JPS62244386A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はα−ケトカルボン酸を基質としてＬ−アミノ酸
を製造する方法に関する。

〔従来の技術〕 従来から微生物や酵素の働きによりα−ケトカルボン酸
を基質としてＬ−アミノ酸を製造する試みがなされてい
る。例えば、微生物菌体にα−ケトゲルタール酸および
各種のアミノ酸を添加してＬ−グルタミン酸を蓄積せし
める方法〔片桐ら、アミノ酸核酸、１．１Ｂ（１９６０
））　、フェニルピルビン酸を含む反応液にＬ−グルタ
ミン酸やＬ−アスパラギン酸を添加し、Ｌ−フェニルア
ラニンを得る方法〔朝井ら、アミノ酸核酸、２．１１４
（１９６０）　）、インドールピルビン酸を含む反応液
にＬ−グルタミン酸やＬ−アスパラギン酸を添加してＬ
−１−リプトファンを合成する方法等がある〔アイダら
、ジャーナル・オフ・ジェネラル・アンド・アプライド
・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅ
ｎｅｒａｌａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　旧ｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ）　　、　４．２００（１９５８）　　］　
　。

］特開昭６０−１６４４９には、種々の微生物をフェニ
ルピルビン酸及びアミノ基供与体と共に培養するか、又
は該微生物の菌体もしくはその処理物をフェニルピルビ
ン酸及びアミノ基供与体に作用せしめることによってＬ
−フェニルアラニンを製造する方法が記載されている。

しかしながらこの明細書には、この方法においていかな
る酵素が関与するかについてはなんら言及されていない
。またこの方法においてはアミノ基供与体としてアミノ
酸が使用されている。

上記の方法はいずれも目的アミノ酸のアミノ基供与体と
して他のアミノ酸が使用されており、アンモニウムイオ
ンを用いる本発明とは基本的に異り、関与する酵素も異
る。また、これらの方法はアミノ基供与体としてアミノ
酸を使用するため目的アミノ酸が高価なものとなるとい
う難点を有する。

特開昭６０−４３３９１には、α−ケト酸をその対応す
るし一アミノ酸に転換することができる微生物を培養し
、この過程でα−ケト酸を培養物に供給してこれをＬ−
アミノ酸に転換せしめることによりし一アミノ酸を製造
する方法が記載されている。

この明細書には反応機構が示唆されているが、それによ
れば、α−ケト酸から目的Ｌ−アミノ酸を生成せしめる
場合のアミノ基供与体としてＬ−グルタメートが使われ
、従ってこの反応はアノミ基転換酵素により行われる。

また、この明細書中に開示されている微生物はブレビバ
クテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及
び大腸菌のみである。

特開昭５９−１９８９７２にはＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼ及びこの酵素を利用するし一α−アミノ
カルボン酸の製造方法が記載されている。

しかしながらこの公開された明細書に記載されているし
一フェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリ
ウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ）属細菌により
生産されたものであり、この明細書にはスポロサルシナ
（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細菌及びバシルス（Ｂ
ａｃ　ｉ　１１　ｕｃ）属細菌が同様の酵素を生産する
ことば全く示唆されていない。

４Ｆ開昭６０−１６０８９０には、種々の微生物を、エ
ネルギー源、無機アンモニウム化合物又は尿素、及び酵
素の存在下で、フェニルピルビン酸と共に培養するか、
あるいは微生物の培養物又はその処理物を、エネルギー
源、無機アンモニウム化合物又は尿素、及び酸素の存在
下で、フェニルピルビン酸に作用せしめることによりＬ
−フェニルアラニンを製造する方法が記載されている。

しかしながら、この明細書には、上記の過程でいかなる
酵素が関与するかは全く示唆されておらず、反応系にエ
ネルギー源、及び酸素の両者が必要であることから、多
数のエネルギー供給系酵素が関与する、発酵的方法であ
ると予想される。また、この明細書にはスポロサルシナ
属細菌についてはなんら記載されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、本発明者等が見出した新規酵素であ
るバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｃ）属又はスポロサルシナ
（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）尿細菌由来のし一フェニ
ルアラニン脱水素酵素を用いて酵素的方法により、ある
いはスポロサルシナ属細菌を用いる方法によりＬ−アミ
ノ酸を製造する方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等はすでにバシルス属又はスポロサルシナ属細
菌が生産するし一フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法、並びに該酵素を使用するし一フェニルアラニ
ンの製造方法の発明を完成している（特願昭６０−０８
０２９３、及び特願昭６Ｏ−１２７１１８）。これらの
酵素の基質特異性を酸化的脱アミノ化について測定した
場合、スポロサルシナ属細菌により生産される酵素はＬ
−フェニルアラニン以外のし一アミノ酸にはきわめてわ
ずかしか反応せず、またバシルス属細菌により生産され
る酵素はＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン以外の
し一アミノ酸には極めてわずかしか反応しない。しかし
ながら、本発明者等は、これらの酵素の基質特異性をさ
らに詳細に検討した結果・これらの酵素は還元的アミノ
化反応については相当に広い基質特異性を有することを
見出し、この知見に基いてこの発明を完成した。

従って、この発明は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
細菌又はスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）
属細菌によって生産されるし一フェニルアラニン脱水素
酵素又は酵素含有物の存在下で、次の式（１）（式中、
Ｒ８は水素又はメチル基であり、Ｒ２は置換基を有する
場合がある炭素原子数１〜４個の直鎖もしくは分岐鎖の
アルキル基、又は置換基を有する場合がある芳香族基で
ある） で表わされるα−ケトカルボン酸、アンモニウムイオン
及びＮＡＤＨを反応せしめることにより、次の式（ＩＩ
） ＩＮ　　ｎ　　ｚ （式中Ｒは前記の意味を有する） で表わされるし一アミノ酸を生成せしめ、このアミノ酸
を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法、
並びにスポロサルシナ属に属する細菌の培養物、菌体又
は菌体処理物をアンモニウムイオン及びエネルギー源の
存在下で式（１）のα−ケトカルボン酸と反応せしめる
ことにより式（ｎ）のし−アミノ酸を生成せしめ、これ
を採取することを特徴とするし一アミノ酸の製造方法を
提供するものである。

本発明において使用することができる微生物としては、
スポロサルシナ属又はバシルス属に属する細菌を挙げる
ことができる。

スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエを挙げることができる。

具体的な菌株として、例えばスポロサルシナ・ウレアエ
ＩＰ０１２６９８　、及びスポロサルシナ・ウレアエＩ
ＦＯ１２６９９（八ＴＣＣ６４７３）、並びにスポロサ
ルシナ。

ウレ了工５ＣＲＣ−ＲＱ４を挙げることができる。前記
の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもとにＩＦＯ又はＡ
ＴＣＣから自由に入手することができ、またスポロサル
シナ・ウレアエ５ＣＲＣ−ＲＯ４は工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第８１７８号（ＦＥＲＭＰ−
８１７８）として寄託され、；；微工研条寄第１０１２
号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０１２）としてブタペスト条約
に基く国際寄託に移管された。このＳＣＩ？Ｃ−１７０
４株は、好気性で運動性及び胞子形成能を有し、ダラム
陽性の２連〜４連の球菌であること等から、バージイズ
・マニュアル・オフ・ディターミネイティブ・バクテリ
オロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄ
ｅｔｅｒ−ｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）第８版、１９７４年の分類基準に従って同定されたも
のであり、その詳細な菌学的性質は特願昭６０−０８０
２９３明細書に記載されている。

バシルスに属する微生物としては、例えばバシルス・ア
ルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｖｅｉ）ＩＦＯ３３４
３；バシルス・チアミノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　Ｌｈｉａｍｉｎｏｌｙ−Ｈｃｕｓ）　ＪＡＭ　１０３
４、微工研菌寄第８５２８号（１７ＥＲＭＰ−８５２８
）　：バシルス・バディウス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ　ｂａ
ｄｉｕｓ）ＪＡＭ　１１０５９（ＡＴＣＣ１４５７４）
微工研菌寄第８５２９号（ＦｆｆＲＭＰ　−８５２９）
　；　ハシルス−スフエリカスＩＦＯ１２６２２：バシ
ルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒ
ｉｃｕｓ）ＩＡＭ　１２２８　、微工研菌寄第８５２７
号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８５２７）を挙げることができる。

これらはいずれもＩＦＯカタログ、ＡＴＣＣカタログ、
又はＪＦＣＣカタログに記載されており、容易に入手す
ることができる。また、本発明者等が最近土壌より分離
した新菌株ハシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、バシル
スｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ、バシルスｓｐ、５ＣＲＣ
−１０１Ａ、及びバシルスｓｐ、５ＣＲＣ−１１４０を
挙げることができる。これらの菌株の菌学的性質は非常
に近似しており、これらの代表株としてバシルスｓｐ、
　５ＣＲＣ−Ｒ７９ａが工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第８１７９号（Ｆｌ！ＲＭ　Ｐ−８１７
９）として寄託され、微工研条寄第１０１３号（ＦＩＲ
Ｍ　ＢＰ−１０１３）としてブタペスト条約に基く国際
寄託に移管された。またバシルスｓｐ、　５ＣＲＣ−１
１４０が微工研条寄第１０１１号としてブタペスト条約
に基き国際寄託されている。５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、５Ｃ
ＲＣ−Ｒ７９ａ　、　５ＣＲＣ−１０１Ａ　、及び５Ｃ
ＲＣ−１１４０株はいずれもダラム陽性の桿菌で内生胞
子を形成し、カタラーゼの生成が認められることからバ
シルス属に属するものと同定された。これらの菌株の詳
細な菌学的性質は特願昭６０−０８０２９３明細書に記
載されている。

なお、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の高い
菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の細胞中
に存在するし一フェニルアラニン脱水素酵素の生産に関
与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えば
プラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主
、例えばエッシエリッヒャ・コリ（Ｅｓｈｃｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）や酵母のごとき異種宿主、又はバシル
ス属菌株もしくはスポロサルシナ属菌株のごとき同種宿
主を形質転換することにより、本発明の方法においてＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素生産株を人為的に創成す
ることもできる。

本発明の方法において使用するし一フェニルアラニン脱
水素酵素は例えば次の性質を有する。

Ａ、スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−ＲＯ４により
生産される酵素 （１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン＋ＮＡＤ”　＋Ｈ２０；品フェニ
ルピルビン （２）基質特異性：本酵素は酸化的脱アミノ化について
測定した場合し一フェニルアラニン以外のし一アミノ酸
には橿めてわずかにしが反応しない。

（３）至適ｐＨ：酸化的脱アミノ化反応ではｐｌ！１０
、５付近が至適であり、還元的アミノ化反応では９．　
０付近が至適である。

（４）　ｐＨ安定性：各ｐＨ（７）緩衝液（０．０５Ｍ
）中３０°Ｃにて１時間保温した後の残存活性を酸化的
膜アミン化について測定した場合、ｐＨ９付近において
安定である。

（５）至適温度＝４０℃付近における活性が最大である
。

（６）温度安定性：　０．　１　Ｍグリシン−ＮａＯ）
ｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中、各温度において１０分間処
理した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測
定したところ、４２℃において活性の半分を失う。

（７）吸収スペクトル：　２７８ｎｍに極大吸収、２８
３ｎｍ付近に肩を有する。可視部の吸収は認められない
。

（８）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン、およびＰＣＭＢ、　Ｎ−エチルマレイミド、５．
５′−ジチオ−ビス（２−二トロ安息香酸）等のＳＨ阻
害剤によって活性が阻害される。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合５．３〜５．４である。

（１０）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ
　３０００　ＳＷ）により約２９０．０００と算出され
る。

（１１）サブユニットの分子１：　５ＯＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動により約３８，０００〜
３９．０００と算出される。

Ｂ、バシルスｓｐ、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａにより生産され
る酵素 （１）作用二次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン十ＮＡＤ”　＋　１１２０−一フ
ェニルビルビン酸＋ＮＡＤｌｌ＋ＮＩｈ　＋Ｈ“（２）
基質特異性二本酵素は酸化的脱アミノ化について測定し
た場合、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン以外の
し一アミノ酸には極めてわずかにしか反応しない。

（３）至適ｐＨ：酸化的脱アミノ化反応ではｐｌ＋１０
．６〜１１．３付近が至適であり、還元的アミノ化反応
ではＰＨ９，８〜１０．８付近が至適である。

（４）　ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ）中
３０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミ
ノ化について測定した場合、ｐＨ４〜１１．３の範囲で
安定であり、特にｐ１１９〜１１の範囲で安定であった
。

（５）至適温度：５０℃付近における活性が最大である
。

（６）温度安定性：０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ９，０）、及び０．１　Ｍグリシン−ＫＣＩ！−
ＫＯＩ＋緩衝液（ｐｆｌｌｌ、ｏ）中、各温度において
１０分間処理した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応
について測定する場合、ｐＨ９，０においては５７℃で
活性が半減し、ｐＨ１１，０においては４８℃で活性が
半減する。

（７）吸収スペクトル：　２７８ｎｍに極大吸収、２８
３ｎｍ付近に肩を有する。可視部の吸収は認められない
。

（８）金属イオン、阻害剤の影１ｉ！二銀、水銀等の金
属イオン、およびＰＣＭＢによって活性が阻害される。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合４．３〜４．４である。

（１０）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ
　３０００　ＳＷ）により約２９０，０００と算出され
る。

（１１）サブユニットの分子量：　５ＯＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルディスク電気泳動により約３８．０００〜
３９，０００と算出される。

酵素の力価の測定法は大島ら〔ザ・ジャーナル・オフ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｓｔｒｙ）　２５
３　、５７１９（１９７８）の方法に準じて行ない、２
５℃におけるＮＡＤＩＩの増加を３４０ｎｍの吸光度の
増加として計測し、１分間当り１マイクロモルのＮ　Ａ
　Ｄ　ＩＩを増加せしめる酵素量を１単位とする。

本発明で用いる微生物を培養しようとする場合、微生物
が増殖しＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産し得る
もの、又はα−ケトカルボン酸のＬ−アミノ酸への変換
を行うことができるものであればいずれの培地でもよい
。詳しくは、この培地は、窒素源として例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類を含有
する。また、この培地には必要に応じて炭素源としてグ
ルコース、澱粉、グリセリン等を加えることができる。

この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、塩化
ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが好まし
い。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、液体培地を用い、振とう培養、通気、攪拌培養
等により好気的条件下で培養を行うのが好ましい。培養
温度は菌が成育する温度範囲内であればいずれの温度で
も良いが、好ましくは２５〜４５℃である。ｐ）１６〜
１１、好ましくは７〜１０の範囲である。培養時間は好
ましくは６〜４８時間である。

得られた培養物からし一フェニルアラニン脱水素酵素を
採取する場合、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって菌体を集め、超音波
処理、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕す
る。細胞片などの固形物を遠心分離などによって除き、
粗酵素を得、さらにこれを硫酸プロタミン又は硫酸スト
レプトマイシンを加えて処理を行い、塩析、有機溶媒沈
澱、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行い、さらに
硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の
添加により結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵
素標品を単離することができる。

本発明のし一アミノ酸の製造方法においては、スポロサ
ルシナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産されるし
一フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でα−ケトカル
ボン酸、ＮＡＤＨ及びアンモニウムイオンを反応せしめ
ることによりＬ−アミノ酸を生成せしめ、ＨＫ　Ｌ−ア
ミノ酸を採取する。

前記のα−ケトカルボン酸としては、例えばフェニルピ
ルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、２−フ
ルオロフェニルピルビン酸、３−フルオロフェニルピル
ビン酸、４−フルオロフェニルピルビン酸、３，４−ジ
フルオロフェニルピルビン酸、２−クロロフェニルピル
ビンＭ、３−クロロフェニルピルビン酸、４−クロロフ
ェニルピルビン酸、３．４−ジクロロフェニルピルビン
酸、４−メチルフェニルピルビン酸、４−ビニルフェニ
ルピルビン酸、４−メトキシフェニルピルビン酸、３．
４−ジメトキシフェニルピルビン酸、２．３．４−）ジ
メトキシフェニルピルビン酸、４−ニトロフェニルピル
ビン酸、４−ジ（２−クロロエチル）アミノ−フェニル
ピルビン酸、インドールピルビン酸、α−ケト−Ｔ−メ
チルチオ酪酸、α−ケト−γ−エチルチオ醋酸、α−ケ
トカプロン酸、α−ケトイソカプロン酸、ＤＬ−α−ケ
ト−β−メチル吉草酸、α−ケト吉草酸、α−ケトイソ
吉草酸、α−ケト酪酸、３−（β−ナフチル）ピルビン
酸、３．４−ジメチルフェニルピルビン酸、３−メトキ
シフェニルピルビン酸、α−ケト−γ−トリフルオロメ
チル醋酸等が挙げられる。従って、これらのα−ケトカ
ルボン酸を基質として使用した場合、それぞれ、Ｌ−フ
ェニルアラニン、Ｌ−チロシン、２−フルオロ−し−フ
ェニルアラニン、３−フルオロ−し−フェニルアラニン
、４−フルオロ−し−フェニルアラニン、３．４−ジフ
ルオロ−し−フェニルアラニン、２−クロロ−し−フェ
ニルアラニン、３−りｏｏ−Ｌ−フェニルアラニン、４
−クロロ−し−フェニルアラニン、３．４−ジクロロ−
し−フェニルアラニン、４−メチル−Ｌ−フェニルアラ
ニン、４−ピニルーＬ−フェニルアラニン、４−メトキ
シ−し−フェニルアラニン、３．４−ジメトキシ−し−
フェニルアラニン、２．３．４−１−リメトキシーし一
フェニルアラニン、４−ニトロ−Ｌ〜フェニルアラニン
、４−ジ（２−クロロエチル）アミノ−し−フェニルア
ラニン、Ｌ−１−リプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−
エチオニン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｌ−バリン、α−アミノ
−Ｌ−ｆｉ酸、３−（β−ナフチル）−Ｌ−アラニン、
３゜４−ジメチル−し−フェニルアラニン、３−メトキ
シ−し−フェニルアラニン、α−アミノ−Ｔ−トリフル
オロメチルーＬ−酪酸等が製造される。

この方法において使用されるし一フェニルアラニン脱水
素酵素の使用形態は特に限定されない。

例えば、精製された酵素を使用することができるのは熱
論のこと、細胞を含有する培養液、培養生菌体、アセト
ン等によって脱水処理された乾燥菌体、菌体破砕物、種
々の段階まで精製された部分精製酵素標品等の酵素含有
物を使用することができる。さらにこれらの酵素又は酵
素含有物を常法用いるのが有利である。

反応液中のし一フェニルアラニン脱水素酵素を含有する
微生物の培養液、菌体、菌体処理物あるいは酵素の量は
基質であるα−ケトカルボン酸又はその塩の濃度等によ
って異なり特に限定されないが、通常１０〜ｉｏ、ｏｏ
ｏ単位／ｌとするのが便利である。

基質としてα−ケトカルボン酸又はその塩、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。α−ケトカルボン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜５００ｇ／Ａとするのが便利
である。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用す
ることができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩
の形で使用するのがｐｌ＋調製の観点から好ましい。例
えば各種のα−ケトカルボン酸のナトリウム塩は高濃度
では完全には溶解しないが、反応液中に未溶解のナトリ
ウム塩が存在していても差しつかえない。また、α−ケ
トカルボン酸のアンモニウム塩又はα−ケトカルボン酸
をアンモニアで中和したものを使用することもでき、こ
の場合このアンモニウム塩はα−ケトカルボン酸の給源
であると同時に後に記載するアンモニウムイオンの給源
としても機能する。α−ケトカルボン酸又はその塩はハ
ツチ式反応においては反応開始時に一度に添加すること
もでき、又反応の進行と共に複数回に分割して、もしく
は連続的に添加することもできる。

アンモニウムイオンの給源としてはアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニＴ毒ガス又は水酸
化アンモニウム水？？Ｉ　？ｆｌを、反応液のρ（１を
所定値に維持しながら反応の進行と共に連続的に導入す
ることも可能である。前記のとしても機能する。アンモ
ニウム塩の使用量はα−ケトカルボン酸の量と同モル量
又はそれより多量とする。この量は一般にα−ゲＩ・カ
ルボン酸の量に対して１〜１００倍モル量とするのが便
利である。アンモニウム塩のモル量を多くすることによ
って酵素反応の平衡をＬ−アミノ酸側に傾け、α−ケト
カルボン酸に対するし一アミノ酸劇初収率を上昇せしめ
ることができる。

ＮＡＤＨは、α−ケトカルボン酸と等モルを加えてもよ
いが、ＮＡＤＨは非常に高価であるから、工業的見地か
ら、前記の反応系のほかに、ＮＡＤＨ再生系、すなわち
前記反応により生成したＮＡＤ”をＮＡＤＨに還元する
系を共有させるのが好ましい。このような系としてＮＡ
Ｄ＋をＮＡＤｌｌに変換する酵素とその基質との組合わ
せ、例えば蟻酸脱水素酵素（ＥＣ１，２゜１．２）と蟻
酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酸素（ＥＣ１゜４．１．２
）とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素（ＥＣ１，１
，１，１）とエタノール、アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ
１，２，１，３）とアセトアルデヒド、グルコース−６
−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，４９）とグリコ
ース−６−リン酸等を使用することができる。また、ヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１，１８，３，１，）による分子状
水素を電子供与体とするＮ６口１のＮ　Ａ　１）ＩＩへ
の還元反応や、電気化学的に還元されたメチルビオロー
ゲンやジヒドロリポアミドのジアホラーゼ（ＩＥＣ１，
６゜４．３）による酸化に伴うＮＡＤ＋のＮＡＤｌｌへ
の還元反応をも使用することができる。蟻酸脱水素酵素
と蟻酸を使用する場合、ＮＡＤ’が還元されてＮＡＤＨ
となると同時に蟻酸が酸化されて二酸化炭素が生成し、
これは反応系から容易に除去され、反応が常に所望の方
向に進行するため特に好ましい。蟻酸脱水素酵素は市販
されており容易に入手することができる。又、例えばカ
ンジダ・ポイディニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ
）　Ｎａ　２２０１　（八ＫＵ　４７０５）や、ハンゼ
ヌラ・ポリモルファ　（Ｉｌａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ）　（＾ＴＣＣ２６０１２）から公知の
方法〔カトウら、アグリカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒａｌ
　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｃｖｉｓｔｒｙ
）　　３８　＋１１１〜１１６（１９７４）　）により
精製して使用することもできる。また＋Ｒ酸脱水素酵素
を菌体に含む形態で反応に供する場合、菌体の前処理は
公知の方法〔イズミら、ジャーナル・オフ・ファーメン
ティジョン・テクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　６１
　、１３５（１９８３）　）の方法を用いることができ
る。

Ｎ＾叶再再生系酵素濃度は、Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素濃度等に依存して異なり、一般に基質α−ケトカ
ルボン酸の還元的アミン化速度（従ってＮＡＤ”生成速
度）に匹敵する速度でＮＡＤ”をＮＡＤＨに還元するた
めに必要な量である。例えば、前記のようにｌＯ〜１０
，０００単位／Ｉ！のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素
を使用し、ＮＡＤ（１再生系酵素として蟻酸脱水素酵素
を使用する場合、この酵素の使用量は１０〜１０，００
０単位／ρ程度とするのが好ましい。蟻酸脱水素酵素の
基質としては＠酸の塩、例えば蟻酸ナトリウム、蟻酸カ
リウム、蟻酸アンモニウム等を使用するのが便利である
。蟻酸塩の使用量はα−ケト酸又はその塩の量の１〜２
倍モル量とするのが好ましい。ＮＡＤＨ再生系を用いる
場合は、ＮＡＤ’又はＮ　Ａ　Ｄ　ＩＩを通常の生理的
濃度である０、１〜１０ｍＭ加えればよい。

Ｌ−アミノ酸の製造のために、増殖中の培養物、例えば
菌体を含む培養液、分離された生菌体、又は酵素系が破
壊されない程度に処理された菌体を使用する場合には、
Ｎ＾ＤＨ，Ｎ＾口＋及びＮＡＤＩ＋再生系を加える必要
はなく、エネルギー源として例えばｔｉｅ、アルコール
類あるいは有機酸類を菌体の培養液や菌体の反応液に加
えれば良い。糖類としては、アラビノース、リボース、
リブロース、キノロース、フコース、ラムノース、フラ
クトース、ガラクトース、グルコン酸、トレハロース、
グルコース、マンニトール、マンノース、ソルビトール
、ソルボース、イノシトール、ラクトース、マルトース
、シュークロース、ラフィノース、グリセロール、澱粉
、イヌリン、グリコーゲン、カルボキシメチルセルロー
ス等が挙げられる。アルコールとしてはエタノール、メ
タノール等が挙げられる。有機酸としてはプロピオン酸
、酢酸、蟻酸、クエン酸、ピルビン酸、コハク酸、リン
ゴ酸、α−ケトゲルタール酸等が挙げられる。

反応媒体としては水、又はアセトン、アセトニトリル、
ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどを含む水性液、例えば水性緩衝液
を用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−
１１Ｃ４緩衝液、グリシン−ＮａＯＩＩ緩衝液等を使用
することができる。

反応液のｐＨとしては、前記のＮＡＤＩＩ再生系を用い
ない場合には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による
還元的アミノ化に適するｐＨを用いることができ、例え
ばスポロサルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはｐ
１１８〜１０、好ましくはｐＨ約９とし、バシルス属細
菌由来の酵素を用いる場合にはｐ１１９〜１１、好まし
くはｐｌ＋約１０とする。α−ケトカルボン酸の還元的
アミノ化系と共にＮＡＤＨ再生系を用いる場合には、こ
れら両者の反応が共に良好に進行するｐＨ範囲を選択す
る必要がある。このようなｐＦｌは、例えば、スポロサ
ルシナ属細菌由来のし一フェニルアラニン脱水素酵素と
カンジダ・ポイディニ由来の蟻酸脱水素酵素を用いる場
合には通常はｐ１１７．５〜９．５、好ましくはｐＨ８
，０〜９．０である。また、バシルス属細菌由来のＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由
来の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常はｐＨ８〜１
０好ましくはｐＨ８，５〜９．５である。

反応温度も、反応ｐｌ＋の場合と同様に考えることがで
きるが酵素のいずれの組合わせにおいても通常は２０°
Ｃ〜５０°Ｃ１好ましくは２５℃〜４０°Ｃである。

反応時間は特に臨界的でなく、反応混合物の基Ｗｔｆｉ
度、酵素力価等に依存して、基質α−ケトカルボン酸が
十分な収率でＬ−アミノ酸に転換されるまで反応を維持
する。

反応方式は回分式であっても連続式であってもよく、反
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。

生成したし一アミノ酸は任意の常法に従って精製採取す
ることができる。例えば、反応終了後にトリクロロ酢酸
を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する場合には
）と共に濾去し、濾液を・イオン交換樹脂等により精製
し、結晶化する。

Ｌ−アミノ酸の定量は、例えばロイコノストック′メセ
ンテロイデス（１，ｅｕｃｏｎｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ８０４２を用いるバイオアッ
セイにより行うことができ、またペーパークロマトグラ
フィーにより展開し、ニンヒドリン発色の後スポットを
抽出し比色計で定量することも出来る。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

実新ｌ粗七 第１表〜第５表に記載する各種のα−ケト酸からそれぞ
れ対応するし一アミノ酸の合成を行なった。なお、表中
でＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の状態で「粗酵素」
とは無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味し、「部分
精製酵素」とは、さらにＤＥＡＥ−１−ヨパールカラム
を通過させた酵素を意味する。ＮＡＤ゛又はＮ１口１１
の濃度は１ないし２０１の濃度となるようにした。アン
モニウムイオンは塩化アンモニウム、蟻酸アンモニウム
又はＮ１１．０１１−Ｎｌｌ、、Ｃβ緩衝液（ｐＨ９，
Ｏ）として供給し、その濃度は０．０５ないし０．５Ｍ
の濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は蟻
酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケトカルボ
ン酸の１〜３０当量とした。反応液のｐＨは８．５ない
し９であり、トリス−１１（Ｊ！緩衝液（ｐＨ８，５）
又はＮ１１．０Ｉｌ−ＮＨ４，（Ｊ！緩衝液（ａｌｌ　
９．０　）を０．０５ないし０．５　Ｍの濃度となるよ
うにして用いた。反応は３０℃で行なった。

なお、具体的には次の様にして反応を行い、後記の結果
を得た。

反応番号１゜ フェニルピルビン酸すｌ・リウム０．６１ｇ（３ｍｍｏ
り、Ｄ−フラクトース０．５４ｇ（３ｍｍｏ＃　）　、
スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−ＲＯ４（微工研菌
寄第８１７８号；微工研菌条寄第１０１２号）の菌体（
２００ｍｏβの培養液から菌体を遠心分離で集菌し、生
理的食塩水で１回洗浄した菌体）を含む５０−の反応液
を３０℃で２８時間静置した。反応液中のし一フェニル
アラニンの量を微生物定量法により測定したところ０．
３４ｇ（２，０７ｍｍｏＡ　：　６９％の転換率）のＬ
フェニルアラニンが生成していた。

反応番号２　、８．３０，３３．３４はこの例と同様に
実験を行なった。

反応番号３゜ フェニルピルビン酸ナトリウム２０．４ｍｇ　（１００
μｍｏｊｌ’　）　、ＮＡＤ”　２．５１Ｊｍｏｌ、ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　２５０　Ｊｊｍｏ／
　、蟻酸アンモニウム２ｍｍａｉｌ　、カンジダ・ボイ
ディニＩｋ２２０１風乾菌体５ｍｇ、スポロサルシナ・
ウレアエ５ＣＲＣ−ＲＯ４（ｉ１研菌寄第８１７８号：
微工研条寄第１０１２号）の菌体（培養液２５ｍ７から
の洗浄菌体）を含む５−の反応液を３０℃で２４時間反
応させた。反応液中のＬ−フェニルアラニン量を微生物
定量法により測定したところ１１．７ｍｇ　（７１ｕｍ
ｏｔｌ　、　７１％の転換率）の１、−フェニルアラニ
ンが生成していた。

反応番号９．２１はこの例と同様に実験を行なった。

反応番号５゜ α−ケト−γ−メチルチオ酪酸ナトリウム１７．０２ｍ
ｇ（１００，＋１ｍｏｆｆ　）　、ＮＡＤＨ７６，３ｍ
ｇ（１００μｍｏｊｉりＩ−リス−塩酸緩衝液（ａｌｌ
　８．５　）　２５０μｆｆ１ｏｌ、塩化アンモニウム
１０７ｍｇ（２ｍｍｏＩり　、スポロサルシナ・ウレア
エ５ＣＲＣ−ＲＯ４＜ｉ軟工研菌寄第８１７８号；微工
研条寄第１０１２号）のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素０．５単位（硫安分画における３０−６０％飽和画分
）を含む５ｍ７の反応液を３０℃において２４時間保温
した。

反応液中のし一メチオニン量を微生物定量法により測定
したところ、１０．０２ｍｇ（６７ｐｍａｌｌ　）のＬ
−メチオニンが生成していた。反応番号１６　、３５　
。

３７はこの例と同様に実験を行なった。

反応番号７゜ α−ケト−Ｔ−メチルヂオ酪酸ナトリウム１７．０２１
Ｗｇ（１００μｍｏＩり　、蟻酸アンモニウム５０ｍｇ
（８００μｍａｉｌ　）　、ＮＡＤ”　３．６ｍｇ　（
５ｐｍｏｌ　）　、）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
　２５０　ｐｍａｌｌ　、スポロサルシナ・ウレアエ５
ＣＲＣ−ＲＯ４（微工研菌寄第８１７８号：微工研条寄
第１０１２号）のし−フヱニルアラニン脱水素酵素２．
５単位（均一に精製された酵素標品）、および粗蟻酸脱
水素酵素０．５単位（ａｌｌ８．５、カンジダ・ボイデ
ィニＮＦＬ２２０１より部分精製）を含む５ｍｌの反応
液を３０℃において２４時間保温した。

微生物定量法により定量したところ１３．０５ｍｇ（８
５μｍｏｆｆ　）のし−メチオニンが生成していた。

反応番号 ４　、６．１０．１１，１２，１３，１４，１５．１７
．１Ｂ。

１９　、２０　、２２　、２３　、２４　、２５　、２
６　、２７　、２８　、２９　、３１　。

３２　、３６　、３Ｂ　、　３９　、４０はこの例と同
様に実験を行なった。

反応１５においては反応液よりＬ−チロシンを結晶とし
て単離して以下の分析を行なった。元素分析値は以下の
とおりであった。

実測値（％）　　　計算値（％） Ｃ５９，４５５９，６６ Ｈ６，１１６，１２ Ｎ　　　　７．６９　　　　　　　７．７３比施光度〔
α）　　＝−７，３３’（ｃ　＝４　、６Ｎ　Ｉｔ（Ｊ
　）でＬ体であり、光学純度は１００％ｅ、ｅである。

マススペクトル、核磁気共鳴吸収スペクトル、および赤
外吸収スベクｌ−ルによる分析結果はいずれも、生成物
がＬ−チロシンであることを示した。

反応２６においては反応液より４−ビニル−Ｌ−フェニ
ルアラニンを結晶として単離し、以下の分析を行なった
。元素分析値は次のとおりであった。

実測値（％）　　　計算値（％） Ｃ６９，０１６０，０９ Ｈ６，７９６，８７ Ｎ　　　　　　７．２９　　　　　　　　　　　７．３
２融点：１９０℃で分解した。

比施光度〔α）　　７　１３．５３　（ｃ＝１．．０２
　、４Ｎ　Ｎａ０ｌｌ）であった。

マススペクトル、核磁気共鳴スペクトル、および赤外吸
収スペクトルによる分析結果はいずれも、生成物が４−
ビニル−Ｌ−フェニルアラニンであることを示した。

反応２７においては反応液より４−フルオロ−し−フェ
ニルアラニンを結晶として単離し、以下の分析を行なっ
た。

元素分析値は次のとおりであった。

実測値（％）　　　計算値（％） Ｃ５Ｂ、９２　　　　　　５９．０１ Ｈ５，４７５，５Ｏ Ｎ　　　　７．６４　　　　　　　７．６５融点：２２
３〜２２６℃。

比施光度〔α）　　＝−１，１２（ｃ＝０．８３　、４
Ｎ　Ｎａ０１１）であった。

マススペクトル、核磁気共鳴スペクトル、および赤外吸
収スペクトルによる分析結果はいずれも生成物が４−フ
ルオロ−し−フェニルアラニンであることを示した。

その他のＪＬ−アミノ酸の定量は微生物定量法によった
。反応１３　、１４　、１９　、２０　、２４および２
５では有機溶媒を含む条件でも反応が進行した。

結果を第１表〜第５表に要約する。表中、Ｕ数は使用し
た酵素の単位数を示す。

〔以下余白〕

次新ｌボλ スポロサルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ−ＲＯ４（微工研菌
寄第８１７８号；微工研条寄第１０１２号）、バシルス
・スフエリカス５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ　（微工研菌条寄第
１０１３号）、ハシルス・バディウスＩＡＭ　１１０５
９　（ｍ１研菌寄第８５２９）　、およびカンジダ・ボ
イディニｌ’ｔ２２０１のアセトン処理菌体を用いてＬ
−フェニルアラニンの合成を行なった。ＮＡＤ”の濃度
は０．５ｍＭとした。

アンモニウムイオンは蟻酸アンモニウム又はＮｉｌ、０
Ｈ−Ｎｉｌ４（Ｊ！緩衝液（ｐｌ＋　８．５　）として
供給し、その濃度は０．１ないし０．４Ｍの濃度となる
ようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は蟻酸アンモニウ
ムとして供給し、その量はフェニルピルビン酸の１〜７
当量とした。反応ン夜のｐｌ＋は８．５であり、トリス
−ＨＣＬＩＩＪ衝液（ｐＨ８゜５）又はＮ１１．０Ｉｌ
−Ｎｌ１４Ｃｆｆｉ　緩ｌｉ液（ｐＨ８，５）を０．０
５ないし０．４Ｍの濃度となるようにして用いた。反応
は３０°Ｃで行なった。

なお、具体的には次の様にして反応を行ない後記の結果
を得た。

反応番号４１゜ フエにルビルピン酸ナトリウム３７．１ｍｇ　（１８２
μｍｏｂ　）　、、　　ＮＡＤ”　　１．５　μｍｏ（
１、トリス−塩酸緩衝ン夜（ｐＨ８，５）　１５０１ｔ
ｍａｌｌ　、蟻酸アンモニウム１．２ｍｍｏｂ　、カン
ジダ・ボイデイニＩｔ　２２０１のアセトン処理菌体３
Ｑｍｇ、スポロサルシナ・ウレアエＳＣＩ？Ｃ−Ｒ０４
（微工研菌寄第８１７８号；微工研条寄第１０１２号）
のアセトン処理菌体６ｎ＋ｇ（培養液３−分）を含む３
−の反応液を３０℃で３時間反応させた。反応液中のフ
ェニルアラニン量を微生物定量法により測定したところ
１８．３ｍｇ　（１１１μｍｏｌ　、６１％の転換率）
のし−フェニルアラニンが生成していた。

反応番号４２ではパシルス・スフエリカスＳＣＩ？Ｃ−
Ｒ７９ａ　（微工研条寄第１０１３号）の、反応番号４
５．ではハシルス・バディウスＩＡ？＋　１１０５９　
（微工研菌寄第８ジ２９号）のアセトン処理菌体を用い
て、この例と同様に実験を行なった。

反応番号４３゜ フェニルピルビン酸ナトリウム３７　、１ｍｇ　（１８
２μｍｏ１）　、ＮＡＤ”１．５　Ａｌｍｏ（１、ＮＨ
４０１１５１１４，ｃｚ　ｆｆｌ衝液（ｐＨ３，５）　
９００　ｐｍａｌｌ、蟻酸ナトリウム４００　μ…ｏ１
２　、カンジダ・ボイディニ１１ｈ２２０１のアセトン
処理菌体３０ｍｇ、バシルス・スフエリカス５ＣＲＣ−
Ｒ７９ａ（８ｉｌ！［工研条寄第１０１３）のアセトン
処理菌体３０ｍ（（（培養液１５−分）を含む３ｍｌの
反応液を３０°Ｃで１５時間反応させたところ、３０．
１ｍｇ　（１８２ｐｍａｌｌ、１００％の転換率）のし
−フェニルアラニンが生成していた。

反応番号４４゜ ＮＡＤ”　　１５　ｐｍａｌｌ　、　ｌ−リス−塩酸緩
衝液（ｐｉｆ８．５）　　１．５ｍ＋＋＋ｏｆ　Ｘ蟻酸
アンモニウム１２ｍｍｏｆｆ、カンジダ・ボイディニＮ
１１２２０１のアセトン処理菌体３００ｍＢ、　ハシル
ス・スフエリカス５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ（微工研菌条寄第
１０１３）のアセトン処理菌体３００ｍｇ　（培養液１
５０　ｍ１分）を含む３０ｍ１の反応液を３０℃に保ち
ながら、フェニルピルビン酸ナトリウム２．２３ｇ（１
０，９２ｍｍｏ！りを６回に分けて添加し、さらに蟻酸
アンモニウム１２ｍｍｏｎを加えたところ、４８時間の
反応で１．８０ｇ（１１，２ｍｍｏＡ　、１００％の転
換率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。

以上の結果を第６表に要約する。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌又はスポロサ
   ルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属細菌によって生
   産されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素又は酵素含有
   物の存在下で、次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１は水素又はメチル基であり、そしてＲ＿
   ２は置換基を有する場合がある炭素原子数１〜４の直鎖
   もしくは分岐鎖のアルキル基、又は置換基を有する場合
   がある芳香族基である） で表わされるα−ケトカルボン酸、アンモニウムイオン
   及びＮＡＤＨを反応せしめることにより、次の式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中Ｒは前記の意味を有する） で表わされるＬ−アミノ酸を生成せしめ、このアミノ酸
   を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。 ２、前記酵素含有物が前記細菌の培養物、菌体、菌体処
   理物、又は部分精製酵素である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、前記反応により生成したＮＡＤ＾＋をＮＡＤＨに再
   生する系をさらに含んで成る特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４、前記ＮＡＤＨ再生系が蟻酸脱水素酵素又はその酵素
   含有物、及び蟻酸又はその塩を含んで成る特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ５、前記ＮＡＤＨ再生系がＬ−フェニルアラニン脱水素
   酵素生産菌中の酸化−還元酵素系である特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ６、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属に
   属する細菌の培養物、菌体又は菌体処理物及びエネルギ
   ー源の存在下で、アンモニウムイオンと次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１は水素又はメチル基であり、そしてＲ＿
   ２は置換基を有する場合がある炭素原子数１〜４の直鎖
   もしくは分岐鎖のアルキル基、又は置換されている場合
   がある芳香族基である） で表わされるα−ケトカルボン酸とを反応させることに
   より、次の式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中Ｒは前記の意味を有する） で表わされるＬ−アミノ酸を生成せしめ、このアミノ酸
   を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。 ７、エネルギー源が糖類、アルコール類もしくは有機酸
   類又はこれらの組合わせである特許請求の範囲第６項記
   載の方法。