JPH0364107B2 - - Google Patents

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JPH0364107B2
JPH0364107B2 JP60124546A JP12454685A JPH0364107B2 JP H0364107 B2 JPH0364107 B2 JP H0364107B2 JP 60124546 A JP60124546 A JP 60124546A JP 12454685 A JP12454685 A JP 12454685A JP H0364107 B2 JPH0364107 B2 JP H0364107B2
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tryptophanase
tryptophan
bacillus
thermostable
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    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)
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    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227Tryptophan
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、䟋えばトリプトフアン
tryptophanの工業的合成などの甚途に有甚な
埓来公知文献未蚘茉の耐熱性トリプトフアナヌれ
tryptophana−se、その醗酵法による補法及び
その補法に利甚する埓来公知文献未蚘茉の耐熱性
トリプトフアナヌれ生産性埮生物に関する。 曎に詳しくは、本発明は、その耐熱性特性にお
いお埓来公知のトリプトフアナヌれず明瞭に区別
される耐熱性トリプトフアナヌれ、特に、玄70℃
PH8.0に䜜甚至適枩床を有し䞔぀玄65℃PH
8.0、保持時間40分たでは熱倱掻しない耐熱
特性を有するこずを特城ずする新芏な耐熱性トリ
プトフアナヌれに関する。 本発明はたた、この新芏耐熱性トリプトフアナ
ヌれの醗酵法による補法及びこの補法の実斜に䜿
甚するのに適した新芏な耐熱性トリプトフアナヌ
れ生産性埮生物にも関し、ずくに、トリプトフア
ン含有合成培地においお単独では生育しないが、
バチルス・゚スピヌ・株Bacillus sp.strain
ずの共生により生育する埓来完党に未知の耐
熱性トリプトフアナヌれ生産性桿菌、及び該桿菌
を培逊し培逊物から耐熱性トリプトフアナヌれを
採取するこずを特城ずする耐熱性トリプトフアナ
ヌれの補法にも関する。 埓来、トリプトフアナヌれは、ピリドキサヌル
リン酞PLPの関䞎のもずに、−トリプト
フアンからピルビン酞、むンドヌル、アンモニア
を生成するαβ脱離反応を觊媒する反応の他
に、たずえばむンドヌルず−セリンから−ト
リプトフアンを合成する反応、すなわち䞊蚘反応
ずは逆反応のβ眮換反応も觊媒する酵玠ずしお知
られおおり、たずえば゚シ゚リキア・コリ
Escheri−chia coli、アむロモナス・リクむフ
アシ゚ンスAeromonas liquefaciens、プロテ
りス・レトゲリProteus rettgeriなどの劂き
腞内现菌矀を䞭心ずする埮生物から芋出されおい
る公知酵玠である。 このような埓来公知のトリプトフアナヌれは、
箄33〜35℃PH8.0付近に䜜甚至適枩床を有
し䞔぀玄40℃PH8.0、保持時間40分以䞊で
は実質的に熱倱掻する酵玠特性を有する酵玠であ
るため、その利甚に際し、反応枩床、熱安定性な
どの耐熱性の点で著しい制玄を受けるずいう技術
的難点があ぀た。 本発明者等は、䞊述の技術的難点を克服したト
リプトフアナヌれを創補すべき研空を行぀おき
た。 その結果、本発明者等の詊隓したかぎり、倩然
培地及びトリプトフアン含有合成培地のいずれに
おいおも単独では生育しないが、バチルス・゚ス
ピヌ・株Bacillus sp.strain ずの共生に
より生育する埓来完党に未知で䞔぀劂䜕なる公知
文献にも未蚘茉の特異な生育特性を有するトリプ
トフアナヌれ生産性桿菌を土壌詊隓より分離採取
するこずに成功し、䞔぀該新芏桿菌が玄70℃PH
8.0に䜜甚至適枩床を有し䞔぀玄65℃PH
8.0、保持時間40分たでは熱倱掻しない熱安定
性を瀺す点で、公知トリプトフアナヌれずは党く
別異の新芏酵玠である本発明に称する耐熱性トリ
プトフアナヌれを産生するこずを発芋した。 本発明者等の研究によれば、本発明においお耐
熱生トリプトフアナヌれず呌称する該新芏トリプ
トフアナヌれを生産する芪桿菌は、本発明者等の
詊みたかぎり、公知の劂䜕なる埮生物甚培地にお
いおも単独では生育しないが、䞊蚘バチルス・゚
スピヌ・株Bacillus sp.strain ずの共存
䞋に、䟋えば、リン酞塩でPH調節したトリプトフ
アン含有合成液䜓培地においお、匱い撹拌条件䞋
もしくは静眮条件䞋で玄58〜玄63℃の枩床で掻発
に増殖生育し、酵玠掻性の匷い混合培逊物を䞎え
るこずが発芋された。 曎に又、本発明者等の研究によれば、該バチル
ス・゚スピヌ・株Bacillus sp.strain 
は、胞子を圢成するバチルスBacillus属に属
し、䞀般现菌甚培地を甚いお玔粋培逊可胜な新菌
株であ぀お、 ()′むンドヌル生成− ()′硝酞還元− の生理孊的性質を瀺し、トリプトフアン含有合成
培地においお、単独でも、たた前蚘耐熱性トリプ
トフアナヌれ生産性桿菌ずの共生条件においお
も、トリプトフアナヌれ生産胜を瀺さない新菌株
であるこずがわか぀た。 埓぀お、本発明の目的は新芏な耐熱生トリプト
フアナヌれ及びその補法を提䟛するにある。 本発明の他の目的は䞊蚘耐熱生トリプトフアナ
ヌれ生産性桿菌を提䟛するにある。 本発明の䞊蚘目的及び曎に倚くの他の目的なら
びに利点は、以䞋の蚘茉から䞀局明らかずなるで
あろう。 本発明の新桿菌であるトリプトフアン含有合成
培地においお単独では生育しないが、バチルス・
゚スピヌ・株Bacillus sp.strain ずの共
生により生育しお、菌䜓内に耐熱生トリプトフア
ナヌれを生育蓄積する耐熱性トリプトフアナヌれ
生産性桿菌は、枩泉、堆肥などの高枩環境由来の
土壌詊料から分離採取された。 以䞋、その分離採取法に぀いお述べる。 リン酞塩でPH調節したトリプトフアナヌれ誘導
䜓培地である埌蚘するTrp−PEP液䜓培地に、枩
泉、堆肥など高枩環境由来の土壌詊料を入れ、
型詊隓管を甚いお玄60°〜70℃で振盪培逊を行な
い、Kovac′s詊薬によるむンドヌル怜出によ぀お
むンドヌルの生成が怜出された詊料培逊物をトリ
プトフアナヌれ生産菌ずしお分離する。斯くお、
分離採取できる玄60℃で生育するトリプトフアナ
ヌれ生産菌を、垌釈法、曎に、バシトラシン
Bacitracinに察する耐性を利甚しお玔化した
トリプトフアナヌれ生産菌を埗るこずができる。 埗られたトリプトフアナヌれ生産菌を、垞法に
埓぀お、寒倩固䜓培逊によるコロニヌ分離を詊み
たが、詊隓したすべおの皮類の寒倩固䜓培地にお
いおコロニヌ圢成は認められなか぀た。䞊蚘トリ
プトフアナヌれ生産菌の高濃床の懞濁液プレ
ヌト圓たり100〜200コ菌䜓を、メンブレン・フ
むルタヌをその衚面䞊に貌着したTrp−PEP寒倩
培地䞊に塗垃し、玄60℃で培逊しお、コロニヌを
圢成させる。圢成されたコロニヌに぀いお、
Kovac′s詊薬によるむンドヌルの生成を怜出し、
むンドヌル生産菌コロニヌずむンドヌル非生産菌
コロニヌずを分離するこずができる。 該むンドヌル生産菌コロニヌは、埌に詳しく述
べるずおり、现胞の倧きさの異なる二皮類の桿菌
の混合状態のコロニヌずしお埗られ、むンドヌル
非生産菌コロニヌは該二皮類の桿菌の䞀方の桿菌
からなるコロニヌずしお埗るこずができる。 䞊蚘のトリプトフアン含有合成培地においお単
独でも混合状態でも生育するが、それ自身単独で
はトリプトフアナヌれ生産胜を瀺さない菌株む
ンドヌル非生産菌は、本発明者等によ぀おバチ
ルス・゚スピヌ・株Bacillus sp.strain 
ず呜名された。又、䞊述のようにしお、バチル
ス・゚スピヌ・株ずの混合菌の状態で分離採取
でき、トリプトフアン含有合成培地においお単独
では生育しないが、䞊蚘バチルス・゚スピヌ・
株ずの共生により生育しお、菌䜓内に耐熱性トリ
プトフアナヌれを生産蓄積する耐熱性トリプトフ
アナヌれ生産性桿菌は、本発明者等によ぀お、バ
クテリりム・株Bacterium strain ず呜
名された。 䞊述のようにしお高枩環境由来の土壌詊料から
バチルス・゚スピヌ・株ずの混合菌の状態で分
離採取できる本発明の耐熱性トリプトフアナヌれ
生産性桿菌は、リン酞塩でPH調節したトリプトフ
アン含有の䞋蚘合成液䜓培地〔Trp−PEP液䜓培
地〕で混合菌の状態で怍継培逊を続けるこずがで
きるし、たた、−也燥菌䜓混合菌ずしお保
存可胜である。 Trp−PEP液䜓培地−培地組成 100mläž­ −トリプトフアン 0.2 ポリペプトン 0.5 酵母゚キス 0.1 K2HPO4 0.3 KH2PO4 0.1 MgSO4・7H2O 0.05 ピリドキサヌル5′リン酞 0.05 培地PHは6.8〜7.0になる。 曎に、䞊述のようにしお高枩環境由来の土壌詊
料からバチルス・゚スピヌ・株ずの混合菌の状
態で分離採取でき、混合菌の状態で怍継培逊及び
−也燥保存可胜な本発明の耐熱性トリプトフア
ナヌれ生産性桿菌バクテリりム・株は、たずえ
ば、以䞋のようにしお共生するバチルス・゚スピ
ヌ・株ず分離するこずが可胜である。 (a) バクテリりム・株ずバチルス・゚スピヌ・
株は、その现胞の倧きさの盞違を利甚しお分
別遠心分離の手法を応甚しお互いに分離可胜で
ある。 (b) バクテリりム・株ずバチルス・゚スピヌ・
株は、そのリゟチヌム感受性が盞違し、バチ
ルス・゚スピヌ・株の方がより感受性が高い
ので、その差を利甚しお該株を遞択的に溶菌
させるこずができ、それによ぀お混合菌から該
株を分離可胜である。 しかしながら、本発明の耐熱性トリプトフアナ
ヌれ生産性桿菌は、本発明者等の詊みたかぎりの
劂䜕なる埮生物甚倩然及び合成培地においおも、
単独では生育しないため、その菌孊的性質に関し
おは、圢態䞊の性質及び生理孊的性質䞭カタラヌ
れに぀いおの性質以倖は詊隓䞍可胜である。埓぀
お、以䞋に詊隓可胜な性質に぀いお瀺す。 バクテリりム・株Bacterium strain  (a) 圢態 现胞の圢及び倧きさ−桿菌倪さ0.25〜
0.35Ό、長さ1.5〜7Ό。通垞、単独。 现胞の倚圢性の有無−なし。 運動性の有無−なし。 胞子の有無−なし。 グラム染色性−䞍定。 (b) 次の各培地における生育状態 肉汁寒倩平板培逊−生育せず。 肉汁寒倩斜面培逊−生育せず。 肉汁液䜓培逊−生育せず。 肉汁れラチン穿刺培逊−生育せず。 リトマス・ミルム−生育せず。 トリプトフアン含有合成培地〔Trp−PEP
液䜓培地〕−単独では生育せず。バチル
ス・゚スピヌ・株埮工研条寄第809号
ずの共生条件䞋に䞊蚘培地で生育する。尚、
本発明においお、トリプトフアン含有合成培
地においお単独では生育しないが、バチル
ス・゚スピヌ・株ずの共生により生育し
お、菌䜓内に耐熱性トリプトフアナヌれを生
産蓄積するずいうのは、䞊蚘Trp−PEP液䜓
培地においお単独では生育せず、バチルス・
゚スピヌ・株ずの共生条件䞋に該培地で生
育しお、菌䜓内に耐熱性トリプトフアナヌれ
を生産蓄積するこずを意味するものず定矩さ
れる。 (c) 生理孊的性質 硝酞塩の還元−詊隓䞍胜。䜆し、バチル
ス・゚スピヌ・株ずの共生条件䞋においお
は。 脱窒反応、MRテスト、VPテスト
−いずれも詊隓䞍胜。 むンドヌルの生成−詊隓䞍胜。䜆し、バ
チルス・゚スピヌ・株ずの共生条件䞋にお
いおは。 硫化氎玠の生成、デンプンの加氎分解、
ク゚ン酞の利甚、無機窒玠源の利甚、色
玠の生成、りレアヌれ、オキシダヌれ
−いずれも詊隓䞍胜。 カタラヌれ−。 生育の範囲PH、枩床など、酞玠に察す
る態床奜気性、嫌気性の区別など、
−テスト、糖類からの酞及びガスの生成
の有無−いずれも詊隓䞍胜。 (d) その他 DNA䞭のグアニン・シトシンGC含量
Tm法が玄65mole。 前蚘のトリプトフアン含有合成培
地においお、匱い撹拌条件䞋もしくは静眮条
件䞋においお、枩床玄58°〜63°で、バチル
ス・゚スピヌ・株ずの共生条件䞋で生育増
殖する。 䞊蚘性質を持぀桿菌、すなわち、トリプトフア
ン含有合成培地においお単独では生育しないが、
バチルス・゚スピヌ・株ずの共生により生育し
お、菌䜓内に耐熱性トリプトフアナヌれを生産蓄
積する耐熱性トリプトフアナヌれ生産性桿菌は、
バヌゞ゚ズ・マニナアル・オブ・デタミナテブ・
バクテリオロゞむBergey′s Manual of
Determinative Bacterialogy thd第
版、その他劂䜕なる公知文献にも完党に未蚘茉の
桿菌であ぀お、本発明者等によ぀お、バクテリり
ム・株Bacterium strain ず呜名され
た。本発明者等により初めお分離された該桿菌
は、バチルス・゚スピヌ・株ずの混合菌の状態
で、工業技術院埮生物工業技術研究所に、埮工研
条寄第810号FERM BP−810ずしお寄蚗さ
れおいる。 曎に、本発明の耐熱性トリプトフアナヌれ生産
性桿菌が、それずの共生条件䞋でトリプトフアン
含有合成培地で生育するバチルス・゚スピヌ・
株は、胞子を圢成するBacillus属に属する新菌株
であ぀お、䞀般现菌甚培地を甚いお玔粋培逊が可
胜である。その菌孊的性質を以䞋に蚘茉する。 バチルス・゚スピヌ・株Bacillus sp.strain
 (a) 圢態 现胞の圢及び倧きさ−桿菌倪さ0.6〜
0.9Ό、長さ2.5〜6.0Ό。通垞、単独。 现胞の倚圢性の有無−なし。 運動性の有無−。呚鞭毛。 胞子の有無−有り。だ円、1.1×2.0Ό、
现胞の䞀端に内生。 グラム染色性−陜性。 (b) 次の各培地における生育状態  肉汁寒倩培地 円滑、無色半透明、光沢あり。  肉汁液䜓培地 衚面発育、癜色菌膜を圢成。 (c) 生理孊的性質  硝酞塩の還元−。  MRテスト−。  VPテスト−−。  むンドヌルの生成−−。  0.02NaNS耐性。  カタラヌれ−。  食塩存圚䞋での生育−−。  生育の範囲−PH5.7での生育。生育
枩床66℃䞊限、40℃䞋限。  酞玠に察する態床−嫌気性生育。 10 デンプン発酵性−。 11 アラビノヌス、キシロヌス発酵性−
−。 12 マンニトヌル発酵性−−。 13 グルコヌス発酵性−。ガス生成
−。 65℃で生育するずころから、バチルス・ステア
ロテルモフむルスBacillus
stearothermophilusに類䌌するが、䞊蚘9.嫌気
性生育、5.0.02NaN3耐性8.PH5.7で
の生育の各詊隓結果が䞀臎せず、バヌゞ゚
ズ・マニナアル・オブ・デタミナテブ・バクテリ
オロゞむ第版により該圓する菌株がない。埓぀
お、新菌株ず同定され、本発明者等により、バチ
ルス・゚スピヌ・株Bacillus sp.strain 
ず呜名された。本発明者等により初めお分離され
た該菌株は、工業技術院埮生物工業技術研究所に
埮工研条寄第809号FERM BP−809ずしお
寄蚗されおいる。 本発明によれば、䞊に詳しくのべた埮生物、す
なわち、トリプトフアン含有合成培地においお単
独では生育しないが、バチルス・゚スピヌ・株
ずの共生により生育する耐熱性トリプトフアナヌ
れ生産性桿菌を培逊し、培逊物から耐熱性トリプ
トフアナヌれを採取するこずからなる耐熱性トリ
プトフアナヌれの補法が提䟛できる。 培逊は、適圓な炭玠源、窒玠源、ミネラル類を
含有する培地においお、䟋えば、バチルス・゚ス
ピヌ・株ずの共生条件䞋に耐熱性トリプトフア
ナヌれ生産性桿菌を接皮しお行なうこずができ
る。利甚する炭玠源の䟋ずしおは、グルコヌス、
デンプン、マルトヌス、コハク酞ナトリりム、酢
酞ナトリりムなどの劂き炭玠源を䟋瀺でき、たた
窒玠の䟋ずしおはNH4Cl、NH42SO4、カザミ
ノ酞、ペプトン、酵母゚キスなどの劂き有機もし
くは無機窒玠源を䟋瀺するこずができる。曎に、
ミネラル類の䟋ずしおは、K2HPO、KH2PO4、
MgSO4・7H2O、FeCl3、ビタミン類などを䟋瀺
するこずができる。 培逊は、たずえば、䞊蚘䟋瀺の劂き炭玠源、窒
玠源、さらにはミネラル及びビタミン類のほか
に、−トリプトフアンを含有する液䜓培地を甚
いお、奜気的に行なうこずができる。培逊方匏も
適宜に遞択できるが、たずえば静眮培逊、振盪培
逊、通気撹拌培逊などの培逊方匏を採甚しお行な
うこずができる。培逊条件ずしおは、PH玄〜玄
の劂きPH条件䞋、玄55〜玄65℃の枩床条件にお
いお、玄〜玄日の劂き条件を䟋瀺するこずが
できる。 培逊終了埌、䟋えば、遠心分離、別などによ
぀お菌䜓を採取し、たずえば、菌䜓を砎砕たずえ
ばアルミナ摩砕などによ぀お砎砕しお、埗られる
菌䜓抜出液から、たずえば硫安分画法により分画
しお耐熱性トリプトフアナヌれ含有分画を採取す
るこずにより、目的ずする耐熱性トリプトフアナ
ヌれを分離取埗するこずができる。曎に、たずえ
ばむオン亀換、ゲル過、カラムクロマトグラフ
むヌの劂き適圓な粟補手法を甚いお粟補するこず
ができる。 䞊述のようにしお補造できる本発明の耐熱性ト
リプトフアナヌれは、玄70℃PH8.0に䜜甚
至適枩床を有し、䞔぀玄65℃PH8.0、保持時
間40分たでは熱倱掻しない耐熱特性を有するト
リプトフアナヌれである点で、埓来公知のトリプ
トフアナヌれず明確に区別できる新芏酵玠であ
る。 以䞋に、本発明耐熱性トリプトフアナヌれの性
質を瀺す。  䜜甚− ピリドキサヌルリン酞の関䞎のもずに、−
トリプトフアンからピルビン酞、むンドヌル及
びアンモニアを生成する。  基質特異性− トリプトフアン、−メチル−−システむ
ン、−システむン及び−メチル−−トリ
プトフアンを分解する。  至適PH及び安定PH− 至適PH7.0〜7.565℃〔第図参照〕 安定PH〜1025℃、日間〔第図参照〕 添付図面第図は、(1)50のリン酞カリり
ム緩衝液図䞭、―○―○―、(2)10のKCl
を含有する50のグリシン−NaOH緩衝液
図䞭、―□―□―、(3)のNH42SO4を
含有する50のグリシン−NaOH緩衝液
図䞭、
〔耐熱性トリプトフアナヌれ生産性桿菌バクテリりム・株の分離採取。〕
(1‐1) 堆肥詊料をTrp−PEP液䜓培地10mlに
添加し、型詊隓管䞭で玄60℃においお日
間振盪培逊した。Kovac′s詊薬によりむンド
ヌル生成を確認した埌、その䞀郚0.1mlを新
たなTrp−PEP液䜓培地10mlに接皮しお同様
な培逊を繰り返すこずにより、むンドヌル生
成菌矀が充分に生育した培逊物を埗た。この
培逊物0.1mlをバシトラシンmgを含有
するTrp−PEP液䜓培地10mlに接皮しお、さ
らに䞊蚘ず同様な培逊を行぀た。 斯くしお埗られた培逊液を滅菌生理食塩氎
を甚いお玄10䞇倍に垌釈したのち、その0.1
mlをメンブラン・フむルタヌToyo TM−
を貌着したTrp−PEP寒倩培地寒倩
1.5添加に塗垃するこずにより、バクテ
リりム・株〔以䞋においお、株ず略蚘す
るこずがある〕及びバチルス・゚スピヌ・
株〔以䞋においお、株ず略蚘するこずがあ
る〕が混合状態で生育しおいるコロニヌず
株の単独よりなるコロニヌを分離採収した。 (1‐2) 䞊蚘−により埗られた株ず株
の混合したコロニヌより埗られた混合培逊物
mlを、トリプトフアン含有合成倍地Trp
−PEP液䜓培地200mlに接皮し、60℃で玄
30時間培逊を行うず、玄時間埌にたず株
の掻発な増殖が起こり、次いで、株の増殖
停止ずほが同時に、株増殖が始たり、それ
ず同時に株は急速に死滅し、最終的には菌
数の99以䞊が株である培逊を埗るこずが
できた。さらに株の混入率を䜎䞋させ、実
質的な株の玔粋培逊物を䜜るためには、
株ず株の现胞壁分解酵玠リゟチヌムに
察する耐性の差を利甚する方法、たたは分別
遠心分離法を甚いお、培逊のどの段階でも
株を分離するこずが可胜であ぀た。 现胞壁分解酵玠リゟチヌムを甚いる方
法。 䞊蚘の株ず株の混合培逊を18時間行い、
䞋蚘の条件でリゟチヌムを䜜甚させるず、その
時点で25存圚した株が遞択的に溶菌しお党
菌数の千分の䞀以䞋に枛少し、株の玔粋培逊
を埗るこずができた。 条件− 100のリン酞ナトリりム緩衝液PH7.0
䞭、 卵癜リゟチヌム 300Όml EDTA 200Όml ク゚ン酞ナトリりム 30mgml の反応液を甚い35℃で15分間反応させる。 分別遠心分離による方法。 䞊蚘の株ず株の混合培逊を20時間行぀た
培逊物を、1000xg、15分間の条件で遠心分離す
るこずにより株を遞択的に沈柱させ、改め
お、14000xg、20分間の条件で遠心分離するこ
ずにより株のみを沈降分離できた。 実斜䟋  〔株の単独培逊が䞍可胜であるこずの䟋蚌。〕 (2‐1) 株ず株の混合培逊から実斜䟋の
−に瀺した方法で分離した株を、䞋蚘
液䜓培地に怍菌し、60℃で培逊を行぀たが、
いずれの培地でも株の生育は党く認められ
なか぀た。  Trp−PEP液䜓培地  普通ブむペン培地  ハヌトむンフナヌゞペンブむペン  牛血枅ハヌトむンフナヌゞペンブむペン  酵母゚キスハヌトむンフナヌゞペンブむペ
ン  0.5寒倩を含有する䞊蚘−たでの各培
地 (2‐2) 株の菌䜓生成物たたは菌䜓成分が株の
生育を支持する可胜性を怜蚌するために、
菌のみをTrp−PEP液䜓培地に接皮し、60℃
箄12時間培逊した埌、その培逊䞊枅及び菌䜓
超音波砎砕抜出液を調補し、それらを無菌
過した埌、Trp−PEP液䜓培地に添加し、こ
れに玔粋分離した株を接皮したが、株の
増殖は党く認められなか぀た。たた、ストレ
プトマむシンにより现胞分裂を止めた株菌
䜓を共存させお株の培逊を詊みたが、増殖
は党く認められなか぀た。 実斜䟋  〔酵玠生産。〕 䞉角フラスコにトリプトフアン含有合成培
地Trp−PEP液䜓培地を1.5入れ、株及
び株の混合培逊をml怍菌し、60℃で30時間静
眮培逊を行぀たのち、実斜䟋に瀺すず同様に凊
理しお77.6の培逊液から、120の株湿菌䜓
を埗た。これを酞化アルミニりムにより摩砕し、
次いで、䞋蚘 10ÎŒMのピリドキサヌル5′−リン酞PLP、 の−メルカプト゚タノヌル、 250ÎŒMのPMSFセリンプロテアヌれ阻害剀、
〔プニルメチルスルホニルフルオラむド
Phenyl methyl slufonyl fluoride〕 50のK2HPO4−KH2PO4緩衝液、PH6.5、
の組成の粟補甚緩衝液166mlを添加するこずによ
り、可溶画分ずしお粗酵玠液を埗た。これから
〜50飜和硫安分画を集め、埗られた粗酵玠分画
液をストレプトマむシンによる陀栞酞凊理に賊し
たのち透析し、DEAE−トペパヌル東掋曹達工
業補品カラム2.6cm埄×12cmに吞着さ
せ、→400 KCl濃床募配400mlで溶出
凊理しお掻性画分を集め、次いでりルトロゲル
AcA34LKB瀟補品カラム2.1cm埄×85
cmでゲル過により粟補する。さらに、ハむド
ロキシルアパタむトゲルHTバむオラツド瀟補
品カラム2.6cm×cmに吞着させ、〜300
NH42SO4濃床募配300mlで溶出を行い、
掻性画分からトリプトフアナヌれ玄100mgを埗た。 本酵玠は玄70℃PH8.0に䜜甚至適枩床を
有し䞔぀玄65℃PH8.0、保持時間40分たで
は熱倱掻しない耐熱特性を瀺した。たた、本酵玠
のトリプトフアン分解の比掻性は垂販品37℃
の倍以䞊あり、逆反応によりむンドヌル、ピル
ビン酞、アンモニアよりのトリプトフアン合成掻
性も怜出された。
【図面の簡単な説明】
添付図面第図は本発明の耐熱性トリプトフア
ナヌれの至適PH及び掻性化を瀺すための各皮緩衝
液におけるトリプトフアナヌれ掻性−PHの関係を
瀺すグラフ、第図は本発明の耐熱性トリプトフ
アナヌれの安定PHを瀺すための各皮緩衝液におけ
る残存トリプトフアナヌれ掻性−PHの関係を瀺す
グラフ、第図は本発明の耐熱性トリプトフアナ
ヌれの至適枩床を瀺すグラフ、そしお第図は本
発明の耐熱性トリプトフアナヌれの熱倱掻特性を
瀺すための50℃−図、55℃−図、
60℃−図、65℃−図及び70℃
−図の各枩床における残存トリプトフア
ナヌれ掻性䞀時間分の関係を瀺すグラフであ
る。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  (a) 䜜甚至適枩床 箄70℃PH8.0 (b) 熱安定性 箄65℃PH8.0、保持時間40分たで熱倱
    掻しない、 (c) 䜜甚 ピリドキサヌルリン酞の関䞎のもずに、−
    トリプトフアンからピルビン酞、むンドヌル及
    びアンモニアを生成する、 (d) 基質特異性 トリプトフアン、−メチル−−システむ
    ン、−システむン及び−メチル−−トリ
    プトフアンを分解する、 (e) 至適PH及び安定PH範囲 至適PH7.0〜7.565℃、 安定PH〜1025℃ (f) 分子量 箄44000〜玄46000SDSゲル電気泳動による によ぀お特城づけられる耐熱性トリプトフアナヌ
    れ。  トリプトフアン含有合成培地においお単独で
    は生育しないが、バチルス・゚スピヌ・株
    Bacillus sp.strain ずの共生により生育す
    るバクテリりム属に属する耐熱性トリプトフアナ
    ヌれ生産性桿菌を培逊し、培逊物から耐熱性トリ
    プトフアナヌれを採取するこずを特城ずする䞋蚘
    の理化孊的性質 (a) 䜜甚至適枩床 箄70℃PH8.0 (b) 熱安定性 箄65℃PH8.0、保持時間40分たで熱倱
    掻しない、 (c) 䜜甚 ピリドキサヌルリン酞の関䞎のもずに、−
    トリプトフアンからピルビン酞、むンドヌル及
    びアンモニアを生成する、 (d) 基質特異性 トリプトフアン、−メチル−−システむ
    ン、−システむン及び−メチル−−トリ
    プトフアンを分解する、 (e) 至適PH及び安定PH範囲 至適PH7.0〜7.565℃、 安定PH〜1025℃ (f) 分子量 箄44000〜玄46000SDSゲル電気泳動による によ぀お特城づけられる耐熱性トリプトフアナヌ
    れの補法。  該耐熱性トリプトフアナヌれ生産性桿菌がバ
    クテリりム・株Bacterium strain 埮
    工研条寄第810号である特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の補法。  該バチルス・゚スピヌ・株Bacillus sp.
    strain がバチルス・゚スピヌ・株埮工
    研条寄第809号である特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の補法。
JP60124546A 1985-06-08 1985-06-08 耐熱性トリプトファナヌれおよびその補法 Granted JPS61282076A (ja)

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EP86304311A EP0206595B1 (en) 1985-06-08 1986-06-05 Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism
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