JPH0361481A - ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物による新規なギ酸脱水素酵素及びその
製造方法に関し、更に詳しくは、パラコツカス属に属し
、ギ酸を唯一の炭素源として生育し得る微生物を培養し
て、その代謝産物としてギ酸脱水素酵素を蓄積させて得
られる新規なギ酸脱水素酵素及びその製造方法に関する
ものであり、その目的とするところは産業上有益なギ酸
脱水素酵素を提供することにある。

〔従来の技術］ ギ酸脱水素酵素については、メタノール酵母や高等植物
においてその存在が知られ、エントウ豆やメタノール酵
母においてはその酵素が精製され、その性質が明らかに
されている。具体的にはエントウ豆（Ｐｉｓｕｍ　ｓａ
ｔｉｖｕｍ：　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、７７＋
　８４５（１９７５）参照）、キャンディダ・ボイディ
ニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ：　Ｅｕｒ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、６２＋　１５１（１９７６
）参照）、キャンディダ・メチリカ（Ｃａｎｄｉｄａ　
ｍｅｔｈｙ−１ｉｃａ：　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、ｖｏｌ、５２．６５７（１９８５）参照）、キャンデ
ィダ・メタノリカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｉｃａ：ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、
　ｖｏｌ、４８．１３９（１９８７）参照）、クロイッ
ケラ属酵母（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ　ｓｐ、：　Ａｇｒｉ
ｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、　ｖｏｌ、３８．１１１（１
９７４）参照）、ピキア・バストリス　（Ｐｉｃｈｉａ
　ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　ｖｏｌ、　４７．２５４７（１９８３）参
照）などである。

しかしながら細菌においては、エシェリキア・コリ　（
Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅ＋ｍ、　ｖｏｌ。

２５０、６６９３（１９７５）参照）、クロストリジウ
ム・パスツーリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａ
ｓｔｅｕｒｔａｎｕｍ：　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、　ｖｏｌ、１５９．３７５（１９
８４）参照）、クロストリジウム・サーモアセティカム
（Ｃｌｏｓｔｒｆｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｅｅｔｉｃｕ
ｓ＋：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、νｏ１．２５
９．１８２６（１９８３）参照〉などがＮＡＤを電子受
容体として利用できないギ酸脱水素酵素（酵素番号［Ｅ
Ｃ１，２，２，１］）を持つことがよく知られているが
、ＮＡＤを電子受容体として利用できるギ酸脱水素酵素
（酵素番号ｉＥｃ　１．２．１．２１　）は、幾つかの
細菌から精製されているに過ぎない。具体的には、モラ
キセラ属細菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ、：　Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｖｏｌ、１７０＋　３１８９（
１９８８）参照）やアクロモバクタ−・バーヴアラス（
八ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　　ｐａｒｖｕｌｕｓ：　
　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ　　ｖｏｌ。

９９、５６９（１９７９）参照〉、シュードモナス・オ
キザラティカス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｘａｌａ
ｔｉｃｕｓ：　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、８３．４８５（１９７８）
参照）などの酵素が知られている。しかしながら、シュ
ードモナス・オキザラティカスやアクロモバクタ−・バ
ーヴアラスの酵素は安定性が悪く、安定剤無しには数日
でその活性を失うことが知られている。

先行発明としては、特開昭６０−１２９７４号にシュー
ドモナス・オキザラティカスからのギ酸脱水素酵素の製
造法が述べられている、上述したようにこの酵素は極め
て酸素耐性が低く、安定剤の存在なしには５日間でその
活性を失ってしまう。従って、このような酵素を工業的
規模でのＮＡＤＩＩ再生用酵素として用いることはあま
り意味がない。また、特開昭６０−２４１８８７号には
りボマイセス・メタノシルビエンス（Ｌｉｐｏｓｙｃｅ
ｓ　ｍｅｔｈａｎｏｓｉｌｖｆｅｎｓｉｓ）によるギ酸
脱水素酵素の製造法が述べられている。この酵素は特開
昭６０−１２９７４号のように酸素耐性の低い酵素では
ないが、ｐＨ安定性、ＮＡＤに対するに一直、精製酵素
の比活性等において十分なものといえない。

〔発明が解決しようとする課題〕

ギ酸脱水素酵素（酵素番号［ＢＣ１，２，１，２］）は
、ギ酸とＮＡＤより炭酸を副産物としてＮＡＤＨを生成
することから、ＮＡＤＨを必要とする酵素反応系におい
てＮＡＤＨ再生用酵素として有望視されており、またそ
のギ酸に対するＫｍ値の低い酵素は、ギ酸の特異的検出
や微量定量にも有用である。特にＮＡＤ）ｌ再生用の酵
素としては、反応生成物が炭酸であることから副産物が
反応系に蓄積しない利点があり、工業的規模でのＮＡＤ
Ｈ再生用酵素として注目されている。

これまでギ酸脱水素酵素を生産する菌株は上記のごとく
知られている。しかしながら、これらの菌株はギ酸脱水
素酵素の生産性が低く、そして得られるギ酸脱水素酵素
は、■比活性が低いこと。

■ギ酸及びＮＡＤに対するギ酸脱水素酵素のＫｍ値が大
きいこと。■温度安定性やｐＨ安定性の範囲が狭いこと
などから、工業的利用に適さないものであった。

本発明者らはギ酸を資化し、かつ高活性のギ酸脱水素酵
素生産細菌の分離を広範囲に行った結果、パラコツカス
属の微生物がギ酸を資化し、かつ高い比活性を有しギ酸
及びＮＡＤに対するＫｍ値の小さいギ酸脱水素酵素を生
産することを見出し本発明を完成するに至った。同時に
この酵素は、温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広く、菌
株の酵素生産性も高いことからその有用性が高いもので
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、下記の理化学的性質に特徴を有するギ酸脱水
素酵素である。

（１）作用適温の範囲 温度範囲：２５〜７０″Ｃ１至適温度＝５０〜６０℃（
２）作用ｐＨの範囲 ｐＨ範囲：５．０〜１１、至適ｐＨ：５．５〜８．０（
３）分子量 約１００，０００ （４）ギ酸に対するＫｍ値 ５．０ｍＭ （５）　ＮＡＤに対するＫｍ値 ０．０３６ｍＭ （６）温度安定性 温度：５０℃以下 （７）ｐＨ安定性 ｐＨ：４．ｏ〜１２．０ 更に、本発明はパラコッカス属に属し、ギ酸脱水素酵素
生産能を有する微生物、好ましくはギ酸を唯一の炭素源
として生育し得る微生物を培地中に培養し培養物中にギ
酸脱水素酵素を蓄積せしめ、この培養物からギ酸脱水素
酵素を採取することを特徴とするギ酸脱水素酵素の製造
方法である。

本発明において使用するパラコッカス属に属する微生物
は以下に詳述する如く、ギ酸を唯一の炭素源としてこれ
を資化することが好ましいが、ギ酸脱水素酵素を生産す
るものであればいずれでもよい。これらの具体的菌株と
して、例えばパラコッカス属１２−Ａ株によって代表さ
れるが、この他にもギ酸を唯一の炭素源としてこれを資
化しギ酸脱水素酵素を有するパラコツカス属細菌であれ
ば何れでも使用できる。

尚、本研究者が分離、採取した前記パラコッカス属１２
−Ａ株は既に微工研菌寄第１０８３５号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−１０８３５）として平成元年７月１１日付で工業技術
院微生物工業技術研究所へ寄託されており、その菌学的
性質は以下の通りである。

１、形態 １）直径０．８μｍＸ１．２μｍ程度の短桿菌。

２）ダラム染色：陰性。

３）運動性：なし。

４）芽胞形成能：なし。

■０次の各培地における生育状態 ■）肉汁寒天平板培養：光沢の無い白色の円形で平滑な
コロニーを形成する。

２）肉汁寒天斜面培地：糸状に生育する。

３）肉汁液体培養：表面に菌膜を生威し、培地に混濁を
生じる。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化せず。

５）リドマス・ミルク：変化せず。

■１次の生理学的性質 １）硝酸塩の還元：還元する。

２）脱窒反応：陽性。

３）ＭＲテスト：陰性。

４）ＶＰテスト：陰性。

５）インドールの生ｔｃ：生戒せず。

６）硫化水素の生成：生成せず。

７）デンプンの加水分解二分解せず。

８）クエン酸の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地およびＣｈｒ
ｉｓ　ｔｅｎｓｅｎの培地でのクエン酸の利用は認めら
れない。

９）無機窒素の利用 硝酸塩；利用する。

アンモニウム塩：利用する。

色素の生成：認められない。

ウレアーゼ：陰性。

オキシダーゼ：陽性。

カタラーゼ：陽性。

生育の範囲 ・温度：２５〜３０”Ｃ ｐＨニア、４〜８．５ 酸素に対する態度の好気性。

０−Ｆテスト：グルコースを分解しない。

下記の糖類からの酸およびガスの生成。

し−アラビノース：酸、ガスとも生成せず。

Ｄ−キシロース：酸、ガスとも生成せず。

Ｄ−グルコース：酸、ガスとも生成せず。

Ｄ−マンノース：酸、ガスとも生成せず。

Ｄ−フラクトース：酸、ガスとも生成せず。

Ｄ−ガラクトース：酸、ガスとも生成せず。

麦芽ｔｉ　：酸、ガスとも生成せず。

シーＩ糖：酸、ガスとも生成せず。

乳糖：酸、ガスとも生成せず。

トレハロース：酸、ガスとも生成せず。

ル）Ｄ−ソルビット：酸、ガスとも生成せず。

ヲ）Ｄ−マンニット；酸、ガスとも生成せず。

ワ）イノジット：酸、ガスとも生成せず。

力）グリセリン：酸、ガスとも生成せず。

３）デンプン：酸、ガスとも生成せず。

本発明の細菌によるギ酸脱水素酵素生産に使用する培地
としては、主炭素源としてのギ酸と窒素源、無機塩類を
各々適量に含有する培地ならば合成培地または天然培地
の何れでも使用できる。特にビタミン等の成長促進物質
を培地中に含有させる必要はないがこれを妨げるもので
はない。

本発明使用の細菌は、培地中のギ酸濃度が高くなると生
育速度が減少するため培地中のギ酸初濃度をできるだけ
低くしてギ酸の消費に合わせてギ酸を添加し、培養液中
のギ酸濃度を低く保ちながら培養する方法を取ることが
望ましい。窒素源としてはアンモニウム塩、尿素、コー
ン・ステイープ・リカー、酵母エキス、ペプトンなどの
窒素化合物が用いられる。また、そのほかの無機塩とし
ては例えばリン酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、
カルシウム塩、カリウム塩、硫酸塩、鉄塩、塩素などが
挙げられ、必要に応じてビタミン類などの生育促進物質
を添加してもよい。

本発明使用の細菌の培養条件は、培養温度２５〜３０℃
で生育可能であるがギ酸脱水素酵素の生成などの点から
２８〜３０℃が特に好ましい。また、ｐＨ７，４〜８．
５で生育可能であるが、ｐＨ７，４〜８．０が好ましい
。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれ
でも良い。

かくして得られた培地中のギ酸脱水素酵素は菌体外にも
蓄積するがおもに菌体内に生成蓄積されている。従って
ギ酸脱水素酵素を分離精製するには、培養終了後に培養
液から遠心分離などの手段によって菌体を集め、超音波
細胞破砕機などの手段により菌体を破砕して、ギ酸脱水
素酵素を菌体から緩衝液中に抽出し、粗ギ酸脱水素酵素
液を得、この粗ギ酸脱水素酵素液を精製することにより
ギ酸脱水素酵素を得る。

次に本発明の新規なギ酸脱水素酵素の理化学的性質を説
明する。

（１）作　用 ギ酸脱水素酵素は、ギ酸を酸化（脱水素）し炭酸を生成
する反応を触媒する。この反応の際同時に、ＮＡＤを還
元しＮＡＤＩ（を生成する。この反応は可逆反応である
が、中性付近ではＮＡＤＨ生戊側生成衡が偏っているた
め、Ｎ　Ａ　Ｄ　！（再生用酵素として優れた性質を持
っている。

（２）基質特異性 この酵素の基質特異性は厳密であって、正反応における
ギ酸もしくは逆反応における炭酸以外には作用しない。

（３）作用ｐＨ ｐＨ範囲：５．０〜１１．０、至適ｐＨ：５．５〜８．
０（４）ｐＨ安定性 ４．０〜１２．０ （５）力価の測定法 ギ酸酵素活性の測定はＮＡＤ　１ｍＭ、ギ酸すＩ−ＩＪ
ウム２４ｍＭ、メルカプトエタノール３０ｍＭ及びグリ
セリン０．５％を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（、ｐ　Ｈ
７，０）を用い、３０″ＣでのＮＡＤＨ生成に伴う３４
０ｎｍの吸光度の増加により行った。１分間に１μｍｏ
ｌｅのＮＡＯＨを生成する酵素量を１単位とした。

（６）作用温度の範囲 温度範囲＝２５〜７０℃１至適温度：５０〜６０“Ｃ（
７）温度安定性 ５０″Ｃ以下 （８）ｐ　Ｈ１温度などによる失活の条件６０″Ｃ，１
時間もしくは６５℃，５分間で完全に失活した。また、
ｐＨ３，０及びｐＨ１２，０において４℃で２４時間保
存した後でも、各々７２％、９１％の活性を保っており
、完全に失活させることはできなかった。

（９）阻害、活性化及び安定化 エチレンジアミン四酢酸（通常ＥＤＴＡと略、１ｍＭ）
　＋　α、α−ジピリヂル（１ｍＭ）、　　ｏ−フェナ
ンスロリン（１ｍＭ）などのキレート剤では阻害されな
カッタ。硝酸銀（０，０１ｍＭ）、　　塩化第二水ｖＡ
（０，０１ｍＭ）　＋　青酸カリ（０，１ｍＭ）、　ア
ジ化ナトリウム（０，１ｍＭ＞、　　ｐ−クロロマーキ
ュリベンゾエイト（通常ＰＣＭＢと略、１　ｍＭ）共存
下で活性を測定したところ完全に酵素活性が阻害された
。また、Ｎ−エチルマレイミド（１０ｎ＋Ｍ）、　　ヒ
ドロキシルアもン（１０ｍＭ）、モノヨード酢酸（１ｍ
Ｍ）では余り阻害を受けなかった。従って、本酵素の活
性発現には金属が関与せず、また特にＰＣＭＢにより強
く阻害されたことから、本酵素の活性発現にはＳＨ基が
関与していることが示唆される。

また、本酵素の活性発現に関して活性化剤や安定化剤を
酵素溶液に添加する必要性はなく、そのような活性を持
つ物質も見つかっていない。

一般に脱水素酵素類は酸素で失活する場合が多く、メル
カプトエタノールなどの還元剤を酵素液に加える場合が
多いが、本酵素については特に添加する必要はない。

ＯＩ精製方法 ギ酸脱水素酵素は塩析法、溶媒析出法、カラムクロマト
グラフィーなどによりギ酸脱水素酵素が精製されるが、
通常、細胞破砕後の粗酵素液に硫酸アンモニウムを３５
％飽和濃度になるように加え生じた沈澱画分を集め、３
０１１Ｍメルカプトエタノールを含有する１０ｎ＋Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０〉に溶解後、同緩衝液に対して
透析を行う。

これを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラ
ム（２６閣φＸ６００ｍｍ）に吸着させ、同緩衝液で洗
浄し、次いで３０ｍＭメルカプトエタノールを含有する
１００ｍＭリン酸緩衝液（’ｐＨ７，０）で溶出してき
たギ酸脱水素酵素活性画分を集め、精製酵素を得ること
ができる。

尚、ＮＡＤＨ再生用酵素として使用するならば精製途中
の段階のギ酸脱水素酵素を使用することも可能であるが
、使用しようとしている反応系の主反応を妨害するよう
な別の酵素活性が混在している場合はこれを除く必要が
ある。

（１１）分子量 約１００，０００ 本酵素の上記理化学的性質を従来公知のギ酸脱水素酵素
と比較し本酵素が新規なギ酸脱水素酵素であることを次
に説明する。

分子量による比較では、−Ｓに酵母由来のギ酸脱水素酵
素は７０，０００〜８４，０００また、最近由来のでは
シュードモナス・オキザラティカスの３１５．０００以
外は８０．０００〜９８，０００である。本酵素は１０
０．０００であり、酵母由来の酵素とは異なり、他の細
菌由来の酵素と似た分子量を持っている。

特に、モラキセラ属細菌の酵素とよく似た分子量を持っ
ている。また、シュードモナス・オキザラティカス以外
の本酵素を含めた他の微生物由来のギ酸脱水素酵素が同
一の分子量のサブユニット２個から戒るのに対し、シュ
ードモナス・オキザラティカスの酵素は分子量の異なる
２種類のサブユニット各２個ずつから成り、他の酵素と
は異なった構造をしている。実際、シュードモナス・オ
キザラティカスのギ酸脱水素酵素は色素依存性のギ酸脱
水素酵素とＮＡＤ脱水素酵素の複合体であり、他の酵素
とは全く異なるものである。シュードモナス・オキザラ
ティカスの酵素はギ酸に対するＫｍ値が非常に低く、ま
た比活性も非常に高いが〔従来の技術〕で述べたように
非常に酸素耐性が低く工業的には利用は難しい。

至適ｐＨにおいては本酵素は他の酵素に比べ酸性側に活
性の至適が少し偏っており、酸性側での反応に有利であ
る。またｐＨ安定性も他の酵素に比べて広い範囲で安定
であり、工業的応用の際には広い条件で利用することが
できる。

至適温度も一番高いが、温度安定性は他の酵素と変わら
ない。

比活性においては文献値ではシュードモナス・オキザラ
ティカス（４２，２５℃）、　　キャンデイダ・メチリ
カ（１６，３７℃）についで３番目に高い比活性を本酵
素（１１，６，３０″Ｃ）は持っており、アクロモバク
タ−・バーヴアラス（１１，０，３７’Ｃ）とほぼ同し
値であるが、一般に失活が起こらなければ測定温度が高
いほど酵素の活性は高いので３７℃の値を至適温度を調
べたグラフから計算すると１９．３になり２番目に高い
比活性を持つことになる。更に、本酵素以外のここに挙
げた３種類の微生物由来の酵素は何れも安定剤の存在な
しには不安定な酵素であり、工業的な利用は難しい。

ギ酸に対するＫｍ値はシュードモナス・オキザラティカ
ス（０，１３５）は別格にして、キャンデイダ・メタノ
リカ（３，０）、　　リボマイセス・メタノシルビエン
ス（３，６４）　と本酵素（５，０）は同程度に他の酵
素より一桁低い値を持っている。これに対し、ＮＡＤに
対するＫｍ値は本酵素（０，０３６）がモラキセラ属細
菌（０，０６８）やりボマイセス・メタノシルビエンス
（０，０７２）など他の酵素の軸値の半分以下の値を持
っている。このことから本酵素を酵素分析などに用いる
のに適した性質を持っている。

以上述べたように本酵素は従来公知のギ酸脱水素酵素と
は異なった性質を持ち、更にその性質の大部分が公知の
ギ酸脱水素酵素よりも優れたものであることが分かる。

次に実施例を示すことにより更に本発明のギ酸脱水素酵
素を詳細に説明する。

実施例１ 菌株の培養には、ギ酸を唯一の炭素源とした以下の組成
の培地を用いた。すなわち、ＨＣＯＯＨ１，０ｍｌ、　
　ＫＩＩｚｒ’Ｏｓ　７．Ｏｇ、　　（Ｎｌ１４）ｚｓ
Ｏ４２，Ｏｇ、　　Ｆｅ５Ｏｎ−７Ｈ，０２、Ｏｇ、　
　Ｍｇ５ｏ４４１１２ｏ　０．３ｇ、　　ＣａＣ１ｚ・
２ＨｚＯ０，１ｇ、ＮａＣ１０，Ｉｇ、微量金属溶液１
．ｏｍｉ＊蒸留水１０００Ｉｄを含有し、最終ｐＨをｐ
Ｈ’７．４に調整した。なおここで用いた微量金属溶液
は、１リツトル中にＨＪ（ｈ　０．３ｇ、　ＭｎＣ１ｚ
・４１１ｚ００．２ｇ’、　ＺｎＣ１ｚ　０．７５ｇ、
　Ｃｕ５Ｏ１５Ｈ２００，２ｇ、　ＦｅＣｌ１−６１１
ｚ０２．５ｇ、　（Ｎ１１４）ｂＭｏ＝Ｏｚａ−４１１
ｔＯＯ，１ｇ、　Ｃｏ５０ａ　４１１ｔｏ０．１５　ｇ
を含有するものである。この培地１０リツトル容ジャー
ファーメンタ−に、７リツトルを入れ、これにパラコツ
カス［１２−Ａ株（微工研菌寄第１０８３５号）の種培
養液１゜２リツトルを接種し、ｐＨ調整をしなから３０
℃で３０時間培養した。培養終了後、遠心分離で集菌し
た後、菌体を超音波破砕し、遠心上清にギ酸脱水素酵素
約２００００を含む菌体抽出液を得、これを粗酵素液と
した。この粗酵素液の蛋白質１■当たりの活性、即ち比
活性は１．８２０／ｍｇ蛋白質であった。

この菌体抽出液から硫安塩析、イオン交換クロマトグラ
フィーによって、電気泳動的に単一なバンドとなったギ
酸脱水素酵素約９０００を精製酵素標品として得た。こ
れは粗酵素液中に含まれたギ酸脱水素酵素活性の約半分
が効率良く精製酵素として得られたことを示す。精製の
結果、ギ酸脱水素酵素は約６．４倍に精製され、その比
活性ば１１．６ＬＩ／■蛋白質であった。

本実施例の結果は、本酵素がパラコツカス属１２Ａ株の
菌体内可溶性蛋白質の約１５％という高濃度で存在する
ことを意味し、このパラコツカス属１２−Ａ株の高い酵
素生産性を証明するものである。

実施例２ 実施例１で得られた精製ギ酸脱水素酵素（以下本酵素と
呼ぶ）の活性測定を異なるｐ　Ｈ（ｌ！で行い各ｐＨの
本酵素の活性を調べた。ｐＨ７，０での活性を１００と
した時の相対活性として表した。

反息痩旦１旦　　　　皿Ｚ引４ヒ性 ４．５４ ５．０２９ ５．５　　　　　　　　　　　　　９６６．０　　　　
　　　　　　　　　９８６．５　　　　　　　　　　　
　　１００７．０ ７．５ ８．０ ８．５ ９．０ ９．５ １０．０ １０．５ １１．０ １１．５ １２．０ これらの結果により本酵素の反応至適ｐＨは５．５〜８
．０で作用範囲はｐＨ５，０〜１１であることを示した
。

実施例３ ｐＨ７，０での本酵素の反応至適温度を調べた。５０℃
での活性を１００としたときの相対活性として表した。

反北４ｎし１ユ　　　　　　朋−封一活一圧０１８ ２５　　　　　　　　　　　　２４ ３０　　　　　　　　　　　　　３２ ３５　　　　　　　　　　　　４８ ４０　　　　　　　　　　　　６６ ４５　　　　　　　　　　　　８４ ５０　　　　　　　　　　　　　１００５５　　　　　
　　　　　　１００ ６０　　　　　　　　　　　　　９９ ６５　　　　　　　　　　　　８３ ７０　　　　　　　　　　　　２８ ７５　　　　　　　　　　　　　３ 本酵素至適温度は５０〜６０℃で作用範囲は２５〜７０
℃であった。

実施例４ 本酵素のｐＨ７，０の温度安定性を各温度で１時前処理
した酵素の残存活性を調べることにより検討した。

垂奥艷側虹Ｌ０江　　　残着ユ駄１１辻本酵素は５０℃
までは非常に安定であった。

実施例５ 本酵素のｐＨ安定性を各ｐＨで４℃２４時間前処理した
酵素の残存活性を調べることにより検討した。

剰」Ｌ理−り比　　　　残ヱ１ｕ１ｊ辻３．５　　　　
　　　　　７２ ４．０　　　　　　　　　９４ ４．５　　　　　　　　　９０ ５．０　　　　　　　　　９４ ５．５ ６．０ ６．５ ７．０ ７．５ ８．０ ８．５ ９．０ ９．５ １０．０ １０．５ １１．０ １１．５ １２．０ 本酵素はｐＨ４，０〜１２の範囲で安定であり、広いｐ
Ｈ範囲での利用が可能になることを示していた。

実施例６ 本酵素のギ酸及びＮＡＤに対するＫｍ値をギ酸及びＮＡ
Ｄの濃度と反応速度との関係から求めたところ、ギ酸に
対しては５．０ｍＭ、Ｎ　Ａ　Ｄ　ニ対シテハ０．０３
６ｍＭ　？！：非常に低いＫｍ値を持つことが明らかに
なり、ＮＡＤＩＩの再生用酵素として用いる際の優位性
が示された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質に特徴を有するギ酸脱水素酵素
   。 （１）作用温度の範囲 温度範囲：２５〜７０℃、至適温度：５０〜６０℃（２
   ）作用ｐＨの範囲 ｐＨ範囲：５．０〜１１、至適ｐＨ：５．５〜８．０（
   ３）分子量約１００，０００ （４）ギ酸に対するＫｍ値５．０ｍＨ （５）ＮＡＤに対するＫｍ値０．０３６ｍＭ （６）温度安定性温度：５０℃以下 （７）ｐＨ安定性ｐＨ：４．０〜１２．０ ２、パラコッカス属に属し、ギ酸脱水素酵素生産能を有
   する微生物を培地に培養し、培養物中にギ酸脱水素酵素
   を蓄積せしめ、該培養物からギ酸脱水素酵素を採取する
   ことを特徴とするギ酸脱水素酵素の製造方法。 ３、ギ酸脱水素酵素が下記の理化学的性質を特徴とする
   ものであることを特徴とする請求項２記載のギ酸脱水素
   酵素の製造方法。 （１）作用温度の範囲 温度範囲：２５〜７０℃、至適温度：５０〜６０℃（２
   ）作用ｐＨの範囲 ｐＨ範囲：５．０〜１１、至適ｐＨ：５．５〜８．０（
   ３）分子量約１００，０００ （４）ギ酸に対するＫｍ値５．０ｍＭ （５）ＮＡＤに対するＫｍ値０．０３６ｍＭ （６）温度安定性温度：５０℃以下 （７）ｐＨ安定性ｐＨ：４．０〜１２．０ ４、パラコッカス属に属し、ギ酸脱水素酵素生産能を有
   する微生物がギ酸を唯一の炭素源として生育し得る微生
   物であることを特徴とする請求項２または３記載のギ酸
   脱水素酵素の製造方法。