JPS6139035B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、酸素の存在下でＮ−アセチルヘキソ
サミンを酸化してＮ−アセチルヘキソサミン酸と
過酸化水素を生成する新規なＮ−アセチルヘキソ
サミン酸化酵素及びその製造法に関する。 最近ウイルスによる細胞のガン化により、細胞
表層のＮ−アセチルグルコサミンを含む糖質の変
化することが指摘され、肝ガンにおいてはＮ−ア
セチルグルコサミンとＮ−アセチルノイラミン酸
の生合成系の律速酵素であるグルコサミン−６−
燐酸合成酵素の活性が極めて高いことが認められ
ている。またある種の血液ガンにおいては、リゾ
チームの活性が極度に上昇することも知られてい
る。このようにＮ−アセチルグルコサミン及びそ
の誘導体に関与する酸素系の変動が病状の指針と
して医療検査の対象となつており、現状ではこれ
を簡易に高精度でかつ定量を効率よく行いうる酵
素の開発が当業界において強く要望されている。 本発明者は、広範囲の微生物についてＮ−アセ
チルヘキソサミン分解菌を検索した結果、シユー
ドモナス属に属する細菌が、新規なＮ−アセチル
ヘキソサミン酸化酵素を生産することを見出し本
発明を完成した。 本発明は、新規なＮ−アセチルヘキソサミン酸
化酵素であり、また本発明は、シユードモナス属
に属し、Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素生産
能を有する菌株を培地に培養し、培養物よりＮ−
アセチルヘキソサミン酸化酵素を採取することを
特徴とする、Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素
の製造法である。 本酵素の理化学的性質は下記のとおりである。 (1) 作用及び基質特異性： 次の反応式に示されるごとく、酸素の存在下
で、Ｎ−アセチルヘキソサミンを酸化してＮ−
アセチルヘキソサミン酸と過酸化水素を生成す
る。ヘキソース、ヘキソサミン及びＮ−アセチ
ルノイラミン酸に対しては、ほとんどもしくは
全く作用しない。 なおＮ−アセチルヘキソサミン酸の具体例は
下記のものである。

【表】 (2) 至適PH及び安定PH範囲： 燐酸カリウム緩衝液（0.1Mグリシン含有）
を用いた場合、至適PHは7.5〜8.5である。例え
ばクエン酸−燐酸ナトリウム緩衝液、燐酸カリ
ウム緩衝液（0.1Mグリシン含有）及びグリシ
ン−苛性ソーダ緩衝液を用いてＮ−アセチルグ
ルコサミンに対する酵素活性を測定した結果
は、第１図に示すとおりで、至適PHは7.5〜8.5
である。なお測定は酸素消費法を用い、クエン
酸−燐酸ソーダ、燐酸カリウム（0.1Mグリシ
ン含有）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液中で
行つた。また第２図に示すごとく安定PH範囲は
３〜９である。この測定は過酸化水素法を用
い、0.1mlのクエン−燐酸ソーダ及びグリシン
−塩酸又は苛性ソーダ緩衝液に溶解して、45℃
で10分間の熱処理した酵素の残存活性を測定し
て行つた。 (3) 力価の測定法： (i) 酸素消費に基づく測定法 密閉型反応容器に、0.1M−燐酸カリウム
緩衝液（0.1Mグリシン含有）（PH8.0）2.9
ml、0.5M−Ｎ−アセチルグルコサミン溶液
0.1mlを加え、酸素電極（米国YSI社製）を
挿入し、反応容器内を37℃で撹拌しながら、
これに本酵素液10μを加えて反応を開始
し、経時的に酸素の消費量をオキシゲン・モ
ニター（米国YSI社製）で測定する。なお酵
素単位は１分間に１μモルの酸素を消費する
活性を１単位とする。 (ii) 生成する過酸化水素の測定法 0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH6.8）に、４
−アミノアンチピリン（0.005％）、Ｎ・Ｎ−
ジメチルアニリン（0.02％）及びパーオキシ
ダーゼを溶解した溶液2.8mlを（パーオキシ
ダーゼ活性４単位）を加え、これに0.5M−
Ｎ−アセチルグルコサミン0.1ml及び本酵素
液0.1mlを添加して総量を３mlとなし、37℃
で10分間反応させる。次いで生成した色素の
可視部の吸収（550nｍ）を測定し、標準曲
線より過酸化水素の生成量を算出する。 (iii) 生成するＮ−アセチルヘキソサミン酸の定
量法 0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH8.0）2.8mlに
0.5M−Ｎ−アセチルグルコサミン0.1mlを加
えたのち、本酵素液0.1mlを加え、37℃で10
分間反応させる。この反応液を適量とり、高
速液体クロマトグラフ装置〔カラム：TSK
−GEL LS−220（東洋曹達製）、カラムサイ
ズ：４mmIDX250mmＬ、移動相：0.03M食塩・
0.025M燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）、温
度：40℃、検出：UV220nｍ〕で分離し、ピ
ークの高さを標準品のピークの高さより換算
し、Ｎ−アセチルグルコサミン酸量を定量す
る。 (4) 作用適温の範囲 高速液体クロマトグラフイにより、Ｎ−アセ
チルグルコサミンの生成量を測定した結果によ
れば、第３図に示すごとく30〜70℃である。こ
の実験はＮ−アセチルヘキソサミン酸の定量法
に基づき、各温度に於けるＮ−アセチルグルコ
サミン酸の生成量を測定して行つた。 (5) PH、温度等による失活の条件 第４図に示すごとく、10分間の熱処理では45
℃から失活を始めるが、65℃においてもほぼ半
分の活性値を保持する。また45℃で10分間の加
熱処理ではPH３〜９で安定であり、それより酸
性側では急速に失活し、逆にアルカリ性側では
徐々に失活する。この実験では過酸化水素法を
用い、燐酸カリウム緩衝液（PH6.8）中で10分
間、各温度で処理した酵素の残存活性を測定し
たものと、それに１mg/mlで牛血清アルブミン
を加えて同様にしたものを比較した。 (6) 阻害活性化及び安定化 各種金属イオン及び阻害剤を含む溶液（1.8
ｍＭ）（トリス−塩酸緩衝液、PH7.5）中で酵素
活性を測定した結果、第２表に示すごとく、第
１鉄、水銀、亜鉛により強力に阻害され、カド
ミウム、鉛、ニツケルによつても阻害される。

【表】 一方、第４図に示すごとく、血清アルブミン
の添加により安定化されると共に若干活性化さ
れる。 (7) 精製方法 本酵素の単離、精製は常法に従つて行うこと
ができ、例えばCM−セルロース塔によるカラ
ムクロマトラフイ、硫安による分画沈殿、CM
−セフアデツクス塔によるカラムクロマトグラ
フイ及びセフアデツクスによるゲル過等の精
製手段を、単独もしくは適宜組合せて使用す
る。 (8) 分子量 0.05M燐酸カリウム緩衝液（0.1M塩化ナトリ
ウムを含む）を用いて、セフアデツクスＧ−
200のカラムによるゲル過法により測定した
値は、約14万〜15万である。 (9) ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ポアサイズ7.5％のアクリルアミドゲル（PH
4.0）を用いて、常法によりアクリルアミドデ
イスク電気泳動を行なつた結果、第５図に示す
ごとく単一のバンドが認められた。 (10) 等電点 デイスクゲル焦点電気泳動法により測定した
値は、8.0である。 (11) アミノ酸分析値（酵素１分子中のアミノ酸数
で表示） アスパラギン酸133、スレオニン83、セリン
72、グルタミン酸103、グリシン137、アラニン
152、1/2シスチン28、バリン99、メチオニン
22、イソロイシン44、ロイシン120、チロシン
52、フエニルアラニン38、リジン49、ヒスチジ
ン37、アルギニン78、トリプトフアン18、プロ
リン83。 以上のように本酵素は、その作用及び基質特異
性において徐来全く知られていない新酵素であ
る。 次に本発明による新規Ｎ−アセチルヘキソサミ
ン酸化酵素の製造法について説明する。 使用される微生物は、シユードモナス属に属し
Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素生産能を有す
る菌株であつて、その具体例としてはシユードモ
ナスsp・No15−１が挙げられ、該菌の変種もし
くは変異株も用いられる。シユードモナスsp・
No15−１は、本発明者が土壌中より分離した菌
株であり、その菌学的性質は下記のとおりであ
る。 (a) 形態 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地30℃ 16時間培
養） (1) 細胞の大きさ：0.5〜0.8×1.0〜1.3ミクロ
ンの桿菌 (2) 細胞の多形性：認められない (3) 運動性：極毛を有し、運動性有り (4) 胞子の有無：形成せず (5) グラム染色性：陰性 (6) 抗酸性：陰性 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：30℃、24時間で淡黄褐
色のコロニー、表面平滑で鈍い光沢を有し、
透明である。色素の生成はない。 (2) 肉汁寒天斜面培養：生育は良好で(1)に同じ (3) 肉汁液体培養：均一に良く生育する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：30℃、４日間でや
や生育し、液化する。 (5) リトマスミルク：わずかにアルカリ性 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：コーザー、クリステンセ
ンの両培地で利用する。 (9) 無機窒素源の利用：アンモニアを利用する
が、硝酸塩は利用せず。 (10) 色素の生成：陰性 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲：至適PH５〜８、至適温度30
〜38℃ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト：酸化性 (17) 糖類から酸及びガスの生成

【表】 (d) その他の性質 (1) 窒素源欠乏培地で菌体内にポリ−β−ハイ
ドロキシブチル酸エステルを蓄積する。 (2) DL−アルギニン及びベタインを唯一の炭
素源として生育できない。 (3) 41℃で生育する。 (4) 水素をエネルギー源として利用しない。 上述の新規なＮ−アセチルヘキソサミンオキシ
ダーゼ生産能を有する本菌の分類学的諸性質を、
「バージエイス・マニユアル・オブ・デターミネ
イテイブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）
の分類と対比すると、本菌株はグラム染色性が陰
性、好気性の無胞子桿菌で極鞭毛を有し運動性が
あり、かつカタラーゼ陽性、オキシターゼ陽性等
により、シユードモナス属に属し、セクシヨン３
に分類され、41℃で生育することから、シユード
モナス・レモイグネイ（Pyeudomonas
lemoignei）に相当するが、ゼラチンの液化、糖
の利用性等で全く異なつている。以上の理由によ
り、本菌をシユードモナスsp.No15−１と命名し
た。なおシユードモナスsp.No15−１は、通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
条寄第227号（FERM BP−227）として寄託され
ている。 次に本発明で使用する培地としては、炭素源、
窒素源、無機物、その他の栄養素を程よく含有す
る培地ならば、合成培地または天熱培地のいずれ
でも使用可能である。炭素源としては、グルコー
ス、ガラクトース、フルクトース、キシロース、
アラビノース等の他にグリセリン、マンニツトや
プロピオン酸、グリコール酸、乳酸等を用いるこ
とができる。窒素酸としては、アンモニウム塩
や、ペプトン、カゼイン消火物等の蛋白性消化
物、あるいは酵母エキス等の窒素性有機物質等が
好適に使用できる。無機物としては、ナトリウ
ム、カリウム、マンガン、マグネシウム、カルシ
ウム、コバルト、ニツケル、鉄、銅、亜鉛等の塩
類が使用できる。本発明においては、Ｎ−アセチ
ルヘキソサミン酸化酵素生産能を有する菌株を、
Ｎ−アセチルヘキソサミンを含有する培地で培養
したときに、Ｎ−アセチルヘキソサミンオキシダ
ーゼが最も収量よく得られる。該培養倍地の好適
な例としては、例えばＮ−アセチルグルコサシン
0.5％、酵母エキス0.4％、ポリペプトン0.15％、
グリセリン0.5％、硫酸マグネシウム0.05％、燐
酸水素二カリウム0.2％、PH6.5の培地例が挙げら
れる。そして該培地で30℃20時間通気撹拌培養し
た場合は、Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコー
スに置きかえた場合の10〜50倍の生産力価を得る
ことができる。培養温度は通常20〜40℃の範囲
で、好適には33〜38℃の範囲で行われる。培養開
始のPHは、通常６〜８の範囲で、好適には７付近
である。このような条件下で18〜24時間振盪又は
深部撹拌培養すれば、培養物中にＮ−アセチルヘ
キソサミン酸化酵素が生成蓄積する。 Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素は、通常は
菌体中に存在するので、培養物を遠心分離あるい
は過によつて集め、適量の緩衝液中で菌体を破
壊し、酵素を可溶化することによつて溶液中に放
出させる。菌体の破壊方法はダイノミル、フレン
チプレス、超音波等の物理的なものや、トリトン
Ｘ−100、ラウリル硫酸ソーダ、EDTA等の化学
的方法、リゾチーム等の酵素的な方法を、単独で
又は併用して用いることができる。このようにし
て得られた菌体破砕液から核酸を常法によつて除
去し、過又は遠心分離によつて不溶物を除き、
Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素を得る。そし
てＮ−アセチルヘキソサミン酸化酵素は、必要に
より酵素の単離精製の常法に従つて例えば、(1)
CM−セルロース塔によるカラムクロマトグラフ
イ、(2)硫安による分画沈殿、(3)CM−セフアデツ
クス塔によるカラムクロマトグラフイ、(4)セフア
デツクスによるゲル過等の方法、又はその他の
方法を必要に応じ組み合わせて用いることによ
り、精製されたＮ−アセチルヘキソサミン酸化酵
素を得ることができる。 本発明の新規なＮ−アセチルヘキソサミン酸化
酵素を用いると、Ｎ−アセチルグルコサミン等を
精度良く定量することができ、これによりグルコ
サミン−６−燐酸合成酵素の活性を知り、該酵素
活性に基づいて、種々の病状の診断を効率良く行
なうことができる。 実施例 １ シユードモナスsp.No15−１（微工研条寄第
227号、FERM BP−227）を500mlの坂口フラス
コ中で、Ｎ−アセチルグルコサミン５ｇ/、酵
母エキス４ｇ/、燐酸−カリウム１ｇ/及び硫
酸マグネシウム0.5ｇ/の組成を有する種培地
（PH6.5）100mlに植菌し、30℃で８時間培養す
る。この種培養液を30のジヤーフアーメンター
中で、Ｎ−アセチルグルコサミン５ｇ/、酵母
エキス４ｇ/、グリセリン５ｇ/、ポリペプト
ン1.5ｇ/、燐酸水素二カリウム２ｇ/、硫酸
マグネシウム0.5ｇ/の組成を有する酵素生産培
地（PH6.5）20に植菌し、35℃で20時間通気
（20／分）撹拌（300rpm）培養する。次いで培
養液を遠心分離（１万2000rpm）して菌体を集め
る。集菌した生菌体411ｇに、0.05M−燐酸カリ
ウム緩衝液（PH7.0）２を加え、菌をよく分散
させる。これにトリトンＸ−100の10％水溶液200
mlを加え、よく混和する。さらに0.05M−燐酸カ
リウム緩衝液（PH7.0）2.5を加え、一晩低温に
放置する。これにプロタミン硫酸の飽和溶液（PH
7.5）を沈殿が生じなくなるまで加え、沈殿を遠
心分離（2000rpm）により除去し、上澄液をホロ
ーフアイバー限外過装置（保持分子量6000）で
濃縮する。次いで0.05M−酢酸緩衝液に対して透
析し、同緩衝液で平衝化したCM−セルロース塔
（10.5φ×40cm）に吸着させ、０〜0.6MKClの濃
度勾配を有する溶出液を用いて溶出させる。 活性部を集めてホローフアイバー限外過装置
（分子量6000保持）を用いて400mlまで濃縮し、こ
れに硫安を30％飽和になるように加え、不溶物を
遠心分離して除去する。更に硫安を加えて55％飽
和となし生じた沈殿を遠心分離によつて集め、35
％飽和硫安溶液（0.05M−燐酸カリウム緩衝液PH
6.8）50mlに溶解する。不溶部分を遠心分離して
除き、35％飽和硫安濃度にした同緩衝液に平衡化
する。次いでフエニルセフアロースCL−4B（ス
エーデン・フアーマシア社製）のカラム（φ４×
15cm）に吸着させ、エチレングリコールの濃度勾
配（０〜30％）と硫安の逆濃度勾配（20％飽和〜
０）をもつ0.05M−燐酸カリウム緩衝液PH6.8で
溶出する。活性部を集めて濃縮し、0.1M−酢酸
緩衝液PH5.25に対して、一晩透析する。これを同
緩衝液に平衡化したCM−セフアデツクスＣ−50
カラム（φ3.5×45cm）に吸着させ、食塩濃度勾
配（０〜0.5M）をもつ溶出液で溶出する。活性
部を集めて濃縮し、0.05M−燐酸カリウム緩衝液
（PH6.8、0.1M食塩含有）に対して透析し、同緩
衝液で平衡化したセフアデツクスＧ−200カラム
（φ２×100cm）にかけてゲル過を行い、比活性
の高い活性ピークの前半を集めて濃縮し、精製Ｎ
−アセチルヘキソサミン酸化酵素21mg（収率4.1
％、比活性15.5単位／mg蛋白質）を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素についての至適PHを、第２図は
安定PHを、第３図は作用適温の範囲をそれぞれ示
すグラフであり、第４図は各温度における失活を
示すグラフであり、第５図はアクリルアミドデイ
スク電気泳動を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するＮ−アセチルヘ
   キソサミン酸化酵素。 (1) 作用及び基質特異性： 酸素の存在下で、Ｎ−アセチルヘキソサミン
   を酸化してＮ−アセチルヘキソサミン酸と過酸
   化水素を生成する。ヘキソース又はヘキソサミ
   ンに対しては、ほとんどもしくは全く作用しな
   い。 (2) 至適PH及び安定PH範囲： 燐酸カリウム緩衝液（0.1Mグリシン含有）
   を用いた場合、至適PHは7.5〜8.5であり、安定
   PH範囲は３〜９である。 (3) 分子量： 0.05M燐酸カリウム緩衝液を用いて、セフア
   デツクスＧ−200によるゲル過法により測定
   した値は、約14万〜15万である。 ２ シユードモナス属に属し、Ｎ−アセチルヘキ
   ソサミン酸化酵素生産能を有する菌株を培地に培
   養し、培養物よりＮ−アセチルヘキソサミン酸化
   酵素を採取することを特徴とする、Ｎ−アセチル
   ヘキソサミン酸化酵素の製造法。