル、ｐＨ８，４）を示し、そしてＢは
５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動（１０，０％ゲル
、ｐＨ７，２）を示し；第１２図はスポロサルシナ・ウ
レアエＳＣＲＣ−ＲＯ４が生産するＬ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッチであり； 第１３図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素のｐｉと反応速度の
関係を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反
応について、Ｂは還元的アミノ化反応についての結果を
示し； 第１４図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るし−フェニルアラニン脱水素酵素のｐｌ（安定性を示
すグラフであり； 第１５図はバシルスｓｐ、　ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産
するし−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度
との関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミン化反
応についての結果を示し； 第１６図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るし−フェニルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示す
グラフであり、Ａは０．１　Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液（ｐＨ９，０）中での結果を示し、そしてＢは０．１
Ｍグリシン−ＫＣｌ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ１１，０）中
での結果を示し； 第１７図はバシルスｓｐ、　ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産
するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペ
クトラムであり； 第１８図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気
泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（７
，５％ゲル、ｐＨ８，４）を示し、そしてＢは５Ｏ５−
ポリアクリルアミド電気泳動（１０，０％ゲル。 ｐＨ７，２）の結果を示し：そして 第１９図はバシルスｓｐ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａが生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッ
チである。 ｐＨ 八−酸化的脱アミノ化 ＳＣＲＣ−Ｒ○４株 乎 第 ｐＨ Ｂ−還元的アミン化 由来酵素のＰＨ特性 ６図 Ｈ ＳＣＲＣ−ＲＯ４株由来酵素のＰＨ安定性温度（０Ｃ） ＳＣＲＣ−ＲＯ４株由来酵素の至適温度第８図 グ ＳＣＲＣ−Ｒ○４株由来酵素の温度安定性＄９図 波　　長　（ｎｍ） ＳＣＲＣ−ＲＯ４株由来酵素の紫外部吸収第１０図 ＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−Ａ°ポリアクリルアミドゲル　７．
５°１０．ｐＨ８，４Ｂ　：　５ＤＳ−ポリアクリＡ／
７ミドデｋ　１０．０’／、、ｐＨ７，２ＳＣＲＣ−Ｒ
Ｏ４株由来酵素の電気泳動第１１図 りｍ−」 ０ｐｍ ＳＣＲＣ−Ｒ○４株由来酵素の結晶 第１２図 ｐＨ 八−酸化的膜アミン化 ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株 第１３図 ｐＨ Ｂ：還元的アミン化 由来酵素の一特性 ｐＨ ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来の酵素のＰＨ安定性第１４図 温度（°Ｃ） ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来酵素の至適温度第１５図 ○　１０　２０　３０　４０　５０　６０　７０温度（
０Ｃ） Ａ　：　　ｐＨ９，０Ｂ−ｐＨ１１，０ＳＣＲＣ−Ｒ７
９ａ株由来酵素の温度安定性ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来
酵素の紫外部吸収＋　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　−Ａ；ポリアクリ
ルアミドゲル　７．５　’／、　、　ｐＨ８，４Ｂ：　
５ＤＳ−ポｌＪ７り＋Ｊルアミｗル１０．０°／、、　
ｐＨ７，２ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ株由来酵素の電気泳動第
１８図 手続補正書（自発） 昭和６１年４月ン十日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１２７１１８号 ２、発明の名称 Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 ３゜補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　財団法人　相撲中央化学研究所 ４、代理人 １　　　　　　住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目
８番１ｏ号５゜補正の対象 （１）明細書の「特許請求の範囲」の欄。 （２）明細書の「発明の詳細な説明」の欄。 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙の通りに補正する。 （２）■　明細書第９頁第４行目「されている。」を「
され、微工研条寄第１０１２号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０
１２）としてブタベスト条約に基く国際寄託に移管され
た。Ｊに補正する。 ■　同第９頁第１２〜１３行目「されている。」を「さ
れ、微工研条寄第１０１３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０１
３）としてブタベスト条約に基く国際寄託に移管された
。またバシルスｓｐ、５ｃＲｃ−１１４０が微工研条彎
第１０１１号としてブタベスト条約に基き国際寄託され
ている。ｊに補正する。 ■　同第１０頁第１５行目ｒ　５００ｍｊ？の」を’　
５００ｍｎ容の」に補正する。 ■　同第１７頁１行目「バーゼイズ」を「バージイズ」
に補正する。 ■　同第１７頁第２行目「ディターミネーティブ」を「
ディターミネイティブ１に補正する。 ■　同第１９頁第７行目「複類種類」を「複数種類Ｊに
補正する。 ■　同第３０頁第８行目〜９行目「１３６％である。」
をｒｐｎ９．ｏにおいて１７６％である。Ｊに補正する
。 ■　同第３６頁第９行目「アンモニウム」を「アンモニ
ア」に補正する。 ■　同第３７頁第１９行目、及び同第２０行目「脱水素
酸素」を「脱水素酵素」に補正する。 ［相］　同第３９頁第１３行目「螺脱水素酵素」を「蟻
酸脱水素酵素」に補正する。 ■　同第４０頁第１１行目「酸酸の」を「酸のＪに補正
する。 ■　同第４０頁第１６行目及び同第１９行目「ポディニ
」を「ボイディニＪに補正する。 ■　同第４２頁第１２行目「号）を接種し」を１号）（
微工研条寄第１０１２号）を接種しｊに補正する。 ［相］　同第４４頁第４行目、第４４頁１１行目、第４
７頁第２０行目、第４８頁第７行目、第５１頁第１６行
目、及び第５１頁第２０行目〜第５２頁第１行目「活性
区分」を「活性画分Ｊに補正する。 ■　同第４６頁第１５行目「遠　分」を「遠心分ｊに補
正する。 ［相］　同第４６頁第８行目、「号）を接種し」を１号
）（微工研条寄第１０１３号）を接種しｊに補正する。 Ｏ同第５０頁第８行目「）を接種し」を「）（微工研条
寄第１０１３号）を接種しｊに補正する。 ［相］　同第５４頁第８行目、第５６頁第８行目、及び
第５７頁６行目「第５表」を「第７表１に補正する。 ［相］　同第５５頁１５行目「〔α〕。」を「（α）Ｄ
Ｊに補正する。 ７、添付書類の目録 （１）補正特許請求の範囲　　　　　　　１通（２）受
託証の写し　　　　　　　　　　１通グ ２、特許請求の範囲 １、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
゛及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１
モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生成
する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０．０００の分子量を示し、沈降平衡法において
約３４０．０００の分子量を示し、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
に作用しＬ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素。 ２、　バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌により生産
される特許請求の範囲第１項記載の酵素。 ３、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モル（７）　
ＮＡＤ“及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン
酸、１モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオン
を生成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０　、０００の分子量を示し、沈降平衡法におい
て約３４０　、０００の分子量を示し、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８．
０００〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを
示す； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
に作用しＬ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い；を有するＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素の製造方法において、該酵素を生産すること
ができるバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し
、この培養物から該酵素を採取することを特徴とする方
法。 ４、前記細菌がバシルスｓｐ、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、　ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ　　
（′１研菌寄第８１７９′：′；微工研条寄第１０１３
号）　、ＳＣＲＣ−１０１Ａ　、又はＳＣＲＣ−１１４
０株（′工研　寄　１０１１号）である特許請求の範囲
第３項記載の方法。 ５、　　Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産するこ
とができるバシルス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ）属細菌種。 ６、　バシルスｓｐ、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　
ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ（微工研菌寄第８１７９号；　（微
工研　寄第１０１３号）である特許請求の範囲第５項記
載の細菌。 ７、バシルス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ）属細菌によって生
産されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフ
ェニルピルビン酸、　ＮＡＤＨ及びアンモニウムイオン
を反応せしめてＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、該
フェニルアラニンを採取することを特徴とするＬ−フェ
ニルアラニンの製造方法。 ８、前記細菌がバシルスｓｐ、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ　、　ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ　
（徽工旦１寄第８１７９号；微工研条寄第１０１３号）
　、ＳＣＲＣ−１０１Ａ　、又はＳＣＲＣ−１１４０株
（微工研条寄第１０１１号）である特許請求の範囲第７
項記載の方法。 ９、前記Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素が次の性質； （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
”及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１
モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生成
する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約２９０　、０００の分子量を示し、沈降平衡法におい
て約３４０．０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，０
００〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示
す； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
に作用し、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対
する特異性が非常に低い；を有することを特徴とする特
許請求の範囲第７項記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
   ＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
   １モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
   成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
   約２９０，０００の分子量を示し、沈降平衡法において
   約３４０，０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
   ０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
   ； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
   に作用しＬ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対す
   る特異性が非常に低い； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
   酵素。 ２、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌により生産さ
   れる特許請求の範囲第１項記載の酵素。 ３、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
   ＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
   １モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
   成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速流体クロマトグラフィーゲル濾過法において
   約２９０，０００の分子量を示し、沈降平衡法において
   約３４０，０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
   ０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
   ； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
   に作用し、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対
   する特異性が非常に低い； を有するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
   おいて、該酵素を生産することができるバシルス（Ｂａ
   ｃｉｌｌｕｓ）属細菌を培養し、この培養物から該酵素
   を採取することを特徴とする方法。 ４、前記細菌がバシルスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
   ｐ．）ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ、ＳＣ
   ＲＣ−１０１Ａ、又はＳＣＲＣ−１１４Ｄ株である特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 ５、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産することが
   できるバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌種。 ６、バシルスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＳＣ
   ＲＣ−Ｒ７９ａ（微工研菌寄第８１７９号）である特許
   請求の範囲第５項記載の細菌。 ７、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌によって生産
   されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェ
   ニルピルビン酸、ＮＡＤＨ及びアンモニウムイオンを反
   応せしめてＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、該フェ
   ニルアラニンを採取することを特徴とするＬ−フェニル
   アラニンの製造方法。 ８、前記細菌がバシルスｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
   ｐ．）ＳＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、ＳＣＲＣ−Ｒ７９ａ、ＳＣ
   ＲＣ−１０１Ａ、又はＳＣＲＣ−１１４Ｄ株である特許
   請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素が次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
   ＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
   １モルのＮＡＤＨ及び１モルのアンモニウムイオンを生
   成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
   約２９０，０００の分子量を示し、沈降平衡法において
   約３４０，０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲルディスク電気泳動法において約３８，００
   ０〜３９，０００の分子量を有するサブユニットを示す
   ； （３）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的
   に作用し、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対
   する特異性が非常に低い； を有することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
   方法。