JPS6318471B2

JPS6318471B2 -

Info

Publication number: JPS6318471B2
Application number: JP56031283A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Furuyama
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1981-03-06
Filing date: 1981-03-06
Publication date: 1988-04-19
Also published as: JPS57146573A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、Ｌ−フエニルアラニンに作用する公
知のＬ−アミノ酸オキシダーゼとは種々の特性に
おいて異なる新規なＬ−フエニルアラニンオキシ
ダーゼ及びその製造法に関する。本発明のＬ−フエニルアラニンオキシダーゼ
は、Ｌ−フエニルアラニンに極めて基質特異性が
高く、かつ従来のＬ−フエニルアラニンオキシダ
ーゼとは異なる新規な作用を有し、必須アミノ酸
であるＬ−フエニルアラニンの定量に有効に用い
られる。従来、Ｌ−フエニルアラニンに作用するオキシ
ダーゼとしてはＬ−アミノ酸オキシダーゼ及びＬ
−フエニルアラニン水酸化酵素が知られている。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、例えばＬ−フエ
ニルアラニンに対しては次式で表わされる作用を有しており、種々の微生物、
蛇毒、ラツト腎臓などにその存在が報告されてい
る〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジイ（J.
Bacteriol.）Vol.121、No.２、P.656（1975）、ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.chem.）Vol.235、P.2013（1960）〕。しか
しＬ−フエニルアラニンに基質特異性の高いＬ−
アミノ酸オキシダーゼは知られていない。また、Ｌ−フエニルアラニン水酸化酵素は次式に示す作用を有しており、ネズミ肝臓、微生物等
にその存在が報告されている〔ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、Vol.226、
P.511（1957）〕が、該酵素はＬ−フエニルアラニ
ンに対する基質特異性は高いものの補酵素（テト
ラヒドロビオプテリン）を介して他の反応と共役
し複雑な反応系を必要とする。そこで本発明者らは、かかる現況に鑑みＬ−フ
エニルアラニンに特異的に作用する酵素について
鋭意研究を重ねた結果、シユードモナス
（Pseudomonas）属に属する細菌がＬ−フエニル
アラニンに対し極めて高い特異性を有し、かつ従
来にない高Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼ活
性をもつ酵素を生産することを見い出し、かかる
知見に基づいて本発明を完成した。即ち本発明は、酸素の存在下、Ｌ−フエニルア
ラニンを酸化的に脱炭酸し、フエニルアセトアミ
ド及び炭酸ガスを生成する作用とＬ−フエニルア
ラニンから酸化的に脱アミノしてフエニルピルビ
ン酸、アンモニア及び過酸化水素を生成する作用
の両作用を有する新規なＬ−フエニルアラニンオ
キシダーゼである。また本発明はシユードモナス
属に属し、上記Ｌ−フエニルアラニンオキシダー
ゼを生産する能力を有する菌株を培地に培養し、
培養物より上記Ｌ−フエニルアラニンオキシダー
ゼを採取することを特徴とする新規なＬ−フエニ
ルアラニンオキシダーゼの製造法である。以下、本発明を詳細に説明する。先ず本発明の精製酵素（以下単に新規なＬ−フ
エニルアラニンオキシダーゼと略称する）の理化
学的性質を以下に記載する。作用及び基質特異性酵素の存在下でＬ−フエニルアラニンを酸化的
に脱炭酸し、フエニルアセトアミド、炭酸ガスと
水を生成する反応式〔〕で表わされる反応並びに酸素の存在下でＬ−フエ
ニルアラニンを酸化的に脱アミノしてフエニルピ
ルビン酸、アンモニアと過酸化水素を生成する反
応式〔〕で表わされる反応を触媒する作用を有する。そし
てＬ−フエニルアラニンに極めて高い基質特異性
を示し、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−スレオニンには作用しない。至適PH及び安定PH 緩衝液として酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液を用いて新規なＬ−フエニルアラニンオ
キシダーゼのＬ−フエニルアラニンに対する酵素
活性（酸素消費量）を測定した結果、第１図に示
す如く至適PHは５〜10と広い範囲にわたり、また
第２図に示す如く安定PHの範囲は6.5〜10である。力価の測定方法１酸素消費法密閉型反応容器に1Mリン酸カリウム緩衝液
（PH6.8）0.27ml、酵素液0.1mlを入れ総量を水で
2.6mlとする。酸素電極（ベツクマン社製）を挿
入し、反応容器内を撹拌しつつ37℃恒温とする。
あらかじめ37℃に保温した27mML−フエニルア
ラニンを0.1ml添加、反応を開始し、経時的に酸
素の消費量をオキシゲンアナライザー（ベツクマ
ン社製）にて測定する。酵素活性は１分間に1μ
モルの酸素を消費する活性を１単位とする。方法２過酸化水素法 1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.8）0.3ml、
10mML−フエニルアラニン0.3ml、４−アミノア
ンチピリン（0.005％）、フエノールあるいはＮ，
Ｎ−ジメチルアニリン（0.02％）、パーオキシダ
ーゼ（４単位）及び酵素液を添加し、総量を３ml
とし、37℃、10分間反応させた後、生成する色素
の可視部吸収（550nm）を測定し、標準曲線より
過酸化水素の生成量を算出する。方法３フエニルアセトアミド、フエニルピルビ
ン酸の定量 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.8）0.8mlに
10mMのＬ−フエニルアラニン0.1ml加えた後、
酵素液0.1mlを加え、37℃で10分間反応させた。
この反応液を適量とりあらかじめ調整した高速液
体クロマトグラフイー（カラム：LS410、カラム
サイズ４mmID×250mmＬ、Mobile phase：メタ
ノール：0.1Mリン酸カリウム緩衝液＝10：90、
温度60℃、デテクター：UV220nm）にて分離後
各ピーク高を標準品のピーク高から換算しフエニ
ルアセトアミド量、フエニルピルビン酸量を定量
した。作用適温の範囲高速液体クロマトグラフイーによりフエニルア
セトアミド及びフエニルピルビン酸の生成量を測
定したところ第３図に示す如く20〜60℃であつ
た。 PH、温度などによる失活条件第４図に示すように65℃、10分間の熱処理では
安定であり、PH４〜９で４℃、１夜放置後酵素活
性（酸素消費法）を測定するとPH6.5〜９で安定
である。PH４以下で失活する。阻害、活性化及び安定化各重金属イオン（1.8mM）又は阻害剤
（1mM）を加え酵素活性（酸素消費法）を測定し
たところ第１表に示すごとくバリウムイオン、カ
ドミウムイオン、銅イオンにより強く阻害され
た。なお第１表中の相対活性は、金属イオン又は阻
害剤無添加時の活性に対する添加時の活性比で示
したものである。

【表】分子量本酵素の分子量は高速液体クロマトグラフイー
（G3000SW×１、東洋曹達工業株式会社）による
ゲル濾過法により測定した結果、約67000であり、
セフアデツクスＧ−200によるゲル濾過法では
140000である。これらの結果から本酵素は同一分子量の同じサ
ブユニツト２ケから構成されていると考えられ
る。均一性ポアサイズ7.5％のアクリルアミドゲル（PH
9.4）を用いて常法によりアクリルアミドデイス
ク電気泳動を行つた結果第５図に示す通り単一の
バンドが認められた。等電点デイスクゲル焦点電気泳動法により測定した結
果、4.83である。アミノ酸分析値アスパラギン酸55，スレオニン28，セリン34，
グルタミン酸41，グリシン49，アラニン72，１／
２−シスチン３〜４，バリン47，メチオニン６，
イソロイシン24，ロイシン50，チロシン30，フエ
ニルアラニン21，リジン17，ヒスチジン13，アル
ギニン30，プロリン34，トリプトフアン14 本発明酵素を、例えば0.1Mリン酸カリウム緩
衝液（PH6.8）、反応温度37℃、10分の反応条件下
でＬ−フエニルアラニンに作用させた場合にはＬ
−フエニルアラニン１モルにつき、１モルの酸素
を要求し、反応式〔〕に従つて0.85モルのフエ
ニルアセトアミド、0.85モルの炭酸ガス及び反応
式〔〕に従つて0.15モルのフエニルピルビン
酸、0.15モルのアンモニア、0.15モルの過酸化水
素を生成する。しかしＬ−フエニルアラニン以外の基質につい
ては酸素の存在下、酸化的脱炭酸反応と酸化的脱
アミノ反応との割合はそれぞれ異なり、全反応に
対する酸化的脱アミノ反応の割合は第２表、Ａ欄
に示す如くである。前記条件で本発明酵素の基質特異性を、Ｌ−フ
エニルアラニンに対する各基質の相対活性（％）
でみると第２表の如くであつて、従来のＬ−フエ
ニルアラニンオキシダーゼとは全く異つた基質特
異性を有し、かつ極めて高いＬ−フエニルアラニ
ンオキシダーゼ活性を示すことから本発明酵素は
公知の何れのＬ−フエニルアラニンオキシダーゼ
とも異つており、新規な酵素と認められる。

【表】

【表】次に本酵素を製造するための具体的手段につい
て以下に述べる。先ず製造原料としては、如何なる起源のもので
もよいが、例えば微生物起源、殊にシユードモナ
ス（Pseudomonas）属に属し、新規なＬ−フエ
ニルアラニンオキシダーゼを生成する能力を有す
る菌株を用いるのが本酵素を製造する上で特に有
利である。そしてシユードモナス属に属する菌株の具体例
としては、シユードモナスsp.P−501が挙げられ、
又この菌の変種若しくは変異株も用いることがで
きる。上記したシユードモナスsp.P−501は、本発明
者らが土壌中より新たに分離した菌株で、その菌
学的性質は以下に示す通りである。なお菌学的性質は概ねマニユアル・オブ・マイ
クロバイオロジカル・メソツヅ（マグロー・ヒ
ル・ブツク・カンパニー社出版、1959年）記載の
方法に準拠した。 (a) 形態顕微鏡的観察（肉汁寒天培地で30℃、16時間培
養）細胞の形および大きさ：0.5〜1.0×1.5〜3.0
ミクロンの桿菌細胞の多形性：認められない。運動性：極毛を有し、運動性有り。胞子の有無：形成せず。グラム染色性：陰性。抗酸性：陰性。 (b) 各培地における生育状態肉汁寒天平板培養 30℃、24時間で黄緑色のコロニー、表面やや粗
面で鈍い光沢を有し、不透明である。黄緑色の拡
散性色素を有する。肉汁寒天斜面培養生育は良好でコロニーの色は黄緑色。肉汁液体培養均一によく生育し、濁度有り。肉汁ゼラチン穿刺培養 30℃、４日間でやや生育し、液化する。リトマスミルク：わずかにアルカリ。 (c) 生理的性質硝酸塩の還元：陽性。脱窒反応：陰性。 MRテスト：陰性。 VPテスト：陰性。インドールの生成：陰性。硫化水素の生成：陰性。デンプンの加水分解：陰性。クエン酸の利用：クリステンセンの培地利
用。無機窒素源の利用：陽性。色素の生成：黄緑色の水溶性色素を生成す
る。ウレアーゼ：陰性。オキシダーゼ：陽性。カタラーゼ：陽性。生育の範囲：至適PH５〜８、至適温度25〜30
℃。酸素に対する態度：好気性。Ｏ−Ｆテスト：酸化性。糖類から酸およびガスの生成。

【表】

【表】 (d) 諸性質 DL−アルギニンを唯一の炭素源として生育
することができる。上述の新規なＬ−フエニルアラニンオキシダー
ゼ生産能を有する本菌の分類学的諸性質を「バー
ジエイス・マニユアル・オブ・デタミネイテイ
ブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）の分類
と対比すると、本菌株はグラム染色が陰性、好気
性の無胞子桿菌で鞭毛を有し、運動性があり、か
つカタラーゼ陽性、オキシターゼ陽性等により、
シユードモナス属に属し、シユードモナス・マー
ジナタ、シユードモナス・セパシアに近縁な株と
目されるが、その分離源及びメサコン酸、Ｄ−酒
石酸、ラムノース、トリプタミンなどの炭素源が
利用できない等の生理学的性質において相違点が
ある。以上の理由により、本菌をシユードモナスsp.P
−501と命名した。なお、シユードモナスsp.P−501は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第5887号とし
て寄託されている。次に上記の新規なＬ−フエニルアラニンオキシ
ダーゼを生産する能力を有する菌を用いるＬ−フ
エニルアラニンオキシダーゼの製造について述べ
る。本発明において上記の新規なＬ−フエニルアラ
ニンオキシダーゼを生産する能力を有する菌を培
養するのに用いられる培地としては、シユードモ
ナス属に属する微生物の培養に用いられる培地が
挙げられる。培地の窒素源としては利用可能な窒
素化合物又はこれを含有するものであればよく、
例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、大豆、
アミノ酸、硫安、硝酸カリウム、尿素等の１種以
上の有機若しくは無機の窒素源が用いられる。炭
素源としては例えばグルコース、ガラクトース、
キシロース、等の炭水化物、レブリン酸等の有機
酸が挙げられる。無機塩類としてはリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第１鉄、塩化ナトリウム等が適宜用いられ、必要
により菌の生育あるいは酵素生産に必要な各種の
有機物、無機物、ビタミンなどを添加したものが
培地として好適に用いられる。菌の培養は固体培養で行つてもよいが通常液体
培養法を採用するのが好ましく、振盪培養、撹拌
培養、通気培養等により好気的に菌の培養を行
う。工業的には液体培地を用い、通気撹拌深部培
養するのが好ましい。培養温度は10〜40℃、好ましくは25〜35℃付近
である。培養時のPHは５〜８が好ましい。培養時
間は培養形態によつても異なるが、14〜72時間で
ある。かくして得られた培養物からの本酵素の抽出、
精製には、一般の酵素の抽出、精製法を用いるこ
とができる。例えば適当な方法により培養物から菌体を分離
したのち、その菌体を摩毛剤の存在下ですりつぶ
す方法、リゾチーム等の加水分解酵素を用いる方
法、超音波エネルギーを適用する方法、浸透圧シ
ヨツクを適用する方法等の公知の方法により破壊
するか、又はトリトンＸ−100のような界面活性
剤、トルエン等の存在下で振盪もしくは放置し、
又は自己消化等により本酵素を菌体外に排出させ
た後、該溶液を濾過法、遠心分離法などの適当な
操作により処理し、固形物を除去して菌体抽出液
を得るか、又は水、緩衝液若しくは適当な溶剤で
抽出し、これをそのまま粗酵素液として得る。ま
た通常の酵素回収法、即ち該抽出液に必要により
凍結乾燥法、硫安等による塩析法、アルコール
類、アセトン類を用いる有機溶媒沈殿法などを適
宜選択して実施することにより粗酵素粉末を得る
こともできる。上記粗酵素液若しくは粗酵素粉末よりさらに精
製酵素標品を得るには、例えばセフアデツクス若
しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン
交換体を用いる吸着溶出法、ハイドロキシアパタ
イトを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心法等
の沈降法、フエニルセフアロース4Bを用いるア
フイニテイクロマト法、分子ふるい膜若しくは中
空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組み合
わせて実施することにより、精製された本酵素標
品を得ることができる。また培養時間を長くして自己消化を行わせた場
合の培養濾液についても、同様に処理することに
より本酵素を得ることができる。本発明者らは、更にシユードモナス属に属し、
新規なＬ−フエニルアラニンオキシダーゼ生産能
を有する菌株をＬ−フエニルアラニン若しくはそ
の類似物質含有培地に培養すると新規なＬ−フエ
ニルアラニンオキシダーゼの生成量を飛躍的に増
加せしめ得ることを知り、この知見に基づいてシ
ユードモナス属に属する新規なＬ−フエニルアラ
ニンオキシダーゼ生産菌をＬ−フエニルアラニン
若しくはその類似物質含有培地に培養し、培養物
から該Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼを採取
する新規なＬ−フエニルアラニンオキシダーゼの
製造法を完成した。Ｌ−フエニルアラニン類似物質としては例えば
Ｄ−フエニルアラニン、安息香酸、メタハイドロ
キシ安息香酸等が挙げられる。そしてこれらの使
用量は0.1％以上添加するのが好ましい。ここで実験例を挙げて説明する。実験例 KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、FeSO₄・7H₂O0.001％、酵母エキス
0.2％からなる培地に第３表に記載の各物質を添
加した後、120℃、10分間殺菌した。次に該培地
にシユードモナスsp.P−501（微工研菌寄第5887
号）を接種し、30℃、20時間、振幅５cm、
120rpmで振盪培養を行ない、得られた培養液の
20KC超音波処理物の新規Ｌ−フエニルアラニン
オキシダーゼ活性を測定したところ第３表に示す
結果が得られた。なお、メタヒドロキシ安息香酸
の添加に際しては、窒素源として培地中に硫酸ア
ンモニウム0.2％を加えた。また対象としては培
地にカザミノ酸１％を添加したものを使用した。

【表】第３表の結果から、Ｌ−フエニルアラニン及び
その類似物質は本酵素の生産を顕著に増加させる
ことがわかる。次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。実施例１ KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、FeSO₄・7H₂O0.001％、酵母エキス
0.2％、カザミノ酸１％からなる培地を50ml宛、
各500ml容の振盪フラスコに分注し、120℃、10分
間殺菌後、シユードモナスsp.P−501（微生物保管
委託申請書受理番号第5887号）を接種し、30℃、
16時間、振幅５cm、120rpmで振盪培養した。培養終了後培養液10を濾過して得られた菌体
を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）2000mlに懸濁し
た後、トリトンＸ−100 0.5％を添加し、溶菌し
た後、遠心分離により固形分を除去し、粗酵素液
を得る。該粗酵素液に硫酸アンモニウムを添加し
30％飽和〜50％飽和の沈殿区分を採取し、これを
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）50mlに溶解し、同
一緩衝液で１夜透析する。次に上記同一緩衝液で
平衝化したDEAEセルロースカラム（5.2×80cm）
に通し、食塩0.1M含有同緩衝液で不純物を溶出
後、食塩0.2M濃度を含む同緩衝液で溶出し、活
性区分を集め、濃縮後バイオゲルＡ−0.5mカラ
ム（2.5×150cm）によるゲル濾過を行ない活性区
分を集めた。該溶液の硫酸アンモニウム60％飽和
の沈殿区分を集め、これを10％硫酸アンモニウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）10mlに溶解
し、フエニルセフアロースCL−4B（フアーマシ
ア社製、スエーデン国）カラム（2.8×10cm）に
通し、10％硫酸アンモニウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.0）でカラムを洗滌後、１％硫酸ア
ンモニウム50％エチレングリコールを含む0.01M
リン酸緩衝液にて酵素を溶出し、活性区分を集め
て、再びバイオゲルＡ−0.5mカラム（2.5×150
cm）にてゲル濾過を行い活性区分を集めて精製酵
素標品0.2mg（収率7.5％、比活性88.4単位／mg蛋
白質）を得た。実施例２実施例１における培地のカザミノ酸１％の代わ
りにＬ−フエニルアラニン１％を用いる以外は実
施例１と同様に実施して精製酵素標品2.1mg（収
率11.6％、比活性94.2単位／mg蛋白質）を得た。実施例３実施例１における培地に、メタヒドロキシ安息
香酸１％を加える以外は実施例１と同様に実施し
て精製酵素標品1.8mg（収率11.3％、比活性87.0単
位／mg蛋白質）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の新規なＬ−フエニルアラニン
オキシダーゼの至適PHを示す図であり、第２図は
同じく４℃、20時間、各PHで処理後の残存活性を
示す図である。第３図は高速液体クロマトグラフ
イーにより定量した本酵素の作用温度を示す図で
あり、第４図は同じくPH6.8での熱安定性を示す
図である。第５図は本発明の新規なＬ−フエニル
アラニンオキシダーゼの電気泳動図を示すもので
ある。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の理化学的性質を有する新規なＬ−フエ
ニルアラニンオキシダーゼ。ａ作用：酸素の存在下でＬ−フエニルアラニンを酸化的
に脱炭酸し、フエニルアセトアミド、炭酸ガスと
水を生成する反応式〔〕で表わされる反応並びに酸素の存在下でＬ−フエ
ニルアラニンを酸化的に脱アミノしてフエニルピ
ルビン酸、アンモニアと過酸化水素を生成する反
応式〔〕で表わされる反応を触媒する作用を有する。ｂ基質特異性：Ｌ−フエニルアラニンに極めて高い基質特異性
を示し、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−スレオニンには作用しない。ｃ至適PH及び安定PH範囲：至適PH：５〜10 安定PH範囲：6.5〜10 ｄ分子量：高速液体クロマトグラフイーによるゲル濾過法
により測定した値が約67000である。２シユードモナス属に属し、下記ａ〜ｄの理化
学的性質を有する新規なＬ−フエニルアラニンオ
キシダーゼを生産する能力を有する菌株を培地に
培養し、培養物より上記Ｌ−フエニルアラニンオ
キシダーゼを採取することを特徴とする新規なＬ
−フエニルアラニンオキシダーゼの製造法。ａ作用：酸素の存在下でＬ−フエニルアラニンを酸化的
に脱炭酸し、フエニルアセトアミド、炭酸ガスと
水を生成する反応式〔〕で表わされる反応並びに酸素の存在下でＬ−フエ
ニルアラニンを酸化的に脱アミノしてフエニルピ
ルビン酸、アンモニアと過酸化水素を生成する反
応式〔〕で表わされる反応を触媒する作用を有する。ｂ基質特異性：Ｌ−フエニルアラニンに極めて高い基質特異性
を示し、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−スレオニンには作用しない。ｃ至適PH及び安定PH範囲：至適PH：５〜10 安定PH範囲：6.5〜10 ｄ分子量：高速液体クロマトグラフイーによるゲル濾過法
により測定した値が約67000である。３シユードモナス属に属し、下記ａ〜ｄの理化
学的性質を有する新規なＬ−フエニルアラニンオ
キシダーゼを生産する能力を有する菌株をＬ−フ
エニルアラニン若しくはその類似物質含有培地に
培養し、培養物より上記Ｌ−フエニルアラニンオ
キシダーゼを採取することを特徴とする新規なＬ
−フエニルアラニンオキシダーゼの製造法。ａ作用：酸素の存在下でＬ−フエニルアラニンを酸化的
に脱炭酸し、フエニルアセトアミド、炭酸ガスと
水を生成する反応式〔〕で表わされる反応並びに酸素の存在下でＬ−フエ
ニルアラニンを酸化的に脱アミノしてフエニルピ
ルビン酸、アンモニアと過酸化水素を生成する反
応式〔〕で表わされる反応を触媒する作用を有する。ｂ基質特異性：Ｌ−フエニルアラニンに極めて高い基質特異性
を示し、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−スレオニンには作用しない。ｃ至適PH及び安定PH範囲：至適PH：５〜10 安定PH範囲：6.5〜10 ｄ分子量：高速液体クロマトグラフイーによるゲル濾過法
により測定した値が約67000である。