JPH0364107B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、例えばトリプトフアン
（tryptophan）の工業的合成などの用途に有用な
従来公知文献未記載の耐熱性トリプトフアナーゼ
（tryptophana−se）、その醗酵法による製法及び
その製法に利用する従来公知文献未記載の耐熱性
トリプトフアナーゼ生産性微生物に関する。 更に詳しくは、本発明は、その耐熱性特性にお
いて従来公知のトリプトフアナーゼと明瞭に区別
される耐熱性トリプトフアナーゼ、特に、約70℃
（PH＝8.0）に作用至適温度を有し且つ約65℃（PH
＝8.0、保持時間40分）までは熱失活しない耐熱
特性を有することを特徴とする新規な耐熱性トリ
プトフアナーゼに関する。 本発明はまた、この新規耐熱性トリプトフアナ
ーゼの醗酵法による製法及びこの製法の実施に使
用するのに適した新規な耐熱性トリプトフアナー
ゼ生産性微生物にも関し、とくに、トリプトフア
ン含有合成培地において単独では生育しないが、
バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain
Ｓ）との共生により生育する従来完全に未知の耐
熱性トリプトフアナーゼ生産性桿菌、及び該桿菌
を培養し培養物から耐熱性トリプトフアナーゼを
採取することを特徴とする耐熱性トリプトフアナ
ーゼの製法にも関する。 従来、トリプトフアナーゼは、ピリドキサール
リン酸（PLP）の関与のもとに、Ｌ−トリプト
フアンからピルビン酸、インドール、アンモニア
を生成するα，β脱離反応を触媒する反応の他
に、たとえばインドールとＬ−セリンからＬ−ト
リプトフアンを合成する反応、すなわち上記反応
とは逆反応のβ置換反応も触媒する酵素として知
られており、たとえばエシエリキア・コリ
（Escheri−chia coli）、アイロモナス・リクイフ
アシエンス（Aeromonas liquefaciens）、プロテ
ウス・レトゲリ（Proteus rettgeri）などの如き
腸内細菌群を中心とする微生物から見出されてい
る公知酵素である。 このような従来公知のトリプトフアナーゼは、
約33〜35℃（PH＝8.0）付近に作用至適温度を有
し且つ約40℃（PH＝8.0、保持時間40分）以上で
は実質的に熱失活する酵素特性を有する酵素であ
るため、その利用に際し、反応温度、熱安定性な
どの耐熱性の点で著しい制約を受けるという技術
的難点があつた。 本発明者等は、上述の技術的難点を克服したト
リプトフアナーゼを創製すべき研空を行つてき
た。 その結果、本発明者等の試験したかぎり、天然
培地及びトリプトフアン含有合成培地のいずれに
おいても単独では生育しないが、バチルス・エス
ピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain Ｓ）との共生に
より生育する従来完全に未知で且つ如何なる公知
文献にも未記載の特異な生育特性を有するトリプ
トフアナーゼ生産性桿菌を土壌試験より分離採取
することに成功し、且つ該新規桿菌が約70℃（PH
＝8.0）に作用至適温度を有し且つ約65℃（PH＝
8.0、保持時間40分）までは熱失活しない熱安定
性を示す点で、公知トリプトフアナーゼとは全く
別異の新規酵素である本発明に称する耐熱性トリ
プトフアナーゼを産生することを発見した。 本発明者等の研究によれば、本発明において耐
熱生トリプトフアナーゼと呼称する該新規トリプ
トフアナーゼを生産する親桿菌は、本発明者等の
試みたかぎり、公知の如何なる微生物用培地にお
いても単独では生育しないが、上記バチルス・エ
スピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain Ｓ）との共存
下に、例えば、リン酸塩でPH調節したトリプトフ
アン含有合成液体培地において、弱い撹拌条件下
もしくは静置条件下で約58〜約63℃の温度で活発
に増殖生育し、酵素活性の強い混合培養物を与え
ることが発見された。 更に又、本発明者等の研究によれば、該バチル
ス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain Ｓ）
は、胞子を形成するバチルス（Bacillus）属に属
し、一般細菌用培地を用いて純粋培養可能な新菌
株であつて、 ()′インドール生成（−） ()′硝酸還元（−） の生理学的性質を示し、トリプトフアン含有合成
培地において、単独でも、また前記耐熱性トリプ
トフアナーゼ生産性桿菌との共生条件において
も、トリプトフアナーゼ生産能を示さない新菌株
であることがわかつた。 従つて、本発明の目的は新規な耐熱生トリプト
フアナーゼ及びその製法を提供するにある。 本発明の他の目的は上記耐熱生トリプトフアナ
ーゼ生産性桿菌を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 本発明の新桿菌であるトリプトフアン含有合成
培地において単独では生育しないが、バチルス・
エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain Ｓ）との共
生により生育して、菌体内に耐熱生トリプトフア
ナーゼを生育蓄積する耐熱性トリプトフアナーゼ
生産性桿菌は、温泉、堆肥などの高温環境由来の
土壌試料から分離採取された。 以下、その分離採取法について述べる。 リン酸塩でPH調節したトリプトフアナーゼ誘導
体培地である後記するTrp−PEP液体培地に、温
泉、堆肥など高温環境由来の土壌試料を入れ、Ｌ
型試験管を用いて約60°〜70℃で振盪培養を行な
い、Kovac′s試薬によるインドール検出によつて
インドールの生成が検出された試料培養物をトリ
プトフアナーゼ生産菌として分離する。斯くて、
分離採取できる約60℃で生育するトリプトフアナ
ーゼ生産菌を、希釈法、更に、バシトラシン
（Bacitracin）に対する耐性を利用して純化した
トリプトフアナーゼ生産菌を得ることができる。 得られたトリプトフアナーゼ生産菌を、常法に
従つて、寒天固体培養によるコロニー分離を試み
たが、試験したすべての種類の寒天固体培地にお
いてコロニー形成は認められなかつた。上記トリ
プトフアナーゼ生産菌の高濃度の懸濁液（１プレ
ート当たり100〜200コ菌体）を、メンブレン・フ
イルターをその表面上に貼着したTrp−PEP寒天
培地上に塗布し、約60℃で培養して、コロニーを
形成させる。形成されたコロニーについて、
Kovac′s試薬によるインドールの生成を検出し、
インドール生産菌コロニーとインドール非生産菌
コロニーとを分離することができる。 該インドール生産菌コロニーは、後に詳しく述
べるとおり、細胞の大きさの異なる二種類の桿菌
の混合状態のコロニーとして得られ、インドール
非生産菌コロニーは該二種類の桿菌の一方の桿菌
からなるコロニーとして得ることができる。 上記のトリプトフアン含有合成培地において単
独でも混合状態でも生育するが、それ自身単独で
はトリプトフアナーゼ生産能を示さない菌株（イ
ンドール非生産菌）は、本発明者等によつてバチ
ルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain Ｓ）
と命名された。又、上述のようにして、バチル
ス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態で分離採取
でき、トリプトフアン含有合成培地において単独
では生育しないが、上記バチルス・エスピー・Ｓ
株との共生により生育して、菌体内に耐熱性トリ
プトフアナーゼを生産蓄積する耐熱性トリプトフ
アナーゼ生産性桿菌は、本発明者等によつて、バ
クテリウム・Ｔ株（Bacterium strain Ｔ）と命
名された。 上述のようにして高温環境由来の土壌試料から
バチルス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態で分
離採取できる本発明の耐熱性トリプトフアナーゼ
生産性桿菌は、リン酸塩でPH調節したトリプトフ
アン含有の下記合成液体培地〔Trp−PEP液体培
地〕で混合菌の状態で植継培養を続けることがで
きるし、また、Ｌ−乾燥菌体（混合菌）として保
存可能である。 Trp−PEP液体培地：−培地組成 100ml中 Ｌ−トリプトフアン 0.2ｇ ポリペプトン 0.5ｇ 酵母エキス 0.1ｇ K₂HPO₄ 0.3ｇ KH₂PO₄ 0.1ｇ MgSO₄・7H₂O 0.05ｇ ピリドキサール5′リン酸 0.05ｇ 培地PHは6.8〜7.0になる。 更に、上述のようにして高温環境由来の土壌試
料からバチルス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状
態で分離採取でき、混合菌の状態で植継培養及び
Ｌ−乾燥保存可能な本発明の耐熱性トリプトフア
ナーゼ生産性桿菌バクテリウム・Ｔ株は、たとえ
ば、以下のようにして共生するバチルス・エスピ
ー・Ｓ株と分離することが可能である。 (a) バクテリウム・Ｔ株とバチルス・エスピー・
Ｓ株は、その細胞の大きさの相違を利用して分
別遠心分離の手法を応用して互いに分離可能で
ある。 (b) バクテリウム・Ｔ株とバチルス・エスピー・
Ｓ株は、そのリゾチーム感受性が相違し、バチ
ルス・エスピー・Ｓ株の方がより感受性が高い
ので、その差を利用して該Ｓ株を選択的に溶菌
させることができ、それによつて混合菌から該
Ｔ株を分離可能である。 しかしながら、本発明の耐熱性トリプトフアナ
ーゼ生産性桿菌は、本発明者等の試みたかぎりの
如何なる微生物用天然及び合成培地においても、
単独では生育しないため、その菌学的性質に関し
ては、形態上の性質及び生理学的性質中カタラー
ゼについての性質以外は試験不可能である。従つ
て、以下に試験可能な性質について示す。 バクテリウム・Ｔ株（Bacterium strain Ｔ） (a) 形態 細胞の形及び大きさ：−桿菌（太さ0.25〜
0.35μｍ、長さ1.5〜7μｍ）。通常、単独。 細胞の多形性の有無：−なし。 運動性の有無：−なし。 胞子の有無：−なし。 グラム染色性：−不定。 (b) 次の各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：−生育せず。 肉汁寒天斜面培養：−生育せず。 肉汁液体培養：−生育せず。 肉汁ゼラチン穿刺培養：−生育せず。 リトマス・ミルム：−生育せず。 トリプトフアン含有合成培地〔Trp−PEP
液体培地〕：−単独では生育せず。バチル
ス・エスピー・Ｓ株（微工研条寄第809号）
との共生条件下に上記培地で生育する。尚、
本発明において、トリプトフアン含有合成培
地において単独では生育しないが、バチル
ス・エスピー・Ｓ株との共生により生育し
て、菌体内に耐熱性トリプトフアナーゼを生
産蓄積するというのは、上記Trp−PEP液体
培地において単独では生育せず、バチルス・
エスピー・Ｓ株との共生条件下に該培地で生
育して、菌体内に耐熱性トリプトフアナーゼ
を生産蓄積することを意味するものと定義さ
れる。 (c) 生理学的性質 硝酸塩の還元：−試験不能。但し、バチル
ス・エスピー・Ｓ株との共生条件下において
は（＋）。 脱窒反応、MRテスト、VPテスト：
−いずれも試験不能。 インドールの生成：−試験不能。但し、バ
チルス・エスピー・Ｓ株との共生条件下にお
いては（＋）。 硫化水素の生成、デンプンの加水分解、
クエン酸の利用、無機窒素源の利用、色
素の生成、ウレアーゼ、オキシダーゼ：
−いずれも試験不能。 カタラーゼ：−（＋）。 生育の範囲（PH、温度など）、酸素に対す
る態度（好気性、嫌気性の区別など）、Ｏ
−Ｆテスト、糖類からの酸及びガスの生成
の有無：−いずれも試験不能。 (d) その他 DNA中のグアニン・シトシン（GC）含量
（Tm法）が約65mole％。 （前記ｂ）のトリプトフアン含有合成培
地において、弱い撹拌条件下もしくは静置条
件下において、温度約58°〜63°で、バチル
ス・エスピー・Ｓ株との共生条件下で生育増
殖する。 上記性質を持つ桿菌、すなわち、トリプトフア
ン含有合成培地において単独では生育しないが、
バチルス・エスピー・Ｓ株との共生により生育し
て、菌体内に耐熱性トリプトフアナーゼを生産蓄
積する耐熱性トリプトフアナーゼ生産性桿菌は、
バージエズ・マニユアル・オブ・デタミナテブ・
バクテリオロジイ（Bergey′s Manual of
Determinative Bacterialogy，８ thd）第８
版、その他如何なる公知文献にも完全に未記載の
桿菌であつて、本発明者等によつて、バクテリウ
ム・Ｔ株（Bacterium strain Ｔ）と命名され
た。本発明者等により初めて分離された該桿菌
は、バチルス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態
で、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
条寄第810号（FERM BP−810）として寄託さ
れている。 更に、本発明の耐熱性トリプトフアナーゼ生産
性桿菌が、それとの共生条件下でトリプトフアン
含有合成培地で生育するバチルス・エスピー・Ｓ
株は、胞子を形成するBacillus属に属する新菌株
であつて、一般細菌用培地を用いて純粋培養が可
能である。その菌学的性質を以下に記載する。 バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain
Ｓ） (a) 形態 細胞の形及び大きさ：−桿菌（太さ0.6〜
0.9μｍ、長さ2.5〜6.0μｍ）。通常、単独。 細胞の多形性の有無：−なし。 運動性の有無：−（＋）。周鞭毛。 胞子の有無：−有り。だ円、1.1×2.0μｍ、
細胞の一端に内生。 グラム染色性：−陽性。 (b) 次の各培地における生育状態 １ 肉汁寒天培地 円滑、無色半透明、光沢あり。 ２ 肉汁液体培地 表面発育、白色菌膜を形成。 (c) 生理学的性質 １ 硝酸塩の還元：−（＋）。 ２ MRテスト：−（＋）。 ３ VPテスト：−（−）。 ４ インドールの生成：−（−）。 ５ 0.02％NaN_S耐性：（＋）。 ６ カタラーゼ：−（＋）。 ７ ５％食塩存在下での生育：−（−）。 ８ 生育の範囲：−PH5.7での生育（＋）。生育
温度66℃（上限）、40℃（下限）。 ９ 酸素に対する態度：−嫌気性生育（＋）。 10 デンプン発酵性：−（＋）。 11 アラビノース、キシロース発酵性：−
（−）。 12 マンニトール発酵性：−（−）。 13 グルコース発酵性：−（＋）。ガス生成
（−）。 65℃で生育するところから、バチルス・ステア
ロテルモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）に類似するが、上記9.嫌気
性生育（＋）、5.0.02％NaN₃耐性（＋）8.PH5.7で
の生育（＋）の各試験結果が一致せず、バージエ
ズ・マニユアル・オブ・デタミナテブ・バクテリ
オロジイ第８版により該当する菌株がない。従つ
て、新菌株と同定され、本発明者等により、バチ
ルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain Ｓ）
と命名された。本発明者等により初めて分離され
た該菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第809号（FERM BP−809）として
寄託されている。 本発明によれば、上に詳しくのべた微生物、す
なわち、トリプトフアン含有合成培地において単
独では生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株
との共生により生育する耐熱性トリプトフアナー
ゼ生産性桿菌を培養し、培養物から耐熱性トリプ
トフアナーゼを採取することからなる耐熱性トリ
プトフアナーゼの製法が提供できる。 培養は、適当な炭素源、窒素源、ミネラル類を
含有する培地において、例えば、バチルス・エス
ピー・Ｓ株との共生条件下に耐熱性トリプトフア
ナーゼ生産性桿菌を接種して行なうことができ
る。利用する炭素源の例としては、グルコース、
デンプン、マルトース、コハク酸ナトリウム、酢
酸ナトリウムなどの如き炭素源を例示でき、また
窒素の例としてはNH₄Cl、（NH₄）₂SO₄、カザミ
ノ酸、ペプトン、酵母エキスなどの如き有機もし
くは無機窒素源を例示することができる。更に、
ミネラル類の例としては、K₂HPO、KH₂PO₄、
MgSO₄・7H₂O、FeCl₃、ビタミン類などを例示
することができる。 培養は、たとえば、上記例示の如き炭素源、窒
素源、さらにはミネラル及びビタミン類のほか
に、Ｌ−トリプトフアンを含有する液体培地を用
いて、好気的に行なうことができる。培養方式も
適宜に選択できるが、たとえば静置培養、振盪培
養、通気撹拌培養などの培養方式を採用して行な
うことができる。培養条件としては、PH約６〜約
８の如きPH条件下、約55〜約65℃の温度条件にお
いて、約１〜約３日の如き条件を例示することが
できる。 培養終了後、例えば、遠心分離、別などによ
つて菌体を採取し、たとえば、菌体を破砕たとえ
ばアルミナ摩砕などによつて破砕して、得られる
菌体抽出液から、たとえば硫安分画法により分画
して耐熱性トリプトフアナーゼ含有分画を採取す
ることにより、目的とする耐熱性トリプトフアナ
ーゼを分離取得することができる。更に、たとえ
ばイオン交換、ゲル過、カラムクロマトグラフ
イーの如き適当な精製手法を用いて精製すること
ができる。 上述のようにして製造できる本発明の耐熱性ト
リプトフアナーゼは、約70℃（PH＝8.0）に作用
至適温度を有し、且つ約65℃（PH＝8.0、保持時
間40分）までは熱失活しない耐熱特性を有するト
リプトフアナーゼである点で、従来公知のトリプ
トフアナーゼと明確に区別できる新規酵素であ
る。 以下に、本発明耐熱性トリプトフアナーゼの性
質を示す。 １ 作用：− ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−
トリプトフアンからピルビン酸、インドール及
びアンモニアを生成する。 ２ 基質特異性：− トリプトフアン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイ
ン、Ｌ−システイン及び５−メチル−Ｌ−トリ
プトフアンを分解する。 ３ 至適PH及び安定PH：− 至適PH＝7.0〜7.5（65℃）〔第１図参照〕 安定PH＝６〜10（25℃、２日間〔第２図参照〕 添付図面第１図は、(1)50ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（図中、―○―○―）、(2)10ｍＭのKCl
を含有する50ｍＭのグリシン−NaOH緩衝液
（図中、―□―□―）、(3)５ｍＭの（NH₄）₂SO₄を
含有する50ｍＭのグリシン−NaOH緩衝液
（図中、

〔耐熱性トリプトフアナーゼ生産性桿菌バクテリウム・Ｔ株の分離採取。〕

(1‐1) 堆肥試料１ｇをTrp−PEP液体培地10mlに
添加し、Ｌ型試験管中で約60℃において１日
間振盪培養した。Kovac′s試薬によりインド
ール生成を確認した後、その一部0.1mlを新
たなTrp−PEP液体培地10mlに接種して同様
な培養を繰り返すことにより、インドール生
成菌群が充分に生育した培養物を得た。この
培養物0.1mlをバシトラシン１mg／を含有
するTrp−PEP液体培地10mlに接種して、さ
らに上記と同様な培養を行つた。 斯くして得られた培養液を滅菌生理食塩水
を用いて約10万倍に希釈したのち、その0.1
mlをメンブラン・フイルター（Toyo TM−
２）を貼着したTrp−PEP寒天培地（寒天
1.5％添加）に塗布することにより、バクテ
リウム・Ｔ株〔以下において、Ｔ株と略記す
ることがある〕及びバチルス・エスピー・Ｓ
株〔以下において、Ｓ株と略記することがあ
る〕が混合状態で生育しているコロニーとＳ
株の単独よりなるコロニーを分離採収した。 (1‐2) 上記（１−１）により得られたＴ株とＳ株
の混合したコロニーより得られた混合培養物
１mlを、トリプトフアン含有合成倍地（Trp
−PEP液体培地）200mlに接種し、60℃で約
30時間培養を行うと、約４時間後にまずＳ株
の活発な増殖が起こり、次いで、Ｓ株の増殖
停止とほぼ同時に、Ｔ株増殖が始まり、それ
と同時にＳ株は急速に死滅し、最終的には菌
数の99％以上がＴ株である培養を得ることが
できた。さらにＳ株の混入率を低下させ、実
質的なＴ株の純粋培養物を作るためには、Ｔ
株とＳ株の細胞壁分解酵素（リゾチーム）に
対する耐性の差を利用する方法、または分別
遠心分離法を用いて、培養のどの段階でもＴ
株を分離することが可能であつた。 細胞壁分解酵素（リゾチーム）を用いる方
法。 上記のＴ株とＳ株の混合培養を18時間行い、
下記の条件でリゾチームを作用させると、その
時点で25％存在したＳ株が選択的に溶菌して全
菌数の千分の一以下に減少し、Ｔ株の純粋培養
を得ることができた。 条件：− 100ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）
中、 卵白リゾチーム 300μｇ／ml EDTA 200μｇ／ml クエン酸ナトリウム 30mg／ml の反応液を用い35℃で15分間反応させる。 分別遠心分離による方法。 上記のＴ株とＳ株の混合培養を20時間行つた
培養物を、1000^xg、15分間の条件で遠心分離す
ることによりＳ株を選択的に沈澱させ、改め
て、14000^xg、20分間の条件で遠心分離するこ
とによりＴ株のみを沈降分離できた。 実施例 ２ 〔Ｔ株の単独培養が不可能であることの例証。〕 (2‐1) Ｔ株とＳ株の混合培養から実施例１の（１
−２）に示した方法で分離したＴ株を、下記
液体培地に植菌し、60℃で培養を行つたが、
いずれの培地でもＴ株の生育は全く認められ
なかつた。 １ Trp−PEP液体培地 ２ 普通ブイヨン培地 ３ ハートインフユージヨンブイヨン ４ 牛血清＋ハートインフユージヨンブイヨン ５ 酵母エキス＋ハートインフユージヨンブイヨ
ン ６ 0.5％寒天を含有する上記１−５までの各培
地 (2‐2) Ｓ株の菌体生成物または菌体成分がＴ株の
生育を支持する可能性を検証するために、Ｓ
菌のみをTrp−PEP液体培地に接種し、60℃
約12時間培養した後、その培養上清及び菌体
超音波破砕抽出液を調製し、それらを無菌
過した後、Trp−PEP液体培地に添加し、こ
れに純粋分離したＴ株を接種したが、Ｔ株の
増殖は全く認められなかつた。また、ストレ
プトマイシンにより細胞分裂を止めたＳ株菌
体を共存させてＴ株の培養を試みたが、増殖
は全く認められなかつた。 実施例 ３ 〔酵素生産。〕 ５三角フラスコにトリプトフアン含有合成培
地（Trp−PEP液体培地）を1.5入れ、Ｔ株及
びＳ株の混合培養を５ml植菌し、60℃で30時間静
置培養を行つたのち、実施例１に示すと同様に処
理して77.6の培養液から、120ｇのＴ株湿菌体
を得た。これを酸化アルミニウムにより摩砕し、
次いで、下記 10μMのピリドキサール5′−リン酸（PLP）、 １ｍＭの２−メルカプトエタノール、 250μMのPMSF（セリンプロテアーゼ阻害剤）、
〔フエニルメチルスルホニルフルオライド
（Phenyl methyl slufonyl fluoride）〕 50ｍＭのK₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液、PH6.5、
の組成の精製用緩衝液166mlを添加することによ
り、可溶画分として粗酵素液を得た。これから０
〜50％飽和硫安分画を集め、得られた粗酵素分画
液をストレプトマイシンによる除核酸処理に賦し
たのち透析し、DEAE−トヨパール（東洋曹達工
業製品）カラム（2.6cm（径）×12cm）に吸着さ
せ、０→400ｍＭ KCl濃度勾配（400ml）で溶出
処理して活性画分を集め、次いでウルトロゲル
AcA34（LKB社製品）カラム（2.1cm（径）×85
cm）でゲル過により精製する。さらに、ハイド
ロキシルアパタイトゲルHT（バイオラツド社製
品）カラム（2.6cm×８cmに吸着させ、０〜300ｍ
Ｍ（NH₄）₂SO₄濃度勾配（300ml）で溶出を行い、
活性画分からトリプトフアナーゼ約100mgを得た。 本酵素は約70℃（PH＝8.0）に作用至適温度を
有し且つ約65℃（PH＝8.0、保持時間40分）まで
は熱失活しない耐熱特性を示した。また、本酵素
のトリプトフアン分解の比活性は市販品（37℃）
の８倍以上あり、逆反応によりインドール、ピル
ビン酸、アンモニアよりのトリプトフアン合成活
性も検出された。

【図面の簡単な説明】

添付図面第１図は本発明の耐熱性トリプトフア
ナーゼの至適PH及び活性化を示すための各種緩衝
液におけるトリプトフアナーゼ活性−PHの関係を
示すグラフ、第２図は本発明の耐熱性トリプトフ
アナーゼの安定PHを示すための各種緩衝液におけ
る残存トリプトフアナーゼ活性−PHの関係を示す
グラフ、第３図は本発明の耐熱性トリプトフアナ
ーゼの至適温度を示すグラフ、そして第４図は本
発明の耐熱性トリプトフアナーゼの熱失活特性を
示すための50℃（４−１図）、55℃（４−２図）、
60℃（４−３図）、65℃（４−４図）及び70℃
（４−５図）の各温度における残存トリプトフア
ナーゼ活性一時間（分）の関係を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 作用至適温度 約70℃（PH＝8.0） (b) 熱安定性 約65℃（PH＝8.0、保持時間40分）まで熱失
   活しない、 (c) 作用 ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−
   トリプトフアンからピルビン酸、インドール及
   びアンモニアを生成する、 (d) 基質特異性 トリプトフアン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイ
   ン、Ｌ−システイン及び５−メチル−Ｌ−トリ
   プトフアンを分解する、 (e) 至適PH及び安定PH範囲 至適PH＝7.0〜7.5（65℃）、 安定PH＝６〜10（25℃） (f) 分子量 約44000〜約46000（SDSゲル電気泳動による） によつて特徴づけられる耐熱性トリプトフアナー
   ゼ。 ２ トリプトフアン含有合成培地において単独で
   は生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株
   （Bacillus sp.strain Ｓ）との共生により生育す
   るバクテリウム属に属する耐熱性トリプトフアナ
   ーゼ生産性桿菌を培養し、培養物から耐熱性トリ
   プトフアナーゼを採取することを特徴とする下記
   の理化学的性質 (a) 作用至適温度 約70℃（PH＝8.0） (b) 熱安定性 約65℃（PH＝8.0、保持時間40分）まで熱失
   活しない、 (c) 作用 ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−
   トリプトフアンからピルビン酸、インドール及
   びアンモニアを生成する、 (d) 基質特異性 トリプトフアン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイ
   ン、Ｌ−システイン及び５−メチル−Ｌ−トリ
   プトフアンを分解する、 (e) 至適PH及び安定PH範囲 至適PH＝7.0〜7.5（65℃）、 安定PH＝６〜10（25℃） (f) 分子量 約44000〜約46000（SDSゲル電気泳動による） によつて特徴づけられる耐熱性トリプトフアナー
   ゼの製法。 ３ 該耐熱性トリプトフアナーゼ生産性桿菌がバ
   クテリウム・Ｔ株（Bacterium strain Ｔ）（微
   工研条寄第810号）である特許請求の範囲第２項
   記載の製法。 ４ 該バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.
   strain Ｓ）がバチルス・エスピー・Ｓ株（微工
   研条寄第809号）である特許請求の範囲第２項記
   載の製法。