JPH02107186A - Nadhオキシダーゼの製造法 - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
(以下、NADHと略す)を酸化して過酸化水素又は水
を生成する酵素反応に関与するNADHオキシダーゼを
微生物を用いて製造する方法に関するものであり、本発
明の方法によれば、活性の安定なNADHオキシダーゼ
を効率よく製造する二とができる。
(以下、NADHと略す)を酸化して過酸化水素又は水
を生成する酵素反応に関与するNADHオキシダーゼを
微生物を用いて製造する方法に関するものであり、本発
明の方法によれば、活性の安定なNADHオキシダーゼ
を効率よく製造する二とができる。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NAD
と略す)は、生体内で行われる種々の脱水素酵素反応の
補酵素であり、それらの酵素の中には工業的に有用な光
学活性化合物、反応中間体等の製造に好適に用いうるち
のが少なくない。目的とする酵素を反応素子として酵素
リアクターに用いる場合、反応当量のNADを使用する
ことは高価なNADを使い捨てにすることになり実用的
方法とはなりえない。従って、反応系に投入するNAD
量を反応当量より減少し、生成したNAI)Hを系内で
再生する必要がある。再生方法としては酵素的方法及び
化学的方法が知られているが、種々の欠点を有している
[ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー(J ournaL 6fA merican
Chemical S ociety)、107巻
、第6999−7008ページ、■985年等参照1゜
例えば、再生反応速度の低さ、再生応用に用いた基質−
生成物と目的反応の生成物の分離、再生反応基質の価格
等の問題がある。これらの問題のいくつかは分子状酸素
を直接の電子受容体としてNADHを酸化することによ
り解決することができる。N A D Hオキシダーゼ
はNADHを分子状酸素を用いて酸化しN’ADを再生
するのに有用な酵素である。
と略す)は、生体内で行われる種々の脱水素酵素反応の
補酵素であり、それらの酵素の中には工業的に有用な光
学活性化合物、反応中間体等の製造に好適に用いうるち
のが少なくない。目的とする酵素を反応素子として酵素
リアクターに用いる場合、反応当量のNADを使用する
ことは高価なNADを使い捨てにすることになり実用的
方法とはなりえない。従って、反応系に投入するNAD
量を反応当量より減少し、生成したNAI)Hを系内で
再生する必要がある。再生方法としては酵素的方法及び
化学的方法が知られているが、種々の欠点を有している
[ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー(J ournaL 6fA merican
Chemical S ociety)、107巻
、第6999−7008ページ、■985年等参照1゜
例えば、再生反応速度の低さ、再生応用に用いた基質−
生成物と目的反応の生成物の分離、再生反応基質の価格
等の問題がある。これらの問題のいくつかは分子状酸素
を直接の電子受容体としてNADHを酸化することによ
り解決することができる。N A D Hオキシダーゼ
はNADHを分子状酸素を用いて酸化しN’ADを再生
するのに有用な酵素である。
従来の技術
従来より分子状酵素を電子受容体としてNADHを酸化
するNADHオキシダーゼとしては、ラクトバチルス・
プランタラム(Lactobacillusplant
arum)由来のもの[アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー(Agricaltur
al and B iological Che
mistry) 25巻、第876ページ、1961年
1、ストレプトコッカス・7アエカリス(S trep
tococcus faecalis)由来のもの[
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミメトリー(J
ouranl of B iological
Chemistry) 、237巻、第2647ペー
ジ、1962年1、アコレプラズマ・ライドラライ(A
choleplasma Iaidlawi i)
由来のもの[ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー(E uropean J ouran
l of B iochemistry)、120
巻、第329ページ、1981年]、バチルス・メガテ
リウム(Bacillus megaLerium)
由来のもの[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(
Journal of Biochemistry
) 、98巻、第1433ページ、1985年1、ロイ
コノストック會メセンテロイデス(L euconos
toc mesenteroides)由来のもの[
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J oura
nl of B iochemistry)、97
巻、第1279ページ、1985年]等が報告されてい
る。
するNADHオキシダーゼとしては、ラクトバチルス・
プランタラム(Lactobacillusplant
arum)由来のもの[アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー(Agricaltur
al and B iological Che
mistry) 25巻、第876ページ、1961年
1、ストレプトコッカス・7アエカリス(S trep
tococcus faecalis)由来のもの[
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミメトリー(J
ouranl of B iological
Chemistry) 、237巻、第2647ペー
ジ、1962年1、アコレプラズマ・ライドラライ(A
choleplasma Iaidlawi i)
由来のもの[ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー(E uropean J ouran
l of B iochemistry)、120
巻、第329ページ、1981年]、バチルス・メガテ
リウム(Bacillus megaLerium)
由来のもの[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(
Journal of Biochemistry
) 、98巻、第1433ページ、1985年1、ロイ
コノストック會メセンテロイデス(L euconos
toc mesenteroides)由来のもの[
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J oura
nl of B iochemistry)、97
巻、第1279ページ、1985年]等が報告されてい
る。
しかしながら、これらの技術知られいるNAD14オキ
シダーゼは、該微生物の培養がむずかしく大量調製が困
難である(アコレプラズマ・ライドラライ等)、菌体内
膜画分に存在するため大量調製がむずかしく、さらに菌
体内含量の向上に困難である(バチルス・メガテリウム
等)、熱安定性が弱く、長期にわたる活性の保持を期待
しえない(ロイコノストック・メセンテロイデス等)等
の欠点を有している。
シダーゼは、該微生物の培養がむずかしく大量調製が困
難である(アコレプラズマ・ライドラライ等)、菌体内
膜画分に存在するため大量調製がむずかしく、さらに菌
体内含量の向上に困難である(バチルス・メガテリウム
等)、熱安定性が弱く、長期にわたる活性の保持を期待
しえない(ロイコノストック・メセンテロイデス等)等
の欠点を有している。
本発明者らは、工業的生産に適したNADHオキシダー
ゼについて広く検索した結果、アルカリ性領域に至適生
育pHををする通性嫌気性細菌が、温度安定性にすぐれ
たNADHオキシダーゼを生産することを見出し本発明
を完成するに到った。
ゼについて広く検索した結果、アルカリ性領域に至適生
育pHををする通性嫌気性細菌が、温度安定性にすぐれ
たNADHオキシダーゼを生産することを見出し本発明
を完成するに到った。
なお、本発明において1通性嫌気性菌」とは、嫌気性菌
のうち酸素の存在下でも非存在下でも生育しうるものを
いう。
のうち酸素の存在下でも非存在下でも生育しうるものを
いう。
発明の要旨
本発明によれば、アルカリ性領域に至適生育pHを有す
る通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌を嫌気的又
は好気的に培地で培養し、該培養物よりNADHオキシ
ダーゼを採取することを特徴とするNADHオキシダー
ゼの製造法が提供される。
る通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌を嫌気的又
は好気的に培地で培養し、該培養物よりNADHオキシ
ダーゼを採取することを特徴とするNADHオキシダー
ゼの製造法が提供される。
発明の詳細な説明
本発明に使用する、NADHオキシダーゼ生産菌株は、
好アルカリ性通性嫌気性細菌に属し、NADHオキシダ
ーゼ生産能を有するものであればいかなる菌株でもよく
、またこれらの変異株であってもよい。そして、これら
の性質を有する菌株の好適具体例としては、例えば、ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー(A gricaltural and B
iological Chemistry)第51巻
、第2271〜2275ページ(1987)に記載され
ているEpO1株があげられる。
好アルカリ性通性嫌気性細菌に属し、NADHオキシダ
ーゼ生産能を有するものであればいかなる菌株でもよく
、またこれらの変異株であってもよい。そして、これら
の性質を有する菌株の好適具体例としては、例えば、ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー(A gricaltural and B
iological Chemistry)第51巻
、第2271〜2275ページ(1987)に記載され
ているEpO1株があげられる。
本菌株はアルカリ性にpHを調節した堆肥に集積、分離
されたものであり、同文献によれば次のような菌学的性
質を有するものである。
されたものであり、同文献によれば次のような菌学的性
質を有するものである。
(1) 形態
(a) 細胞の形及び大きさ:桿菌、(0,3〜0゜
6)X (1,5〜2.5)pm (b) 多形性の有無:無 (c) 運動性:なし くd) 胞子:耐熱性胞子あり (e) ダラム染色:培養のごく初期には陽性(f)
抗酸性:陰性 (2)各培地における生育 (a) 肉汁寒天培地:生育せず (b)ゼラチン:液化せず (3)生理学的性質 (a) 生育の範囲:pH7,0で生育せず、pH8
。
6)X (1,5〜2.5)pm (b) 多形性の有無:無 (c) 運動性:なし くd) 胞子:耐熱性胞子あり (e) ダラム染色:培養のごく初期には陽性(f)
抗酸性:陰性 (2)各培地における生育 (a) 肉汁寒天培地:生育せず (b)ゼラチン:液化せず (3)生理学的性質 (a) 生育の範囲:pH7,0で生育せず、pH8
。
5〜1O00を至適とする。
40℃付近を至適とする。
(b) オキシダーゼ:陰性
(c) カタラーゼ:陰性
(d) 発酵可能な糖=D−キシロース、D−アラビ
ノース、D−リポース、D−グリコース、D−マンノー
ス、D−フルクトース、アミフタリン、エスクリン、サ
リシン、マルトース、サッカロース、セロビオース、ト
レハロース、可溶性でン粉、ペクチン、キシラン (e)3%食塩存在下で生育 (4)その他の性質 (a) 細胞壁成分:メソジアミノピメリン酸含有 (b) チトクローム:チトクロームa、 b、 c
、 dを含有せず。
ノース、D−リポース、D−グリコース、D−マンノー
ス、D−フルクトース、アミフタリン、エスクリン、サ
リシン、マルトース、サッカロース、セロビオース、ト
レハロース、可溶性でン粉、ペクチン、キシラン (e)3%食塩存在下で生育 (4)その他の性質 (a) 細胞壁成分:メソジアミノピメリン酸含有 (b) チトクローム:チトクロームa、 b、 c
、 dを含有せず。
(C) キノン:メナキノン、ユビキノン含有せず。
(d)DNA中グアニン、シトシン含有(GC含量)
35.9%(e) 細胞脂肪酸
組成:アンティン 23.7%(嫌気培養時) イ
ソブランチ135.4%直鎖 37.2% (g) 嫌気及び好気培養時にキシラナーゼを生成。
35.9%(e) 細胞脂肪酸
組成:アンティン 23.7%(嫌気培養時) イ
ソブランチ135.4%直鎖 37.2% (g) 嫌気及び好気培養時にキシラナーゼを生成。
以上の諸性質を「バーシーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティク・バクテリオロジー(B ergey s
Manual or Systematic B
acteriology)J第2巻(1986年)より
検索した。好アルカリ性バチルス属(Bacillus
)とは、ダラム染色陽性、胞子形成、好気での生育、多
様な炭水化物への生育等、性質を同じくするものが多い
が、カタラーゼ陰性、運動性陰性、肉汁寒天での生育を
示さない等の性質を異にする。チトクロム、キノンを含
まないこともバチルス属への帰属を示さない。
テマティク・バクテリオロジー(B ergey s
Manual or Systematic B
acteriology)J第2巻(1986年)より
検索した。好アルカリ性バチルス属(Bacillus
)とは、ダラム染色陽性、胞子形成、好気での生育、多
様な炭水化物への生育等、性質を同じくするものが多い
が、カタラーゼ陰性、運動性陰性、肉汁寒天での生育を
示さない等の性質を異にする。チトクロム、キノンを含
まないこともバチルス属への帰属を示さない。
クロスリジウム属(Clostridium)とも菌体
脂肪酸組成、好気での生育等合致しない点かあり、これ
ら既存の属には帰属されない新菌株の可能性がある。従
って、本発明においては未同定菌EpO1株とのみ称呼
することとする。なお、本菌株は工業技術院微生物工業
技術研究所に微生物受託番号 微工研菌寄@10096
号(FERMP−10096)として寄託されている。
脂肪酸組成、好気での生育等合致しない点かあり、これ
ら既存の属には帰属されない新菌株の可能性がある。従
って、本発明においては未同定菌EpO1株とのみ称呼
することとする。なお、本菌株は工業技術院微生物工業
技術研究所に微生物受託番号 微工研菌寄@10096
号(FERMP−10096)として寄託されている。
本発明に使用する微生物菌体の培養に使用しうる培地の
栄養源である窒素源としては、例えは、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
等の無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いるこ
とができる。また、無機塩金属塩としては、例えばリン
酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等が
用いられる。以上のような無機栄養源の他に、コーンス
テイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源
を加えてもよい。さらに、炭素源として例えば、グルコ
ース、キシロース、マンノース、フルクトース、アルド
ース、シュークロース、セロビオース、キシラン等を培
地に添加することができる。
栄養源である窒素源としては、例えは、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
等の無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いるこ
とができる。また、無機塩金属塩としては、例えばリン
酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等が
用いられる。以上のような無機栄養源の他に、コーンス
テイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源
を加えてもよい。さらに、炭素源として例えば、グルコ
ース、キシロース、マンノース、フルクトース、アルド
ース、シュークロース、セロビオース、キシラン等を培
地に添加することができる。
前述したN A D Hオキシダーゼ生産菌を上記の如
き組成の培地で培養するにあたり、培養温度は通常約2
0〜約50°C1好ましくは約35〜約45°Cの範囲
内で適当である。また、培養中のpHは約pH7,5以
上のアルカリ性領域であれば厳密に限定されるものでは
ないが、一般には8〜10゜5、好ましくは8.5〜1
0.0の範囲内とするものが有利である。培養中のpH
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸すトリウム等のアルカリを培地に添加することにより
至適範囲内となるよう調整するのが好都合である。培養
時間は通常3〜24時間、好ましくは5〜20時間程度
とすることができる。培養は通気撹拌、振盪等の好気的
条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条件下
で行ってもよい。
き組成の培地で培養するにあたり、培養温度は通常約2
0〜約50°C1好ましくは約35〜約45°Cの範囲
内で適当である。また、培養中のpHは約pH7,5以
上のアルカリ性領域であれば厳密に限定されるものでは
ないが、一般には8〜10゜5、好ましくは8.5〜1
0.0の範囲内とするものが有利である。培養中のpH
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸すトリウム等のアルカリを培地に添加することにより
至適範囲内となるよう調整するのが好都合である。培養
時間は通常3〜24時間、好ましくは5〜20時間程度
とすることができる。培養は通気撹拌、振盪等の好気的
条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条件下
で行ってもよい。
嫌気的条件下での培養を行う場合には、還元銅カラムで
酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス
、又はそれらの混合物等の酸素不含ガス雰囲気や、培地
の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育を容易にす
るチタニウム(III)クエン酸、ジチオナイト等の還
元剤の添加等、偏性嫌気性菌の培養に際し通常用いられ
る手法[例えば山里、宇田用、児玉、森地編、[微生物
の分離法J R&Dプランニング(1986年刊)24
6〜274頁、等参照1の中から、本菌の生育至適とす
るアルカリ性領域において効力を有し、かつ本菌の生育
に悪影響を及ぼさない条件であれば、それを適用するこ
とができる。
酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス
、又はそれらの混合物等の酸素不含ガス雰囲気や、培地
の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育を容易にす
るチタニウム(III)クエン酸、ジチオナイト等の還
元剤の添加等、偏性嫌気性菌の培養に際し通常用いられ
る手法[例えば山里、宇田用、児玉、森地編、[微生物
の分離法J R&Dプランニング(1986年刊)24
6〜274頁、等参照1の中から、本菌の生育至適とす
るアルカリ性領域において効力を有し、かつ本菌の生育
に悪影響を及ぼさない条件であれば、それを適用するこ
とができる。
さらに、菌体取得にいたるまでの培養はその全段階を嫌
気条件下又は好気条件下の一条件下でのみ行う必要はな
く、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あるいは好気
条件から嫌気条件に変更することにより、両者の条件を
組み合わせて培養するのもまた好ましい方法である。
気条件下又は好気条件下の一条件下でのみ行う必要はな
く、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あるいは好気
条件から嫌気条件に変更することにより、両者の条件を
組み合わせて培養するのもまた好ましい方法である。
かくして培養される菌体は、NADHオキシダーゼをそ
の菌体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波
処理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段
にて破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交
換クロマトグラフィ、ゲル濾過等のそれ自体公知の分離
、精製方法[例えば日本生化学会場 生化学実験講座第
1巻「タンパク質の化学■分離精製」東京化学同人刊、
1〜334頁;掘尾武−1山下仁平編「蛋白質・酵素の
基礎実験法」南江堂刊1〜379頁等参照](1)作用
:本酵素は以下の反応式で示される如<NADHを酸化
してNADと過酸化水素を生成する。
の菌体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波
処理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段
にて破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交
換クロマトグラフィ、ゲル濾過等のそれ自体公知の分離
、精製方法[例えば日本生化学会場 生化学実験講座第
1巻「タンパク質の化学■分離精製」東京化学同人刊、
1〜334頁;掘尾武−1山下仁平編「蛋白質・酵素の
基礎実験法」南江堂刊1〜379頁等参照](1)作用
:本酵素は以下の反応式で示される如<NADHを酸化
してNADと過酸化水素を生成する。
NADH+H”+O,−シN A D ”+ H202
(2)至適pHニリン酸緩衝液、Tris緩衝液、炭酸
緩衝液を用いて測定したところ、本酵素は7゜0付近に
至適pHを有していた(添付の第1図参照)。
(2)至適pHニリン酸緩衝液、Tris緩衝液、炭酸
緩衝液を用いて測定したところ、本酵素は7゜0付近に
至適pHを有していた(添付の第1図参照)。
(3)至適温度及び熱安定性ニリン酸緩衝液(pH7,
0)を用いて測定したところ、本酵素は約37°Cに至
適温度を有していた(添付の第2図参照)。
0)を用いて測定したところ、本酵素は約37°Cに至
適温度を有していた(添付の第2図参照)。
(4)温度安定性二本酵素を上記(3)にて用いたと同
じ緩衝液に懸濁し37°Cにて保存し活性の温度安定性
を調べたところ、100時間経過後も0時間におけると
略々間等の活性を有していた。
じ緩衝液に懸濁し37°Cにて保存し活性の温度安定性
を調べたところ、100時間経過後も0時間におけると
略々間等の活性を有していた。
一方、既に知られているロイコノストック・メセンテロ
イデス(Louconostoc Meserter
oides)は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(J ournal of B iochemi
stry)第97巻、1285頁(+985)の第7B
図に記載されているごとく、30°Cでは60分後も活
性を保つものの、40°Cでは約60%、50°Cでは
0%に活性が低下し、安定性が劣ることがわかる。
イデス(Louconostoc Meserter
oides)は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(J ournal of B iochemi
stry)第97巻、1285頁(+985)の第7B
図に記載されているごとく、30°Cでは60分後も活
性を保つものの、40°Cでは約60%、50°Cでは
0%に活性が低下し、安定性が劣ることがわかる。
(5)−両隣イオンの要求:無細胞菌体抽出液を5Qm
M Tris緩衝液にて透析して得た酵素液のNAD
Hオキシダーゼ活性を100とした場合、該酵素液に2
0mM濃度となるようにに+、Na”、N H、+を添
加したときの活性はそれぞれ、310.180.310
であった。
M Tris緩衝液にて透析して得た酵素液のNAD
Hオキシダーゼ活性を100とした場合、該酵素液に2
0mM濃度となるようにに+、Na”、N H、+を添
加したときの活性はそれぞれ、310.180.310
であった。
(6)NADHオキンダーゼは無細胞抽出液を100.
000Xgで1時間超遠心処理した上溝画分に存在する
。
000Xgで1時間超遠心処理した上溝画分に存在する
。
なお、本酵素の定性的分析は、N A D )Iの34
0nmの吸光の減少もしくはN A D H共存時の酸
素の吸収を酸素電極又はマノメーターにより観測するこ
とにより行なった。また、本酵素の活性測定は次のよう
に行うことができる。すなわち、50mM緩衝液1.9
m(2,酵素液Q、Q5mf2からなる反応液を指定す
る温度にて予め保持した後、5mMNADH0,05m
Qを加え反応を開始し、340nmにおける吸光の減少
を測定する。酵素活性は1分間に1μmobのNADH
を酸化する酵素量を1単位とした。
0nmの吸光の減少もしくはN A D H共存時の酸
素の吸収を酸素電極又はマノメーターにより観測するこ
とにより行なった。また、本酵素の活性測定は次のよう
に行うことができる。すなわち、50mM緩衝液1.9
m(2,酵素液Q、Q5mf2からなる反応液を指定す
る温度にて予め保持した後、5mMNADH0,05m
Qを加え反応を開始し、340nmにおける吸光の減少
を測定する。酵素活性は1分間に1μmobのNADH
を酸化する酵素量を1単位とした。
発明の効果
以上に述べた本発明によれば、アルカリ性領域に至適生
育pHを有するNADHオキシダーゼ生産菌を使用する
ため、培養時に雑菌汚染の恐れの少ないNADHオキシ
ダーゼ生産菌から、温度安定性等の優れたN A D
Hオキシダーゼを容易に生産することができる。
育pHを有するNADHオキシダーゼ生産菌を使用する
ため、培養時に雑菌汚染の恐れの少ないNADHオキシ
ダーゼ生産菌から、温度安定性等の優れたN A D
Hオキシダーゼを容易に生産することができる。
実施例
次に実施例をあげて本発明のNADHオキシダーゼの製
造法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施
例に何ら限定されるものではない。
造法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施
例に何ら限定されるものではない。
実施例1
K2HPO41g、硝酸アンモニウム2g、Mg5Q、
・7H20200mg1Mn5O,・7H7H2O5,
Fe50.・7Hz0 5mg、CaCu5・2Hz0
700mg、酵母エキス3gsポリペプトン300m
g、キシランlOg及びレサズリン1mgを蒸留水9Q
Qm(2に溶解し、90m4ずつloomQ容血清ビン
に分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して調製
した無酸素窒素ガスを通気後ブチルゴム栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ120℃15分殺菌を行なった。
・7H20200mg1Mn5O,・7H7H2O5,
Fe50.・7Hz0 5mg、CaCu5・2Hz0
700mg、酵母エキス3gsポリペプトン300m
g、キシランlOg及びレサズリン1mgを蒸留水9Q
Qm(2に溶解し、90m4ずつloomQ容血清ビン
に分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して調製
した無酸素窒素ガスを通気後ブチルゴム栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ120℃15分殺菌を行なった。
この培地に120°C115分減菌済みの10%炭酸ナ
トリウム水溶液(pH10,6)をlomQ添加し、培
地のpH1!1−10とした。さらに、還元剤としてサ
イエンス(S cience)第194巻1165−1
166頁記載のA。
トリウム水溶液(pH10,6)をlomQ添加し、培
地のpH1!1−10とした。さらに、還元剤としてサ
イエンス(S cience)第194巻1165−1
166頁記載のA。
J 、 B 、 Z ehnder & K 、W
uhrmannらの方法に準じて調製したチタニウム(
III)クエン酸溶液を最終濃度0.13mMとなるよ
うに添加した。本培地に好アルカリ性菌EpO1株(微
工研菌寄第10096号)を接種し、40°Cl2O時
間静置培養を行なったものを種培養液とした。
uhrmannらの方法に準じて調製したチタニウム(
III)クエン酸溶液を最終濃度0.13mMとなるよ
うに添加した。本培地に好アルカリ性菌EpO1株(微
工研菌寄第10096号)を接種し、40°Cl2O時
間静置培養を行なったものを種培養液とした。
キシランlOgをグルコース]Ogに変えた他は同組成
の培地450m4を500mQ容血清ビンに分注し、同
様の操作を行ない120°C115分殺菌後、lO%炭
酸ナトリウム水溶液50mLチタニウム(In)クエン
酸溶液を最終濃度0.13mMとなるように添加した。
の培地450m4を500mQ容血清ビンに分注し、同
様の操作を行ない120°C115分殺菌後、lO%炭
酸ナトリウム水溶液50mLチタニウム(In)クエン
酸溶液を最終濃度0.13mMとなるように添加した。
前記種培養液10m12を接種し、40°C124時間
静置培養した。培養終了後培養液100mQを、1.0
00xg、20分遠心し得られた菌体を50 mM
T ris塩酸緩衝液に懸濁後、遠伸集菌し洗浄菌体を
得た。この菌体を同上緩衝液5mQに懸濁後、超音波処
理により菌体を破壊し、遠心分離して得られた上澄を粗
酵素液とし、NADHオキシダーゼ活性を測定したとこ
ろ、0゜25単位1m(2であった(1単位は1分間に
1μm。
静置培養した。培養終了後培養液100mQを、1.0
00xg、20分遠心し得られた菌体を50 mM
T ris塩酸緩衝液に懸濁後、遠伸集菌し洗浄菌体を
得た。この菌体を同上緩衝液5mQに懸濁後、超音波処
理により菌体を破壊し、遠心分離して得られた上澄を粗
酵素液とし、NADHオキシダーゼ活性を測定したとこ
ろ、0゜25単位1m(2であった(1単位は1分間に
1μm。
leのN A D l−1を酸化する酵素量を示す)。
実施例2
キンランlogの代わりにグルコースlogを、さらに
レサズリン奈含有しない他は実施例1に記述したと同じ
培地90mQを500m4容三角フラスコに分注し12
0°C115分殺菌する。別途加熱滅菌した10%炭酸
ナトリウム水溶液を添加し、pHを10に調製したのち
、実施例1記載の種培養液5mCを接種し、30℃、2
0時間振盪培養を行なった。培養終了後、培養液100
m12より遠心分離して得られた菌体を5m12の5Q
mM)リス塩酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕し、遠心分
離して得られた上澄を粗酵素液とした。その活性は01
18単位1mQであった。
レサズリン奈含有しない他は実施例1に記述したと同じ
培地90mQを500m4容三角フラスコに分注し12
0°C115分殺菌する。別途加熱滅菌した10%炭酸
ナトリウム水溶液を添加し、pHを10に調製したのち
、実施例1記載の種培養液5mCを接種し、30℃、2
0時間振盪培養を行なった。培養終了後、培養液100
m12より遠心分離して得られた菌体を5m12の5Q
mM)リス塩酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕し、遠心分
離して得られた上澄を粗酵素液とした。その活性は01
18単位1mQであった。
第1図は本発明により得られるNADHオキンダーゼの
至適pHを示すグラフであり、第2図は本発明により得
られるl’J A D Hオキシダーゼの至適温度を示
すグラフである。 H 差戻 (0C)
至適pHを示すグラフであり、第2図は本発明により得
られるl’J A D Hオキシダーゼの至適温度を示
すグラフである。 H 差戻 (0C)
Claims (1)
- アルカリ性領域に至適生育pHを有する通性嫌気性のN
ADHオキシダーゼ生産菌を培地で培養し、培養物より
NADHオキシダーゼを採取することを特徴とするNA
DHオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25737488A JP2768473B2 (ja) | 1988-10-14 | 1988-10-14 | Nadhオキシダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25737488A JP2768473B2 (ja) | 1988-10-14 | 1988-10-14 | Nadhオキシダーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02107186A true JPH02107186A (ja) | 1990-04-19 |
JP2768473B2 JP2768473B2 (ja) | 1998-06-25 |
Family
ID=17305502
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25737488A Expired - Lifetime JP2768473B2 (ja) | 1988-10-14 | 1988-10-14 | Nadhオキシダーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2768473B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008092832A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Keio Gijuku | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ |
WO2009091054A1 (ja) | 2008-01-17 | 2009-07-23 | Keio University | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ及びそれをコードするdna |
-
1988
- 1988-10-14 JP JP25737488A patent/JP2768473B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008092832A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Keio Gijuku | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ |
WO2009091054A1 (ja) | 2008-01-17 | 2009-07-23 | Keio University | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ及びそれをコードするdna |
US8546113B2 (en) | 2008-01-17 | 2013-10-01 | Keio University | Hydrogen peroxide-forming NADH oxidase and DNA encoding the same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2768473B2 (ja) | 1998-06-25 |
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